Комплексы нуклеиновых кислот - лигандов сосудистого эндотелиального фактора роста (vegf)

Комплексы нуклеиновых кислот - лигандов сосудистого эндотелиального фактора роста (vegf)

Реферат

 

Изобретение относится к очищенным и выделенным не встречающимся в природе РНК-лигандам к сосудистому эндотелиальному фактору роста (VEGF) (указаны олигонуклеотидные последовательности). Описаны комплексы формулы А-В-Y, где А - полиалкиленгликоль или глицеринлипид, В - линкер(ы), Y - РНК-лиганд к VEGF. Описан способ получения этих комплексов, включающий идентификацию РНК-лиганда из смеси Кандидатов Нуклеиновых Кислот, обладающих повышенной аффинностью к VEGF, а также липидная конструкция, включающая этот комплекс. Комплексы по изобретению улучшают фармакокинетические свойства РНК-лигандов к VEGF и используются для лечения VEGF-опосредованных заболеваний, в том числе для ингибирования VEGF-опосредованного ангиогенеза, роста опухолей и дегенерации желтого пятна. Предлагаются также способ снижения клиренса из плазмы Нуклеиновой Кислоты Лиганда к VEGF, способ пролонгации его действия в глазе и способ направления терапевтического или диагностического агента к биологической мишени. 15 с. и 62 з. п. ф-лы, 39 ил. , 13 табл.

Описываются высоко аффинные 2'фтор(2-F')-пиримидин-РНК-лиганды к сосудистому эндотелиальному фактору роста (VEGF). Использованный здесь способ идентификации таких Нуклеиновых Кислот-Лигандов называется SELEX, акроним для Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment. Далее в данное изобретение включен способ получения терапевтического или диагностического Комплекса, состоящего из Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF и Неиммуногенного Соединения Высокой Молекулярной Массы или Липофильного Соединения, посредством идентификации Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF с помощью методологии SELEX и ковалентной сшивки Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF с Неиммуногенным Соединением Высокой Молекулярной Массы или Липофильным Соединением. Далее изобретение включает в себя Комплексы, состоящие из одной или более чем одной Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF и Неиммуногенного Соединения Высокой Молекулярной Массы или Липофильного Соединения. Кроме того, изобретение относится к усовершенствованию фармакокинетических свойств Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF посредством ковалентной сшивки Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF с Неиммуногенным Соединением Высокой Молекулярной Массы или Липофильным Соединением с образованием Комплекса. Далее изобретение относится к усовершенствованию фармакокинетических свойств Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF посредством использования Липидной Конструкции, содержащей Нуклеиновую Кислоту-Лиганд VEGF или Комплекс, содержащий Нуклеиновую Кислоту-Лиганд VEGF и Неиммуногенное Соединение Высокой Молекулярной Массы или Липофильное Соединение. Кроме того, данное изобретение относится к способу для направления терапевтического или диагностического агента к биологической мишени, которая экспрессирует VEGF, посредством соединения этого агента с Комплексом, состоящим из Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF и Липофильного Соединения или Неиммуногенного Соединения Высокой Молекулярной Массы, причем этот Комплекс дополнительно соединен с Липидной Конструкцией, а Нуклеиновая Кислота-Лиганд VEGF дополнительно соединена с наружной стороной Липидной Конструкции.

Предпосылки изобретения A. SELEX В течение многих лет догмой являлось то, что нуклеиновые кислоты играют прежде всего информационную роль. Благодаря способу, известному как систематическое выделение лигандов посредством экспоненциального обогащения (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment), названному SELEX, стало ясно, что нуклеиновые кислоты, подобно белкам, имеют трехмерное структурное многообразие. SELEX представляет собой способ выделения in vitro молекул Нуклеиновых Кислот с высокоспецифичным связыванием с молекулами-мишенями и описан в Заявке на патент США, порядковый N 07/536428, поданной 11 июня 1990, озаглавленной "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment", в настоящее время отозвана, в Заявке на патент США, порядковый N 07/714131, поданной 10 июня 1991, озаглавленной "Nucleic Acid Ligands", в настоящее время патент США N 5475096, в Заявке на патент США, порядковый N 07/931473, поданной 17 августа 1992, озаглавленной "Method for Identifying Nucleic Acid Ligadns", в настоящее время патент США N 5270163 (см. также WO 91/19813), каждая из которых конкретно включена здесь путем ссылки. В каждой из этих заявок, на которые совокупно ссылаются здесь как на Заявки на патент SELEX, описывается фундаментально новый способ получения Нуклеиновой Кислоты-Лиганда к любой желаемой молекуле-мишени. Способ SELEX обеспечивает класс продуктов, на которые ссылаются как на Нуклеиновые Кислоты-Лиганды, причем каждый лиганд имеет уникальную последовательность, и которые обладают свойством специфического связывания с желаемым соединением-мишенью или с желаемой молекулой-мишенью. Каждая идентифицированная по SELEX Нуклеиновая Кислота-Лиганд представляет собой специфический лиганд данного соединения-мишени или данной молекулы-мишени. SELEX основан на уникальном представлении, что нуклеиновые кислоты имеют достаточную способность к образованию множества двух- и трехмерных структур и достаточную химическую многосторонность, возможную в пределах их мономеров, чтобы действовать в качестве лигандов (образовывать специфичные связывающиеся пары) фактически с любым химическим соединением, либо мономерным, либо полимерным. В качестве мишеней могут служить молекулы любого размера и состава.

Способ SELEX включает в себя отбор из смеси олигонуклеотидов-кандидатов и ступенчатые повторения связывания, разделения и амплификации с использованием одной и той же общей схемы отбора, чтобы достичь фактически любого желаемого критерия аффинности и избирательности связывания. Начиная со смеси Нуклеиновых Кислот, предпочтительно содержащей сегмент рандомизированной последовательности, способ SELEX включает в себя стадии приведения в контакт смеси с мишенью в условиях, благоприятных для связывания, отделения несвязанных Нуклеиновых Кислот от тех Нуклеиновых Кислот, которые специфически связались с молекулами-мишенями, диссоциации Комплексов Нуклеиновая Кислота-мишень, амплификации Нуклеиновых Кислот, диссоциированных из Комплексов Нуклеиновая Кислота-мишень, с получением смеси Нуклеиновых Кислот, обогащенной лигандами, затем повторения еще раз стадий связывания, разделения, диссоциации и амплификации в течение стольких циклов, сколько желательно для получения высокоспецифичных высоко аффинных Нуклеиновых Кислот-Лигандов к молекуле-мишени.

Авторами настоящего изобретения показано, что способ SELEX демонстрирует, что нуклеиновые кислоты как химические соединения могут образовывать большое множество форм, размеров и конфигураций и способны к значительно более широкому спектру связывания и к функциям, иным чем те, которые проявляют нуклеиновые кислоты в биологических системах.

Авторы настоящего изобретения показали, что SELEX или подобные SELEX способы могут применяться для того, чтобы идентифицировать нуклеиновые кислоты, которые могут способствовать любой выбранной реакции путем, подобным тому, при котором можно идентифицировать Нуклеиновые Кислоты-Лиганды для любой данной мишени. Авторы настоящего изобретения постулируют, что теоретически в пределах Смеси Кандидатов из примерно от 10¹³ до 10¹⁸ Нуклеиновых Кислот существует по меньшей мере одна Нуклеиновая Кислота подходящей формы, чтобы способствовать каждому из широкого разнообразия физических и химических взаимодействий.

Основной способ SELEX был модифицирован для достижения ряда конкретных целей. Например, в Заявке на патент США, порядковый N 07/960093, поданной 14 октября 1992, озаглавленной "Method for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure", описывается применение SELEX вместе с гель-электрофорезом для отбора молекул Нуклеиновых Кислот со специфическими структурными характеристиками, таких как изогнутая ДНК. В Заявке на патент США, порядковый N 08/123935, поданной 17 сентября 1993, озаглавленной "Photoselection of Nucleic Acid Ligands", описывается способ на основе SELEX для отбора Нуклеиновых Кислот-Лигандов, содержащих фотореактивные группы, способные к связыванию и/или к поперечному фотосвязыванию и/или к фотоинактивации молекулы-мишени. В Заявке на патент США, порядковый N 08/134028, поданной 7 октября 1993, озаглавленной "High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffeine", в настоящее время патент США N 5580737, описывается способ идентификации высокоспецифичных Нуклеиновых Кислот-Лигандов, способных различать близкородственные молекулы, которые могут не являться пептидами, названный Counter-SELEX. В Заявке на патент США, порядковый N 08/143564, поданной 25 октября 1993, озаглавленной "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Solution SELEX", в настоящее время патент США N 5567588, описывается способ на основе SELEX, с помощью которого достигается высокоэффективное разделение между олигонуклеотидами, имеющими высокую и низкую аффинность к молекуле-мишени.

Способ SELEX заключается в идентификации высоко аффинных Нуклеиновых Кислот-Лигандов, содержащих модифицированные нуклеотиды, придающие лиганду усовершенствованные характеристики, такие как улучшенная стабильность in vivo или улучшенные характеристики доставки. Примеры таких модификаций включают в себя химические замещения в положениях рибозы и/или фосфата и/или основания. Идентифицированные по SELEX Нуклеиновые Кислоты-Лиганды, содержащие модифицированные нуклеотиды, описываются в Заявке на патент США, порядковый N 08/177991, поданной 8 сентября 1993, озаглавленной "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides", в настоящее время патент США N 5660985, где описываются олигонуклеотиды, содержащие производные нуклеотидов, химически модифицированных в 5- и 2'-положениях пиримидинов. В Заявке на патент США, порядковый N 08/134028, см. выше, описываются высокоспецифичные Нуклеиновые Кислоты-Лиганды, содержащие один или более чем один нуклеотид, модифицированный 2'-амино (2'-NH₂), 2'-фторо(2'-F) и/или 2'-O-метил (2'-ОМе). В Заявке на патент США, порядковый N 08/264029, поданной 22 июня 1994, озаглавленной "Novel Method of Preparation of Known and Novel 2'-Modified Nucleosides by Intramolecular Nucleophilic Displacement", описываются олигонуклеотиды, содержащие различные 2'-модифицированные пиримидины.

Способ SELEX заключается в соединении выбранных олигонуклеотидов с другими выбранными олигонуклеотидами и не-олигонуклеотидными функциональными единицами, как описано в Заявке на патент США, порядковый N 08/284063, поданной 2 августа 1994, озаглавленной "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chimeric SELEX", в настоящее время патент США N 5637459, и в Заявке на патент США, порядковый N 08/234997, поданной 28 апреля 1994, озаглавленной "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Blended SELEX", соответственно. Данные заявки дают возможность сочетания широкого множества форм и других свойств, а также свойств эффективной амплификации и репликации олигонуклеотидов с желаемыми свойствами других молекул.

Способ SELEX далее заключается в соединении отобранных Нуклеиновых Кислот-Лигандов с Липофильными Соединениями или Неиммуногенными Соединениями Высокой Молекулярной Массы в диагностический или терапевтический Комплекс, как описано в Заявке на патент США, порядковый N 08/434465, поданной 4 мая 1995, озаглавленной "Nucleic Acid Complexes". Нуклеиновые Кислоты-Лиганды VEGF, которые соединены с Липофильным Соединением, таким как диацилглицерин или диалкилглицерин, в диагностический или терапевтический Комплекс, описаны в Заявке на патент США, порядковый N 08/739109, поданной 25 октября 1996, озаглавленной "Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Nucleic Acid Ligand Complexes". Нуклеиновые Кислоты-Лиганды VEGF, которые соединены с Неиммуногенным Соединением Высокой Молекулярной Массы, таким как Полиэтиленгликоль, или Липофильным Соединением, таким как Глицеролипид, фосфолипид или глицеринамидлипид, в диагностический или терапевтический Комплекс, описаны в Заявке на патент США, порядковый N 08/897351, поданной 21 июля 1997, озаглавленной "Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Nucleic Acid Ligand Complexes". Каждая из вышеописанных Заявок на патент, в которых описываются модификации основной методики SELEX, конкретно включены здесь полностью путем ссылки.

Б. ЛИПИДНЫЕ КОНСТРУКЦИИ Липидные бислойные везикулы представляют собой замкнутые, заполненные жидкостью микроскопические сферы, которые образуются главным образом из индивидуальных молекул, имеющих полярные (гидрофильные) и неполярные (липофильные) участки. Гидрофильные участки могут содержать фосфатную, глицерилфосфатную, карбокси, сульфатную, амино, гидрокси, холиновую или другие полярные группы. Примерами липофильных групп являются насыщенные или ненасыщенные углеводороды, такие как алкил, алкенил, или другие липидные группы. Стерины (например, холестерин) и другие фармацевтически приемлемые адъюванты (включая антиоксиданты, подобные альфа-токоферолу) также могут быть включены для улучшения стабильности везикул или придания других желаемых характеристик.

Липосомы представляют собой подгруппу этих бислойных везикул и содержат главным образом фосфолипидные молекулы, которые несут два гидрофобных хвоста, состоящих из цепей жирных кислот. При экспозиции с водой эти молекулы спонтанно выстраиваются с образованием сферических бислойных мембран с липофильными концами этих молекул в каждом слое, соединенными в центре мембраны, и противоположными полярными концами, образующими соответствующие внутреннюю и внешнюю поверхности этой двухслойной мембраны (мембран). Таким образом, каждая сторона мембраны представляет собой гидрофильную поверхность, тогда как внутри мембрана представляет собой липофильную среду. Эти мембраны могут быть организованы в ряд концентрических сферических мембран, разделенных тонким слоем воды, в некоторой степени подобно слоям луковицы, вокруг внутреннего водного пространства. Эти многослойные везикулы (MLV) можно превратить в маленькие или Однослойные Везикулы (UV) при приложении силы гидродинамического фрагментирования.

Терапевтическое применение липосом включает в себя доставку лекарственных средств, которые обычно являются токсичными в свободной форме. В форме липосом токсичное лекарственное средство является закрытым и может не затрагивать ткани, чувствительные к этому лекарственному средству, и доставлено к избранным областям. Липосомы также можно применять терапевтически для высвобождения лекарственных средств в течение длительного периода времени, уменьшая частоту введения. Кроме того, липосомы могут обеспечить способ получения водных дисперсий гидрофобных или амфифильных лекарственных средств, которые обычно являются неподходящими для внутривенного введения.

Для того чтобы многие лекарственные средства и визуализирующие агенты обладали терапевтическим или диагностическим потенциалом, необходимо, чтобы они были доставлены к правильному местоположению в организме, и, таким образом, липосома может быть легко инъецирована, что создает основу для длительного высвобождения и доставки лекарственного средства к клеткам специфических типов или частям организма. Можно использовать несколько методик для применения липосом для направления инкапсулированных лекарственных средств к избранным тканям хозяина и удаления от чувствительных тканей. Эти методики включают в себя манипулирование размером липосом, их поверхностным зарядом и путем их введения. MLV, прежде всего в связи с тем, что они являются относительно большими, обычно быстро поглощаются ретикулоэндотелиальной системой (в основном, печени и селезенки). С другой стороны, обнаружено, что UV демонстрируют повышенное время циркуляции, пониженные скорости клиренса и большее биологическое распространение относительно MLV.

Пассивная доставка липосом включает в себя применение различных путей введения, например внутривенного, подкожного, внутримышечного и местного. Каждый путь дает различия в локализации липосом. Два общих способа, используемых для активного направления липосом к избранным областям-мишеням, включают в себя присоединение к поверхности липосом либо антител, либо специфичных рецепторных лигандов. Известно, что антитела обладают высокой специфичностью к их соответствующему антигену, и их присоединяли к поверхности липосом, но результаты во многих случаях были менее чем успешными. Некоторые усилия, однако, были успешными при направлении липосом к опухолям без использования антител, см. , например, патент США N 5019369, патент США N 5441745 или патент США N 5435989.

Областью разработок, которыми энергично занимаются исследователи, является доставка агентов не только к специфическому типу клеток, но внутрь цитоплазмы клетки и, более того, в ядро. Это является особенно важным для доставки биологических агентов, таких как ДНК, РНК, рибозимы и белки. Многообещающее терапевтическое исследование в этой области включает в себя применение антисмысловых олигонуклеотидов ДНК и РНК для лечения заболевания. Однако, одна из главных проблем, встречающихся на пути эффективного применения антисмысловой технологии, состоит в том, что олигонуклеотиды в своей фосфодиэфирной форме быстро разрушаются в жидкостях организма, а также внутриклеточными и внеклеточными ферментами, такими как эндонуклеазы и экзонуклеазы, прежде чем достигают клетки-мишени. Внутривенное введение также приводит к быстрому почечному клиренсу из кровотока, и поглощение является недостаточным для получения эффективной внутриклеточной концентрации лекарственного средства. Липосомная инкапсуляция защищает олигонуклеотиды от расщепления ферментами, повышает период полураспада в кровообращении и повышает эффективность поглощения в результате фагоцитоза липосом. Таким образом, олигонуклеотиды способны достичь их желаемой мишени и доставляться к клеткам in vivo.

Сообщалось о нескольких случаях, когда исследователи присоединяли антисмысловые олигонуклеотиды к Липофильным Соединениям или Неиммуногенным Соединениям Высокой Молекулярной Массы. Антисмысловые олигонуклеотиды, однако, являются эффективными только как внутриклеточные агенты. Антисмысловые олигодезоксирибонуклеотиды, имеющие мишенью рецептор эпидермального фактора роста (EGF), инкапсулированные в липосомы, связанные с фолатом через полиэтиленгликолевый спейсер (фолат-ПЭГ-липосомы), доставляли к культивируемым клеткам KB через опосредованный рецептором фолата эндоцитоз (Wang et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3318-3322). Кроме того, к олигонуклеотидам присоединяли алкилендиолы (Weiss et al. , патент США N 5245022). Кроме того, в литературе описано Липофильное Соединение, ковалентно присоединенное к антисмысловому олигонуклеотиду (ЕР 462145В1).

Загрузку биологических агентов в липосомы можно осуществлять путем включения в липидный препарат или загрузки в преформированные липосомы. Описано пассивное заякоривание олигопептидных и олигосахаридных лигандов во внешнюю поверхность липосом (Zalipsky et al. (1997) Bioconjug. Chem. , 8: 111: 118).

В. VEGF Рост новых кровеносных сосудов из существующего эндотелия (ангиогенез) у здоровых взрослых людей жестко контролируется противоположными воздействиями позитивных и негативных регуляторов. При определенных патологических состояниях, включая пролиферативные ретинопатии, ревматоидный артрит, псориаз и рак, превалируют позитивные регуляторы, и ангиогенез вносит вклад в прогрессирование заболевания (обзор Folkman (1995) Nature Medicine 1: 27-31). Представление о том, что при раке ангиогенез представляет собой лимитирующую скорость стадию опухолевого роста и метастаза (Folkman (1971) New Engl. J. Med. 285: 1182-1186), в настоящее время подтверждается многочисленными экспериментальными данными (обзоры Aznavoorian et al. (1993) Cancer 71: 1368-1383; Fidler and Ellis (1994) Cell 79: 185-188; Folkman (1990) J. Natl. Cancer Inst. 82: 4-6).

Количество кровеносных сосудов в ткани опухоли является сильным отрицательным прогностическим признаком при раке молочной железы (Weidner et al. (1992) J. Natl. Cancer Inst. 84: 1875-1887), раке простаты (Weidner et al. (1993) Am. J. Pathol. 143: 401-409), опухолях головного мозга (Li et al. (1994) Lancet 344: 82-86) и меланоме (Foss et al. (1996) Cancer Res. 56: 2900-2903).

Оказывается, что ряд ангиогенных факторов роста, описанных к настоящему времени, среди которых находится сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), играют ключевую роль в качестве позитивного регулятора физиологического и патологического ангиогенеза (обзор в Brown et al. (1996) Control of Angiogenesis (ред. Goldberg and Rosen) Birkhauser, Basel, в печати: Thomas (1996) J. Biol. Chem. 271: 603-606). VEGF представляет собой секретируемый дисульфидно связанный гомодимер, который избирательно стимулирует эндотелиальные клетки к пролиферации, миграции и продуцированию ферментов, разрушающих матрикс (Conn et al. (1990) Рrос. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1323-1327; Ferrara and Henzel (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 161: 851-858; Gospodarowicz et al. (1989) Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 7311-7315; Pepper et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 181: 902-906; Unemori et al. (1992) J. Cell. Physiol. 153: 557-562), причем все эти процессы требуются для образования новых сосудов. Кроме того, что VEGF является единственным известным митогеном, специфичным для эндотелиальных клеток, он является уникальным среди ангиогенных факторов роста по своей способности индуцировать в кровеносном сосуде временное повышение его проницаемости для макромолекул (отсюда его исходное и альтернативное название - фактор сосудистой проницаемости, VPF) (Dvorak et al. (1979) J. Immunol. 122: 166-174; Senger et al. (1983) Science 219: 983-985; Senger et al. (1986) Cancer Res. 46: 5629-5632). Повышенная сосудистая проницаемость и, в результате нее, отложение белков плазмы во внесосудистом пространстве содействуют образованию новых сосудов посредством создания временного матрикса для миграции эндотелиальных клеток (Dvorak et al. (1995) Am. J. Pathol. 146: 1029-1039). Сверхпроницаемость в действительности является характерной чертой новых сосудов, включая те, которые связаны с опухолями (Dvorak et al. (1995) Am. J. Pathol. 146: 1029-1039). Кроме того, в настоящее время известно, что компенсаторный ангиогенез, индуцированный гипоксией ткани, является опосредованным VEGF (Levy et al. (1996) J. Biol. Chem. 2746-2753); Shweiki et al. (1992) Nature 359: 843-845).

VEGF встречается в четырех формах (VEGF-121, VEGF-165, VEGF-189, VEGF-206) в результате альтернативного сплайсинга гена VEGF (Houck et al. (1991) Mol. Endocrin. 5: 1806-1814; Tischer et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 11947-11954). Две меньшие формы являются способными к диффузии, тогда как две большие формы остаются преимущественно локализованными на клеточной мембране как следствие их высокой аффинности к гепарину. VEGF-165 также связывается с гепарином и является наиболее часто встречающейся формой. VEGF-121, единственная форма, которая не связывается с гепарином, как оказывается, обладает более низкой аффинностью к рецепторам (Gitay-Goren et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 5519-5523), так же как и более низкой митогенной активностью (Keyt et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 7788-7795). Биологические воздействия VEGF опосредованы двумя тирозинкиназными рецепторами (Flt-1 и Flk-1/KDR), экспрессия которых в высокой степени ограничена клетками эндотелиального происхождения (de Vries et al. (1992) Science 255: 989-991; Millauer et al. (1993) Cell 72: 835-846; Terman et al. (1991) Oncogene 6: 519-524). Хотя для высоко аффинного связывания требуется экспрессия обоих функциональных рецепторов, хемотаксическая и митогенная передача сигнала в эндотелиальных клетках, как оказывается, осуществляется прежде всего через KDR рецептор (Park et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 25646-25654; Seetharam et al. (1995) Oncogene 10: 135-147; Waltenberger et al. (1994) J. Biol. Chem. 26988-26995). Значение VEGF и рецепторов VEGF для развития кровеносных сосудов недавно продемонстрировано на мышах, у которых отсутствует единственная аллель для гена VEGF (Carmeliet et al. (1996) Nature 380: 435-439; Ferrara et al. (1996) Nature 380: 439-442) или обе аллели Flt-1 (Fong et al. (1995) 376: 66-70) или Flk-1 генов (Shalaby et al. (1995) Nature 376: 62-66). В каждом случае наблюдались явные аномалии в образовании сосудов, приводящие к эмбриональной летальности.

VEGF продуцируется и секретируется в варьирующих количествах фактически всеми опухолевыми клетками (Brown et al. (1997) Regulation of Angiogenesis (ред. Goldberg and Rosen) Birkhauser, Basel, pp. 233-269). Прямое свидетельство того, что VEGF и его рецепторы вносят вклад в рост опухоли, было недавно получено путем демонстрации того, что рост ксенотрансплантатов опухоли человека у мышей nude может ингибироваться нейтрализующими антителами к VEGF (Kim et al. (1993) Nature 362: 841-844), экспрессией доминантно-негативного рецептора VEGF flk-1 (Millauer et al. (1996) Cancer Res. 56: 1615-1620; Millauer et al. (1994) Nature 367: 576-579), низкомолекулярными ингибиторами Flk-1 тирозинкиназной активности (Strawn et al. (1996) Cancer Res. 56: 3540-3545) или экспрессией антисмысловой последовательности к мРНК VEGF (Saleh et al. (1996) Cancer Res. 56: 393-401). Важно, что распространение метастазов опухоли, как было обнаружено, также резко снижается антагонистами VEGF (Claffey et al. (1996) Cancer Res. 56: 172-181).

Ингибиторы VEGF, помимо их использования в качестве противораковых агентов, могут быть полезными при широком разнообразии пролиферативных заболеваний, характеризующихся избыточным ангиогенезом, включая псориаз, глазные расстройства, коллагеново-сосудистые заболевания и ревматоидный артрит. Хотя известно, что большинство типов опухолей продуцируют VEGF, до недавнего времени не показано, что какой-либо из них экспрессирует функциональные рецепторы VEGF. Показано, что клетки саркомы Капоши (КS) не только продуцируют обильные количества VEGF, но также экспрессируют функциональные рецепторы VEGF и, следовательно, используют VEGF для аутокринного роста. Саркому Капоши обычно лечат с использованием общепринятых антиметаболических лекарственных средств. Однако, основной недостаток применения химиотерапии у пациентов с KS состоит в сопутствующей индукции иммуносупрессии, которая имеет серьезные последствия для пациентов, иммунная система которых уже подвержена риску. Потребность в альтернативных терапиях особенно велика на ранних стадиях этого заболевания, когда поражения KS начинают появляться, но в других отношениях пациенты чувствуют себя совершенно здоровыми. Недавно доказано, что в этом отношении инкапсуляция химиотерапевтических лекарственных средств, таких как даунорубицин (daunorubicin), в липосомы является многообещающим способом минимизации побочных эффектов химиотерапии при сохранении противоопухолевой эффективности. Лекарственные средства с низкой токсичностью, которые избирательно направляются к активированным клеткам эндотелиального происхождения, такие как описанные здесь Нуклеиновые Кислоты-Лиганды - антагонисты VEGF, должны представлять огромную ценность при лечении КS.

Другими областями возможного клинического применения Нуклеиновых Кислот-Лигандов VEGF являются глазные расстройства, характеризующиеся избыточным ангиогенезом. Примерами таких заболеваний являются дегенерация желтого пятна и диабетическая ретинопатия. При дегенерации желтого пятна прогрессирующий ангиогенез сосудистой оболочки под желтым пятном (частью сетчатки, ответственной за самую высокую остроту зрения) вредит зрению. При диабетической ретинопатии ангиогенез в сетчатке вредит зрению. Хотя начальные стимулы, которые инициируют рост кровеносных сосудов при дегенерации желтого пятна и диабетической ретинопатии, в настоящее время неизвестны, VEGF, как оказывается, является ключевым индуктором ангиогенеза (Lopez, P. F. et al. (1996) Invest. Ophthalmol. Visual Science 37, 855-868; Kliffen, M. et al. (1997) Br. J. Ophthalmol. 81, 154-162; Kvanta, A. et al. (1996) Invest. Ophthalmol. Visual Science 37, 1929-1934; Paques et al. (1997) Diabetes & Metabolism 23: 125-130). Ингибиторы VEGF, таким образом, могут быть полезными для ослабления ангиогенеза при дегенерации желтого пятна.

Сущность изобретения Здесь описываются высоко аффинные 2'фтор(2'-F)-модифицированные-пиримидин-РНК-лиганды к сосудистому эндотелиальному фактору роста (VEGF). Способ, использованный здесь для идентификации таких Нуклеиновых Кислот-Лигандов, называется SELEX, акроним для Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment. Лиганды, описанные здесь, были отобраны из исходного пула примерно 10¹⁴ молекул РНК, рандомизированных по 30 или 40 смежным положениям. В настоящее изобретение включены выделенные лиганды, которые представлены в таблицах 2-6. Далее, в настоящее изобретение включен способ получения Комплекса, состоящего из Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF и Неиммуногенного Соединения Высокой Молекулярной Массы или Липофильного Соединения, с помощью способа, при котором идентифицируют Нуклеиновую Кислоту-Лиганд из Смеси Кандидатов Нуклеиновых Кислот, где Нуклеиновая Кислота является лигандом VEGF, с помощью способа (а) приведения в контакт Смеси Кандидатов Нуклеиновых Кислот с VEGF, (б) отделения членов указанной Смеси Кандидатов на основе аффинности к VEGF и (в) амплификации отобранных молекул с получением смеси Нуклеиновых Кислот, обогащенной последовательностями Нуклеиновых Кислот с относительно высокой аффинностью для связывания с VEGF, и ковалентной сшивки указанной идентифицированной Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF с Неиммуногенным Соединением Высокой Молекулярной Массы или Липофильным Соединением. Далее изобретение включает в себя Комплекс, состоящий из Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF и Неиммуногенного Соединения Высокой Молекулярной Массы или Липофильного Соединения.

Далее изобретение включает в себя Липидную Конструкцию, содержащую Нуклеиновую Кислоту-Лиганд VEGF или Комплекс. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения Липидной Конструкции, содержащей Комплекс, где Комплекс состоит из Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF и Липофильного Соединения.

В другом воплощении данного изобретения предлагается способ усовершенствования фармакокинетических свойств Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF путем ковалентной сшивки Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF с Неиммуногенным Соединением Высокой Молекулярной Массы или Липофильным Соединением с образованием Комплекса и введения этого Комплекса пациенту. Далее изобретение относится к способу усовершенствования фармакокинетических свойств Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF путем дополнительного соединения этого Комплекса с Липидной Конструкцией.

Задачей настоящего изобретения является разработка Комплексов, содержащих одну или более чем одну Нуклеиновую Кислоту-Лиганд VEGF в соединении с одним или более чем одним Неиммуногенным Соединением Высокой Молекулярной Массы или Липофильным Соединением, и способов их получения. Дальнейшей задачей настоящего изобретения является разработка Липидных Конструкций, содержащих этот Комплекс. Следующей задачей настоящего изобретения является разработка одной или более чем одной Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF в соединении с одним или более чем одним Неиммуногенным Соединением Высокой Молекулярной Массы или Липофильным Соединением с усовершенствованными фармакокинетическими свойствами.

В воплощениях изобретения, направленных на Комплексы, состоящие из Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF и Неиммуногенного Соединения Высокой Молекулярной Массы, предпочтительным является то, что Неиммуногенное Соединение Высокой Молекулярной Массы представляет собой полиалкиленгликоль, более предпочтительно полиэтиленгликоль (ПЭГ). Более предпочтительно этот ПЭГ имеет молекулярную массу примерно 10-80К. Наиболее предпочтительно ПЭГ имеет молекулярную массу примерно 20-45К. В воплощениях изобретения, направленных на Комплексы, состоящие из Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF и Липофильного Соединения, предпочтительным является то, что Липофильное Соединение представляет собой глицеролипид. В предпочтительных воплощениях изобретения Липидная Конструкция предпочтительно представляет собой липидную бислойную везикулу, и наиболее предпочтительно липосому. В предпочтительном воплощении Нуклеиновую Кислоту-Лиганд VEGF идентифицируют согласно способу SELEX.

В воплощениях изобретения, направленных на Комплексы, состоящие из Неиммуногенного Соединения Высокой Молекулярной Массы или Липофильного Соединения, ковалентно сшитого с Нуклеиновой Кислотой-Лигандом или лигандами VEGF, Нуклеиновая Кислота-Лиганд или лиганды VEGF могут служить для направляющей способности.

Кроме того, Нуклеиновая Кислота-Лиганд VEGF может быть соединена через Ковалентные или Нековалентные Взаимодействия с Липидной Конструкцией, не являясь частью Комплекса.

Кроме того, в воплощениях изобретения, направленных на липидные конструкции, содержащие Нуклеиновую Кислоту-Лиганд VEGF или Комплекс Неиммуногенное Соединение Высокой Молекулярной Массы либо Липофильное Соединение/Нуклеиновая Кислота-Лиганд VEGF, где Липидная Конструкция представляет собой конструкцию такого типа, который имеет мембрану, определяющую внутренний компартмент, как например липидная бислойная везикула, Нуклеиновая Кислота-Лиганд VEGF или Комплекс в соединении с Липидной Конструкцией могут быть соединены с мембраной Липидной Конструкции или инкапсулированы внутри компартмента. В воплощениях, где Нуклеиновая Кислота-Лиганд VEGF находится в соединении с мембраной, Нуклеиновая Кислота-Лиганд VEGF может соединяться с ориентированной внутрь либо с ориентированной наружу частью мембраны, таким образом, что Нуклеиновая Кислота-Лиганд VEGF выступает внутри или снаружи везикулы. В некоторых воплощениях Комплекс Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF может быть пассивно загружен во внешнюю сторону преформированной Липидной Конструкции. В воплощениях, где Нуклеиновая Кислота-Лиганд VEGF выступает снаружи Липидной Конструкции, Нуклеиновая Кислота-Лиганд VEGF может служить для направляющей способности.

В воплощениях, где Нуклеиновая Кислота-Лиганд VEGF Липидной Конструкции служит для направляющей способности, Липидная Конструкция может быть соединена с дополнительными терапевтическими или диагностическими агентами. В одном воплощении этот терапевтический или диагностический агент соединен с внешней стороной Липидной Конструкции. В других воплощениях этот терапевтический или диагностический агент инкапсулирован в Липидную Конструкцию или соединен с внутренней стороной Липидной Конструкции. В еще одном дополнительном воплощении этот терапевтический или диагностический агент соединен с Комплексом. В одном воплощении этот терапевтический агент представляет собой лекарственное средство. В альтернативном воплощении этот терапевтический или диагностический агент представляет собой одну или более чем одну дополнительную Нуклеиновую Кислоту-Лиганд.

Дальнейшей задачей настоящего изобретения является разработка способа ингибирования ангиогенеза посредством введения Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF либо Комплекса, состоящего из Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF и Неиммуногенного Соединения Высокой Молекулярной Массы или Липофильного Соединения, либо Липидной Конструкции, содержащей Комплекс по настоящему изобретению. Еще одной дальнейшей задачей настоящего изобретения является разработка способа ингибирования роста опухолей посредством введения Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF либо Комплекса, состоящего из Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF и Неиммуногенного Соединения Высокой Молекулярной Массы или Липофильного Соединения, либо Липидной Конструкции, содержащей Комплекс по настоящему изобретению. Еще одной дальнейшей задачей настоящего изобретения является разработка способа ингибирования саркомы Капоши посредством введения Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF либо Комплекса, состоящего из Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF и Неиммуногенного Соединения Высокой Молекулярной Массы или Липофильного Соединения, либо Липидной Конструкции, содержащей Комплекс по настоящему изобретению. Еще одной дальнейшей задачей настоящего изобретения является разработка способа ингибирования дегенерации желтого пятна посредством введения Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF либо Комплекса, содержащего Нуклеиновую Кислоту-Лиганд VEGF и Неиммуногенное Соединение Высокой Молекулярной Массы или Липофильное Соединение, либо Липидной Конструкции, содержащей Комплекс по настоящему изобретению. Еще одной дальнейшей задачей настоящего изобретения является разработка способа ингибирования диабетической ретинопатии посредством введения Нуклеиновой Кислоты-Лиганда VEGF либо Комплекса, содержащего Нуклеиновую Кислоту-Лиганд VEGF и Неиммуногенное Соединение Высокой Молекулярной Массы или Липофильное Соединение, либо Липидной Конструкции, содержащей Комплекс по настоящему изобретению.

Следующей задачей настоящего изобретения является разработка способа направления терапевтического или диагностического агента к биологической мишени, которая экспрессирует VEGF, путем соединения агента с Комплексом, содержащим Нуклеиновую Кислоту-Лиганд VEGF и Липофильное Соединение или Неиммуногенное Соединение Высокой Молекулярной Массы, причем Комплекс дополнительно соединен с Липидной Конструкцией, а Нуклеиновая Кислота-Лиганд VEGF дополнительно соединена с внешней стороной Липидной Конструкции.

Эти и другие задачи, а также характер, объем и применение данного изобретения станут легко очевидными специалистам из дальнейшего описания и прилагаемой формулы изобретения.

Краткое