Ингибиторы тромбина

Ингибиторы тромбина

Реферат

 

Описывается новый ингибитор тромбина формулы 1: А-В-С-Lys-D, в котором А представляет собой Н, 2-гидрокси-3-циклогексилпропионил-, R₁, R₁-CO-, R₁-SO₂-, -(СНR₂)_nСООR₃-, где R₁ выбран из -(1-6С)алкилен-СOOН, (1-12С)алкила, (6-14С)арила, (7-15С)аралкила и (8-16С)аралкенила, арильная группа которого может быть заменена (1-6С)алкилом, (2-12С)алкокси или галогеном; R₂ представляет собой Н или (1-12С)алкил; R₃ представляет собой Н или (1-12С)алкил; n является целым числом от 1 до 3; В представляет собой связь L-Asp, Leu, norLeu, -N(бензил)-СН₂-СО-, -N(2-индан)-СН₂-СО-, D-1-Piq, D-3-Piq, D-Tiq, Atc или D-аминокислоту, имеющую гидрофобную ароматическую боковую цепь; С является Pro, norLeu(цикло)Gly, аминокислотой одной из формул -N[(3-8С)циклоалкил] -СН₂-СО- или -N(бензил)-СН₂-СО-; D выбрано из СООН, тетразола, оксазола, тиазола и бензотиазола; или А и С имеют указанные выше значения, В является D-(3-8С)циклоалкилаланином, а D является тетразолом, оксазолом, тиазолом или бензотиазолом; или его пролекарство; или его фармацевтически приемлемая соль; за исключением соединения Me-D-Phe-Pro-Lys-COOH. Вышеуказанные соединения могут быть использованы в качестве антитромботических агентов. 2 с. и 7 з. п. ф-лы.

Настоящее изобретение относится к немедленно связывающимся ингибиторам тромбина, процессу получения названных ингибиторов, фармацевтическим композициям, содержащим их, и использованию этих ингибиторов тромбина в качестве антитромботических агентов.

Большое внимание было уделено ингибированию тромбина в качестве возможности потенциальной антикоагуляции. Ингибиторы фермента тромбина, ключевой сериновой протеиназы в каскаде реакций свертывания крови, некоторое время считали потенциальными кандидатами на роль профилактических и терапевтических антикоагулянтов. В частности, многоплановая роль тромбина, выражающаяся в его воздействии на факторы свертывания, циркулирующие компоненты крови и клетки стенок кровеносных сосудов делает его особенно выраженной мишенью в условиях различных патологических состояний. Более того, ограничения, связанные с применением обычно используемых антикоагулянтов, в частности, возникающие при осложнениях в виде кровотечений, диктуют необходимость поиска агентов, действующих более специфично.

Обнаружено много пептидо(подобных) ингибиторов сериновых протеиназ и среди них - ингибиторы промежуточного состояния тромбина. Однако многие из них являются медленно связывающимися ингибиторами. Использование медленно связывающихся ингибиторов тромбина весьма уязвимо. In vivo тромбин постоянно вырабатывается в плазме, и первоочередная функция ингибиторов тромбина - замедление процесса выработки тромбина путем ингибирования опосредованных тромбином ступеней каскадного процесса. Для замедления каскадных реакций предпочтительнее было бы использовать не-медленно связывающийся ингибитор тромбина. Такого же результата можно достичь и повышая дозу медленно связывающегося ингибитора, однако соответственно увеличится и риск побочных реакций.

Соответствующие ингибиторы тромбина были обнаружены Brady et al. , Bioorganic & Medicinal Chemistry, 3 (1995), 1063-78; они являются производными D-Phe-Pro-Arg-амида и D-Phe-Pro-Lys-X, где Х - кетосложный эфир или амин. Было показано, что эти соединения являются медленно связывающимися ингибиторами тромбина, и в связи с этим они исключаются из рассмотрения в настоящем изобретении. В поисках немедленно связывающихся ингибиторов тромбина Jones et al. , J. Enzyme Inhibition, 9 (1995), 43-60, сделали попытку добиться успеха, используя производные D-Cha-Pro-Lys-COOH. Однако несмотря на то, что эти производные оказались более сильными ингибиторами тромбина, они все-таки обладали свойствами медленно связывающихся ингибиторов тромбина.

Среди недавних попыток получить сильные не-медленно связывающиеся ингибиторы тромбина следует отметить работу Levis et al. , Thrombosis and Haemostasis, 74 (4) (1995), 1107, в которой получили производные Ме-D-Phe-Pro-Lys-X, где X - карбоксиамид или карбоновая кислота. Эти соединения, и в особенности Me-D-Phe-Pro-Lys-COOH, классифицированы как медленно связывающиеся ингибиторы. Следовательно, они не удовлетворяют требованиям настоящего изобретения и поэтому должны быть изъяты из рассмотрения.

Ингибитор тромбина с алкил-замещенным лизином описан в патенте США N 5523308.

В более ранних работах описаны другие последовательности, например, в работе Iwanowicz et al. In Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2 (1992), 1607-12, изучали производные D-Phe-Pro-Lys-X, где Х является, например, кетосложным эфиром. Эти соединения также относятся к медленно связывающимся ингибиторам.

Обнаружены и другие типы пептидов, ингибирующих различные сериновые протеиназы. Tsutsumi et al. in J. Med/ Chem. , 37 (1994), 3492-3502 описаны пептидоподобные соединения, содержащие на С-конце тиазол и бензотиазол. Было показано, что такие производные тиазола в 300 раз эффективнее соответствующих тиофеновых аналогов. Позже было установлено, что С-концевые гетероциклические группы могут обеспечить критическое взаимодействие посредством водородной связи с гистамином протеазы пролилэндопептидазы. Хотя в дальнейшем и высказывалось предположение, что это явление можно перенести и на другие сериновые протеиназы, однако конкретно тромбин не был указан. Механистическое объяснение Tsutsumi было в дальнейшем продолжено Edwards et al. In J. Med. Chem. , 38 (1995), 76-85, однако эти авторы обнаружили еще, что ингибиторы эластазы типа D-Phe-Val-Pro-Val-X, где Х тиазол или бензотиазол, представляют собой немедленно связывающиеся ингибиторы указанной сериновой протеиназы. Ими было также высказано предположение, что пептидил-альфа-кетогетероциклы могут оказаться подходящими ингибиторами и для других сериновых протеиназ.

Настоящее изобретение связано с неожиданным обнаружением того, что результаты, полученные Edwards, Tsutsumi и другими, могут быть применимы также и к ингибиторам тромбина. Как обнаружили Lewis, Jones и Brady, приложение С-концевых гетероциклов к этим соединениям обеспечивает потенциальным ингибиторам тромбина свойство их немедленного связывания с тромбином. Более того, многие из этих соединений характеризуются повышенным временем биологической полужизни и полезными свойствами при оральном применении.

Таким образом, изобретение связано с немедленно связывающимися ингибиторами тромбина, имеющими формулу A-B-C-Lys-D, где А является Н, 2-гидрокси-3-циклогексилпропионил-, R₁, R₁-О-СО-, R₁-CO-, R₁-SO₂, -(chr₂)_nСООR₃ или N-защищающую группу, где R₁ выбран из-(1-6С)алкилен-СООН, (1-12С)алкила, (2-12С)алкенила, (6-14С)арила (7-15С)аралкила и (8-16С)аралкенила, арильная группа которого может быть заменена на (1-6С)алкил, (2-12С)алкокси, гидрокси или галоген; R₂ является Н или имеет то же значение, что и R₁.

R₃ выбран из Н, (1-12С)алкила, (2-12С)алкенила, (6-14С)арила, (7-15С)аралкила и (8-16С)аралкенила, арильная группа которого может быть заменена на (1-6С)алкил, (2-12С)алкокси, гидрокси или галоген; n - целое число от 1 до 3; В - связь, L-ASp или производная его сложного эфира, Leu, norLeu, -N(бензил)-СН₂-СО-, -N(2-индан)-СН₂-СО-, D-l-Piq. D-3-Piq, D-Tiq, Atc или D-аминокислота, имеющая гидрофобную ароматическую боковую цепь; С - это Azt, Pro, Pec, norLeu(цикло)Gly, аминокислота одной из формул -N-[(3-8С)циклоалкил] -СН₂-СО- или -N(бензил)-СН₂-СО-; D выбран из СООН, тетразола, оксазола, тиазола и бензотиазола; или А и С имеют вышеуказанные значения, В является D-(3-8C)циклоалкилаланином и D является тетразолом, оксазолом, тиазолом или бензотиазолом; или его пролекарством; или его фармацевтически приемлемой солью; за исключением соединения Me-D-Phe-Lys-COOH.

Соединения согласно настоящему изобретению полезны при лечении и профилактике опосредованных тромбином и связанных с ним заболеваний. Сюда входит множество тромботических и протромботических состояний, в которых активирован каскад свертываемости; такие состояния включают следующий перечень, но не ограничены им: тромбоз глубоких вен, легочная эмболия, тромбофлебиты, закупорка артерий от тромбозов или эмболии, артериальная реокклюзия во время или после ангиопластики или растворения тромба, послеоперационный тромбоз вен или эмболия, рестеноз в результате повреждения сосудов или инвазивных кардиологических процедур, острый или хронический атеросклероз, удар, инфаркт миокарда, рак и метастазирование и нейродегенеративные заболевания. Соединения согласно изобретению могут быть использованы также в качестве антикоагулянтов при экстракорпоральном кровообращении, как это бывает необходимо при диализе и операциях. Соединения согласно изобретению могут быть использованы также и в качестве антикоагулянтов in vitro.

Предпочтительными соединениями согласно изобретению являются соединения, в которых D является СООН. Кроме того, предпочтительно, чтобы А представляло собой Н, (1-12С)алкил, -СО-(7-15С)аралкил, -SO₂-(1-12C)алкил, -SO₂-(6-14С)арил или -SO₂-(7-15C) аралкил; В представляет собой связь, L-Asp, norLeu, D-1-Piq или D-Phe, С является Pro, norLeu(цикло)Gly или -N-циклопентил-СН₂-СО-. Более предпочтительными являются немедленно связывающие тромбин ингибиторы, в которых А представляет собой -SO₂-бензил, В - связь, а С -norLeu-(цикло)-Gly, или где А является -SO₂-этилом, В является D-Phe, а С является Pro; или же где А - водород, В является D-1-Piq, а С представляет собой Pro.

Остальными предпочтительными соединениями согласно изобретению являются такие, в которых D является оксазолом или тиазолом. Далее, предпочтительно, чтобы А представляло собой Н, (1-12С)алкил, 2-гидрокси-3-циклогексил-пропионил-, -СО-(СН₂)_nСООН, -СО-(7-15C)аралкил, -SO₂-(6-14С)арил, -SO₂-(7-15С)аралкил, -SO₂-(1-12C)алкил, -(chr₂)_nCOOR₃, R₂ является Н или (1-12С) алкилом, а R₃ являлся Н, (1-12С)алкилом или бензилом; и чтобы С являлся Pro, norLeu(цикло)Gly или -N[(3-8С)циклоалкил] -СН₂-СО-. Особенно предпочтительными являются не-медленно связывающиеся ингибиторы тромбина, в которых А является -(СН₂)_nCOOR₃, R₃ является Н, (1-12С)алкилом или бензилом; В является D-(3-8C)циклоалкилаланином или D-Phe, факультативно однозамещенным алкокси или галогеном; и С является Pro. Наиболее предпочтительными соединениями согласно изобретению являются соединения, в которых D является тиазалом. Определенно предпочтительным является немедленно связывающийся ингибитор HOOC-CH₂-D-Cha-Pro-Lys-(2-тиазолил).

N-защищающей группой, определяемой при изучении подвижности А, может являться какая-нибудь N-защищающая группа, используемая в пептидах. Подходящие N-защищающие группы можно найти в работе Т. W. Green and P. G. M. Wuts: Protective Groups in Organic Synthesis, Second Edition (Wiley, NY, 1991) and in The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 3 E. Gross and J. Meienhofer, Eds. , (Academic Press, New York. 1981).

Используемый здесь алкил является разветвленной или неразветвленной алкильной группой, имеющей от 1 до 12 атомов углерода, такой как метил, этил, изопентил, додецил и другие им подобные.

Обозначение (1-6С)алкилен означает разветвленную или неразветвленную алкиленовую группу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, такую как -(СН₂)_m-, где m принимает значения от 1 до 6, -СН(СН₃)-, -СН(СН₃)-(CH₂)- и т. д. Предпочтительной алкиленовой группой является метилен.

Алкенил представляет собой разветвленную или неразветвленную ненасыщенную алкенильную группу, имеющую от 2 до 12 атомов углерода.

Примерами являются этенил, аллил, пропенил и им подобные.

Аралкильные и аралкенильные группы представляют собой, соответственно, алкильные и алкенильные группы, замещенные одной или более арильными группами с общим количеством атомов углерода от 7 до 15 и от 8 до 16, соответственно. Предпочтительными аралкильными группами являются, например, группы согласно формуле -(СН₂)_p-СН-(С₆Н₅)₂, где р принимает значения 1 или 2, или -(СН₂)_q-C₆H₅, факультативно замещенные галогеном, и где q принимает значения 1, 2 или 3.

Арил в вышеназванном определении и в определении, использованном в соединении согласно изобретению, является ароматической частью, содержащей от 6 до 14 атомов углерода. Арильная группа может в дальнейшем содержать один или более гетероатомов, таких как азот, сера или кислород. Примерами арильных групп являются фенил, нафтил, (изо)хинолил, инданил и им подобные. Наиболее предпочтительной является фенильная группа. Арильная группа может быть замещена одной или более алкильной группой, предпочтительно метильной, алкокси-группами, предпочтительно метокси, гидрокси или галогеном. Под галогеном подразумеваются фтор, хлор, бром или йод. Хлор является наиболее предпочтительным галогеном.

Обозначения D-1-Piq и D-3-Piq означают 1- и 3-карбоксипергидроизохинолин, соответственно. Tiq означает 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-карбоновую кислоту. Atc является 2-амино-тетралин-2-карбоновой кислотой. Azt и Реc означают 2-азетидин-карбоновую кислоту и пипеколиновую кислоту, соответственно.

Обозначение norLeu(цикло)Gly означает структурный фрагмент формулы Под гидрофобной ароматической боковой цепью подразумевается (1-12С)алкил, замещенный одной или более (6-14С)арильными группами (которые могут содержать гетероатом, например, азот), например, фенилом, пиридинилом, нафтилом, тетрагидронафтилом и им подобными, гидрофобные боковые цепи которых могут быть замещены гидрофобными заместителями, такими как галоген (предпочтительно хлор), трифторметил, низший алкил (например, метил или этил), низший алкокси (например, метокси), фенилокси, бензилокси и им подобными.

Обозначение (3-8С)циклоалкил означает циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогептил или циклооктил.

Тетразол, оксазол, тиазол и бензотиазол имеют, соответственно, следующие формулы: Настоящее изобретение включает в себя также и пролекарства соединений общей формулы, которые после приема (вовнутрь) метаболизируются в активные соединения. Пригодными для этого пролекарствами являются, например, N-алкоксикарбонил-защищенные (предпочтительно N-этоксикарбонил) производные общей формулы.

Использованное здесь понятие фармацевтически допустимой соли относится к солям, которые сохраняют требуемую биологическую активность исходного соединения и которые не обладают нежелательным токсическим действием. Примерами таких солей являются соли присоединения кислот, образованные неорганическими кислотами, например, хлористоводородной кислоты, бромистоводородной кислоты, серной кислоты, фосфорной кислоты, азотной кислоты и им подобных. Соли могут быть образованы также и из органических кислот, таких как, например, уксусная кислота, щавелевая кислота, винная кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, глюконовая кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, аскорбиновая кислота, бензойная кислота, дубильная кислота, памоевая кислота, альгиновая кислота, полиглутаминовая кислота и им подобные. Соли могут быть сформированы с поливалентными ионами металлов, таких как цинк, кальций, висмут, барий, магнезий, алюминий, медь, кобальт, никель и тому подобное, или с органическим катионом, образованным из N, N'-дибензилэтилендиамина или этилендиамина или же их комбинаций (например, цинковая соль дубильной кислоты).

Соединения согласно изобретению обладают одним или несколькими хиральными атомами углерода и могут, следовательно, быть получены в виде чистого энантиомера или в виде смеси энантиомеров, или в виде смеси, содержащей диастереомеры. Способы получения чистых энантиомеров хорошо известны, например, кристаллизация солей, полученных из оптически активных кислот, и рацемически смешанных, или хроматография с использованием хиральных колонок. Для диастереомеров можно использовать колонки с прямой или обратимой фазой.

Изобретение включает далее процесс получения соединения формулы, процесс, включающий попарное соединение защищенных должным образом аминокислот или аминокислотных аналогов, после чего протекторные группы убираются.

Соединения согласно общей формуле можно получить общепринятым для таких соединений способом. Для этого соответствующие N-защищенные (и с защищенными боковыми цепями, если они реактивны) производные аминокислот или пептидов активируются и попарно связываются с подходящей защищенной с С-конца аминокислотой или пептидными производными либо в растворе, либо на твердом носителе. Защиту -амино-функций обычно производят с помощью уретана, такого как кислотолабильная трет. -бутилоксикарбонильная группа (Boc), бензилоксикарбонильная (Z) группа и замещенные аналоги или щелочелабильная 9-фторенил-метилоксикарбонильная (Fmoc) группа, Z-группа может также быть удалена путем каталитической гидрогенизации. Другие подходящие защитные группы включают Nps, Bmv, Врос, Aloc, MSC и т. д. Хороший обзор амино-защищающих групп приведен в книге: The Peptides, Analysis, Synthesis. Biology. Vol. 3 E. Gross and J. Meienhofer, Eds. , (Academic Press, New York, 1981). Защиту карбоксильных групп можно произвести путем образования сложного эфира, например, щелочелабильных сложных эфиров наподобие метила или этила, кислотолабильных сложных эфиров, таких как трет. бутил или гидрогенолитически-лабильных сложных эфиров, таких как бензил. Защита функций боковых групп, например, лизина может быть обеспечена с помощью указанных выше групп. Активацию карбоксильной группы защищенных аминокислот или пептидов можно произвести с помощью азида, смешанного ангидрида, активного сложного эфира или карбодиимидным способом, особенно с добавлением каталитических и тормозящих рацемизацию соединений наподобие 1-гидроксибензотриазола, N-гидроксисукцинимида, 3-гидрокси-4-оксо-3,4-дигидро-1,2,3-бензотриазина, N-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксимида. Могут быть использованы также ангидриды фосфорных кислот. См. , например, The Peptides, Analysis. Synthesis, Biology, supra Pure and Applied Chem. 59(3), 331-344 (1987).

Эти соединения можно получить также и твердофазным способом по Merrifield. Известны различные твердые носители и разные способы - см. , например, Barany and Merrifield in The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2, E. Gross and J. Meienhofer, Eds. , (Acad. Press, N. Y. , 1980), Kneib-Cordonier and Mullen Int. J. Peptide Protein Res. , 30, 705-739 (1987) and Fields and Noble Int. J. Peptide Protein Res. , 35, 161-214 (1990).

Удаление защитных групп и, в случае твердофазного синтеза пептидов, отделение от твердой подложки производят разными способами, в зависимости от природы этих защитных групп и типа линкера к твердой подложке. Обычно удаление защиты происходит в кислых условиях и в присутствии утилизаторов супероксидных радикалов. См. , например, тома 3, 5 и 9 серии The Peptides Analysis, Synthesis, Biology, supra.

Другой возможностью применения ферментов в синтезе таких соединений является, например, способ, описанный в обзоре H. D. Jakubke in The Peptides, Analysis. Synthesis Biology. Vol. 9. S. Udenfriend and J. Meienhofer. Eds. , (Acad. Press. N. Y. , 1987).

Полученные тем или иным способом, такие соединения полезны в изготовлении медикаментов, используемых при лечении патологических состояний, при которых имеет место нежелательная свертываемость крови. В таком случае конкретное синтезированное соединение будет соответствующим образом ассоциировано с фармацевтическим носителем. Фармацевтические носители могут быть разными, начиная от относительно простых, таких как стерильная вода для инъекций, до относительно сложных, таких как микросферы и биодеградируемые имплантаты.

В качестве медикаментов предпочтительно применять эти соединения перорально, подкожно, местно, в нос, внутривенно, внутримышечно или локально (например, в виде имплантата). Возможно также применение с целью депонирования.

Точная доза и режим применения этих соединений и композиций непременно будут зависеть от индивидуальных потребностей больного, которому назначается медикамент, от степени нарушений, имеющихся у больного, и, конечно же, от точки зрения лечащего врача. Обычно парентеральный способ введения требует меньших доз, чем другие, которые больше зависят от степени абсорбции. Однако ориентировочная доза составляет от 0,001 до 100 мг/кг веса тела, предпочтительнее - от 0,01 до 10 мг/кг веса тела.

Медикаменты, изготовленные с применением этих соединений, могут быть использованы также в качестве адъювантов в острой антикоагуляционной терапии. В таком случае препарат назначают совместно с другими соединениями, необходимыми при лечении подобных патологических состояний.

Эти соединения могут использоваться также и в имплантационных фармацевтических приемах, таких как описано в патенте США 4767628, содержание которого использовано в настоящей работе. Затем в этих приемах должно быть использовано достаточное количество соединения для его медленного высвобождения в течение длительного периода (например, более месяца).

Способы изготовления медикаментов, содержащих это соединение, для внутреннего и парентерального применения описан в работе Gennaro et al. , Remington's Pharmaceutical Sciences, (18^th ed. , Mack Publishing Company, 1990, см. , в частности. Часть 8: Фармацевтические препараты и их изготовление), стр. 1519-1580. В смеси с фармацевтически необходимыми добавками, указанные соединения могут быть спрессованы с получением твердых дозированных единиц, таких как драже, таблетки, а также капсулы или суппозитории. С использованием фармацевтически приемлемых жидкостей эти соединения могут быть также получены и применимы в виде раствора, суспензии, эмульсии, например, для использования в виде инъекций, или в виде аэрозоля, например, для распыления в нос.

Для изготовления дозированных единиц, например, таблеток, подразумевается использование традиционных добавок, таких как красители, наполнители, полимерные связующие вещества и другие. Обычно используют какую-нибудь фармацевтически приемлемую добавку, которая не влияет на функциональные свойства активных соединений.

Приемлемыми носителями, в сочетании с которыми могут назначаться эти соединения, являются такие как лактоза, крахмал, производные целлюлозы и им подобные, либо их смеси, используемые в приемлемых количествах.

Дальнейшие разъяснения в связи с настоящим изобретением будут представлены в виде иллюстративных примеров.

Пример 1.

3,3-Дифенилпропионил-Pro-Lys-(2-тиазолил) 3,3-Дифенилпропионил-пролил-метил-сложный эфир К холодному раствору (0^oС) 3,3-дифенилпропионовой кислоты (5,0 г) в этилацетате (100 мл) последовательно добавляли DCCI (1,3-дициклогексилкарбодиимид; 5,03 г), HOBt. (1-гидроксибензотриазолгидрат; 3,28 г), Н-Pro-ОМе. НСl (3,66 г) и триэтиламин (3,1 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при 0^oС, а затем выдерживали в течение ночи при комнатной температуре. Затем реакционную смесь охлаждали до -20^oС и путем фильтрации удаляли DCU (1,3-дициклогексилмочевина). Фильтрат последовательно промывали 5%-ным бикарбонатом натрия, водой, 5%-ным бисульфатом калия и насыщали водным хлоридом натрия, высушивали над сульфатом натрия и концентрировали в вакууме. Осадок хроматографически очищали на кремнеземе (элюэнт: дихлорметан/этилацетат; 9/1 по объему) с выходом 5,68 г 3,3-дифенилпропионил-пролилметил-сложного эфира в виде кристаллического порошка. ТСХ (тонкослойная хроматография) Rf = 0,75, силикагель, дихлорметан/этилацетат = 7/3 по объему.

3,3-Дифенилпропионил-пролил-ОН 3,3-Дифенилпропионил-пролил-метил-сложный эфир (5,6 г) растворяли в диоксане/воде в соотношении 7/3 объем на объем (60 мл) медленно, в течение 30 минут при комнатной температуре добавляли 4 М раствор NaOH (6,2 мл), доведя рН до 10-10,5. Через 30 минут реактивную смесь разбавляли водой (60 мл), а 4 М раствором HCl доводили рН раствора до 2,0, и водный слой экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические фазы промывали водой, насыщали водным хлористым натрием и высушивали над сульфатом натрия, растворитель удаляли путем выпаривания, в результате получался 3,3-дифенилпропионил-пролил-ОН в виде сиропа (5,18 г). ТСХ: Rf = 0,65, силикагель, EPAW (этилацетат/пиридин/уксусная кислота/вода) 63/20/6/11 по объему.

Boc-Lys(Cbz)-NМeOMe Boc-Lys(Cbz)-OH. DCHA (10 г) суспендировали в дихлорметане (200 мл). Суспензию дважды промывали охлажденным раствором 0,1 N HCl. К полученной органической фазе добавляли 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурониумтетрафторборат (6,0 г) и O, N-диметил-гидроксиламин-хлористоводородная кислота (1,82 г), и добавлением триэтиламина рН доводили до 8. Реакционную смесь перемешивали в течение часа при комнатной температуре. Эту смесь промывали последовательно холодным раствором 2 N соляной кислоты, водой, 5%-ным бикарбонатом натрия и водой. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали. Осадок хроматографически очищали на кремнеземе (элюент: дихлорметан/метанол; 5/5 по объему) с получением Вос-Lys-(Cbz)-NMeOMe (7,2 г), ТСХ: Rf = 0,55, силикагель, дихлорметан/метанол 95/5 по объему.

Boc-Lys(Cbz)-(2-тиазолил) К холодному (-78^oС) перемешиваемому раствору n-бутиллития (63,9 ммоль) в диэтиловом эфире (58 мл) по каплям добавляли раствор 2-бромотиазола (10,5 г) в диэтиловом эфире (30 мл). Раствор перемешивали в течение 30 минут при -78^oС, затем медленно добавляли раствор Boc-Lys(Cbz)-NMeOMe (8,2 г) в сухом THF (тетрагидрофуран; 75 мл). Смесь перемешивали при -78^oС в течение 1 часа, затем добавляли 5%-ный водный гидрокарбонат натрия. Смесь выдерживали при комнатной температуре и образовавшиеся слои разделяли. Водный слой экстрагировали диэтиловым эфиром. Объединенные органические фракции промывали водой, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали. Осадок хроматографически очищали на кремнеземе (элюент: этилацетат/гептан; 3/1 по объему) с выходом Boc-Lys(Cbz)-(2-тиазола) (8,6 г). ТСХ: Rf = 0,77, силикагель, этилацетат/гептан = 3/1 по объему.

H-Lys(Cbz)-(2-тиазолил). TFA Boc-Lys(Cbz)-(2-тиазолил) (500 мг) растворяли в смеси 50%-ной TFA (трифторуксусная кислота)/дихлорметан (5 мл) и перемешивали в течение часа при комнатной температуре. Сырой H-Lys(Cbz)-(2-тиазолил). ТФУ был выделен с количественным выходом после удаления растворителя путем выпаривания и немедленно использован в следующей стадии. ТСХ: Rf = 0,25, силикагель, EPAW = 63/20/6/11 по объему.

3,3-Дифенилпропионил-Pro-Lys(Cbz)-(2-тиазолил) К холодному (0^oС) раствору 3,3-дифенилпропионил-пролил-ОН (385 мг) в диметилформамиде (5 мл) последовательно добавляли DCCI (270 мг), HOBt (176 мг), H-Lys(Cbz)-(2-тиазолил). TFA (515 мг) и N-этилморфолин (0,28 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при 0^oС, а затем выдерживали в течение ночи при комнатной температуре. Затем смесь охлаждали до -20^oС и путем фильтрации удаляли DCU. Фильтрат выпаривали досуха. Осадок растворяли в этилацетате и последовательно промывали 5%-ным водным гидрокарбонатом натрия, водой, 5%-ным водным гидросульфатом калия и насыщенным водным хлоридом натрия, высушивали над сульфатом натрия и концентрировали в вакууме. Осадок хроматографически очищали на кремнеземе (элюент: этилацетат/гептан 4/1 по объему) с получением 3,3-дифенилпропионил-Pro-Lys(Cbz)-(2-тиазолил) (332 мг). ТСХ: Rf = 0,40, силикагель, этилацетат/гептан; 3/1 по объему.

3,3-Дифенилпропионил-Pro-Lys-(2-тиазолил) 3,3-Дифенилпропионил-Pro-Lys(Cbz)-(2-тиазолил) (320 мг) обрабатывали с помощью ТФУ/тиоанизола, 10/1 по объему (3,3 мл), в течение 3 часов при комнатной температуре. Реакционную смесь концентрировали в вакууме и осадок растворяли в воде. Водную фазу экстенсивно высушивали диэтилэфиром.

Водный слой, содержащий 3,3-дифенилпропионил-Pro-Lys(Cbz)-(2-тиазолил) заряжали прямо на препаративной колонке Supelcosil LC-18-DB высокоэффективной жидкостной хроматографии с помощью системы градиентной элюции от 20% А/60% В/20% С до 20% А/80% С через 45 минут при скорости элюции 20 мл/мин. (А: 0,5 М натрий-фосфатный буфер, рН 2,1, В: вода, С: ацетонитрил/вода; 3/2 по объему).

Выход: 47 мг 3,3-дифенилпропионил-Pro-Lys-(2-тиазолил). ТСХ: Rf = 0,57, силикагель, EPAW; 63/20/6/11 по объему, Rt(ЖХ): 32,9 мин; 20% А/60% В/20% С до 20% А/0% В/80% C через 40 минут.

Пример 2.

Подобным описанному в примере 1 способом было получено: (a). H-D-Phe-Pro-Lys-(2-тиазолил) Rt(ЖХ): 25,67 мин; 20% А/80% В/60% С до 20% А/20% В/60% С через 40 мин.

(b). H-D-1-Tiq-Pro-Lys-(2-тиазолил) Rt(ЖХ): 23,40 мин; 20% А/80% В/0% С до 20% А/20% В/60% С через 40 мин. (Tiq= тетрагидроизохинолин) (c). H-D-(p-Cl)-Phe-Pro-Lys-(2-тиазолил) Rt(ЖX): 30,47 мин; 20% А/80% В/0% С до 20% А/20% В/60% С через 40 мин.

(d). Инданеглицил-(N-циклопропил)-Gly-Lys-(2-тиазолил) Rt(ЖX): 27,88 мин; 20% А/80% В/0% С до 20% А/20% В/60% С через 40 мин.

(e). H-D-Phe-(N-циклопентил)-Gly-Lys-(2-тиазолил) Rt(ЖХ): 31,07 мин; 20% А/80% В/0% С до 20% А/20% В/60% С через 40 мин.

(f). Ацетил-D-Phe-(N-циклопропил)-Gly-(2-тиазолил) Rt(ЖХ): 33,73 мин; 20% А/80% В/0% С до 20% А/20% В/60% С через 40 мин.

(g). H-D-Cha-Pro-Lys-(2-тиазолил) Rt(ЖX): 30,59 мин; 20% А/80% В/0% С до 20% А/20% В/60% С через 40 мин. (Cha = циклогексилаланин).

(h). H-D-Phe-(N-циклопропил)-Gly-Lys-(2-тиазолил) Rt(ЖХ): 5.1 мин; изократически; 55/45 MeOH/25 mM фосфат, рН 7.

(i). 3,3-Дифенилпропионил-(N-циклопропил)-Gly-Lys-(2-тиазолил) Rt(ЖХ): 8,1 мин; изократически; 75/25 MeOH/25 mM фосфат, рН 7.

(j). H-D-Phe-(N-циклобутил)-Gly-Lys-(2-тиазолил) Rt(ЖХ): 30,59 мин; 20% А/80% В/0% С до 20% А/20% В/60% С через 40 мин.

(k). H-Atc-Pro-Lys-(2-тиазолил) Rt(ЖХ): 27,79+28,04 мин; 20% А/80% В/0% С до 20% А/20% В/60% С через 40 мин.

(Atc = 2-аминотетралин-2-карбоновая кислота) (l). H-D-Phe-(N-бензил)-Gly-Lys-(2-тиазолил) Rt(ЖХ): 16,99 мин; 20% А/80% В/20% С до 20% А/0% В/80% С через 40 мин.

(m). H-D-Cha-(N-циклопропил)-Gly-Lys-(2-тиазолил) Rt(ЖХ): 30/84 мин; 20% А/80% В/0% С до 20% А/20% В/60% С через 40 мин.

(n). р-хлоро-3-фенилпропионил-(N-циклопентил)-Gly-Lys-(2-тиазолил Rt(ЖX): 36,15 мин; 20% А/60% В/20% С до 20% А/0% В/80% С через 40 мин.

(о). (N-бензил)-Gly-(N-циклопентил)-Gly-Lys-(2-тиазолил) Rt(ЖХ): 28,14 мин; 20% А/80% В/0% С до 20% А/80% С через 40 мин.

Пример 3.

НООН-СН₂-(N-циклопентил)-Gly-Lys-(2-тиазолил) (N-циклопентил)-Gly-OMe К раствору, содержащему 23,2 г H-Gly-OMe. HCl в 200 мл метанола добавляли 15,6 г циклопентанона. Смесь размешивали в течение 15 минут и добавляли 7 г цианоборгидрида. Устанавливали рН 6. Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Для завершения реакции добавляли 1 г циклопентанона и продолжали перемешивать. Регистрировали реакцию на ТСХ. Когда весь первоначальный материал исчезал, смесь подкисляли до рН 2 и перемешивали в течение 30 минут. Растворитель удаляли, а осадок разбавляли водой. Раствор промывали эфиром, рН доводили 6 N NaOH до 12 и экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические слои промывали насыщенным раствором хлористого натрия, высушивали на сульфате натрия и выпаривали в вакууме до получения 16 г масла. Rf = 0,46 в этилацетате/пиридине/уксусной кислоте/воде = 63/20/6/11 по объему на кремнеземе.

N-(t-бутилоксикарбонил-метил)-D-Cha-OMe К перемешиваемому раствору, содержащему 26 г H-D-Cha-OМe. HCl в 300 мл ацетонитрила, добавляли 17 г t-бутилбромоацетата. рН реакции доводили диизопропилэтиламином до 8,5. Смесь перемешивали в течение 16 часов при комнатной температуре и выпаривали в вакууме. Осадок растворяли в дихлорметане, раствор промывали водой, сушили на сульфате натрия и выпаривали в вакууме. Хроматографировали на силикагеле в гексане: этилацетате, 9: 1 по объему, получали 20 г вышеназванного продукта. Rf = 0/46 в этилацетате/пиридине/уксусной кислоте/воде, 15,75/5/1,5/2,75 по объему, на кремнеземе.

N, N-Boc. (t-бутилоксикарбонил-метил)-D-Cha-OMe Диизопропилэтиламином доводили рН раствора, содержащего 20 г N-(t-бутилоксиметил)-D-Cha-OMe и 17 г ди-t-бутилбикарбоната, до 8,5. Полученную смесь перемешивали в течение 16 часов при комнатной температуре. Растворитель удаляли под вакуумом. К осадку добавляли дихлорметан и воду. Органическую фракцию отделяли, промывали охлажденной 1 N соляной кислотой, водой, 5%-ным бикарбонатом натрия и водой. Органическую фракцию высушивали на сульфате натрия, и фильтрат выпаривали до аморфного твердого состояния с выходом, составляющим 28 г.

Rf = 0,60 в этилацетате/пиридине/уксусной кислоте/воде, 252/20/6/11 по объему на кремнеземе.

N, N-Boc. (t-бутилоксикарбонилметил)-D-Cha-ОН pH раствора, содержащего 28 г N, N-Boc. (t-бутилкарбонилметил)-D-Cha-Оме в 420 мл диоксана с водой, 9/1, доводили 1 N гидроокисью натрия до 13 в течение 90 минут при комнатной температуре. После закисления смесь вливали в воду и экстрагировали дихлорметаном. Органическую фракцию промывали водой и сушили на сульфате натрия. Фильтрат выпаривали с получением 24 г целевого продукта.

Rf = 0,23 в смеси дихлорметан/метанол, 9/1 по объему, на кремнеземе.

N, N-Boc. (t-бутилоксикарбонил-метил)-D-Cha-(N-циклопентил)-Gly-OMe К раствору, содержащему 24 г N, N-Boc. (t-бутилоксикарбонил-метил)-D-Cha-OH в 300 мл N, N-диметилформамида добавляли 10,2 г (N-циклопентил)-Gly-OMe и 21,2 г 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурониум-тетрафторбората (TBTU).

pH раствора доводили до 8,5. Смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре и концентрировали путем выпаривания. К осадку добавляли воду и этилацетат. Отделяли органический слой и промывали его 1 N соляной кислотой, водой, 5%-ным бикарбонатом натрия и водой и сушили над сульфатом натрия. Фильтрат выпаривали, и осадок хроматографировали на силикагеле в смеси гексана и этилацетата, 8: 2, в качестве элюэнта. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяли и выпаривали. Выход составлял 17 г.

Rf = 0,57 в гексане/этилацетате 7/3 по объему на кремнеземе.

N, N-Boc. (t-бутилоксикарбонилметил)-D-Cha-(N-циклопентил)-Gly-OH Используя тот же прием, что и для N, N-Boc. (t-бутилоксикарбонилметил)-D-Cha-OH, омыляли 17 г N, N-Boc. (t-бутилоксикарбонилметил)-D-Cha-(N-циклопентил)-Gly-ОМе, и на выходе получали 15 г аморфного твердого вещества. Хроматография на силикагеле с дихлорметаном/метанолом, 95/5 по объему, в качестве элюэнта давала на выходе 13 г целевого продукта.

Rf = 0,30 в метилхлориде/метаноле, 9/1 по объему на кремнеземе.

HOOH-CH₂-D-Cha-(N-циклопентил)-Gly-Lys-(2-тиазолил) Это соединение получали с помощью той же процедуры, которая описана в примере 1, но с использованием N, N-Boc. (t-бутилоксикарбонилметил)-D-Cha-(N-циклопентил)-Gly-OH.

Rt(ЖХ): 23,57 мин; 20% А, 60% В, 20% С до 20% А, 80% С через 40 мин.

(а). Аналогичным описанному выше образом, используя Proline. HCl и HONSu (как в примере 11), было получено соединение HOOC-CH₂-D-Cha-Pro-Lys-(2-тиазолил). Rt(ЖХ): 31,44 мин; 20% А, 80% В, 0% С до 20% А, 20% В, 60% С через 40 мин.

Пример 4.

3-Фенилпропионил-Pro-Lys[COCO] -ОН Boc-Lys(Cbz)-OMe Boc-Lys(Cbz)-OH (25 г) растворяли в дихлорметане/метаноле = 9/1 по объему (500 мл). Добавляли 21,1 г TBTU и триэтиламином доводили рН раствора до 8. Реакционную смесь перемешивали в течение часа при комнатной температуре. Затем смесь последовательно промывали охлажденным раствором 2 N соляной кислоты, водой, 5% бикарбонатом натрия и водой. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали. Осадок хроматографически очищали на кремнеземе (элюэнт: этилацетат/гептан = 1/4 по объему) и в результате получали 26,7 г Boc-Lys(Cbz)-Оме.

ТСХ: Rf = 0,79, силикагель, этилацетат/гептан = 3/1 по объему.

Boc-Lys[цианоацетат] К холодному (-78^oС) раствору Boc-Lys(Cbz)-OMe (20 г) в сухом дихлорметане (600 мл) добавляли по каплям диизобутилалюминиумгидрид (127 мл 1 М раствора в гексане) при такой скорости, чтобы температура реакции оставалась ниже -70^oС. Полученный в результате раствор перемешивали в течение 30 минут при -78^oС. 5% раствор лимонной кислоты (500 мл) добавляли к реакционной смеси. Двуфазный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут, слои разделяли, и водную фазу дважды экстрагировали в дихлорметане. Смесь дихлорметановых слоев промывали водой, сушили над сульфатом натрия и фильтровали. Раствор замораживали под азотом в водной ледяной бане. Добавляли водный (500 мл) раствор цианида натрия (24,85 г) и бензилтриэтилхлористого аммония (2,89 г). При интенсивном перемешивании порционно (66 мл) через каждые 30 мин добавляли уксусный ангидрид. Отделяли органический слой, а водный слой экстрагировали дважды дихлорметаном. Смесь дихлорметановых слоев промывали водой, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали под вакуумом. Осадок хроматографически очищали на кремнеземе (элюэнт: дихлорметан/этилацетат = 9/1 по объему) с выходом 17,2 г Boc-Lys(Cbz)[цианоацетата] . ТСХ: Rf = 0,60, силикагель, дихлорметан/этилацетат = 7/3 по объему.

Boc-Lys(Cbz)([СНОНСО] -ОМе Раствор Boc-Lys(Cbz)(цианоацетата (17,2 г) в смеси диэтилэфир/метанол = 3/1 по объему (500 мл) охлаждали до -20^oС под азотом и затем, поддерживая температуру ниже -5^oС, вводили 54,7 г газообразной соляной кислоты. Реакционную смесь выдерживали в течение ночи при 4^oС. Поддерживая температуру ниже 5^oС, к реакционной смеси по каплям добавляли воду (85 мл). После перемешивания в течение 4 часов при комнатной температуре отделяли органическую фазу и промывали ее водой. Водную фазу насыщали хлористым натрием и экстрагировали сухим бутанолом/дихлорметаном = 3/2 по объему. Органическую фазу промывали рассолом, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали в вакууме с получением 17,4 г сырого амина. К осадку добавляли