Способ получения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-adca)

Способ получения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-adca)

Реферат

 

Изобретение относится к области генетической инженерии и может быть использовано в производстве цефалоспориновых антибиотиков. Штамм Penicillium chrysogenum, способный ассимилировать и утилизировать адипиновую кислоту или ее соли и эфиры с образованием адипоил-6-аминопенициллиновой кислоты (адипоил-6-АРА), трансформируют вектором экспрессии, содержащим ген фермента экспандазы, в частности из Streptomyces clavuligerus, которая преобразует адипоил-6-АРА в адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспорановую кислоту (адипоил-7-ADCA). Рекомбинантный штамм культивируют в присутствии адипинатного питания, в частности динатрийадипината, а полученную in situ адипоил-7-ADCA затем обрабатывают ферментом адипоилацилазой с получением конечного продукта - 7-ADCA. Изобретение обеспечивает возможность быстрого (в 2 стадии) получения ключевого промежуточного соединения для синтеза цефалоспоринов в промышленном масштабе. 4 з. п. ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к синтетическим способам получения коммерческих цефалоспориновых антибиотиков, которых в настоящее время существует достаточное число, причем сейчас эти терапевтические средства представляют четвертое поколение. Признано, что большое разнообразие боковых цепей в коммерческих цефалоспоринах и существенная экономическая роль цефалоспоринов увеличивают значение разработки более экономичных и эффективных способов получения ключевых промежуточных соединений, которые позволяют легко синтезировать различные цефалоспорины.

Одним из таких ключевых промежуточных соединений является 7-аминодезацетоксицефалоспорановая кислота /7-ADCA/, которая может быть изображена следующей формулой: Обычно 7-ADCA получают из пенициллина С, и требуется четыре или пять химических стадий, чтобы расширить систему пенициллинового кольца от 5-членного до 6-членного кольца, которое характеризует цефалоспорины. Как типично для полностью химического синтеза, этот способ имеет серьезные недостатки. К их числу относятся необходимость многостадийного и комплексного процесса, и высокая стоимость реагентов, проблемы обработки вод, содержащих значительные количества побочных продуктов, образующихся в результате процесса, и очистка исходного материала перед началом химической обработки. Поэтому продолжаются поиски микробиологического или ферментативного процесса, который обеспечил бы осуществление расширения ферментного кольца и отщепление боковой цепи с образованием 7-ADCA на более экономичной основе, чем химический способ, который используется сейчас.

Соответственно, настоящее изобретение касается, в особенности, области получения ключевого промежуточного соединения цефалоспорина 7-ADCA и более конкретно к области биопроцесса для получения 7-ADCA.

Сначала поиски удачного биопроцесса для получения 7-ADCA были безуспешны, особенно с точки зрения коммерческого масштаба. Например, хотя возможно получить 6-аминопенициллановую кислоту /6-АРА/ прямой ферментацией и/или ферментативной обработкой пенициллина G, после чего остается только необходимость расширения кольца, чтобы получить 7-ADCA, найдено, что, к несчастью, ферменты Cephalosporium или Streptomyces, которые осуществляют расширение кольца при обычном обмене в этих микроорганизмах, не приемлют 6-АРА в качестве субстрата. Эти ферменты, которые все вместе относят в технике к DAOCS или экспандазе, определяются как ферменты, которые катализируют расширение кольцевых структур пенама, обнаружненных в молекулах типа пенициллина, до цеф-3-ем-колец, найденных в цефалоспоринах. Далее здесь такие ферменты будут упоминаться как "фермент экспандаза".

Субстратом, на котором фермент экспандаза проявляет активность, является пенициллин N, который при расширении кольца дает дезацетоксицефалоспорин С /DAOC/. В таком случае, чтобы получить 7-ADCA, необходимо только отщепить боковую (D)--аминоадипоиловую цепь, но эта боковая цепь оказывает упорное сопротивление ферментативному отщеплению, давая только неприемлемо низкие выходы.

В соответствии с настоящим изобретением возможно осуществить эффективный биопроцесс, в котором образуется соединение пенициллина /имеющее боковую адипоильную цепь/ посредством нового способа ферментации с высокими титрами, причем упомянутое соединение пенициллина является приемлемым субстратом для ферментной системы экспандазы, которая образуется in situ тем же микроорганизмом, который образует соединение пенициллина, которое трансформируется для экспрессии упомянутой системы фермента экспандазы. Экспандаза затем с высоким выходом расширяет кольцо соединения пенициллина до соединения цефалоспорина. И, что важно для второго критического момента, боковая цепь соединения пенициллина, теперь - соединения цефалоспорина, способна удаляться при действии другой ферментной системы с удивительно высоким выходом. Неожиданным результатом этого уникального биопроцесса, который составляет суть настоящего изобретения, является производство 7-ADCA с удивительно высоким выходом.

Cantwell et al. , Curr, Genet. /1990/ 17: 213-221, предложили биопроцесс для получения 7-ADCA посредством расширения кольца пенициллина V с последующим ферментативным гидролизом получающегося в результате дезацетоксицефалоспорина V с образованием 7-ADCA. Такое предложение основано на наличии клонированного пенициллином N гена экспандазы /СеfE/ из S. clavuligerus, Kovacevic et al. , J. Ваcteriol. /1989/ 171: 754-760 и патент США 5070020. Однако, так как экспандаза проявляет активность на пенициллине N, своем природном субстрате, но не на пенициллине V, предложение требует приемов генной инженерии для получения модифицированного гена экспандазы, который может расширять кольцо пенициллина. Однако Сantwell et al. не добились требуемой модификации, и они только преуспели в трансформации Penicillium chvysogenum с cef-E-геном из Streptomyces clavuligerus и экспрессии низкого уровня фермента DAOCS /экспандазы/.

Фермент экспандаза хорошо изучен в технике как с точки зрения его активности, так и его последовательности. Например, в патентах США 4510246 и 4536476, Wolfe, циклаза, эпимераза и ферменты расширения кольца выделены только из бесклеточного экстракта прокариотных продуцирующих -лактам организмов, включая Streptomyces clavuligerus. чтобы дать устойчивые ферментные реагенты. Заявка на Европейский патент ЕР-А-0366354 описывает очищенный фермент экспандазу, выделенный из S. clavuligerus, который отличается концевой группой и аминокислотным составом, и упоминается, что его молекулярная масса составляет около 34600 дальтон. Это, однако, находится в противоречии с молекулярной массой, равной 29000, приписываемой этому же ферменту в патенте США 4536476. Заявка на Европейский патент ЕР-А-0233715 раскрывает выделение и создание карты эндонуклеазного ограничения фермента экспандазы, полученной из S. clavuligerus, трансформацию и экспрессию в хозяине упомянутого фермента, и примеры расширения кольца субстрата пенициллина N с использованием упомянутого фермента. Патент США 5070020 раскрывает последовательность ДНК, кодирующую фермент экспандазу, полученную из S. clavuligerus, и описывает трансформацию штамма P. chrysogenum с вектором экспрессии, содержащим упомянутую последовательность ДНК, за счет чего получают экспрессию фермента экспандазы. Хотя предполагается, что этот фермент пригоден для экспансии субстратов и иных, чем пенициллин N, примеров такой экспансии не приводится.

Описанная выше работа сосредоточивает внимание на ферменте экспандазе, полученной из прокариотного S. clavuligerus. Этот же фермент или по крайней мере фермент, явно имеющий ту же активность по расширению кольца, также подвергается экспрессии штаммами эукариотного Cephalasporium acremonium /также называемого Аcremonium chrysogenum/. Однако таких штаммах активность экспандазы экспрессируется бифункциональным геном /cefE-F/, который также экспрессирует активность DACS /гидроксилазы/, естественной функцией которой является конверсия дезацетоксицефалоспориновой кислоты /DAOC/ - продукта фермента экспандазы в дезацетилцефалоспорин С /DAC/. Результатом является один, но бифункциональный фермент - экспандаза /гидроксилаза. Хотя предприняты усилия по разделению активностей этих двугенных продуктов, успех пока не достигнут. Например, заявка на Европейский патент ЕР-А-0281391 раскрывает выделение и идентификацию ДНК последовательности гена DAOCS/DACS, полученного из С. acremonium AТСС 11550, вместе с соответствующими аминокислотными последовательностями ферментов. Penicillium трансформируется и экспрессирует ферменты, однако попытки конверсии пенициллинов G и V в соответствующие цефалоспорины нигде не демонстрируется. Кроме того, несмотря на предложение, что техника генной инженерии дает легкий способ разделения генетической информации, кодирующей DAOCS, и DACS, и их раздельного выражения, фактических примеров такого разделения не приводится.

Фермент DAOCS/DACS (экспандаза/гидроксилаза) из С. асremonium также хорошо изучен в технике как в отношении его активности, так и в отношении его свойств и генетической последовательности. Например, в патентах США 4178210, 4248966 и 4307192, Demain, различные исходные материалы типа пенициллина обрабатывают бесклеточным экстрактом С. аcremonium, который эпимеризует и экспандирует кольцо с образованием антибиотика типа цефалоспорина. Wu-Kuang Yeh в патенте США 4753881 описывает фермент С. acremonium с точки зрения его свойств, таких как изоэлектрическая точка, молекулярная масса, аминокислотные остатки, соотношение активностей гидроксилазы и экспандазы и пептидные ферменты.

Прототипы, описанные выше, имеют дело только с одним аспектом настоящего изобретения, т. е. с трансформацией штамма Р. chrysogenum геном, экспрессирующим фермент экспандазу, и получением экспрессии этого фермента. В технике, однако, используют экспрессированный фермент только для расширения кольца пенициллина N, но не пенициллинов G и V. Даже в этом случае пенициллин N имеет боковую цепь в положении 7, которая не может быть отщеплена ферментативно с образованием 7-ADCA, как по способу настоящего изобретения. Настоящее изобретение основывается на поразительном открытии, что адипоильная боковая цепь может быть эффективно присоединена штаммом P. сhrusogenum, и что фермент экспандазы, экспрессированный in situ, может эффективно использовать это соединение в качестве субстрата для расширения кольца до адипоил-7-АDCA, и что адипоильная боковая цепь затем может быть эффективно удалена с помощью еще одного фермента с образованием 7-ADCA. Хотя отдельные выделенные фрагменты настоящего изобретения могут быть найдены в прототипах, нельзя предположить, что их можно соединить и получить непредвиденные результаты, которые получают по способу настоящего изобретения.

Например, в технике известен способ получения 6-адипоилпенициллановой кислоты, см. Ballio, А. et al. , Nature /1960/, 185, 97-99. Ферментативное расширение 6-адипоилпенициллановой кислоты in vitro также известно в технике, см. Baldwin et al. , Tetrahedron /1987/ 43, 3009-3014; и ЕР-А-0268343. Также известно и ферментивное отщепление боковых адипоильных цепей: см. Matsufa et al. , J. Bact. /1987/ 169, 5815-5820.

Адипоильная боковая цепь имеет строение СООН (СН₂)₄-СО-, в то время как ближайшая родственная боковая цепь представляет собой глутарил и имеет строение СООН-(СН₂)₃-СО-. Ферментативное отщепление боковых глутариловых цепей известно в технике, см. , например, Shibuya et al. , Agric. Biol. Chem. /1981/ 45, 1561-1567; Matsuda and Komatsu, J. Bact. /1985/ 163, 1222-1228; Matsuda et al. , J. Bact. /1987/ 169, 5815-5820; Jap. 53-086084 /1987 - Banyu Pharmaceutical Co. , Ltd. /; и Jap. 52-128293 /1977 - Banyu Pharmaceutical Co. Ltd. /.

Также, заявка ЕРА-А-0453048 описывает способы улучшения отщепляющей адипоил активности глутарилацилазы, полученной с помощью Pseudomonas SY-77-1. При замещении различных аминокислот в некоторых местоположениях в пределах альфасубъединицы наблюдают увеличение степени отщепления адипоила /из адипоилсерина/ в три-пять раз. Следует отметить, что хотя заявка ЕР-А-0453048 приводит примеры ацилазы с улучшенной активностью по отношению к адипоильным боковым цепям, в ней не описаны какие-либо пути /ни химические, ни какие-либо биопроцессы, аналогичные описанным в настоящем описании/, в соответствии с которыми на первой стадии можно генерировать адипоилцефалоспорин.

В технике известно, что когда присутствует боковая (D)--аминоадипоильная цепь, в первую очередь (D)-аминоацидоксидазой удаляют аминогруппу и укорачивают боковую цепь, оставляя боковую глутариловую /GL-7/ цепь, и глутариловую боковую цепь удаляют другим ферментом /глутарилацилазой/. Такое двустадийное отщепление раскрывается в патенте США 3960662, Matsuda, в заявке на Европейский патент ЕР-А-0275901; Jap. 6-218057 /1988 - Komatsu, Asahi Chemical Industry Co. /; ВОИС 90/12110/ 1990 - Wong, Biopure Corp. /; и Isogai et al. , Bio/Technology /1991/ 9, 188-191.

Делается ссылка на заявку, находящуюся в процессе одновременного рассмотрения /Attorney Docket 185721 А/, которая раскрывает биопроцесс для приготовления 7-АСА, основанный на экспрессии активности фермента экспандазы в трансформанте Р. chrysogenum по тому же способу, что и в биопроцессе для получения 7-АDCA, описанном здесь. Однако в биопроцессе для 7-АСА требуются дополнительные трансформации для экспрессии дополнительной ферментной активности, для того чтобы достичь полностью отличного пути рекомбинантного метаболизма для разного конечного продукта, ни об одном из которых не говорится в настоящем описании.

Для того чтобы облегчить лучшее понимание способа настоящего изобретения и изучение прототипов, которые обсуждались выше, в конце описания представлены различные стадии путей метаболизма, ведущие к пенициллину G и цефалоспорину С, промежуточным продуктам и ферментам, которые осуществляют трансформации.

Настоящее изобретение относится к новому биопроцессу для получения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты /7-ADCA/, который включает стадии: 1) выдержки в культуральной среде, способной поддерживать его рост, штамма Penicillium chrysogenum, который продуцирует изопенициллин N, и добавления к упомянутой культуральной среде адипинатного сырья (питания), содержащего адипиновую кислоту или одну, или большее число, ее солей и эфиров, которые способны ассимилироваться и быть использованными упомянутым штаммом Penicillium chrysogenum для продуцирования адипоил-6-аминопенициллановой кислоты /адипоил-6-АРА/, в результате чего продуцируется упомянутая адипоил-6-АРА; на этой стадии штамм Penicillium chrysogenum трансформируется ДНК, кодирующей фермент экспандазу, использующую адипоил-6-АРА в качестве субстрата, после чего продуцированная этим штаммом адипоил-6-АРА in situ расширяет кольцо с образованием адипоил-7-ADCA; и 2) приведения в контакт упомянутой адипоил-7-ADCA с адипоилацилазой, посредством чего удаляется боковая адипоильная цепь и образуется продукт 7-ADCA; и упомянутый продукт затем выделяют.

Здесь используются термины, имеющие указанные далее значения.

"Адипоил-6-АРА" означает [2S-(2,5,6)]-3,3-диметил-7-оксо-6-[(гексан-1,6-диоил)амино] -4-тиа-1-азабицикло-[3.2.0] гептан-2-карбоновую кислоту; и "адипоил-7-ADCA" означает 7-[(гексан-1,6-диоил)амино] -3-метил-8-оксо-5-тиа-1-азабицикло-(4.2.0)-окт-2-ен-2-карбоновую кислоту.

В частности, настоящее изобретение относится к новому биопроцессу для получения 7-аминодезацетоксицефалоспарановой кислоты /7-АDCA/, изложенному выше, в котором адипинатное сырье представляет собой динатрийадипинат, ДНК, кодирующая фермент экспандазу, получена из Streptomyces clavuligerus АТСС 27064, и для которого адипоилацелаза получена из вида Pseudomonas.

Настоящее изобретение относится также к вектору экспрессии рекомбинантной ДНК, содержащему ДНК, кодирующую фермент экспандазу, происходящую из Streptomyces clavuligerus АТСС 27064, и промотор, который стимулирует экспрессию этой ДНК, кодирующей экспандазу, включая плазмиду рРеn-FTSO, как описано далее.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к клетке хозяину Penicillium chrysogenum, трансформированного вектором экспрессии, содержащим рекомбинантную ДНК, кодирующую фермент экспандазу, происходящую из Streptomyces clavuligerus АТСС 27064, и промотор, который стимулирует экспрессию этой ДНК, кодирующей экспандазу, и содержащий промотор гена IPNS Рenicillium chrysogenum. В частности, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину Рenicillium chrysogenum, трансформированного вектором экспрессии рекомбинантной ДНК, содержащим плазмиду рPenFTSO, как описано далее.

Настоящее изобретение относится еще к способу, включающему стадию выращивания клетки-хозяина рекомбинантного Рenicillium chrysogenum в условиях, подходящих для генной экспрессии, при этом упомянутая клетка-хозяин содержит вектор экспрессии, содержащий ДНК, кодирующую экспандазный фермент, происходящий из Streptomyces clavuligerus АТСС 27064, и промотор, который стимулирует экспрессию этой ДНК, кодирующей экспандазу, и содержащий промотор гена IPNS Рenicillium chrysogenum. В частности, настоящее изобретение относится к способу выращивания клетки-хозяина рекомбинантного Рenicillium chrysogenum в условиях, подходящих для экспрессии гена, при этом упомянутая клетка рекомбинантного хозяина включает вектор экспрессии рекомбинантной ДНК, содержащей плазмиду рРеnFTSO, как описано далее.

Первым аспектом настоящего изобретения является новый биопроцесс для получения 7-аминодезацетоксицефалоспарановой кислоты /7-АDCA/, ключевого промежуточного соединения при получении синтетических коммерческих цефалоспоринов, которая может быть представлена следующей структурной формулой: Помимо цефалоспоринового ядра отличительными чертами 7-ADCA являются группа 7-амино и 3-метилгруппа. Группа 7-амино является такой группой, которая может быть превращена в любые производные, которые образуют боковые цепи, и, таким образом, является основанием для синтеза различных коммерческих цефалоспоринов. 3-Метильная группа обычно, но не всегда - как в случае цефалексина - должна быть превращена в некоторую другую боковую цепь, чтобы синтезировать коммерческий цефалоспорин.

7-ADCA - продукт способа настоящего изобретения может быть сопоставлена с цефалоспорином С - еще одним ключевым промежуточным соединением цефалоспорина, который может быть изображен структурной формулой Для такого промежуточного соединения для коммерческих цефалоспоринов может быть приемлема 3-ацетилоксиметильная боковая цепь. Однако 7-(D)--аминоадипоильная боковая цепь неприемлема для дальнейшего синтеза и должна быть отщеплена, чтобы дать приемлемую 7-аминогруппу. К несчастью, 7-(D)--аминоадипоильная боковая цепь всегда отщепляется с большим трудом как химическими, так и биохимическими способами.

Определения: 7-ADCA - 7-аминодезацетоксицефалоспорановая кислота; 6-АРА - 6-аминопенициллановая кислота; DAOC - дезацетоксицефалоспарановая кислота; DAOCS - DAOC синтетаза; DAC - дезацетилцефалоспорин С; DACS - ДАС синтетаза; IPNS - синтетаза изопенициллина N; Трис - Ттис[гидроксиметил] аминометан; ЭДта - этилендиаминтетрауксусная кислота; DEPC - Диэтилпирокарбонат; ТЕ - буфер Трис/ЭДТА; SSC - буфер соль (хлорид натрия)/ цитрат натрия; SDS - Дддецилсульфат натрия; ПЭГ - полиэтиленгликоль.

Культура Penicillium chrysogenum Первая стадия способа настоящего изобретения представляет собой стадию выдержки в культуральной среде, способной поддерживать его рост, штамма Penicillium chrysogenum, который продуцирует изопенициллин N, и добавления к упомянутой культуральной среде адипинатного сырья, содержащего адипиновую кислоту или ее соли и эфиры. Адипинатное сырье может быть добавлено к культуральной среде после инокуляции P. chrysogenum, но предпочтительно, чтобы оно уже присутствовало в культуральной среде в то время, когда происходит инокуляция. Адипиновая кислота или ее соли и эфиры имеют свойство ассимилироваться и использоваться упомянутым штаммом P. chrysogenum для образования адипоил-6-АРА; при этом упомянутый штамм P. chrysogenum трансформирован ДНК, кодирующей активность экспандазного фермента, после чего, в результате ее экспрессии, упомянутая адипоил-6-АРА in situ является расширяющей кольцо и образует адипоил-7-ADCA.

Другие виды рода Penicillium, кроме вида chrysogenum, продуцируют изопенициллин N. Однако исторически все штаммы самого высокого продуцирования изопенициллина N разрабатывались с помощью хорошо известных технических приемов улучшения штамма, из вида chrysogenum. При существующей практике настоящее изобретение ограничено штаммами Penicillium chrysogenum, хотя его применимость к другим видам очевидна. Любой депозитный штамм Penicillium chrysogenum или из другого доступного источника такого штамма является подходящим отправным моментом для осуществления способа настоящего изобретения.

Культуральная среда, способная поддерживать рост штамма Penicillium chrysogenum, который продуцирует изопенициллин N, имеет тип, который был бы удобен в обращении для специалиста. Например, выращивание может выполняться по способу глубинной аэробной ферментации, и используемая среда будет выбираться из числа доступных подходящих сред. Типичная среда использует источники углерода, такие как сахароза, глюкоза и крахмал; источники азота, такие как соевая мука и овсяная мука, хлопковое масло, арахисовая мука и различные аминокислоты, их смеси и пептоны. Требования производства придают особое значение выходу и легкости выделения, и, таким образом, предпочтительными средами в такой ситуации могут быть меласса как источник углерода и соевая мука и аминокислоты в качестве источника азота.

К культуральной среде обычно добавляются питательные неорганические соли, и такие соли включают соли, способные дать следующие ионные компоненты: натрий, калий, аммоний, кальций, фосфат, сульфат, хлор-ион, бром-ион, нитрат, карбонат, железо двухвалентное, железо трехвалентное, магний, марганец и т. п. Микроэлементы обычно также существенны для роста, развития и метаболизма Penicillium chrysogenum, и могут быть добавлены непосредственно в культуральную среду, если они не введены уже в качестве примесей, по существу, с другими ингредиентами культуральной среды.

Штаммы Penicillium chrysogenum могут быть получены в оборудовании небольшого объема, таком как встряхиваемые колбы емкостью 1 л, в таком оборудовании желательно получать только небольшие количества 7-ADCA. Когда нужно получить большие количества адипоил-7-ADCA, тогда будут использоваться ферментеры большого размера в условиях глубинной аэробной ферментации.

При осуществлении крупномасштабного получения адипоил-7-ADCA споры Penicillium chrysogenum хранят на "косяках" агара. Споры с агара используют для инокулирования вегетационной среды небольшого объема. Вегетационную среду инкубируют, и получают обильную, свежую, активно растущую культуру микроорганизма. Эту вегетативную поросль затем используют в качестве инокулянта для ферментационной среды большого масштаба. В некоторых случаях может быть желательно включить еще одну, следующую, вегетационную среду в качестве инокулянта для ферментационной среды. Такую вегетационную среду второй фазы обычно используют тогда, когда объем ферментационной среды значительно больше объема первой вегетационной среды. В таком случае споры микроорганизма сначала выращивают в небольшом объеме вегетационной среды, чтобы получить инокулянт для вегетационной среды большего объема. В вегетационной среде большего объема концентрация микроорганизмов становится достаточной, чтобы инициировать быстрое начало ферментации в ферментере большого размера. Вегетационная среда может иметь тот же состав, что и ферментационная среда, или она может содержать дополнительные ингредиенты для стимулирования роста и развития микроорганизма в небольшом объеме.

Штаммы Penicillium chrysogenum, используемые в способе настоящего изобретения, наиболее эффективно выращиваются при 20 - 30^oС, но оптимальный выход будет получен при 22 - 28^oС, предпочтительно при 25^oС.

Максимальное образование адипоил-7-ADCA имеет место тогда, когда штамм Penicillium chrysogenum выращивают в больших резервуарах в течение 10-30 суток, предпочтительно в течение 15-25 суток. Однако, когда выращивание осуществляют в небольшой аппаратуре, такой как встряхиваемые колбы емкостью 250 мл, рост микроорганизма происходит быстрее, и он образует адипоил-7-ADCA за более короткое время, например за 4-15 суток, чаще 5-7 суток.

Если конечная величина рН в ферментерах большого объема достигает 8,0 или выше, это может неблагоприятно воздействовать на выход адипоил-7-ADCA. В таких случаях желательно контролировать величину рН в процессе ферментации. Оказывается, что рН достигает такого уровня раньше времени максимального образования адипоил-7-ADCA, и рН может быть снижена добавлением в ферментационную среду подходящей кислоты или буферного вещества.

Образование адипоил-7-ADCA может быть отслежено хроматографической проверкой образцов ферментационной среды.

При осуществлении глубинной аэробной ферментации через культуральную среду пропускают стерильный воздух, чтобы получить более эффективный рост штамма Penicillium chrysogenum и увеличенное образование адипоил-7-ADCA. Объем воздуха, пропускаемого через культуральную среду, обычно составляет по крайней мере приблизительно 0,2 объема в минуту на объем культуральной среды. Однако увеличение скорости пропускания воздуха часто может оказать благоприятное влияние на получение адипоил-7-ADCA.

Штамм Penicillium chrysogenum, как правило, помимо адипоил-7-ADCA, будет продуцировать много побочных продуктов и метаболитов. Так как некоторые из них являются неустойчивыми кислотами, желательно при извлечении адипоил-7-ADCA из ферментационной среды обрабатывать весь ферментационный бульон до кислой рН на короткое время, чтобы разрушить некоторые из образовавшихся примесей. Адипоил-7-ADCA - продукт ферментации - извлекают из фильтрованного обработанного таким образом ферментационного бульона и затем необязательно отделяют от других компонентов ферментационной среды хроматографией на ионообменной смоле, и далее возможна хроматографическая очистка, если необходимо, перед следующей стадией ферментного отщепления адипоильной боковой цепи. Также возможно осуществить такое ионообменное хроматографическое разделение после того, как осуществят отщепление боковой цепи. Одним из наиболее важных побочных продуктов, который создает проблему при разделении, является адипоил-6-АРА, и, чтобы сделать разделение более легким, возможно разрушить этот побочный продукт химически или ферментативно. Сначала отфильтрованный ферментационный бульон подвергают предварительной очистке, которая может включать экстракцию сначала несмешивающимся с водой органическим растворителем, таким как н-бутанол или амилацетат, чтобы удалить примеси. Экстрагированный бульон затем может быть очищен далее, предварительно, хроматографией над активированным углем.

Добавление адипинатного сырья Предпочтительно во время ферментативного выращивания Penicillium chrysogenum, как описано выше, т. е. перед инокуляцией добавлять к другим ингредиентам ферментативной среды для выращивания адипинатное сырье. Необязательно, адипинатное сырье может быть добавлено в течение некоторого времени после инокуляции, например в 1, 2 и/или 3 день после инокуляции. Адипинатное сырье представляет собой адипиновую кислоту или одну или большее число солей или эфиров адипиновой кислоты, которые способны ассимилироваться и использоваться штаммом Penicillium chrysogenum, который выращивают для продуцирования адипоил-7-АРА. Адипиновая кислота, соли и эфиры могут использоваться по одному или в любом сочетании. Предпочтительна динатриевая соль, хотя походящими являются также соли калия и смешанные соли натрия. Может быть использован метиловый эфир, но этиловый эфир является водо-нерастворимым. Соль или эфир адипиновой кислоты должны быть такими, чтобы они могли быть ассимилированы и утилизованы штаммом Penicillium chrysogenum для получения адипоил-6-АРА. Например, сама адипиновая кислота может быть подходящей, даже хотя она не растворяется в воде, если при подходящей величине рН образуется способная ассимилироваться соль.

Подходящие ферменты экспандазы Штамм Penicillium chrysogenum, который выращен и обеспечен адипинатным сырьем, как описано выше, так что он продуцирует адипоил-6-АРА, является также штаммом, который трансформирован ДНК, кодирующей активность фермента экспандазы, после чего, как результат экспрессии, упомянутая адипоил-6-АРА in situ расширяет кольцо с образованием адипоил-7-ADCA.

Адипоил-6-АРА продуцируется внутриклеточно выращенным с адипинатным сырьем Penicillium chrysogenum. В таком внутриклеточном состоянии, т. е. in situ, трансформированный Penicillium chrysogenum также экспрессирует ДНК, кодирующую активность фермента экспандазы, после чего фермент действует на адипоил-6-АРА как субстрат, и расширяет ее кольцо с образованием адипоил-7-ADCA.

Новый биопроцесс настоящего изобретения включает в свой объем трансформацию штамма Penicillium chrysogenum описанного выше типа с любой ДНК, кодирующей активность фермента экспандазы, после чего, как результат экспрессии, адипоил-6-АРА in situ расширяет кольцо с образованием адипоил-7-ADCA. Таким образом, ДНК, с которой трансформируется Penicillium chrysogenum должна выражать фермент, обладающий не только активностью фермента экспандазы, как это понимается в технике, т. е. способностью расширять кольцо изопенициллина N до DAOC, но способностью расширять кольцо адипоил-6-АРА до адипоил-7-ADCA. Однако на основании подобия боковых цепей ожидается, что любой фермент экспандазы будет способен работать в новом биопроцессе настоящего изобретения.

В разделе описания прототипов уже отмечалось, что фермент экспандазы, происходящий из Streptomyces clavuligerus АТСС 27064, имеет полностью известную последовательность, как и карту эндонуклеазной рестрикции. Однако, как оказалось, тот же фермент, полученный из S. clavuligerus NRRL 3585, как сообщается, имеет другую молекулярную массу, но последовательность не представлена.

Эти ферменты экспандазы, уже идентифицированные в технике, являются пригодными для нового биопроцесса настоящего изобретения. Другие, еще не идентифицированные ферменты экспандазы, происходящие из других штаммов S. clavuligerus, или даже из микроорганизмов других родов, также могут оказаться подходящими для осуществления нового биопроцесса настоящего изобретения. Процедуры идентификации таких новых штаммов и родов пригодных микроорганизмов, как и выделения предполагаемых ферментов экспандазы, и подтверждения, что они являются подходящими для применения в способе настоящего изобретения, являются простыми и доступными для специалистов. Скрининг бесклеточных экстрактов кандидатов в новые штаммы и родов пригодных микроорганизмов может быть сделан надежным и воспроизводимым способом путем добавления упомянутых экстрактов к субстрату адипоил-6-АРА в присутствии известных кофакторов DAOCS, которые включают ионы железа /Fe²⁺/, аскорбат, -категлутарат и аденозинтрифосфат /АТФ/. Субстрат адипоил-6-АРА может быть получен в достаточных количествах при питании адипинатным сырьем нетрансформированного Penicillium chrysogenum по способу, аналогичному способу, подробно описанному далее. Нужный экспандазный фермент присутствует, если образуется адипоил 7-ADCA, присутствие которой может быть установлено методом хроматографии.

Также возможно, используя хорошо известные приемы рекомбинантной техники, генерировать пробы ДНК, основанных на последовательности экспандазы S. clavuligerus и С. acremonium, например, чтобы выделить ДНК-содержимое предполагаемых для применения микроорганизмов, подходящих для продуцирования экспандазы, подходящей для использования в способе настоящего изобретения.

Потенциальные источники ферментов экспандазы Ферменты экспандазы, как уже отмечалось, представляют собой ферменты, которые катализируют расширение пенамного кольца /обнаруженного в молекулах типа пенициллина/ до цеф-3-ем-колец /которые обнаружены в цефалоспоринах/. Любой организм, продуцирующий метаболиты, которые содержат цефемное кольцо, является, следовательно, потенциальным источником ДНК, кодирующей экспандазу. Примеры таких организмов приведены в конце описания, но этот список представлен только для примера и не должен рассматриваться как исчерпывающий.

Экспандазы продуцирующих метаболиты организмов, перечисленные в конце описания, являются только кандидатами для дальнейших исследований, и может оказаться, что не все они будут подходящими для нового способа настоящего изобретения. Например, применение таких ферментов, которые обладают как активностью экспандазы, так и активностью гидроксилазы, таких как ферменты из С. acremonium, могут в результате синтеза дать гидроксилированную адипоил-7-ADCA, т. е. DAC с адипоильной боковой цепью.

Выделение фрагментов ДНК, кодирующих активность экспандазы Сразу же, как только установлено присутствие нужного фермента экспандазы по способу, описанному выше, выясняется, какие методики - простые и хорошо известные в технике - нужны для выделения ДНК, кодирующей активность фермента экспандазы. Конструируют пробы ДНК на основе известных последовательностей и неполных последовательностей генов, кодирующих ферменты экспандазы, которые будут гидридизироваться с низкой кодирующей фермент ДНК, которую выделяют. Составление таких проб основано на знании последовательности аминокислот и нуклеотидных оснований, кодирующей фермент экспандазы, так же, как и предпочтительных кодонов конкретного микроорганизма. Подробное описание типичной процедуры такого типа, используемой для геномной ДНК Streptomyces clavuligerus АТСС 27064, представлено далее.

Выделение ДНК, кодирующей активность фермента экспандазы, сопровождается применением методик рестрикции и лигирования, хорошо известных в технологии рекомбинантной ДНК. Необходимо иметь карту эндонуклеазной рестрикции генома микроорганизма, чтобы можно было получить и выделить подходящий рестрикционный фрагмент. Рестрикционные карты для S. сlavuligerus и С. аcremonium уже доступны, так, в первом случае используют рестрикционные ферменты Bam HI и Sal I, и электрофорез обеспечивает фрагменты нужного размера 1,8-2,2 кb.

Трансформация штамма Penicillium chrysogenum Как только получены фрагменты ДНК, кодирующие активность экспандазы, они могут быть вставлены /лигированы/ в плазмиду или в другой вектор экспрессии, вместе с фрагментами ДНК, включающими промоторы, трансляционные активирующие последовательности, маркеры устойчивости, регуляторные последовательности, элементы космид и любые другие последовательности ДНК, которые делают возможной или способствуют трансформации, стимулируют экспрессию генного продукта и облегчают выделение трансформантов. Вектор экспрессии, который составлен таким образом, затем используют для достижения трансформации штамма Penicillium chrysogenum и внутримолекулярной экспрессии активности фермента экспандазы. Технические приемы для достижения трансформации и экспрессии хорошо известны в технике, и подробное описание таких типичных процедур приводится далее.

Как уже подробно отмечалось выше, штамм трансформированного Penicillium chrysogenum экспрессирует фермент экспандазу внутриклеточно, который затем действует in situ на адипоил-6-АРА-субстрат и расширяет ее кольцо до адипоил-7-ADCA.

Новый трансформант Специфический трансформант Penicillium chrysogenum, экспрессирующий ген экспандазы, который представляет собой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения, является новым относительно таких конструкций, существующих в технике, как конструкция, описанная в Саntwell et al. /1990/ Current Genetic, 17, 213-221. В обоих конструкциях для связывания промотора с геном экспандазы используют мутагенез in vitro. В конструкции Cantwell манипуляция вводит сайт Ndel в АТG гена экспандазы, который лигируют в сайт Хbal в окончании 3' промотора IPNS линкером Xbal/Ndel. В конструкции настоящего изобретения сайт Ncol cоздается в АТG гена экспандазы и легируется в сайт Ncol в окончании 3' линкера IPNS. Это создает в таких конструкциях в местах соединения промотора и гена приведенные в таблице 1 последовательности.

Конструкция Cantwell замещает С на Т, в то время как в конструкции настоящего изобретения С сохраняется; таким образом, последовательность промотора IPNS, непосредственно примыкающая к исходному кодону АТG, точно подходит под пару к той, которая встречается с геном IPNS естественного происхождения. Возможно, что промотор прототипа, хотя он отличается только одним нуклеотидным основанием, может привести к более низкой эффективнос