Производные ов-протеина

Производные ов-протеина

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины, а именно производному протеина ожирения ОВ с продолжительным временем полужизни. Изобретение, в частности, относится к ОВ-протеин-иммуноглобулиновым химерам и полиэтиленгликоль (PEG)-ОВ-производным, которые имеют продолжительное время полужизни по сравнению с соответствующими нативными ОВ-протеинами. Кроме того, изобретение относится к способам уменьшения аппетита и/или веса и лечения других физиологических состояний, используя ОВ-производные с продолжительным временем полужизни. Технический результат изобретения - расширение арсенала средств для борьбы с ожирением. 12 с. и 14 з. п. ф-лы, 33 ил.

Изобретение относится к производным OB-протеина с продолжительным временем полужизни. В частности, изобретение относится к OB-протеин-иммуноглобулиновым химерам и другим производным OB-протеина с продолжительным временем полужизни, к содержащим их композициям и к способам их введения. Кроме того, изобретение относится к способу лечения ожирения путем введения варианта OB-протеина с продолжительным временем полужизни, например OB-ротеин-иммуноглобулиновой химеры.

Ожирение является наиболее общим нарушением питания, которым согласно последним эпидемиологическим исследованиям страдают около 1/3 всех американцев в возрасте 20 лет и старше (Kuczmarski et al. , J. Am. Med. Assoc. 272, 205-11 (1994)). Ожирение ответственно за целый ряд серьезных проблем, связанных со здоровьем, включая сердечно-сосудистые нарушения, диабет II типа, инсулинорезистентность, гипертензию, гипертриглицеридемию, диспипопротеинемию, и некоторые формы злокачественных образований (Pi-Sunyer, F. X. , Anns. Int. Med. 119, 655-60 (1993); Colfitz, G. A. , Am. J. Clin. Nutr. 55, 503S- 507S (1992)). Показано, что мутация однокопийного гена (ожирение или "ob мутация" приводит к ожирению и диабету II типа у мышей (Friedman, Genomics 11, 1054-1062 (1991)). В работе Zhang et al. , Nature 372, 425-431 (1994) недавно сообщалось о клонировании и секвенировании ob-гена мыши и его гомолога, относящегося к человеку, и высказывалось предположение, что продукт ob-гена может функционировать как часть сигнального пути от жировой ткани, которая влияет на регулирование величины запаса жира в теле. Исследования парабиоза, проведенные более 20 лет назад, предсказали, что мышь, генетически страдающая ожирением, содержащая две мутантные копии ob-гена (ob/ob мыши), не продуцирует фактора сытости, который регулирует потребление пищи, в то время как мышь, страдающая диабетом (db/db), продуцирует фактор сытости, но не реагирует на него (Coleman, Hummal; Am. J. Physiol. 217, 1298-1304 (1969); Coleman, Diabetol 9, 294-98 (1973)). Недавние сообщения трех независимых исследовательских коллективов продемонстрировали, что ежедневные инъекции химерного (рекомбинантного) OB протеина ингибируют потребление пищи и уменьшают вес тела и отложение жира в ob/ob мышах, страдающих чрезмерным ожирением, а не в db/db мышах (Pelleymounter et al. , Science 269, 540-43 (1995); Halaas et al. , Science 269, 543-46 (1995); Campfield et al. , Science 269, 546-49 (1995)), предполагая, что ob-протеин является таким фактором сытости (насыщения), как это ранее предполагалось в исследованиях по перекрестному кровообращению. Результаты этих первых исследований оставили много нерешенных вопросов и показали ряд еще нерешенных противоречий. Например, хотя об умеренных влияниях ежедневных инъекций ob-протеина на потребление пищи и на вес тела сообщалось для худых мышей, наблюдалось значительное уменьшение запаса жира в теле, что объяснялось строением тела (комплекцией) в одном (Halaas et al. , supra), но не в другом (Pelleymounter et al. , supra) из этих сообщений, несмотря на эквивалентные уменьшения веса тела. Кроме того, Pelleymounter et al. , supra заметили, что по неизвестным причинам при лечении ob/ob мышей дозой в 0,1 мг/кг/день OB-протеина действительно увеличивался их вес тела на 17,13%, в то время как уменьшение веса мышей, страдающих ожирением, которые получали дозу ob в 1 мг/кг/день было довольно небольшим. Рецептор или рецепторы ob-протеина до сих пор не идентифицированы. Хотя существование периферийных рецепторов нельзя в настоящее время исключить, последнее сообщение о том, что увеличенная экспрессия ob-гена в жировой ткани мышей с гипоталамусным повреждением не приводит к худому фенотипу, наводит на мысль, что OB-протеин не действует непосредственно на жировые клетки (Maffei et al. , Proc Natl. Acad. Sd. 92, 6957-60 (1995)). Ученые предполагают, что по крайней мере один OB рецептор расположен в мозгу. Об идентификации и экспрессии клонирования лептинового рецептора (OB-R) сообщалось в работе Tartaglia et al. , Cell 83, 1263-71 (1995). Различные изоформы лептинового рецептора описаны Ciofi et al. , Nature Medicine 2, 585-89 (1996). Гематопоэтиновый рецептор человека, который может быть рецептором OB-протеина, описан в заявке PCT (Publication No. WO 96/08510, published 21 March 1996). Рецептор OB-протеина обнаружен Tartaglia et al. , Cell 83, 1263-71 (1995).

Настоящее изобретение основано на наблюдении, что OB-протеин значительно более эффективен для уменьшения веса тела и веса жировой ткани, если его вводить непрерывным подкожным вливанием, чем если та же доза вводится ежедневной подкожной инъекцией. Кроме того, изобретение основано на неожиданно полученных данных, что химерный белок, в котором OB полипептид слит с константной областью иммуноглобулина, является значительно более эффективным для уменьшения веса тела и жировых отложений, чем нативный OB человека, если оба протеина вводятся подкожной инъекцией один раз в день. Последнее наблюдение особенно неожиданно, так как считают, что ОВ-протеин-иммуноглобулиновая химера вследствие ее большого молекулярного веса не в состоянии преодолевать гематоэнцефалический барьер и достигать ОВ-рецептора, который, полагают, расположен в мозге.

В одном варианте изобретение относится к производным ОВ-протеина с продолжительным временем полужизни, способным уменьшить вес тела и/или потребление пищи у лечащихся людей. Кроме того, изобретение относится к композициям, содержащим такие производные, и введению их для уменьшения веса тела и/или потребления пищи.

В другом варианте изобретение относится к химерным полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность ОВ-протеина, способную к связыванию с нативным OB-рецептором, присоединенным к последовательности иммуноглобулина (для краткости называемой OB-иммуноглобулиновыми химерами или иммуноадгезинами). В особом (конкретном) варианте, химерные полипептиды включают слияние OB-аминокислотной последовательности, способной к связыванию нативного ОВ-рецептора, с последовательностью константной области иммуноглобулина. Предпочтительно, чтобы OB-область химер, описанных в настоящем изобретении, имела бы достаточное количество аминокислотных последовательностей из нативного ОВ-протеина для сохранения способности его к связыванию с нативным OB-рецептором и для передачи сигнала посредством нативного ОВ-рецептора. Наиболее предпочтительно, чтобы OB-протеин сохранял бы способность к уменьшению веса тела при введении его страдающим ожирением людям или субъектам, не относящимся к человеческому роду. OB-полипептид предпочтительно относится к человеку, и слияние происходит предпочтительно с последовательностью константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. В отдельном (частном) варианте, ассоциация двух слияний тяжелой цепи OB-полипептид - иммуноглобулина (например, путем ковалентного связывания с помощью дисульфидной(ых) связи(ей)) приводит к гомодимерной иммуноглобулин-подобной структуре. Легкая цепь иммуноглобулина, кроме того, может связываться с одной или обеими OB-иммуноглобулиновыми химерами в димер, соединенный дисульфидными связями, с образованием гомотримерной или гомотетрамерной структуры.

Кроме того, изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей цепи химерного (гибридного) полипептида, описанного в данном изобретении, к экспрессирующим векторам, содержащим ДНК, кодирующую такие молекулы, к трансформированным клеткам хозяина и к способам продуцирования молекул путем культивирования трансформантов клеток хозяина.

Несмотря на то что производные с продолжительным временем полужизни, описанные в данном изобретении, особенно пригодны для уменьшения веса тела и/или потребления пищи, они также могут применяться для лечения состояний, связанных с патологической (аномальной) экспрессией или функцией OB-гена и/или для установления (вызывания) биологической ответной реакции, вызванной OB-рецептором. Таким образом, OB-производные, описанные в данном изобретении, могут использоваться для лечения булемии, для уменьшения уровня инсулина, например, у пациентов с I и II типами сахарного диабета и в качестве митогенов различных типов клеток, экспрессирующих OB-рецептор. Все эти и другие применения находятся в пределах объема данного изобретения.

В другом варианте данное изобретение относится к очистке OB-рецептора с применением OB-протеин-иммуноглобулиновой химеры.

Фиг. 1. Верхний рисунок (фиг. 1A). Худых самок мышей лечили относящимся к мышам или крысам OB-протеином при помощи непрерывной подкожной инфузии или ежедневных подкожных инъекций. Представленные данные являются средним значением веса тела каждой группы в граммах, n= 4 мыши/для точки.

Фиг. 1. Нижний рисунок (фиг. 1Б). Показан средний вес ретроперитонеального скопления жировой ткани. Непрерывные подкожные инфузии (вливания) OB-протеина также более эффективны, чем ежедневные подкожные инъекции для уменьшения веса жировой ткани.

Фиг. 2. Верхний рисунок (фиг. 2А). Страдающих ожирением ob/ob мышей лечили OB-протеином человека (hOB), или OB-IgG-1-гибридным протеином, относящимся к человеку (hOB IgG-1). Представленные данные являются средней величиной изменения веса тела для каждой лечащейся группы с первого до последнего дня эксперимента, в граммах, n= 3 мыши/на столбец диаграммы, за исключением инъекции hOB 0,19 мг/кг/день, где n= 4 и при инъекции PBS (забуференного фосфатом физиологического раствора), где n= 1.

Фиг. 2. Нижний рисунок, (фиг. 2Б). Представленные данные являлись средней величиной потребления пищи для каждой лечащейся группы для шести 24-часовых периодов эксперимента, в г/мышь/день, n= 1/на столбец диаграммы.

Фиг. 3. Верхний и нижний рисунки (фиг. 3А и фиг. 3Б). Страдающих ожирением самок ob/ob мышей лечили или OB-протеином человека (hOB) или hOB-IgG-1-гибридным протеином, относящимся к человеку, при помощи ежедневных подкожных инъекций в течение 7 дней. Данные, изображенные как и на фиг. 2, с n= 4 для всех лечащихся групп.

Фиг. 4. Верхний рисунок (фиг. 4А). Страдающих ожирением самок ob/ob мышей лечили OB-протеином человека (hOB) или PEG-hOB. Представленные данные являются средним значением изменения веса тела для каждой лечащейся группы с первого до последнего дня эксперимента, в граммах, n= 3-4 мыши/на столбец диаграммы, за исключением инъекции забуференным фосфатом физиологического раствора, где n= 1. Вещества вводили ежедневно подкожно. "PEG IX" и "PEG 2X" относятся к отношению PEG реагента (полиэтиленгликоля) к протеину при получении молекулы.

Фиг. 4. Нижний рисунок (фиг. 4Б). Приведенные данные представляли среднее потребление пищи для каждой лечащейся группы для шести 24 часовых периодов эксперимента, в граммах/мышь/день, n= 3-4 мыши/на столбец диаграммы.

Фиг. 5. Страдающих ожирением (ob/ob) самок мышей лечили или hOB-IgG лечили гибридным протеином, нативным OB-протеином человека (hOB), или hCD4-IgG при помощи ежедневных подкожных инъекций в течение 7 дней, n= 6 для всех лечащихся групп, за исключением hOB при 3,8 мг/кг/день, где n= 2. Снова наблюдали, что гибридный протеин был более эффективен для уменьшения веса тела (верхний и средний рисунки - фиг. 5А и фиг. 5Б) и потребления пищи (нижний рисунок - фиг. 5В), чем нативный hOB протеин.

Фиг. 6. Нуклеотидная последовательность (SEQ. ID. No: 1) и аминокислотная последовательность (SEQ. ID. No: 2) OB-IgG-1 химеры примера 1, относящейся к человеку.

А. Определения Термин "ожирение" используется для обозначения состояния, связанного с избыточным весом, чрезмерной телесной упитанностью. Подходящий вес для определенного индивидуума зависит от ряда факторов, включающих пол, рост, возраст, общее телосложение и т. д. Теми же факторами будет определяться, страдает ли индивидуум ожирением. Определение оптимального веса тела данного индивидуума как раз находится в компетенции обычного врача.

Фраза "продолжительное время полужизни" и ее грамматические варианты, которые используются в связи с OB-производными, относятся к OB-производным, имеющим более продолжительное время полужизни плазмы и/или более медленный клиренс, чем у соответствующего нативного OB-протеина. Предпочтительно, чтобы производные с продолжительным временем полужизни имели бы время полужизни по крайней мере примерно в 1,5 раза более продолжительное, чем у нативного OB-протеина; более предпочтительно по крайней мере примерно в 2 раза более продолжительное, чем у нативного OB-протеина; и наиболеее предпочтительно по крайней мере примерно в 3 раза более продолжительное, чем у нативного OB-протеина. Нативный OB-протеин предпочтительно является протеином индивидуума, которого лечат.

Термин "OB", "ОВ-полипептид", "ОВ-протеин и их грамматические варианты используются взаимозаменяемо и относятся к "нативным" OB-протеинам или к "нативным последовательностям" OB-протеинов (известных также как "лептины") и их функциональным производным. OB-полипептиды обладают типичными структурными свойствами цитокинов, т. е. полипептидов, высвобождающихся одной популяцией клеток, которые действуют на другие клетки как межклеточные медиаторы, такие как, например, гормоны роста, инсулиноподобные факторы роста, интерлейкины, инсулин, гликопротеиновые гормоны, например, фолликулостимулирующий гормон (follicle stimulating hormone. FSH), тиреотропный [тиреостимулирующий] гормон (thyroid stimulating hormone, TSH), - и -фактор опухолевого некроза (tumor necrosis factor- и - (TNF- и -); нервные факторы роста, такие как NGF-, PDGF; трансформирующие факторы роста (transforming growth factors, TGFs), например, TGF- и TGF-, инсулиноподобный ростовый фактор-1 и -2 (insulinlike growth factor-1 и -2, IGF-1 и IGF-2), эритропоэтин, остеоиндуктивные факторы, интерфероны (interferons, IFNs), например, IFN-, IFN-, и IFN-; колониестимулирующие факторы (colony stimulating factors, CSFs), например, M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (interleukins, ILs), например, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 и другие полипептидные факторы.

Термины "нативный" OB-полипептид или "нативная последовательность" OB-полипептида используются для обозначения OB-полипептида из любого вида животного (например, относящегося к человеку, мышам или крысам, кролику, кошке, корове, овце, цыпленку, свинье, лошади и т. д. ), как встречающегося в природе, включая встречающиеся в природе варианты аллелей, делеции, замещения и/или инсерции, которые известны в настоящее время или которые могут быть идентифицированы в будущем, при условии, что они сохранят способность к связыванию с OB-рецептором и предпочтительно дадут сигнал посредством OB-рецептора. Таким образом, нативный OB-полипептид человека включает аминокислотную последовательность между N-концевой последовательностью и цистеином (Cys) в положении 167 аминокислотной последовательности, представленной на фиг. 6 (см. также SEQ. ID. No: 2 и фиг. 6 работы Zhang et al. , supra) и встречающиеся в природе варианты этого протеина, которые в настоящее время известны или могут быть идентифицированы в будущем. Аналогично, "нативный" OB-полипептид или "нативная последовательность" OB-полипептида, относящегося к мышам или крысам, имеет аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 6 из работы Zhang et al. , supra и встречающиеся в природе варианты этого полипептида, которые известны в настоящее время или которые могут быть идентифицированы в будущем. Определение, в частности, включает варианты с глутамином в положении 49 или без него, используя нумерацию аминокислот из Zhang et al. , supra. Термины "нативный" OB-полипептид и "нативная последовательность" OB-полипептида включают нативные протеины с инициирующим N-концевым метионином (Met) или без него и с нативной сигнальной последовательностью или без нее, или в мономерной, или в димерной форме. Известные нативные OB-полипептиды, относящиеся к человеку и мышам или крысам, имеют 167 аминокислот, содержат два сохраненных остатка цистеина и обладают свойствами (особенностями) секретируемого (выделяемого) протеина. Полипептиды в значительной степени гидрофильны и предсказанный сайт расщепления сигнальной последовательности находится в положении 21, используя нумерацию аминокислот Zhang et al. , supra. Полная гомологичность последовательности последовательностям, относящимся к человеку и мышам или крысам, составляет около 84%. Два протеина показывают более широкую идентичность в N-концевой области созревшего протеина только с четырьмя консервативными и тремя неконсервативными заменами среди остатков между сайтом расщепления сигнальной последовательности и сохраненным Cys в положении 117. Молекулярный вес OB-протеинов в мономерной форме составляет около 16 kD.

"Функциональным производным" нативного полипептида является соединение, обладающее качественным биологическим свойством (способностью), общим с нативным полипептидом. Функциональным производным OB-полипептида является соединение, обладающее качественным биологическим свойством, общим с нативным OB-полипептидом (относящимся и не относящимся к человеческому роду). "Функциональные производные" включают, но не ограничиваются только фрагментами нативных полипептидов из любых видов животных (включая людей) и производными нативных полипептидов и их фрагментов (относящихся и не относящихся к человеческому роду) при условии, что они обладают биологической активностью, общей с соответствующим нативным полипептидом.

"Фрагменты" включают области в пределах последовательности созревшего нативного OB-полипептида. Предпочтительные фрагменты OB-полипептидов включают C-концевую последовательность созревшего протеина и могут содержать относительно короткую(ие) делецию(ии) на N-концевой последовательности и в других частях молекулы, неиспользуемых для связывания рецептора и/или структурной целостности.

Термин "производное" используется для определения вариантов аминокислотной последовательности и ковалентных модификаций нативного полипептида, тогда как термин "вариант" относится к вариантам аминокислотной последовательности в пределах данного определения.

"Биологическое свойство" в контексте определения "функциональных производных" определяется или как 1) иммунологическая перекрестная реактивность по крайней мере с одним эпитопом (антигенной детерминантой) нативного полипептида (например, нативного OB-полипептида любого вида), или 2) обладание по крайней мере одной адгезивной, регуляторной или эффекторной функцией, качественно общей с нативным полипептидом.

Предпочтительно, чтобы функциональные производные являлись полипептидами, которые имели по крайней мере 65% идентичности аминокислотной последовательности, более предпочтительно приблизительно 75% идентичности аминокислотной последовательности и даже более предпочтительно по крайней мере около 85% идентичности аминокислотной последовательности и наиболее предпочтительно по крайней мере около 95% идентичности аминокислотной последовательности нативному полипептиду. В контексте данного изобретения функциональные производные нативной последовательности OB-полипептидов, относящихся к человеческому роду, предпочтительно показывают по крайней мере 95% идентичности аминокислотной последовательности нативным OB-протеинам и не являются иммуногенными у людей.

Идентичность или гомологичность аминокислотной последовательности в данном изобретении определяется как процентное содержание остатков аминокислот в последовательности кандидата, которые идентичны остаткам соответствующей последовательности нативного полипептида после выравнивания последовательностей и введения "брешей", если необходимо, для достижения максимального процента гомологии и без учета любых консервативных замен как части идентичности последовательности. Ни N- или C-концевые удлиняющие сегменты, ни инсерционные сегменты не должны рассматриваться как уменьшающие идентичность или гомологичность.

Иммунологично перекрестно реакционноспособный, как это используется в данном изобретении, означает, что (поли)пептид кандидата способен к конкурентному ингибированию качественной биологической активности соответствующего нативного полипептида, обладающего данной активностью, поликлональными антителами или иммунной сывороткой, направленной против известной активной молекулы. Такие антитела и иммунную сыворотку (антисыворотку) получают по принятой форме путем введения, например, козе или кролику подкожно с известным нативным OB-протеином полного адъюванта Фрейнда, за которым следовала бустер-инъекция - внутрибрюшинная или подкожная инъекция неполного адъюванта Фрейнда.

Термин "выделенный" (изолированный) OB-полипептид" и его грамматические варианты относятся к OB-полипептидам (как определено выше), отделенным от контаминантных полипептидов, присутствующих в человеке, других видах животных или в другом источнике, из которого полипептид выделен.

Обычно термин "вариант аминокислотной последовательности" относится к молекулам с некоторыми различиями в их аминокислотных последовательностях по сравнению с исходным (например, нативной последовательностью) полипептидом. Изменения аминокислот можно осуществлять замещениями, инсерциями, делециями или любыми необходимыми комбинациями таких изменений в нативной аминокислотной последовательности.

Варианты замещения (замены) являются такими, которые имеют по крайней мере один удаляемый аминокислотный остаток в нативной последовательности и введение вместо него другой аминокислоты в то же положение. Замещение может быть единственным, если замещается только одна аминокислота в молекуле, или эти замещения могут быть многочисленными, если две или более аминокислот замещаются в одной и той же молекуле.

Инсерционные варианты являются вариантами с одной или более аминокислот, вводимых непосредственно по соседству с аминокислотой в определенном положении в нативной аминокислотной последовательности. Непосредственно по-соседству к аминокислоте означает связывание или с -карбокси- или -амино-функциональной группой аминокислоты.

Варианты делеции являются вариантами с одной или более удаляемых аминокислот в нативной аминокислотной последовательности. Обычно варианты делеции должны иметь одну или две аминокислоты, подвергаемых делеции, в определенной области молекулы.

"Ковалентные производные" включают модификации нативного полипептида или его фрагмента органическим белковым или небелковым дериватизирующим агентом, и посттрансляционные модификации. Ковалентные модификации по традиции вводят путем взаимодействия определенных аминокислотных остатков с органическим дериватизирующим агентом, который способен реагировать с выбранными сайтами или концевыми остатками или с помощью механизмов "впрягания" посттрансляционных модификаций, которые функционируют в выбранных рекомбинантных клетках-хозяина. Некоторые посттрансляционные модификации являются результатом воздействия рекомбинантных клеток хозяина на экспрессируемый полипептид. Глутаминил- и аспарагинилостатки часто деамидируются посттрансляционно до соответствующих глутамил- и аспартилостатков. Или же эти остатки деамидируются в умеренно кислых условиях. Каждая форма этих остатков может присутствовать в OB-иммуноглобулиновых химерах, описанных в данном изобретении. Другие посттрансляционные модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп серильных, тирозинных или треонильных остатков, метилирование -аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина (Т. Е. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co. , San Francisco, pp. 79-86 (1983)).

Термины "ДНК-последовательность кодирующая", "ДНК-кодирующая" и "нуклеиновая кислота кодирующая" относятся к упорядоченности или последовательности деоксирибонуклеотидов вдоль цепи деоксирибонуклеиновой кислоты. Последовательность этих деоксирибонуклеотидов определяет порядок аминокислот вдоль полипептидной цепи. Таким образом, ДНК-последовательность кодирует аминокислотную последовательность.

Термин "способный реплицироваться экспрессирующий вектор" и "экспрессирующий вектор" относятся к фрагменту ДНК, обычно двухцепочечному, который может вводиться во фрагмент другой (чужой) ДНК. Чужую ДНК определяют как гетерологичную ДНК, которая является ДНК, не встречающейся в клетке-хозяине. Вектор используют для переноса чужой или гетерологичной ДНК в подходящую клетку-хозяин. Если в клетке-хозяине вектор может реплицироваться независимо от хромосомной ДНК хозяина, то может генерироваться несколько копий вектора и вставленной в него чужой ДНК (с чужой ДНК-вставкой). Кроме того, вектор содержит необходимые элементы, которые позволяют трансформировать чужую ДНК в полипептид. Таким образом, могут быстро синтезироваться много молекул полипептида, кодируемого чужой ДНК.

Термин "контрольные последовательности" относится к ДНК-последовательностям, необходимым для экспрессии непосредственно (операбельно) связанной кодирующей последовательности в определенном организме хозяина. Контрольные последовательности, которые пригодны для прокариотов, например, включают промотор, возможно операторный участок (последовательность), рибосомосвязывающий сайт и возможно другие еще плохо понимаемые последовательности. Известно, что эукариотные клетки используют промоторы, полиаденилированные сигналы и энхансер.

Нуклеиновая кислота является "непосредственно (операбельно) соединенной", если она помещена в функциональную зависимость от другой последовательности нуклеиновой кислоты. Например, ДНК- предпоследовательности или секреторной лидерной последовательности операбельно соединена с ДНК полипептида, если он экспрессирует как предшественник протеина, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер непосредственно (операбельно) соединен с кодирующей последовательностью, если он затрагивает транскрипцию последовательности; или рибосомосвязывающий сайт непосредственно соединен с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что облегчает трансляцию. Обычно "непосредственно (операбельно) соединенный" означает, что ДНК- последовательности, будучи соединенными, являются близкими, и в случае секреторной лидерной последовательности являются близкими и в фазе считывания. Однако энхансеры не должны быть близкими. Соединение достигается лигацией в удобных сайтах рестрикции. Если такие сайты не существуют, тогда в соответствии с принятой практикой используют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры.

В контексте данного изобретения выражения "клетка", "линия клеток" и "культура клеток" используются взаимозаменяемо и все такие обозначения включают потомство. Таким образом, слова "трансформанты" и "трансформируемые клетки (хозяина)" включают первичные подверженные клетки и культуры, полученные из них, не учитывая количество переносов. Также следует понять, что все потомство не должно быть полностью идентичным по содержанию ДНК вследствие преднамеренных или нечаянных мутаций. Включено мутантное потомство, которое имеет ту же функцию или биологическую активность, по которой проводился скрининг в первоначально трансформируемых клетках. Где предполагаются отличные обозначения, будет ясно из контекста.

Нативные иммуноглобулины обычно являются гетеротетрамерными гликопротеинами с молекулярным весом около 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (light, L) цепей и двух идентичных тяжелых (heavy, Н) цепей. Каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью с помощью ковалентной дисульфидной связи, тогда как количество дисульфидных связей изменяется между тяжелыми цепями различных изотипов иммуноглобулина. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет закономерно расположенные внутри цепи дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельную область (V_H), за которой следует ряд константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельную область (V_L) на одном и константную область на другом конце; константная область легкой цепи находится на одной линии с первой константной областью тяжелой цепи, и вариабельная область легкой цепи находится на одной линии с вариабельной областью тяжелой цепи. Считают, что определенные остатки аминокислот образуют поверхность раздела между вариабельными областями легкой и тяжелой цепи (Clothia et al. , J. Mol. Biol. 186. 651-663 (1985); Novotny, Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4592-4596 (1985)).

Иммуноглобулины в зависимости от аминокислотной последовательности константной области их тяжелых цепей относят к различным классам. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM и некоторые из них далее могут подразделяться на подклассы (изотипы), например: IgG-1, IgG-2, IgG-3 и IgG-4; IgA-1 и IgA-2. Константные области тяжелых цепей, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются , , , , , соответственно. Хорошо известны структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов. IgA-1 и IgA-2 являются мономерными подклассами IgA, который обычно находится в виде димеров или полимеров с большим количеством мономеров. Иммуноциты в кишке продуцируют главным образом полимерный IgA (также относится к поли-IgA, включая димеры и полимеры с большим количеством мономеров). Такой поли-IgA содержит связанный дисульфидным мостиком полипептид, называемый "соединительным" пептидом или "J-пептидом, и может переноситься посредством гландулярного эпителия вместе с J-содержащим полимерным IgM (поли-IgМ), включающим пять субъединиц.

Гибридизацию предпочтительно проводят при "точных условиях", которые означают (1) использование растворов с низким значением ионной силы и высокой температурой для промывки, например 0,015 М хлорид натрия/0,0015 М цитрат натрия/0,1% додецилсульфат натрия при 50^oC, или (2) применение при гибридизации денатурирующего агента, такого как формамид, например 50% (об. /об. ) формамид с 0,1% бычьим сывороточным альбумином/0,1% Ficoll/ 0,1% поливинилпирролидон/50 нМ натрийфосфатного буфера с pH 6,5 с 750 мМ хлорида натрия, 75 мМ цитрата натрия при 42^oC. В другом примере используют 50% формамид, 5xSSC (0,75 М NaCl, 0,075 М цитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (pH 6/8), 0,1% пирофосфат натрия, 5 х раствор Денхардта (Denhardt's solution), гомогенат, полученный из клеток ДНК спермы лосося при воздействии ультразвука (50 мкг/мл), 0,1% SDS (додецилсульфат натрия) и 10% сульфата декстрана при 42^oC, с промывками при 42^oC в 0,2xSSC и 0,1% SDS.

В. OB-протеин-иммуноглобулиновые химеры (иммуноадгезины) Иммуноадгезины представляют собой молекулы, подобные химерному антителу, которые объединяют функциональную(ые) область(и) связывающего протеина (обычно рецептора, молекулы или лиганда клеточной адгезии) с последовательностью иммуноглобулина. Наиболее общий пример этого типа гибридного протеина объединяет шарнирную и Fc области иммуноглобулина (Ig) с доменами (областями) клеточно-поверхностного рецептора, который распознает специфический лиганд. Данный тип молекулы называют "иммуноадгезином", поскольку он объединяет "иммунные" и "адгезионные" функции; другим часто используемым названием является "Ig-химера", "Ig-" или "Fc-гибридный протеин" или "рецептор-глобулин".

В настоящее время известно более пятидесяти иммуноадгезинов. Иммуноадгезины, о которых сообщалось в литературе, включают, например, слияния Т-клеточного рецептора (Gascoigne et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2936-2940 (1987)); CD4 (Capon et al. , Nature 337, 525-531 (1989); Traunecker et al. , Nature 339, 68-70 (1989); Zettmeissi et al. , DNA Cell Biol. USA 9, 347-353 (1990); Bym et al. , Nature 344, 667-670 (1990)); L-селектина ("хоминг"-рецептора) (Watson et al. , J. Cell. Biol. 110, 2221-2229 (1990); Watson et al. , Nature 349, 164-167 (1991)); E-селектина (Mulligan et al. , J. Immunol. 151, 6410-17 (1993); Jacob et al. , Biochemistry 34, 1210-1217 (1995)); P-селектина (Mulligan et al. , supra; Hollenbaugh et al. , Biochemistry 34, 5678-84 (1995)); ICAM-1 (Stauton et al. , J. Exp. Med. 176, 1471-1476 (1992); Martin et al. , J. Virol. 67, 3561-68 (1993); Roep et al. , Lancet 343, 1590-93 (1994)); ICAM-2 (Damle et al. , J. Immunol. 148, 665-71 (1992)); ICAM-3 (Holness et al. , J. Biol. Chem. 270, 877-84 (1995)); LFA-3 (Kanner et al. J. Immunol. 148, 2-23-29 (1992)); L1 гликопротеина (Doherty et al. , Neuron 14, 57-66 (1995)); TNF-R1 (Ashkenazi et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535-539 (1991); Lesslauer et al. , Eur. J. Immunol. 21, 2883-86 (1991); Peppel et al. , J. Exp. Med. 174, 1483-1489 (1991)); TNF-R2 (Zack et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2335-39 (1993); Wooley et al. , J. Immunol. 151, 6602-07 (1993)); CD44 (Aruffo et al. , Cell 61, 1303-1313 (1990)); CD28 и B7 (Linsley et al. , J. Exp. Med. 173, 721-730 (1991)); CTLA-4 (Lisley et al. , J. Exp. Med. 174, 561-569 (1991)); CD22 (Stamenkovic et al. , Cell 66, 1133-1144 (1991)); NP рецепторов (Bennett et al. , J Biol. Chem. 266, 23060-23067 (1991)); IgE -рецептора (Ridgway и Gorman, J, Cell. Biol. 115, abstr. 1448 (1991)); HGF рецептора (Mark, M. R. etal. , 1992, J. Biol. Chem. submitted)); IFN-R - и -цепи (Marsters et al. , Proc. Nail. Acad. Sci. USA 92, 5401-05 (1995)); trk-A, -В b -С (Shelton etal. , J. Neuriosci. 15, 477-91 (1995)); IL-2 (Landolfi, J. Immunol. 146. 915-19 (1991)); IL-10 (Zheng etal. , J. Immunol. 154, 5590-5600 (1995)).

Самая простая и самая прямая конструкция иммуноадгезина объединяет связывающую(ие) область(и) "адгезин" протеина с шарнирной и Fc областями тяжелой цепи иммуноглобулина. Обычно, когда получают OB-иммуноглобулиновые химеры, описанные в данном изобретении, нуклеиновая кислота, кодирующая нужный OB-полипептид, должна сливаться по C-концу с нуклеиновой кислотой, кодирующей N-концевую последовательность константной области иммуноглобулина, однако N-концевое слияние также возможно. Обычно, при таких слияниях кодируемый химерный полипептид будет сохранять, по крайней мере функционально, активные шарнирный, CH2 и CH3 домены константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Слияния также проводятся с C-концом Fc участка константной области или непосредственно N-конца с CH1 тяжелой цепи или соответствующей области легкой цепи. Точный участок, на котором происходит слияние, не является решающим; определенные сайты хорошо известны и могут выбираться для того, чтобы оптимизировать биологическую активность, секрецию или связывающие характеристики OB-иммуноглобулиновых химер.

В предпочтительном варианте последовательность нативного созревшего OB-полипептида сливается с N-концом C-концевого участка антитела (в частности Fc-областью), содержащего эффекторные функции иммуноглобулина, например IgG-1. Возможно слить всю константную область тяжелой цепи с OB-последовательностью. Однако более предпочтительно, когда в слиянии используется начало последовательности в шарнирной области, как раз в обратном направлении (в 3'-5' направлении) от сайта расщепления папаина (который определяет IgG Fc химически; остаток 216, приняв первый остаток константной области тяжелой цепи - 114 (Kobet et al. , supra) или аналогичные сайты других иммуноглобулинов). В особенно предпочтительном варианте последовательность OB-полипептида сливается с шарнирной областью и CH2 и CH3 или CH1, шарнирной, CH2 и CH3 областями тяжелой цепи IgG-1, IgG-2 или IgG-3. Точный сайт, на котором происходит слияние, не является решающим и оптимальный сайт может определяться рутинным экспериментированием.

В некоторых вариантах OB иммуноглобулиновые химеры собираются в мультимеры и, в частности, в гомодимеры или -тетрамеры (WO 9108298). Обычно эти собранные иммуноглобулины состоят из известных единичных структур. Основной четырехцепочной структурной единицей является форма, в которой существуют IgG, IgD и IgE. Четырехцепочная единица повторяется в иммуноглобулинах большего молекулярного веса; IgM обычно существует в виде пентамера основных четырехцепочных единиц, соединенных между собой дисульфидными связями. IgA глобулин и иногда IgG глобулин могут также существовать в мультимерной форме в сыворотке. В случае мультимера каждая четырехцепочная единица может быть одинаковой или различной.

Различные типичные собранные OB-иммуноглобулиновые химеры в пределах объе