Средство, применяемое при лечении опухолей лимфатической ткани

Средство, применяемое при лечении опухолей лимфатической ткани

Реферат

 

Изобретение относится к медицине. Сущность его составляет лекарственное средство, применяемое при лечении опухолей лимфатической ткани (за исключением миеломы), включающее в качестве активного ингредиента антитело, которое специфически связывается с белком, имеющим аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1, в описании, и которое обладает цитотоксической активностью. Указанное антитело содержит констатную область C или представляет собой химерное антитело против НМ1. Технический результат - расширение арсенала средств против опухолей лимфатической ткани. 2 с. и 17 з. п. ф-лы, 27 ил. , 1 табл.

Область техники, к которой относится настоящее изобретение Изобретение относится к средствам, применяемым при лечении опухолей лимфатических тканей (за исключением миеломы), включающим в качестве активного ингредиента антитела, которые специфически связываются с белками, экспрессируемыми в указанных опухолях лимфатической ткани. Настоящее изобретение относится также к средствам, применяемым при лечении опухолей Т-клеток или опухолей В-клеток (за исключением миеломы). Кроме того, настоящее изобретение относится к антителам, которые специфически связываются с белками, экспрессируемыми в опухолях лимфатических тканей, и которые обладают цитотоксической активностью.

Предпосылки создания изобретения За иммунитет живых существ отвечают прежде всего лимфатические клетки. К лимфатическим клеткам относятся все клетки, происходящие из одних и тех же гемопоэтических стволовых клеток, которые высвобождаются в периферический кровоток после повторных стадий дифференцировки под действием различных факторов, индуцирующих дифференцировку, включая факторы, называемые иначе ростовыми факторами, имеющиеся в костном мозге или других органах. На основании различий в дифференцировке лимфоциты классифицируются на две больших группы В-клеток и Т-клеток. Считается, что В-клетки обладают способностью продуцировать антитела, тогда как Т-клетки имеют отношение к проявлению антигенности, цитотоксичности и др. свойств. При этом состояние, когда такие клетки по тем или иным причинам подвергаются изменениям, связанным с образованием опухолей, на тех или иных стадиях дифференцировки и начинают бесконтрольно пролиферировать в костном мозге, лимфатической ткани, крови или т. п. , относят к опухоли лимфатической ткани.

Благодаря использованию новой технологии, в частности тех преимуществ, которые дает метод применения моноклональных антител против поверхностных антигенов дифференциации, стало возможным идентифицировать начало и/или стадию дифференцировки лимфатических клеток. В этом случае стало возможно не только определить, из каких: Т-клеток или В-клеток, происходят такие опухолевые клетки, но также идентифицировать степень зрелости опухолевых клеток.

Опухоли лимфатической ткани на основе происхождения и степени зрелости опухолевых клеток подразделяют на два крупных класса: опухоли В-клеток и опухоли Т-клеток. В зависимости от степени зрелости опухолевых клеток опухоли В-клеток далее классифицируют на острый В-лимфолейкоз (В-ОЛЛ), хронический В-лимфолейкоз (В-ХЛЛ), пре-В-лимфому, лимфому Буркитта, фолликулярную лимфому, фолликулярную лимфому коры головного мозга, диффузную лимфому и др. С другой стороны, опухоли Т-клеток, в зависимости от степени зрелости опухолевых клеток, классифицируют на острый В-лимфолейкоз (В-ОЛЛ), хронический В-лимфолейкоз (В-ХЛЛ), заболевание, связанное с человеческим вирусом Т-клеток (АТЛ), лимфому периферических Т-клеток не АТЛ-типа (ПНТЛ) и др. (Zukai Rinso [Gan] (Illustrated Clinical: Cancer), series 17 Leukemia and lymphoma, Takashi Sugimura et al. , Medical View Co. , Ltd. , 1987, В cell tumors, Kiyoshi Takatsuki, Nishimura Shoten, 1991).

Однако, несмотря на последние достижения медицинской технологии, лечение опухолей лимфатических тканей не достигло удовлетворительных результатов. Степень излечивания острого лимфолейкоза (ОЛЛ), например, все еще составляет 20% или ниже, а лимфомы на стадии развитого заболевания около 50%, при этом относительно высокая степень излечивания В-лимфомы связана с прогрессом множественной терапии. Кроме того, Т-лимфома более склонна к проникновению в другие ткани и характеризуется степенью излечивания около 30%, тогда как степень излечивания заболевания, связанного с человеческим вирусом Т-клеток (АТЛ), в настоящее время составляет 10%.

Кроме того, Гото с соавт. (Goto, A. et al. ) сообщили о получении моноклонального антитела (антитела к НМ1.24) при иммунизации мышей миеломными клетками человека (Blood, 1994, 84, 1922-1930). При введении мыши с трансплантированными клетками миеломы человека антитела к НМ1.24, антитело специфически накапливается в опухолевых тканях (Masaakai Kosaka et al. , Nippon Rinsho (Japan Clinical) 1995, 53, 627-635), что дает основание предположить возможность применения антитела к НМ1.24 для диагностики локализации опухоли при радиоизотопном мечении, при терапии частицами, такой как радиоиммунотерапия и др. Однако не было известно данных о том, что антитело к НМ1.24 используется для лечения опухолей лимфатических тканей.

Сущность изобретения Применяемый в настоящее время метод лечения опухолей лимфатических тканей включает различные виды химиотерапии, рентгенотерапию, трансплантацию костного мозга и др. Однако, как отмечалось выше, ни один из этих методов не дает удовлетворительных результатов при лечении указанных заболеваний и, в этой связи, все еще имеется потребность в прорыве по созданию лекарственных средств и разработке методов, которые могли бы облегчить течение опухолей лимфатических тканей и удлинить продолжительность жизни пациентов.

В связи с вышесказанным целью настоящего изобретения является разработка лекарственного средства для применения в случае опухолей лимфатических тканей, за исключением миеломы.

Для создания такого лекарственного средства авторы изобретения провели обширные исследования in vitro, которые включали анализ методом проточной цитометрии, определение цитотоксической активности, такой как антителообусловленной клеточнозависимой цитотоксичности (ADCC/АОКЦ активности), комплементзависимой цитотоксичности (CDC/КЗЦ цитотоксичности) и др. , исследования in vivo по определению противоопухолевого эффекта с использованием антитела к НМ1.24 (Goto et al. Blood, 1994, 84, 1922-1930), а также работы по выделению белкового антигена, с которым специфически связывается антитело к НМ1.24. В результате проведенных исследований авторы показали, что на лимфатических опухолях экспрессируется белковый антиген, специфически распознаваемый антителом к НМ1.24, при этом указанное антитело к НМ1.24 обладает противоопухолевым действием в отношении опухолей лимфатических тканей, что и составило предмет настоящего изобретения.

В связи с этим, настоящее изобретение относится к лекарственному средству, применяемому при опухолях лимфатических тканей (за исключением миеломы), которое включает в качестве активного ингредиента, антитело, которое специфически связывается с белком, имеющим аминокислотную последовательность, указанную в последовательности SEQ ID NO: 1, и которое обладает цитотоксической активностью (перечни последовательностей приведены в конце описания).

Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству, применяемому при опухолях Т-клеток, или к лекарственному средству, применяемому при опухолях В-клеток (за исключением миеломы), включающему в качестве активного ингредиента антитело, которое специфически связывается с белком, имеющим аминокислотную последовательность, указанную в последовательности SEQ ID NO: 1, и которое обладает цитотоксической активностью.

Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству, применяемому при опухолях Т-клеток, или к лекарственному средству, применяемому при опухолях В-клеток (за исключением миеломы), включающему в качестве активного ингредиента моноклональное антитело, которое специфически связывается с белком, имеющим аминокислотную последовательность, указанную в последовательности SEQ ID NO: 1, и которое обладает цитотоксической активностью.

Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству, применяемому при опухолях Т-клеток, или к лекарственному средству, применяемому при опухолях В-клеток (за исключением миеломы), включающему в качестве активного ингредиента антитело, которое специфически связывается с белком, имеющим аминокислотную, последовательность, указанную в последовательности SEQ ID NO: 1, и которое обладает АОКЦ или КЗЦ активностью в качестве цитотоксической активности.

Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству, применяемому при опухолях Т-клеток, или к лекарственному средству, применяемому при опухолях В-клеток (за исключением миеломы), включающему в качестве активного ингредиента антитело, которое специфически связывается с белком, имеющим аминокислотную последовательность, указанную в последовательности SEQ ID NO: 1, и которое в качестве константной области содержит С человеческого антитела.

Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству, применяемому при опухолях Т-клеток, или к лекарственному средству, применяемому при опухолях В-клеток (за исключением миеломы), включающему в качестве активного ингредиента химерное антитело или гуманизированное антитело, которое специфически связывается с белком, имеющим аминокислотную последовательность, указанную в последовательности SEQ ID NO: 1, и которое обладает цитотоксической активностью.

Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству, применяемому при опухолях Т-клеток, или к лекарственному средству, применяемому при опухолях В-клеток (за исключением миеломы), включающему в качестве активного ингредиента антитело, которое специфически связывается с эпитопом, распознаваемым антителом к НМ1.24.

Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству, применяемому при опухолях Т-клеток, или к лекарственному средству, применяемому при опухолях В-клеток (за исключением миеломы), включающему в качестве активного ингредиента антитело к НМ1.24.

Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с белком, экспрессируемым в опухолях лимфатических тканей, и которое обладает цитотоксической активностью.

Краткое описание чертежей На фиг. 1 показана гистограмма, полученная в результате анализа методом проточной цитометрии указанной В-клеточной линии непрямым методом с использованием антитела к НМ1.24 и контрольного мышиного IgG2a.

На фиг. 2 показана гистограмма указанной В-клеточной линии, которая была исследована непрямым методом по способу проточной цитометрии с использованием антитела к НМ1.24 и контрольного мышиного IgG2a.

На фиг. 3 показана гистограмма указанной В-клеточной линии, которая была исследована непрямым методом по способу проточной цитометрии с использованием антитела к НМ1.24 и контрольного мышиного IgG2a.

На фиг. 4 показана гистограмма указанной В-клеточной линии, которая была исследована непрямым методом по способу проточной цитометрии с использованием антитела к НМ1.24 и контрольного мышиного IgG2a.

На фиг. 5 показана гистограмма указанной В-клеточной линии, которая была исследована непрямым методом по способу проточной цитометрии с использованием антитела к НМ1.24 и контрольного мышиного IgG2a.

На фиг. 6 показана гистограмма указанной В-клеточной линии, которая была исследована непрямым методом по способу проточной цитометрии с использованием антитела к НМ1.24 и контрольного мышиного IgG2a.

На фиг. 7 показана гистограмма указанной В-клеточной линии, которая была исследована непрямым методом по способу проточной цитометрии с использованием антитела к НМ1.24 и контрольного мышиного IgG2a.

На фиг. 8 показана гистограмма указанной В-клеточной линии, которая была исследована непрямым методом по способу проточной цитометрии с использованием антитела к НМ1.24 и контрольного мышиного IgG2a.

На фиг. 9 показана гистограмма указанной В-клеточной линии, которая была исследована непрямым методом по способу проточной цитометрии с использованием антитела к НМ1.24 и контрольного мышиного IgG2a.

На фиг. 10 показана гистограмма указанной Т-клеточной линии, которая была исследована непрямым методом по способу проточной цитометрии с использованием антитела к НМ1.24 и контрольного мышиного IgG2a.

На фиг. 11 показана гистограмма указанной Т-клеточной линии, которая была исследована непрямым методом по способу проточной цитометрии с использованием антитела к НМ1.24 и контрольного мышиного IgG2a.

На фиг. 12 показана гистограмма указанной Т-клеточной линии, которая была исследована непрямым методом по способу проточной цитометрии с использованием антитела к НМ1.24 и контрольного мышиного IgG2a.

На фиг. 13 показана гистограмма указанной Т-клеточной линии, которая была исследована непрямым методом по способу проточной цитометрии с использованием антитела к НМ1.24 и контрольного мышиного IgG2a.

На фиг. 14 показана гистограмма указанной Т-клеточной линии, которая была исследована непрямым методом по способу проточной цитометрии с использованием антитела к НМ1.24 и контрольного мышиного IgG2a.

На фиг. 15 показана гистограмма указанной Т-клеточной линии, которая была исследована, непрямым методом по способу проточной цитометрии с использованием антитела к НМ1.24 и контрольного мышиного IgG2a.

На фиг. 16 показана гистограмма указанной Т-клеточной линии, которая была исследована непрямым методом по способу проточной цитометрии с использованием антитела к НМ1.24 и контрольного мышиного IgG2a.

На фиг. 17 показана гистограмма указанной Т-клеточной линии, которая была исследована непрямым методом по способу проточной цитометрии с использованием антитела к НМ1.24 и контрольного мышиного IgG2a.

На фиг. 18 показана гистограмма указанной Т-клеточной линии, которая была исследована непрямым методом по способу проточной цитометрии с использованием антитела к НМ1.24 и контрольного мышиного IgG2a.

На фиг. 19 показана гистограмма указанной Т-клеточной линии, которая была исследована непрямым методом по способу проточной цитометрии с использованием антитела к НМ1.24 и контрольного мышиного IgG2a.

На фиг. 20 показана гистограмма указанной клеточной линии, не относящейся ни к Т-, ни к В-типу, которая была исследована непрямым методом по способу проточной цитометрии с использованием антитела к НМ1.24 и контрольного мышиного IgG2a.

На фиг. 21 показана гистограмма указанной клеточной линии, не относящейся ни к Т-, ни к В-типу, которая была исследована непрямым методом по способу проточной цитометрии с использованием антитела к НМ1.24 и контрольного мышиного IgG2a.

На фиг. 22 показана гистограмма указанной клеточной линии, не относящейся ни к Т-, ни к В-типу, которая была исследована непрямым методом по способу проточной цитометрии с использованием антитела к НМ1.24 и контрольного мышиного IgG2a.

На фиг. 23 показана гистограмма указанной клеточной линии, не относящейся ни к Т-, ни к В-типу, которая была исследована непрямым методом по способу проточной цитометрии с использованием антитела к НМ1.24 и контрольного мышиного IgG2a.

На фиг. 24 приведен график, показывающий, что антитело к НМ1.24 оказывает цитотоксический эффект на клеточные линии опухолей Т-клеток CCRF-CEM, CCRF-HSB-2 и HPB-MLT зависимым от дозы образом.

На фиг. 25 приведен график, показывающий, что антитело к НМ1.24 оказывает цитотоксический эффект на клеточные линии опухолей В-клеток ЕВ-3, МС116 и CCRF-SB зависимым от дозы образом.

На фиг. 26 приведен график, показывающий, что при введении антитела к НМ1.24 опытной группе мышей с трансплантированной лимфатической опухолью человека, наблюдается подавление увеличения объема опухоли в сравнении с контрольной группой животных, которым вводили IgG2a.

На фиг. 27 приведен график, показывающий, что при введении антитела к НМ1.24 опытной группе мышей с трансплантированной лимфатической опухолью человека, происходит удлинение периода выживания в сравнении с контрольной группой животных, которым вводили IgG2a.

Варианты реализации изобретения 1. Получение антител 1-1. Получение гибридомы Гибридомы, которые продуцируют антитела, используемые по настоящему изобретению, могут быть сконструированы, в основном, с использованием известных процедур, проведенных ниже. Так, белковый антиген НМ1.24 или клетки, которые экспрессируют антиген НМ1.24, могут использоваться в качестве сенсибилизирующего антигена и далее применяться для иммунизации в рамках традиционного метода иммунизации. Полученные иммунные клетки сливают с известными родительскими клетками в ходе обычного процесса слияния клеток и затем проводят скрининг с помощью традиционного метода скрининга для отбора клеток, которые продуцируют моноклональные антитела.

Конкретно, моноклональные антитела могут быть получены следующим способом. Так, например, в качестве клеток, экспрессирующих антиген НМ1.24, который представляет собой сенсибилизирующий антиген для получения антитела, может использоваться множественная миеломная клеточная линия человека КРММ2 (нерассмотренная заявка на патент Японии (Kokai) 7-236475) или КРС-32 (Goto Т. et. al. , Jpn. J. Clin. Hematol. , 1991, 32, 1400). Альтернативно, в качестве сенсибилизирующего антигена может быть использован белок, имеющий аминокислотную последовательность, указанную ниже в SEQ ID NO: 1, или пентид, или полипептед, содержащие эпитоп, распознаваемый антителом против НМ1.24.

В рамках настоящего описания кДНК, которая кодирует белок, имеющий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1, была вставлена в сайт расщепления XbaI вектора pUC19 с получением плазмиды pRS38-pUC19. E. coli, несущая эту плазмиду, депонирована в Международной Коллекции в соответствии с положением Будапештского Договора как Escherichia coli DH5 (pRS38-pUC19) 5 октября 1993 года Национальным Институтом биологических наук и гуманитарных технологий (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref. , Япония) как FERM BP-4434 (см. нерассмотренную заявку на патент Японии (Kokai) 7-196694). Фрагмент кДНК, содержащийся в плазмиде pRS38-pUC19, может быть использован для получения пептида или полипептида, содержащих эпитоп, распознаваемый антителом против НМ1.24, с использованием методов генной инженерии.

Предпочтительно, млекопитающие, которые иммунизируют сенсибилизирующим антигеном, отбирают с учетом совместимости их с родительской клеткой в процедуре клеточного слияния. В основном они включают, не ограничиваясь ими, грызунов, таких как мыши, крысы, хомячки и др.

Иммунизация животных сенсибилизирующим антигеном проводится с использованием известного метода. Общий метод включает, например, внутрибрюшинное или подкожное введение сенсибилизирующего антигена млекопитающему. Специфически, сенсибилизирующий антиген, который был разбавлен и суспендирован в соответствующем количестве фосфатно-буферного раствора (ФБР) или физиологического раствора и др. , смешивают, по желанию, с соответствующим количеством адъюванта Фрейнда. После эмульгирования его предпочтительно вводят млекопитающему несколько раз, каждые 4-21 день. Альтернативно может использоваться подходящий носитель для введения его в момент иммунизации сенсибилизирующим антигеном.

После проведения иммунизации и подтверждения повышения уровня нужного антитела в сыворотке иммунные клетки отбирают из организма млекопитающего и проводят клеточное слияние, в котором предпочтительные иммунные клетки включают, в частности, клетки селезенки.

Миеломные клетки млекопитающих, как пример других родительских клеток, которые подвергают процедуре клеточного слияния с указанными иммунными клетками, включают предпочтительно другие различные клеточные линии, такие как Р3Х63Аg8.653 (J. Immunol. 1979, 123: 1548-1550), P3X63Ag8U. l (Current Topics in Microbiology and Immunology, 1978, 81: 1-7), NS-1 (Kohler, G. and Milstein, C. , Eur. J. Immunol. , 1976, 6: 511-519), MPC-11 (Margulies, D. H. et. al. , Cell, 1976, 8: 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al. , Nature, 1978, 276: 269-270), FO (de St. Groth, S. F. et. al. , J. Immunol. Methods, 1980, 35: I-21), S194 (Trowbridge, I. S. , J. Exp. Med. , 1978, 148: 313-323), R210 (Galfre, G. et. al. , Nature, 1979, 277: 131-133) и др.

Процедура клеточного слияния между указанными иммунными клетками и миеломными клетками может быть проведена, по существу, в соответствии с известным методом, таким как описано Мильштейном с соавт. (Kohler, G. and Milstein, С. , Methods Enzymol. , 1981, 73: 3-46) и др.

Более конкретно указанная процедура слияния клеток проводится в обычном питательном бульоне в присутствии, например, ускорителя слияния клеток. В качестве ускорителя слияния клеток используют, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ), Сендаи вирус (HVJ) и, кроме того, может быть, по желанию, добавлен адъювант, такой как диметилсульфоксид и др. , для повышения активности процесса слияния.

Предпочтительно, соотношение использованных иммунных клеток и миеломных клеток соответствует, например, 1-10-кратному количеству иммунных клеток в сравнении с миеломными. Примером культуральных сред, которые могут использоваться для осуществления вышеуказанного процесса слияния клеток является среда RPMI1640 и культуральная среда MEM, пригодные для роста указанных миеломных клеточных линий, и традиционная культуральная среда, которые используются для культивирования указанного типа клеток, кроме того, в них могут быть внесены сывороточные добавки, такие как околоплодная сыворотка теленка (OCT, FSC).

В процессе слияния клеток заданное количество указанных иммунных клеток и миеломных клеток тщательно перемешивают в культуральной среде, в которую добавляют раствор ПЭГ, предварительно нагретый примерно до 37^oС, например раствор ПЭГ со средним молекулярным весом от примерно 1000 до 6000, в концентрации от 30 до 60% (вес/объем) и перемешивают с получением нужных клеток слияния (гибридом). Затем, посредством повторного последовательного добавления подходящей культуральной среды и центрифугирования с удалением супернатанта, агенты, необходимые для слияния клеток и др. , которые нежелательны для роста гибридом, могут быть удалены.

Селекцию указанных гибридом проводят при культивировании в традиционной селекционной среде, например в культуральной среде HAT (жидкая культура, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Культивирование в указанной культуральной среде продолжают, в основном, в течение времени, достаточного для гибели клеток, отличных от желательных гибридом (которые не являются клетками слияния), и, как правило, это составляет от нескольких дней до нескольких недель. Обычно применяют традиционный метод серийных разведений, в рамках которого гибридомы, которые продуцируют желательное антитело, отбирают и подвергают моноклональному клонированию.

Кроме получения указанной гибридомы посредством иммунизации антигеном животного, отличного от человека, можно также сенсибилизировать человеческие лимфоциты in vitro антигеном НМ1.24 или клеткам, экспрессирующими антитен НМ1.24, а затем полученные сенсибилизированные лимфоциты сливают с миеломными клетками человека, например U266, с получением желательного человеческого антитела, обладающего активностью по связыванию с антигеном НМ1.24 или клетками, экспрессирующими антиген НМ1.24 (см. публикацию по заявке на патент Японии (Kokoku) 1-59878). Кроме того, трансгенное животное, несущее спектр всех генов антител человека, иммунизируют антигеном, например антигеном НМ1.24, или клетками, эспрессирующими антиген НМ1.24, с получением желательного гуманизированного антитела по описанному выше методу (см. заявки на Международный патент WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 и WO 96/33735).

Сконструированные таким образом гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело, могут быть подвергнуты субкультивированию в традиционной культуральной среде или могут храниться в течение длительного периода времени в жидком азоте.

Для получения моноклонального антитела от указанной гибридомы используют метод, в рамках которого указанную гибридому культивируют традиционным способом и получают антитела в супернатанте, или метод, в соответствии с которым гибридому вводят для последующего роста в организм млекопитающего, совместимого с указанной гибридомой, и затем антитела получают из асцитов. Первый способ подходит для получения антител высокой степени чистоты, тогда как последний пригоден для крупномасштабного процесса получения антител.

В частности, гибридома, продуцирующая антитело против НМ1.24, может быть получена с использованием метода Гото (Goto, Т. , et. al. , Blood, 1994, 84: 1922-1930). Она также может быть получена с помощью метода, в рамках которого гибридому, продуцирующую антитело против НМ1.24, которая была депонирована в Международной Коллекции в соответствии с положениями Будапештского Договора как FERM ВР-5233 14 сентября 1995 года Национальным Институтом биологических наук и гуманитарных технологий (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref. , Япония) инъецируют внутрибрюшинно мышам линии BALB/C (производство CLEA, Япония) с получением асцитов, из которых выделяют и очищают антитела против НМ1.24, или используется метод, в соответствии с которым указанную гибридому культивируют в подходящей культуральной среде, такой как RPMI1640, содержащей 10% околоплодной сыворотки и 5% BM-Condimed H1 (производство Boehringer Mannheim), среде SFM для выращивания гибридом (производство GIBCO-BRL), среде PFHM-II (производство GIBCO-BRL) и др. , и в этом случае антитело против НМ1.24 может быть выделено и очищено из супернатанта.

1-2. Рекомбинантное антитело Рекомбинантное антитело, получаемое в соответствии с технологией манипулирования рекомбинантными генами, в рамках которой ген для антитела клонируют из гибридомы и интегрируют в соответствующий вектор, который затем вводят в организм хозяина, может использоваться по настоящему изобретению как моноклональное антитело (см. , например, Carl, А. К. , Вorrebaeck, James, W. Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, опубликованная в Великобритании, Macmillan Publishers LTD. , 1990).

В частности, мРНК, кодирующую вариабельную область (V-область) желательного антитела, выделяют из гибридомы, продуцирующей антитело. Для выделения мРНК получают общую РНК с использованием, например, известного метода, такого как метод ультрацентрифугирования в гуанидине (Chirgwin, J. M et al. , Biochemistry, 1979, 18: 5294-5299), the AGPC method (Chomczynski, P. et al. , Analytical Biochemistry, 1987, 162: 156-159) и затем выделяют мРНК из общей массы РНК с использованием набора для очистки мРНК (производство Pharmacia) и др. Альтернативно, мРНК можно непосредственно получить с использованием набора Quick Prep для очистки мРНК производства Pharmacia.

кДНК к V-области антитела может быть синтезирована из полученной указанным способом мРНК с использованием обратной траскриптазы. кДНК может быть синтезирована с использованием включающего обратную транскриптазу набора для синтеза кДНК AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit и др. Альтернативно, для синтеза и амплификации кДНК может быть использован набор 5'-Ampli Finder Race Kit (производство Clontech) и метод 5'-Race (Frohman, M. A. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85: 8998-9002; Belyavsky, A. et al. , Nucleic Acids Res. , 1989, 17: 2919-2932), в рамках которой используется полимеразная цепная реакция (ПЦР). Желательный фрагмент ДНК очищают из полученного продукта ПЦР и далее он может быть лигирован с векторной ДНК. Кроме того, на его основе конструируют рекомбинантный вектор и вводят его в E. coli и далее до отбора колоний для получения желательного рекомбинантного вектора. Нуклеотидная последовательность заданной ДНК может быть подтверждена с помощью известного метода, такого как дидезоксиметод.

При получении ДНК, кодирующей V-область желательного антитела, ее можно лигировать с ДНК, кодирующей константную область (С-область) желательного антитела, и затем полученный продукт интегрируют в вектор экспрессии. Альтернативно, ДНК, кодирующая V-область антитела, может быть интегрирована в вектор экспрессии, который уже содержит ДНК, кодирующую С-область антитела.

Для продуцирования антитела, применяемого по настоящему изобретению, ген антитела интегрируют, как будет описано ниже, в вектор экспрессии так, чтобы экспрессия проходила под контролем регуляторной области экспрессии, например энхансера и/или промотора. Впоследствии вектор экспрессии может быть принесен трансформацией в клетку хозяина, где антитело может экспрессироваться.

1-3. Измененное антитело В соответствии с настоящим изобретением искусственно измененное рекомбинантное антитело, такое как химерное антитело и гуманизированное антитело, может использоваться для цели снижения гетерологичной антигенности в отношении человека. Такие измененные антитела могут быть получены с использованием известных методов.

Химерное антитело может быть получено при лигировании полученной описанным выше способом ДНК, кодирующей V-область антитела, с ДНК, кодирующей С-область антитела человека, и затем полученный продукт встраивают в вектор экспрессии и вводят в организм хозяина для продуцирования в нем антитела (см. заявку на Европейский патент ЕР 125023 и заявку на Международный патент WO 96/02576). Химерное антитело, применяемое по настоящему изобретению, может быть получено с использованием известного метода.

Например, E. coli, несущая плазмиду, которая содержит ДНК, кодирующую L-цепь V-области или Н-цепь V-области химерного антитела против НМ1.24, была депонирована в Международной Коллекции в соответствии с положениями Будапештского Договора как Escherichia coil DH5 (pUC19-1.24L-gk) и Escherichia coil DH5 (pUC19-1.24H-gl), соответственно, 29 августа 1996 года Национальным Институтом биологических наук и гуманитарных технологий (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref. , Япония) как FERM BP-5646 и FERM BP-5644 соответственно (см. заявку на патент Японии 9-271536).

Гуманизированное антитело, которое также называют восстановленным человеческим антителом, получают при трансплантации гипервариабельного участка (ГВУ) антитела млекопитающего, отличного от человека, например антитела мыши, в ГВУ человеческого антитела. В целом, технология, основанная на получении рекомбинантной ДНК, для продуцирования таких антител также известна (см. заявку на Европейский патент ЕР 125023 и заявку на Международный патент WO 96/02576).

Конкретно, методом ПЦР синтезируют последовательность ДНК, которая должна подходить для лигирования ГВУ мышиного антитела с каркасной областью (КО) человеческого антитела с использованием нескольких раздельных олигонуклеотидов, несущих на концах разрезы, перекрывающиеся один с другим. Полученную таким образом ДНК лигируют с ДНК, кодирующей С-область человеческого антитела, и затем встраивают полученный продукт в вектор экспрессии, который затем вводят в организм хозяина для продуцирования антител (см. заявку на Европейский патент ЕР 239400 и заявку на Международный патент WO 96/02576).

Отбирают КО человеческих антител, сшитые через ГВУ так, чтобы участки, определяющие комплементарность, образовывали сайт, благоприятный для связывания с антигеном. При желании, аминокислоты в каркасных областях вариабельной области антитела могут быть замещены так, чтобы гипервариабельный участок восстановленного человеческого антитела мог образовывать подходящий сайт для связывания с антигеном (Sato, К. et al. , Cancer Res. , 1993, 53: 851-856).

Например, E. coli, несущая плазмиду, которая содержит ДНК, кодирующую вариант a (SEQ ID NO: 2) L-цепи V-области и вариант r (SEQ ID NO: 2) L-цепи V-области гуманизированного антитела против НМ1.24, была депонирована в Международной Коллекции в соответствии с положениями Будапештского Договора как Escherichia coli DH5 (pUC19-RVLa-AHM-gk) и Escherichia coli DH5 (рUС19-РVНr-AНМ-gyl) соответственно 29 августа 1996 года Национальным Институтом биологических наук и гуманитарных технологий (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref. , Япония) как FERM BP-5645 и FERM BP-5643, соответственно (см. заявку на патент Японии 9-271536). Кроме того, E. coli, несущая плазмиду, которая содержит ДНК, кодирующую вариант s (SEQ ID NO: 4) Н-цепи V-области гуманизированного антитела против НМ1.24, была депонирована в Международной Коллекции в соответствии с положениями Будапештского Договора как Escherichia coli DH5 (pUC19-RVHs-AHM-gyl) 29 сентября 1997 года Национальным Институтом биологических наук и гуманитарных технологий (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref. , Япония) как FERM BP-6127 (заявка на патент Японии 9-271536).

В случае химерного или гуманизированного антитела используют С-область человеческого антитела и наиболее предпочтительно в качестве константной области человеческого антитела может быть использована С, такая как С1, С2, С3 и С4. Среди них антитела, содержащие С1 и С3, обладают мощной цитотоксической активностью, т. е. АОКЦ и КЗЦ активностью, и в этой связи они предпочтительно используются по настоящему изобретению.

Химерное антитело включает вариабельную область антитела, происходящего из млекопитающего, отличного от человека, и С-область, происходящую из человеческого антитела, при этом гуманизированное антитело включает гипервариабельные участки антитела, происходящего из млекопитающего, отличного от человека, каркасные области (КО) и С-область антитела, происходящие из человеческого антитела. В соответствии с этим их антигенность в организме человека снижается, так что они могут быть использованы в качестве активного ингредиента лекарственных средств по настоящему изобретению.

Предпочтительный вариант гуманизированного антитела для использования по настоящему изобретению включает гуманизированное антитело против НМ1.24 (см. заявку на патент Японии 9-271536). Предпочтительный вариант L-цепи V-области гуманизированного антитела против НМ1.24 включает тот, в котором имеется аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 2. Предпочтительный вариант Н-цепи V-области гуманизированного антитела против НМ1.24 включает тот из них, который имеет аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью оснований, указанной в SEQ ID NO: 3 или 4.

1-4. Экспрессия и продуцирование Гены для антител, сконструированных как указано выше, могут экспрессироваться, в результате чего с использованием известного метода может быть получено антитело. В случае использования клеток млекопитающих экспрессия может проводиться с использованием вектора экспрессии, содержащего обычно применяемый промотор, ген антитела, который должен экспрессироваться, и ДНК, в которой поли А сигнал был оперативно сшит на 3' конце по направлению репликации, или вектор, содержащий указанную ДНК. Примеры промотора/энхансера включают ранний промотор/энхансер цитомегаловируса человека.

Кроме того, в качестве промотора-энхансера, которые могут использоваться для экспрессии антитела по настоящему изобретению, могут найти применение вирусные промоторы/энхансеры, такие как промоторы/энхансеры ретровируса, вируса полиомы, аденовируса и вакуолизирующего обезьяньего вируса 40 (SV40), а также промоторы/энхансеры, полученные из клеток млекопитающих, такие как человеческий фактор элонгации 1 (HEF1).

Так например, экспрессия может быть легко осуществлена по методу Миллигана с соавт. (Milligan et al. , Nature, 1979, 277, 108) в рамках которого используется промотор/энхансер SV40, или по методу Мицушима с соавт. (Mizushima et al. , Nucleic Acids Res. , 1990, 18, 5322), в котором используется промотор/энхансер HEF1.

В случае E. coli экспрессия может быть осуществлена при оперативном связывании обычно используемого промотора, сигнальной последовательности для секреции антитела и гена антитела, который подлежит экспрессии, с последующей его экспрессией. В качестве промотора можно, например, упомянуть промотор lacz и промотор аrаВ. В случае использования промотора lacz можно использовать метод Варда с соавт. (Ward et al. , Nature, 1998, 341, 544-546; Faseb J. 1992, 6, 2422-2427), а в случае использования промот