Новые пептиды, являющиеся производными аутоантигена, предназначенные для использования в иммунотерапии аутоиммунных заболеваний

Новые пептиды, являющиеся производными аутоантигена, предназначенные для использования в иммунотерапии аутоиммунных заболеваний

Реферат

 

Настоящее изобретение относится к новым пептидам, происходящим из аутоантигена HC_gp-39, причем указанные пептиды содержат, по крайней мере, одну из аминокислотных последовательностей FGRSFTLAS (SEQ ID N 1), FTLASSETG (SEQ ID N 2), YDDQESVKS (SEQ ID N 3) и FSKIASNTQ (SEQ ID N 4). Такие пептиды напоминают МНС класса 11 ограничительные Т-клеточные эпитопы, присутствующие на аутоантигене HC_gp-39 в суставном хряще. HC_gp-39 и указанные пептиды могут использоваться при антиген-специфичном лечении разрушения суставного хряща при аутоиммунном заболевании с целью обеспечения толерантности иммунной системы. Аутоантиген HC_gp-39 и указанные пептиды также пригодны для индуцирования артрита у животных нечеловеческого происхождения, особенно у мышей. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим указанный аутоантиген и/или указанные пептиды, к методу диагностики определения аутореактивных Т-клеток и испытательному образцу и аналитическому набору для использования в указанном методе. 6 c. и 9 з. п. ф-лы, 4 ил. , 8 табл.

Изобретение относится к новому аутоантигену и являющимся его производным пептидам, их использованию в лечении хронического разрушения суставного хряща при аутоиммунных заболеваниях, фармацевтическим композициям, содержащим указанные пептиды, диагностическому методу детекции аутореактивных Т-клеток в анализируемом образце и аналитическому набору, используемому в указанном методе.

Принцип действия иммунной системы основан на распознавании посторонних антигенов (не свои антигены) и аутоантигенов (свои антигены, образующиеся в собственном организме особи), достигаемом в результате развития толерантности к аутоантигенам.

Иммунная система защищает организм особи от посторонних антигенов и реагирует на воздействие постороннего антигена путем активации таких специфических клеток, как Т- и В-лимфоциты и вырабатывания таких растворимых факторов, как интерлейкины, антитела и комплементные факторы. Антиген, на который реагирует иммунная система, деградирует под действием антигенпредставляющих клеток (АРС), и фрагмент антигена экспрессирует на поверхности клетки, связанной с главным комплексом гистосовместимости (МНС) гликопротеина класса 11. МНС-гликопротеин-антиген-фрагментный комплекс встречается с Т-клеткой, которая с помощью Т-клеточного рецептора распознает фрагмент антигена совместно с МНС-белком класса 11, с которым связан указанный фрагмент. Т-клетка активируется, т. е. пролиферирует и/или продуцирует интерлейкины, в результате чего происходит экспансия активированных лимфоцитов в направлении атакуемого антигена (Grey c coтр. , Sci. Am, 261: 38-46, 1989).

Собственные антигены также непрерывно подвергаются воздействию и предстают перед Т-клетками в виде фрагментов антигена, связанных с МНС-гликопротеинами (Jardetsky с сотр. , Nature 253: 326-329, 1991). Таким образом, отличительным признаком иммунной системы является способность к самораспознаванию. В нормальных условиях иммунная система толерантна к собственным антигенам и активация иммунной реакции такими собственными антигенами не нужна.

При потере толерантности на собственные антигены иммунная система становится активированной в отношении одного или более собственных антигенов, в результате чего происходит активация аутореактивных Т-клеток и продуцирование аутоантител. Такое явление называется аутоиммунитетом. Поскольку иммунная реакция по своей природе носит деструктивный характер, под которым подразумевается способность разрушать инвазивный посторонний антиген, аутоиммунные реакции могут приводить к разрушению собственных тканей организма.

Вклад Т-клеток в аутоиммунные заболевания был установлен в нескольких исследованиях. Как было показано в опытах на мышах, экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ) вызывается чрезвычайно ограниченной группой Т-клеток, специфичность которых связана с одним эпитопом миелинового основного летка (МВР), входящего в комплекс с МНС-молекулами класса 11. Как было показано в экспериментах на крысах Levis, разновидностью с высокой восприимчивостью к различным аутоиммунным заболеваниям, болезнь является зависимой от Т-клеток. В случае аутоиммунных заболеваний людей также предполагается, что такие болезни связаны с развитием аутоагрессивных Т-клеток.

Деструктивная аутоиммунная реакция является частью различных заболеваний, таких как ревматоидный артрит (RA), в которых целостность суставного хряща нарушается под действием хронического воспалительного процесса, являющегося результатом присутствия большого числа активированных лимфоцитов и МНС-класс 11 экспрессирующих клеток. Простое наличие хряща оказывается необходимым для реализации локальной воспалительной реакции: было показано, что деградация хряща связана с активностью реагирующих на хрящ аутореактивных Т-клеток при RA (Sigall с сотр. Clim. Exp. Rheumat. 6: 59, 1988; Glant с сотр. . , Biochem. Soc. Trans, 18: 96, 1990; Burmuster с сотр. , Rhematoid Orthrits Smolen, Kalden, Main (ред. ) Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1992). Кроме этого, было показано, что удаление хряща у RA-пациентов хирургическим путем уменьшает воспалительный процесс (G. S. Panagi с сотр. , Clin. Exp. Reumatol. 11 (дополнение 8): 1-8, 1993). Поэтому хрящевые белки рассматриваются как аутоантигены-мишени, компетентные в стимуляции Т-клеток. Активация таких аутореактивных Т-клеток приводит к развитию аутоиммунного заболевания.

Воспалительная реакция, приводящая к разрушению хряща, может излечиваться с помощью некоторых лекарственных средств, например лекарств стероидного типа. Однако такие лекарственные средства часто оказываются имуноподавляющими, неспецифическими и вызывают токсические побочные эффекты. Недостатки, связанные с неспецифической иммунодепрессией, делают такую терапию чрезвычайно неблагоприятной.

Чрезвычайно привлекательной альтернативой такой неспецифической имунодепрессии является антиген-специфичная, нетоксичная иммунодепрессия. Такая антиген-специфичная терапия предусматривает лечение пациентов целевым аутоантигеном или синтетическим Т-клеточно-реактивными пептидами, являющимися производными такого аутоантигена. Такие синтетические пептиды соответствуют Т-клеточным эпитопам аутоантигена и могут использоваться для индуцирования специфической Т-клеточной толерантности как в отношении самих себя, так и аутоантигена. Хотя идея десенсибилизации иммунной системы с помощью того же антигена, который ответственен за активацию иммунной системы, представляется парадоксальной, регулируемое применение (ауто)антигена-мишени может оказаться весьма эффективным для десенсибилизации иммунной системы.

Эффективное применение толерантной терапии для лечения деструкции хряща под воздействием Т-клеток предусматривает необходимость идентификации ответственного аутоантигена и обнаружения Т-клеткок реактивных пептидов, способных десенсибилизировать пациентов в отношении аутоантигена, который активирует Т-клетки, ответственные за развитие воспалительного процесса.

Цель настоящего изобретения заключается в разработке аутоантигена и Т-клеточных реактивных пептидов, являющихся производными указанного аутоантигена, которые способны индуцировать специфическую Т-клеточную толерантность к ответственному хрящевому антигену у пациентов с Т-клеточной зависимостью деструкции суставного хряща. Другая цель настоящего изобретения состоит в разработке способа детекции аутореактивных Т-клеток, принимающих участие в деструкции суставного хряща и создании аналитических наборов для такого способа.

Неожиданно было обнаружено, что гликопротеин 39 человеческого хряща (далее в тексте НС_gp-39) представляет собой аутоантиген-мишень у RA-пациентов, который активирует специфические Т-клетки, что вызывает или приводит к развитию воспалительного процесса. Пептиды, являющиеся производными НС_gp-39, преимущественно распознаются аутореактивными Т-клетками от RA-пациентов, но редко - Т-клетками от здоровых доноров, что является указанием на тот факт, что НС_gp-39 представляет собой аутоантиген у RA. Артритогенная природа НС_gp-39 получила дальнейшее подтверждение в опытах на мышах Balb/с. Единственная подкожная инъекция указанного протеина мышам разновидности Balb/с способна инициировать у животных артрические признаки. Развитие НС_gp-39-индуцированного заболевания характеризовали рецидивами, которые периодически имели место в передних лапах и/или задних лапах и постепенно развивались от состояния мягкого артрита до более тяжелых его форм.

Кроме этого наблюдалось симметричное распределение подверженных заболеванию суставов, что совместно с наблюдением повторяющихся рецидивов и образования узелковых утолщений напоминает развитие заболевания при артрите, особенно при RA.

Еще более удивительно было обнаружено, что применение НС_gp-39 приводит к иммунологической толерантности и, что более важно, к замедлению и/или подавлению развития артрита.

НС_gp-39 присутствует в сыворотке как пациентов, так и здоровых особей, хотя концентрация белка в сыворотке пациентов примерно вдвое выше, чем у здоровых особей. Кроме этого, мRНK кодирующая НС_gp-39 может быть обнаружена в образцах синовиальной жидкости или в хрящах, полученных от RA-пацентов, тогда как хрящ здоровых особей, полученный хирургическим путем, не содержит значительного количества указанной мRHK. При культивировании суставных хондроцитов и синовиальных клеток основным продуктом их секреции становится НС_gp-39 (Hakala с сотр. , J. Biol. Chem. , т. 268,34: 25803, 1993). Артритогенная природа НС_gp-39 не была описана или предложена ни в публикации Hakala и ни в какой-либо другой публикации.

Другая цель настоящего изобретения достигается с помощью пептидов, включающих субпоследовательность аутоантигена НС_gp-39, характеризующегося тем, что указанные пептиды содержат одну или более аминокислотных последовательностей FGRSFTLAS (SEQ ID 1), FTLASSETG (SEQ ID 2), YDDQESVKS (SEQ ID 3) и FSKIASNTQ (SEQ ID 4).

Более конкретно, пептид согласно настоящему изобретению включает одну или более аминокислотных последовательностей, выбранных из PTFGRSFTLASSE (SEQ ID 5), RSFTLASSETGVG (SEQ ID 6), VGYDDQESVKSKV (SEQ ID 7), и SQ RFSKIASNTQSR (SEQ ID 8).

Под термином "субпоследовательность" подразумевается "часть" и не будет ошибкой, если такая часть охватывает полный белок. Более предпочтительно, пептиды настоящего изобретения содержат последовательность из 9-35, особенно из 9-25 аминокислотных остатков. Более предпочтительными являются пептиды, содержащие аминокислотную последовательность из 9-15 аминокислотных остатков. Особенно предпочтительными являются пептиды, содержащие аминокислотную последовательность из 13 или 14 аминокислотных остатков, например пептиды, имеющие аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID 5-8.

Мультимеры пептида настоящего изобретения, например димер или тример, в которых мономерные последовательности необязательно могут быть разделены спейсерными остатками, также входят в сферу настоящего изобретения. Такие мультимеры обеспечивают множество эпитопов Т-клеток, представленных SEQ ID 1-8.

В пептидах настоящего изобретения аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID 1-8, могут быть ограничены фланкирующими областями, которые могут соответствовать нативным фланкирующим сайтам соответствующих аминокислот в аминокислотной последовательности НС_gp-39 белка или других белков, в которых присутствуют указанные аминокислотные последовательности. С другой стороны, указанные фланкирующие области могут также представлять собой ненативные аминокислотные последовательности, полученные из случайных аминокислотных остатков.

Такие ненативные фланкирующие сайты могут использоваться для стабилизации пептидов, что повышает их биологическую применимость. Для увеличения степени биологической применимости пептидов настоящего изобретения особенно предпочтительными являются ненативные фланкирующие сайты.

Аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID 1-4, более конкретно, последовательности, представленные в SEQ ID 5-8, имеют сходство с МНС класса 11 ограничительными Т-клеточными эпитопами (Т-клеточные антигенные детерминанты), которые присутствуют на НС_gp-39. Главные комплексы гистосовместимости класса 11 рестрикционных эпитопов Т-клеток на НС_gp-39 отображаются областями 103-116, 259-271, 263-275 и 326-338 аминокислотной последовательности НС_gp-39 (начиная от метионина в сигнальной последовательности, см. Hakala с сотр. , 1993). Таким образом, согласно изобретению, термин "пептиды" может также охватывать фрагменты аутоантигенного НС_gp-39, который содержит один или более указанных МНС класса 11 рестрикционных Т-клеточных эпитопов, которые также входят в сферу настоящего изобретения. Пептиды настоящего изобретения представляют собой Т-клеточные реактивные пептиды, которые распознаются и способны стимуляционно активироваться аутореактивными Т-клетками. Такие аутореактивные Т-клетки обнаружены в крови RA-пациентов, и они редко детектируются у здоровых доноров.

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением НС_gp-39 белок или синтетические пептиды, причем следует отметить, что указанные синтетические пептиды похожи на МНС класса 11 рестрикционные Т-клеточные эпитопы, присутствующие в целевом аутоантигене НС_gp-39, весьма подходят для применения в терапии с целью индуцирования специфической Т-клеточной толерантности к НС_gp-39 у пациентов, с нарушениями суставного хряща, зависимыми от Т-клеток такими, как, например, артрит, особенно ревматоидный артрит.

В WO 95/01995 и WO 95/02188 описывается диагностическое применение НС_gp-39 в качестве маркера на RA, однако не раскрывается и не предполагается артритогенная природа НС_gp-39. Нигде в литературе не содержится намека или предположения относительно использования НС_gp-39, его фрагментов или Т-клеточных реактивных пептидов настоящего изобретения в антиген или пептид - специфичной терапии с целью индуцирования Т-клеточной специфической толерантности на НС_gp-39 хряща, подверженного воздействию.

Получение пептидов настоящего изобретения осуществляется с помощью одного из известных методов органического химического пептидного синтеза. НС_gp-39 и пептиды могут также быть получены с помощью методов рекомбинантной ДНК-технологии.

Рассматриваются такие методы органического химического синтеза пептидов, которые включают сочетание требуемых аминокислот с помощью реакции конденсации, которую можно осуществлять в гомогенной фазе или в так называемой твердой фазе.

Реакцию конденсации осуществляют следующим образом: а) проводят конденсацию соединения (аминокислота, пептид) со свободной карбоксильной группой и защищенными другими реакционноспособными группами с соединением (аминокислота, пептид) со свободной аминогруппой и защищенными другими реакционноспособными группами, в присутствии агента конденсации; б) осуществляют конденсацию соединения (аминокислота, пептид) с активированной карбоксильной группой и свободными или защищенными другими реакционноспособными группами с соединением (аминокислота, пептид), имеющими свободные аминогруппы и другие реакционноспособные группы, которые могут быть свободными или защищенными.

Активация карбоксильной группы inter alia может реализоваться путем превращения карбоксильной группы в галоидный алкил, азид, ангидрид, имидазолид или активированный эфир, например, в такие соединения, как N-гидрокси-сукцинимид, N-гидрокси-бензотриазол, n-нитрофениловый сложный эфир, N-гидрокси-бензотриазольный сложный эфир или пентафторфенольный сложный эфир.

Наиболее приемлемые методы реализации указанной выше реакции конденсации составляют следующее: карбодиимидный метод, азидный метод, смешанный ангидридный метод и метод с использованием таких активированных эфиров, как те, что описаны в The Peptides, Analysis, Synthesis: Biology т. 1-3 (Изд. Gross и Meienhofer) 1979, 1980, 1981 Academis Press. , Inc.

Получение подходящих фрагментов для упомянутых выше пептидов настоящего изобретения осуществляют твердофазным синтезом, описанным, например, в J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149 (1963) и в Int. J. Peptide Protein Res. 35: 161-214 (1990). Сочетание аминокислот пептида, который желают получить, обычно начинают со стороны карбоксила. Для реализации такого способа необходима твердая фаза, содержащая такие реакционноспособные группы, или представляющая собой сусбтрат для введения таких групп. Это может быть, например, сополимер бензола и дивинилбензола с реакционноспособными хлорметильными группами, полимерная твердая фаза, обладающая реакционной способностью за счет содержания гидроксиметильной или аминной фракции.

Особенно подходящей твердой фазой является, например, смола на основе n-алкоксибензилспиртовой смолы (4-гидрокси-метил-фенокси-метил-сополистирол-1% дивинилбензольная смола), описанная Wang (1987) J. Am. Chem. Soc. 95: 1328. После синтеза пептиды могут быть отщеплены от такой твердой фазы в мягких условиях.

После синтеза желаемой аминокислотной последовательности осуществляют отщепление пептида от смолы, например, с помощью трифторуксусной кислоты, содержащей такие акцепторы, как, например, триизопропилсилан, анизол или этандиол, тиоанизол.

Реакционноспособные группы, которые могут не участвовать в реакции конденсации, как известно, эффективно защищаются группами, которые снова могут очень легко удаляться путем гидролиза с помощью кислоты, основания или в результате восстановления. Так, например, карбоксильная группа может эффективно защищаться, например, в результате этерификации метанолом, этанолом, третичным бутанолом, бензиловым спиртом или n-нитробензиловым спиртом и аминами, связанными с твердой подложкой.

Группы, которые могут эффективно защищать аминогруппу, представляют собой этоксикарбонил, бензилоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил (t-boc) или n-метокси-бензилоксикарбонильную группу, или кислотную группу, являющуюся производной сульфокислоты, такую как бензол-сульфонильную или n-толуол-сульфонильную группу, однако могут использоваться другие группы, например замещенные или незамещенные арильные или аралкильные группы, например бензил и трифенилметил, или такие группы, как орто-нитрофенил-сулфенил или 2-бензоил-1-метил-винил. Особенно подходящая альфа-аминозащитная группа представляет собой, например, основно-чувствительный 9-флуоренил-метоксикарбонил (Fmoc)/Carpino и Han (1970), J. Am. Chem. Soc. 92: 5748/.

Более обширный обзор возможных защитных групп приведен в книге Пептиды, Анализ, Синтез, Биология, т. 1-9 (изд. Gross. , Udenfriend Neienhofer) 1979-1987 (Академик Пресс. , Инк. ).

Отщепление защитных групп может осуществляться различными традиционными методами, в зависимости от природы конкретной группы, например, с помощью трифторуксусной кислоты или путем мягкого восстановления, например, с использованием водорода и катализатора, такого как палладий, или с помощью HBr в среде ледяной уксусной кислоты.

Как уже отмечалось выше, НС_gp-39 и пептиды настоящего изобретения могут быть получены с помощью рекомбинантной ДНК-технологии. Для этой цели последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей НС_gp-39 или пептид настоящего изобретения, либо мультимер указанного пептида, вставляют в вектор экспрессии. Подходящими векторами экспрессии, среди прочих, являются плазмиды, космиды, вирусы и УАС (искусственные хромосомы дрожжей), которые содержат необходимые контрольные участки для репликации и экспрессии. Вектор экспрессии может использоваться для экспрессии в клетке хозяине. Подходящими клетками-хозяевами являются, например, бактерии, дрожжевые клетки и клетки млекопитающих. Такие методы хорошо известны в данной области техники (Sambrook с сотр. , Молекулярное клонирование: Лабораторное руководство, Колд Спринг Харбор Лаборатори Пресс, Колд Спринг Харбор, 1989).

Хотя десенсибилизация иммунной системы с помощью того же антигена, что ответственен за активацию иммунной системы представляется парадоксальной, контролируемое применение НС_gp-39 и/или пептидов, содержащих субпоследовательность НС_gp-39, может оказаться эффективным средством десенсибилизации иммунной системы. В соответствии с настоящим изобретением пациенты, хрящи которых находятся под воздействием аутоиммунореактивных Т-клеток, могут лечиться фармацевтической композицией, включающей НС_gp-39, либо один, или более пептидов настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель с тем, чтобы сделать специфические аутореактивные Т-клетки таких пациентов толерантными к НС_gp-39 в хряще, подверженном воздействию, а также к другим собственным антигенам, несущим эпитопы идентифицированных Т-клеток, содержащие одну из аминокислотных последовательностей, представленных последовательностями SEQ ID 1-8, с целью уменьшения воспалительной реакции. Особенно подходящими пептидами для использования в фармацевтической композиции настоящего изобретения, являются пептиды, имеющие аминокислотную последовательность, представленную последовательностями SEQ ID 5, 6, 7 и 8.

Также весьма подходящим для использования в фармацевтической композиции настоящего изобретения являются ДНК (Экспрессирующие) векторы, содержащие ДНК кодирующую НС_gp-39, либо один или более пептидов настоящего изобретения. После доставки к тканям ДНК (экспрессирующий) вектор способен обеспечивать в результате экспрессии уровень содержания рекомбинантного НС_gp-39 белка или пептидов настоящего изобретения, аналогичный уровню, который может достигаться в результате непосредственного применения фармацевтической композиции, содержащей НС_gp-39 белок или пептиды.

Преимущество аутоантигена и пептидов настоящего изобретения состоит в том, что они оказывают специфическое, вызывающее толерантность, воздействие на аутореактивные Т-клетки, не затрагивая при этом другие компоненты иммунной системы, по сравнению с неспецифическим, подавляющим действием иммуноссупрессивных стероидных лекарств. Лечение аутоантигеном и пептидами настоящего изобретения является безопасным и не дает токсических побочных эффектов.

Толерантность может достигаться в результате применения высоких или низких доз аутоантигена или пептидов настоящего изобретения. Количество применяемого аутоантигена или пептида будет зависеть от способа применения, времени применения, возраста пациента, а также от общего состояния его здоровья и используемой диеты.

Как правило, может использоваться дозировка, составляющая 0,01-1000 мкг пептида или белка на кг веса тела пациента, предпочтительно 0,5-500 мкг, более предпочтительно 0,1-100 мкг пептида или белка.

Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны специалистам в данной области и они включают, например, стерильный физиологический раствор, лактозу, сахарозу, фосфат кальция, желатин, декстрин, агар, пектин, масло земляного ореха, оливковое масло, кунжутное масло и воду. Другие носители, например молекулы МНС класса 11, могут, если это желательно, закрепляться в липосомах.

Кроме этого, фармацевтическая композиция согласно изобретению может содержать одно или более вспомогательных лекарственных средств. Подходящие вспомогательные средства среди прочих включают гидроксид алюминия, фосфат алюминия, амфиген, токофенолы, моно-фосфенил липид А, мурамил-дипептид и такие сапонины, как Qui11 A. Количество применяемого адьюванта зависит от его природы.

Кроме этого, фармацевтическая композиция настоящего изобретения может содержать один или более таких стабилизаторов, как, например, карбогидраты, включающие сорбит, маннит, крахмал, сахарозодекстрин и глюкозу, такие протеины, как альбумин или казеин и буфферы, например, щелочные фосфаты.

Подходящими методами применения могут служить внутримышечная инъекция, подкожные инъекции, внутривенные инъекции или внутрибрюшинные инъекции, а также оральное или интраназальное применение. Наиболее предпочтительными методами являются оральное и интраназальное применение.

В связи с артритогенной природой НС_gp-39 и пептиды настоящего изобретения могут использоваться для индуцирования клинического артрита у млекопитающих нечеловеческого происхождения. При применении небольших количеств НС_gp-39, либо одного или более пептидов настоящего изобретения у указанных млекопитающих развиваются симптомы артрита, дающие в результате картину заболевания, напоминающую развитие болезни при артритах, особенно при ревматоидных артритах. При подкожном применении на мышах разновидности Balb/с НС_gp-39 белка у животных развиваются симптомы артрита. Ход НС_gp-39 индуцированного заболевания характеризуется периодически рецидивами в передних лапах и/или задних лапах, которые развиваются от состояния мягкого артрита до более тяжелых форм этого заболевания. Кроме этого, наблюдается симметричное распределение подверженных заболеванию суставов, что совместно с наблюдающимися повторными рецидивами и образованием узелкового утолщения напоминает развитие болезни при артрите, особенно RA.

Таким образом, такие заболевшие животные представляют собой адекватную животную модель для изучения механизма инициирования и прогресса развития артрита. Кроме этого, указанные животные с вызванным заболеванием могут использоваться для поиска новых лекарств для лечения артрита и для изучения влияния таких лекарственных средств на развитие артрита. Предпочтительными моделями для артрита, особенно ревматоидного артрита, являются мыши.

Для индуцирования артрита на указанных млекопитающих следует применять подходящие количества НС_gp-39, либо одного или более пептидов настоящего изобретения. Подходящие количества составляют 0,1-1000 мкг, предпочтительно, 1-100 мкг, более предпочтительно, 10-50 мкг на кг веса тела. Количество применяемого НС_gp-39 или пептидов будет зависеть от метода применения, времени применения и типа используемого животного. Подходящие методы применения являются теми же, что были описаны выше. Для индуцирования артритного эффекта НС_gp-39 белок или пептиды настоящего изобретения могут содержать один или более стабилизаторов или адъювантов из тех, что были описаны выше.

НС_gp-39 или пептиды настоящего изобретения также могут использоваться в диагностическом методе определения присутствия активированных аутореактивных Т-клеток, принимающих участие в хроническом воспалении суставного хряща.

Диагностический метод согласно изобретению включает следующие стадии: а) выделение мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) из образца крови индивидуума, в) культивирование указанных РВМС в подходящих условиях, с) инкубацию указанной РВМС культуры в присутствии аутоантигена или одного или более пептидов, производных из аутоантигена настоящего изобретения, и д) детекцию ответа Т-клеток, например пролиферационного ответа, указывающего на присутствие в организме индивидуума активированных аутореактивных Т-клеток.

В случае детекции ответа путем измерения пролиферационного ответа аутореактивных Т-клеток, мерой такой пролиферации служит внедрение такого радиоизотопа, как, например, ³Н-тимидин. Ответ аутореактивных клеток, присутствующих в РВМС, может также детектироваться путем измерения выделения цитокина с помощью цитокинспецифичного анализа ELISA или цитотоксичности по выделению ⁵¹хрома. Другой метод детекции заключается в измерении экспрессии маркеров активации анализом FASC, например, 11-2R. Таким образом, диагностическая композиция, включающая один или более пептидов изобретения и подходящий детектирующий агент, составляют часть настоящего изобретения. В зависимости от типа обнаружения, детектирующий агент может представлять собой радиоизотоп, энзим или антитела, специфичные в отношении поверхности клетки или маркеров активации.

В сферу настоящего изобретения входят также аналитические наборы, содержащие один или более пептидов настоящего изобретения. Такие аналитические наборы могут использоваться в диагностическом методе настоящего изобретения.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способ детекции в ситуации, когда аутоагрессивные Т-клетки, реакционноспособные в отношении НС_gp-39, присутствуют у пациентов с хрящевыми нарушениями, вызванными воздействием Т-клеток, как это имеет место в случае артрита, особенно ревматоидного артрита. В случае присутствия НС_gp-39-специфичных Т-клеток, приобретение толерантности такими Т-клетками с помощью фармацевтической композиции, включающей НС_gp-39 или пептиды настоящего изобретения, или их комбинации, способно замедлить или подавить развитие артрита.

Следующие ниже примеры носят исключительно иллюстративный характер и никоим образом не ограничивают сферу изобретения.

Надписи к чертежам Фиг. 1(A-D). Инициирование и прогресс артрита у мышей Balb/с с приобретенной толерантностью к НС_gp-39 и без такой толерантности. Общая оценка артритного состояния больных животных на день после сенсибилизации проведена как для передних, так и для задних лап. Указано также число больных животных на день после сесибилизации.

Пример 1 Методы Пациенты Собирали мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) от пациентов, которым был поставлен диагноз ревматоидного артрита (RA) в соответствии с критериями Американской ассоциации по ревматизму (АРА) (Arnett с сотр. , Arthritis Rheum. 31: 315, 1988). Тяжесть заболевания RA у пациентов ранжировали в диапазоне стадий I-IV в соответствии с данными рентгеновского обследования.

РВМС от здоровых доноров, имеющих DR4DW4 (DRBI*0401) или DRI специфичность, собирали в целях контроля. Собирали также РВМС от двух здоровых доноров, не имеющих одну из RA-связанных DR-молекул.

Тестирование МНС РВМС хромосомные ДНК-экстракты пациентов и здоровых доноров анализировали с использованием Dynal DR "низко-разрешающего" SSP набора. Субтипирование DR4 осуществляли с использованием набора Dynal DRBI*04-SSP (Институт переливания крови, госпиталь Радбоуда, Ниджмеген, Нидерланды).

Пептиды Пептиды настоящего изобретения и контрольные пептиды синтезировали твердофазным пептидным синтезом. Вкратце, пептиды с амино и карбоксиокончаниями синтезировали на синтезаторе Миллигена 950 с использованием Fmoc (трет. -Buзащищенных активированных сложных эфиров на смоле PEG-PS). После отщепления и снятия защитных групп пептиды очищали методом препаративной НРLC, превращали в уксуснокислые соли с помощью смолы Дауэкс Ас или в хлориды и лиофилизировали. Чистоту пептидов проверяли методом масс-спектрометрии. Используемые в данном исследовании пептиды перечислены в таблице 1.

N-терминальный биотимилированный пептид производный от Influenza Haemagglutinine (SEQ ID 9), биотин-спэйсерный IHA (307-319)F, в котором третий остаток (У) замещен на F, (биотин-NH-(CH₂)₅-CO-PKFVKQNTLKLAТ), использован в качестве пептида /маркера в исследованиях по связыванию с DR4DW4 (DRBI*0401). В качестве контрольного пептида использовали небиотинилированный пептид IHA (307-319) F, имеющий последовательность SEQ ID 9.

Представленные аминокислотные последовательности пептидов 1-4 и контрольного пептида 1РФ (307-319)F соответствуют соответствующим последовательностям ID.

Культивация клеток для продукции очищенных НLA-ДР молекул Две линии EBV трансформированных В-клеток, ВSM (А2, В62, CW3, DR4DW4, DQ8, DpW2) и ВМ 92 (А25, В 51, CW1, DR4DW14, DQ8) были подарены Академическим госпиталем в Лейдене, Нидерланды. Такие клетки культивировали в ВМЕМ/НАМ F12 Гибко Лабораториз, Гранд Айленд, НЮ), дополненной 10% FCS (Хиклон Лабораториз), 1% несущественных аминокислот (ICI), 1-глутамином, 2-МЕ и антибиотиками. Клетки подвергали общепринятому пассированию каждые 2-3 дня в соотношении 1: 2. Проводили сбор супернатанта и полученный материал трижды промывали в РВS (4^oС), содержащем 1мМ РМSF. Клеточные гранулы хранили до применения при 70^oС.

Аффинная очистка HLA-DR молекул HLA-DR молекулы подвергали аффинной очистке от клеточных лизатов с использованием моноклонального антитела L243 (ATCC HB55) к неполиморфному детерминанту на ДR-комплексе (Lampson с сотр. , J. Immunol. 124: 293, 1980). L243 очищенный сефарозой белок G конъюгировали с NHS-сефарозой 4FF (Фармация /Pharmacia/) в соответствии с инструкциями производителя.

HLA-DR экспрессирующие клетки оттаивали и лизировали на льду в течение 30 минут в PBS, 1% NP-40, 1мМ AEBSF (Calbiochem). Лизат осветляли центрифугированием со скоростью 15.000 об. /мин. (Sorvall, SS 34 ротор) в течение 30 минут. Супернатант пропускали через 0,45 мкм фильтр и добавляли к L243-NHS-сефарозным гранулам. После инкубации в течение ночи гранулы переносили в колонку и промывали пятью объемами РВS, 1% NP-40, 5 объемами РВS 0,5% NP-40, 15 объемами РВS, 0,5% NP-40, 0,1% SDS, 5 объемами PBS, 0,05% NP-40, 5 объемами PBS, 1% н-октилглюкозида (Сигма, Сент-Льюис, США) и 5 объемами 50 мМ диэтиламина (Флюка), 150 мМ NaCl 1% н-октил-глюкозида, рН 8.0. Молекулы НLA-ДR элюировали 50 мМ диэтиламина, 150 мМ NaCl, 1% ноктил-глюкозида, рН 11. Сразу после сбора фракции нейтрализовали 2М глицина при рН 4,8. Собранные фракции анализировали методом SDS-PAGE в невосстановительных условиях с последующим серебряным окрашиванием. Фракции, содержащие очищенный HLA-DR, концентрировали ультрафильтрацией с использованием 30 кД пропускающей мембраны.

Анализ на HLA-DR пептидное связывание Исследование пептидного связывания проводили с использованием усовершенствованного варианта полуколичественного анализа на связывание, описанного ранее (Joosten с сотр. , Int. , Immunol. 6 751, 1994). Очищенные HLA-DR молекулы (0,5-500 нМ) инкубировали при рН 0,5 в присутствии 50 нМ биотинилированного маркерного пептида (биотин-спайсер -1НА(307-319)F) в интервале концентраций конкурентного пептида (пептиды 1-4 и IН (307-319)F в качестве контрольного пептида) в конечном объеме связующего буффера 25 мкл (PBS, 1мМ AEBSF, 1мМ N-этил малеинимида, 8 мМ EDTA, 10 мМ пепстатина А, 0,01% NaN₃, 0,05 NP-40 и 5% ДМСО).

Примерно через 45 часов инкубации при комнатной температуре связанные и несвязанные маркерные пептиды разделяли с помощью метода SDS-PAGE в комбинации с блоттингом на нитроцеллюлозном фильтре (Bio Rad) или с помощью вакуумного ДОТ блоттинга с использованием нитроцеллюлозного фильтра (Bio Rad) и 96-луночного Hybry. Dot устройства (BRL). Пятна блокировали с помощью 0,5% ДНК-блокирующего реагента (Bochringer Manngeim, Германия) в 0,1М малеиновой кислоты при рН 7,5, 150 мМ NaCl. Через 0,5 часа пятна промывали в РBS, 0,02% Твина 20 (Сигма, Сант-Льюис, США) и инкубировали в присутствии Стрептавадин-HRPO (Саузерн Биотехнолоджи) при разбавлениях 1: 40.000 и 1: 5.000, соответственно. DR-связанный биотинилированный маркерный пептид детектировали методом усиленной хемилюминесценции с использованием ECL набора для Вестерн-Блотирования (Амершам, Великобритания) в соответствии с инструкциями производителя. Предварительно испаренные (preflached fibms) пленки (гиперпленка - ECL, Амершам, Великобритания) экспонировали в течение 10 минут. Относительную связующую аффинность данного пептида соотносили с конкуренцией маркерным пептидом. Такую относительную аффинность определяли как концентрацию пептида, при которой сигнал понижался на 50% (^RIC₅₀).

В случае анализа SDS-PAGE значения ^RIC₅₀ определяли визуально. Плотность ДОТ Блот-пятен анализировали с использованием компьютерного денситометра (Молекуьюлар Динамикс, США), а также программного обеспечения Image Quant и Exсell.

Пролиферационные ответы мононуклеарных клеток крови С целью идентификации Т-клеточной реактивности в отношении пептидных последовательностей НС_gp-39 пептиды 1-4 тестировали на их способность индуцировать пролиферационные ответы в РВМС от RA пациентом в сравнении со здоровыми DR1 или DR4 контрольными пациентами.

PBMC, полученные из гепаринизированной венозной периферической крови, выделяли стандартным центрифугированием на градиенте F: coll-Paque. Клетки культивировали при трех- или четырехкратном разбавлении при концентрации 1,510⁵ клеток/лунку в среде, дополненной 10% термо-инактивированной аутологичной плазмы, L глютамином, 2-МЕ и антибиотиками в плоскодонном титрационном микропланшете. Клетки инкубировали только в среде или в присутствии RHA (2,5 мкг/мл), либо в присутствии антигенов, включающих экстракт Candida albсaus ("воскресший" антиген) (1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл) или одного из пептидов 1-4 при концентрации 100 мкг/мл, 25 мкг/мл или 10 мкг/мл. Культуры инкубировали в общем объеме 210 мкл в течение 7 дней при 37^oС в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО₂. Импульсы культуры подавали в течение последних 18 часов в прис