Соли переходного металла с полипептидом и способ повышения активности полипептида против вич

Соли переходного металла с полипептидом и способ повышения активности полипептида против вич

Реферат

 

Изобретение относится к соединениям соли полипептида, представленного в формуле (I), где А₁, А₂, А₃, А₄, Х, Y и Z имеют значения, представленные в описании, и переходного металла, которые обладают высокой антивирусной активностью против вируса иммунодефицита человека. Описаны также способ повышения активности против ВИЧ соединения полипептида формулы (I), заключающийся в том, что указанный полипептид переводят в соль с переходным металлом, а также фармацевтическая композиция, включающая в себя соединение соли полипетида (I) с переходным металлом, обладающая антивирусной активностью. 3 c. и 4 з.п. ф-лы, 2 табл.

Изобретение касается соли переходного металла с полипептидом, который проявляет сильное сродство к липополисахаридам, в частности к эндотоксинам, и кроме того, изобретение касается способа повышения антивирусной активности (например, активности против ВИЧ) полипептида, посредством которого указанная антивирусная активность проявляется стабильно и сильно, путем преобразования указанного полипептида в соль переходного металла, а также касается фармацевтической композиции или лекарственной композиции для ингибирования ВИЧ-активности, которая включает в себя в качестве активного ингредиента указанную соль переходного металла с полипептидом (которая здесь иногда называется солью полипептида и переходного металла).

Как показано в упоминаемых ниже публикациях, из мечехвостов выделили два семейства антимикробных полипептидов, которые проявляют сродство к эндотоксинам.

См. , например, Shigenaga et al., 1990, J.Biol. Chem., 265:21350-21354; Kawano et al., 1990, J.Biol. Chem., 265:15365-15367; Muta et al., 1990, J. Biochem., 108:261-266; выложенная заявка на патент Японии 167230/1990; выложенная заявка на патент Японии 1152987/1990; выложенная заявка на патент Японии 53799/1990; патент США номер 5068314 (опубликованная заявка с проведенным патентным поиском 500194/1990); Miyata et al., 1989, J.Biochem., 106: 663-668; Akaji et al., 1989; Chem. Pharm. Bull. 37:2661:2664; Tokunaga and Iwanaga, 1989, Taisha (Metabolism), 26:429-439); Shieh et al., 1989, FEBS Lett., 252:121-124; Nakamura et al., 1988, J. Biol. Chem., 263:16709-16713.

Одно семейство - семейство тахиплесинов - выделили из японского меченосца Tachypleus. Идентифицировали три тахиплесина I, II и III. Другое семейство - семейство полифемузинов - выделили из американского меченосца Limulus polyphemus. Идентифицировали два полифемузина I и II.

Было установлено, что оба указанные семейства тахиплесины и полифемузины ингибируют рост как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий при низких концентрациях, а также грибков, таких как Candida albicans, и образуют комплексы с бактериальным липополисахаридом (Shigenaga et al., 1990, J. Biol. Chem., 265:21350-21354; Muta et al., 1990, J. Biochem., 108:261-266).

Было также установлено, что полипептид семейства тахиплесинов оказывает ингибирующее действие на вирусы, такие как вирус гриппа, вирус везикулярного стоматита (Murakami et al., 1991, Chemotherapy, 37, 327-334) или вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) (Morimoto et al., 1991, Chemotherapy, 37, 206-211).

С другой стороны, с точки зрения выживания высокоразвитых человеческих существ чрезвычайно необходима разработка лекарств, которые могут оказать профилактическое или терапевтическое действие в отношении синдрома приобретенного иммунодефицита человека (СПИДа), вызываемого заражением вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ).

Авторы настоящего изобретения в результате исследований по корреляции между структурным преобразованием полипептида, обладающего сродством к эндотоксину, и его активностью против ВИЧ открыли серию неизвестных ранее полипептидов, которые принципиально отличаются от обычной структуры полипептида меченосцев и проявляют высокую степень активности против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), и эти результаты были опубликованы в нижеуказанных публикациях (Nakashima et al. , 1992, Antimicrob. Agents Chemother., 36: 1249-1255; Masuda et al., 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun., 189:845-850; Tamamura et al. , 1993, Chem. Pharm. Bull., 41:978-980; Tamamura et al., 1993. Biochem. Biophys. Acta, 1163:209-216; Masuda et al., 1992, J. Pharmacobio. Dyn. , 15: s-90; патент США 5571892 (международная публикация WO 92/04374); патент США 5449752 (выложенная заявка на патент Японии 163298/1993)).

В результате изучения требований к структуре, связанных с экспрессированием активности полипептида против ВИЧ, на основе базовой структуры полипептида, полученного из меченосцев, который состоит из 16-18 аминокислотных остатков, авторы настоящего изобретения разработали и представили в качестве изобретения неизвестную ранее концепцию, в которой фокусируется внимание на минимально необходимой структуре (Международная заявка WO 95/10534).

В соответствии с вышеупомянутым изобретением структурная концепция взятого в качестве примера соединения - полипептида, происходящего из полипептида меченосцев как стандартного материала и проявляющего антивирусную активность, может быть выражена с помощью нижеприведенной формулы [I] (в которой A₁ независимо представляет собой остаток основной аминокислоты, выбранной из Lys (лизина), Аrg (аргинина) и Оrn (орнитина); остаток пептида, имеющий, по меньшей мере, два из указанных остатков основных аминокислот; или остаток N--замещенной аминокислоты или остаток N--замещенного пептида, в которых атом водорода в N--положении остатка аминокислоты, находящийся в амино-конце указанного остатка основной аминокислоты или указанного остатка пептида, может быть заменен на ацильную группу или на группу замещенного тиокарбамоила; A₂ независимо представляет собой остаток аминокислоты, выбранной из Phe (фенилаланина), Тrр (триптофана) и Туr (тирозина); А₃ независимо представляет собой остаток основной аминокислоты, выбранной из Lys, Arg и Orn; А₄ представляет собой -ОН (происходящий из карбоксильной группы) или -NH₂ (происходящий из группы кислого амида); Х представляет собой пептидный остаток из двух аминокислотных остатков, где в следующем положении одного остатка аминокислоты, выбранной из А1а (аланина), Val (валина), Leu (лейцина), Ilе (изолейцина), Sеr (серина), Met (метионина) и Суs (цистеина), одна из аминокислот из A₂ присоединена через пептидную связь; Y представляет собой пептидный остаток из двух аминокислотных остатков, который состоит из комбинации остатка Gly (глицина) и одного остатка аминокислоты, выбранной из А₃, или пептидный остаток из двух аминокислотных остатков, который состоит из комбинации остатка Pro (пролина) и остатка одной аминокислоты, выбранной из D-Arg, D-Lys и С-Оrn; Z представляет собой пептидный остаток из двух аминокислотных остатков, где в следующем положении одного остатка аминокислоты, выбранной из Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Met и A₂, Cys присоединен через пептидную связь; и остаток X-Y-Z, соединенный пептидными связями, присоединен к каждому аминокислотному остатку в 6-м и 10-м положениях через пептидные связи, или из-за конкурентной делеции Х и Z, остаток Y может быть присоединен напрямую к каждому аминокислотному остатку в 6-м и 10-м положениях через пептидные связи, где атом водорода находящейся в боковой цепи -аминогруппы D-Lys, L-Lys, D-Orn или L-Orn, являющийся составной частью аминокислоты из Y, может быть замещен -аминоацильной группой.

Уже установлено, что полипептиду, имеющему структуру вышеупомянутой формулы [I] , в дополнение к высокой активности против ВИЧ можно также придать свойство сохранять эту активность при модификации специфического сайта без снижения активности и при этом за счет такой модификации полипептид получает новые свойства, что позволяет иметь широкий выбор разнообразных физических и/или химических свойств и возможностей терапевтического использования, на основе свойств, которые имеет базовая структура, например, можно увеличивать или уменьшать гидрофильность или липофильность, селективно аккумулировать его в конкретной ткани, органе или клетке, увеличивать или уменьшать время удерживания его в организме или разрабатывать лекарственные формы со стандартными дозировками. В таблице 1 приведены примеры тех полипептидов формулы [I], которые проявляют высокую активность против ВИЧ.

Авторы настоящего изобретения сделали это изобретение на основе полученного ими факта, что образование соли между полипептидом формулы [I] и соединением переходного металла позволяет проявлять и стабильно сохранять высокую активность полипептида против ВИЧ, и на основе выяснения причины того, почему полипептид, показанный в формуле [I], специфически проявляет активность против ВИЧ.

Первой целью настоящего изобретения является создание не существовавшей ранее соли переходного металла с полипептидом, который проявляет высокую антивирусную активность и имеет специфическую структурную формулу, а вторая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы посредством преобразования указанного полипептида в соль переходного металла создать способ повышения физиологической активности, особенно антивирусной активности, такой как активность против ВИЧ, а также способ проявления фармацевтически стабильной активности в качестве терапевтического средства, а также создать лекарственную композицию.

Настоящее изобретение касается соединения соли переходного металла с полипептидом, показанным в формуле [I], который проявляет сильное сродство к липополисахаридам, в частности к эндотоксинам, и кроме того, настоящее изобретение касается способа повышения антивирусной активности (например, активности против ВИЧ) этого полипептида, в результате чего она проявляется стабильно и сильно, посредством преобразования указанного полипептида в соль переходного металла.

В частности, настоящее изобретение касается: (1) соединения, являющегося солью переходного металла с полипептидом, показанного в следующей формуле: (в которой A₁ независимо представляет собой остаток основной аминокислоты, выбранный из Lys, Arg и Orn; остаток пептида, имеющий, по меньшей мере, два из указанных остатков основных аминокислот; или остаток N--замещенной аминокислоты или остаток N--замещенного пептида, в которых атом водорода в N--положении аминокислотного остатка в амино-конце указанного остатка основной аминокислоты или указанного остатка пептида может быть заменен ацильной группой или группой замещенного тиокарбамоила; A₂ независимо представляет собой остаток аминокислоты, выбранной из Phe, Trp и Туr; А₃ независимо представляет собой остаток основной аминокислоты, выбранной из Arg, Lys и Orn; А₄ представляет собой -ОН (происходящий из карбоксильной группы) или -NH₂ (происходящий из группы кислого амида); Х представляет собой пептидный остаток двух аминокислотных остатков, где в следующем положении одного остатка аминокислоты, выбранной из Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Met и Cys, одна из аминокислот из А₂ присоединена через пептидную связь; Y представляет собой пептидный остаток двух аминокислотных остатков, который состоит из комбинации остатка Gly и остатка одной аминокислоты, выбранной из А₃, или пептидный остаток двух аминокислотных остатков, который состоит из комбинации остатка Pro и остатка одной аминокислоты, выбранной из D-Arg, D-Lys и D-Orn; Z представляет собой пептидный остаток двух аминокислотных остатков, где в следующем положении одного остатка аминокислоты, выбранной из Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Met и А₂, Cys присоединен через пептидную связь; и остаток X-Y-Z, соединенный пептидными связями, присоединен к каждому аминокислотному остатку в 6-м и 10-м положениях пептидными связями, или в результате конкурентной делеции Х и Z, остаток Y может быть присоединен напрямую к каждому аминокислотному остатку в 6-м и 10-м положениях пептидными связями, где атом водорода находящейся в боковой цепи -аминогруппы D-Lys, L-Lys, D-Orn или L-Orn, являющийся составной частью аминокислоты из Y, может быть замещен -аминоацильной группой, или кислот соли присоединения указанного соединения соли переходного металла с полипептидом и кислоты; (2) соединения соли переходного металла с полипептидом или кислот соли присоединения указанной соли переходного металла с полипептидом по п.(1), в котором соль переходного металла представляет собой комплексную соль; (3) соединения соли переходного металла с полипептидом или кислот соли присоединения указанной соли переходного металла с полипептидом по пп. (1) или (2), в котором переходный металл выбирают из группы, состоящей из группы железа в составе Fe, Co и Ni, группы меди в составе Сu, Аg и Аu, группы цинка в составе Zn, Cd и Нg, группы марганца в составе Мn, Тc и Re; (4) способа повышения и экспрессирования высокой и стабильной активности против ВИЧ соединения полипептида, показанного в следующей формуле: (в которой A₁ независимо представляет собой остаток основной аминокислоты, выбранной из Lys, Arg и Orn; остаток пептида, имеющий, по меньшей мере, два из указанных остатков основных аминокислот; или остаток N--замещенной аминокислоты или остаток N--замещенного пептида, в которых атом водорода в N--положении аминокислотного остатка, находящийся в амино-конце указанного остатка основной аминокислоты или указанного остатка пептида, может быть заменен на ацильную группу или на группу замещенного тиокарбамоила; А₂ независимо представляет собой остаток аминокислоты, выбранной из Phe, Trp и Туr; А₃ независимо представляет собой остаток основной аминокислоты, выбранной из Arg, Lys и Оrn; А₄ представляет собой -ОН (происходящий из карбоксильной группы) или -NH₂ (происходящий из группы кислого амида); Х представляет собой пептидный остаток двух аминокислотных остатков, где в следующей позиции одного остатка аминокислоты, выбранной из Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Met и Суs, одна из аминокислот из А₂ присоединена через пептидную связь; Y представляет собой пептидный остаток двух аминокислотных остатков, который состоит из комбинации остатка Gly и остатка одной аминокислоты, выбранной из А₃, или пептидный остаток двух аминокислотных остатков, который состоит из комбинации остатка Pro и остатка одной аминокислоты, выбранной из D-Arg, D-Lys и D-Orn; Z представляет собой пептидный остаток двух аминокислотных остатков, где в следующем положении одного остатка аминокислоты, выбранной из Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Met и A₂, Cys присоединен через пептидную связь; и остаток X-Y-Z, присоединенный пептидными связями, присоединен к каждому аминокислотному остатку в 6-м и 10-м положениях пептидными связями, или из-за одновременно действующей делеции Х и Z, остаток Y может быть присоединен напрямую к каждому аминокислотному остатку в 6-м и 10-м положениях пептидными связями, где атом водорода находящейся в боковой цепи -аминогруппы D-Lys, L-Lys, D-Orn или L-Orn, являющийся составной частью аминокислоты из Y, может быть замещен -аминоацильной группой посредством преобразования указанного полипептида [I] в соль с переходным металлом; (5) фармацевтической композиции или лекарственной композиции, включающей в себя эффективное количество соединения соли переходного металла с полипептидом или кислотной соли присоединения указанного соединения соли переходного металла с полипептидом согласно (1) и фармацевтический носитель; (6) композиции по п. (5), ингибирующей вирусную активность; и (7) композиции по п.(5), ингибирующей активность ВИЧ у пациента.

В качестве примеров ацильных групп, на которые может быть заменен атом водорода в вышеупомянутом положении N-, приведены ацильные группы, имеющие от 2 до 18 атомов углерода, и в частности ацетильная группа, пропионильная группа, бутирильная группа, гексаноильная группа, октаноильная группа, деканоильная группа, лауроильная группа, миристоильная группа, пальмитоильная группа, стеароильная группа, никотиноильная группа и подобные им. В качестве примеров замещающих групп, которые могут быть использованы вместо групп замещенного тиокарбамоила, которые, в свою очередь, могут замещать атом водорода в вышеупомянутом положении N-, приведены флуоресцеиновая группа, фенильная группа, группа замещенного фенила (например, диметиламинофенил-азофенильная группа) и подобные им.

В качестве примеров -аминоацильных групп, которые могут замещать атом водорода находящейся в боковой цепи -аминоацильной группы D-Lys, L-Lys, D-Orn или L-Orn, который является составной частью аминокислоты вышеупомянутого Y, приведены -аминоацильная группа, имеющая от 2 до 6 атомов углерода, и особенно -аминоацетильная группа, -аминобутирильная группа, -аминогексаноильная группа и подобные им.

В приведенной здесь последовательности полипептида каждый символ представляет собой остаток аминокислоты или остаток замещенной аминокислоты, обозначенный в соответствии с международно принятой трехбуквенной аббревиатурой, и кроме особо оговоренных случаев, этот остаток аминокислоты или остаток замещенной аминокислоты представляет собой L-форму. Например, каждый символ представляет собой нижеследующую аминокислоту или замещенную аминокислоту: Ala, Arg, Cys, Ile, Gly, Leu, Ser, Met, Lys, Orn, Phe, Pro, Trp, Tyr, Val, DArg, DLys, Dorn, Ac-Arg (N--ацетиларгинин), FTC-Arg (N--флуоресцеин тиокарбамоил аргинин), Laur-Arg (N-- лауроил аргинин), Myr-Arg (N--миристоил аргинин), Nicot-Arg (N--никотиноил аргинин), Oct-Arg (N--октаноил аргинин), Parm-Arg (N--пальмитоил аргинин), Parm-Orn (N--пальмитоил орнитин), PTC-Arg (N--фенилтиокарбамоил аргинин), -N-Ac-Dlys(-N--аминоацетил-D-лизин)и-N-But-Dlysаминобутирил-D-лизин).

Настоящее изобретение, которое было выполнено на основе вышеизложенных точек зрения, касается соли полипептида, включающей в себя соль переходного металла, выбранного из группы, состоящей из группы железа, группы меди, группы цинка и группы марганца, и полипептид, показанный в нижеследующей формуле: (в которой A₁ независимо представляет собой остаток основной аминокислоты, выбранной из Lys (лизина), Аrg (аргинина) и Оrn (орнитина); остаток пептида, имеющий, по меньшей мере, два из указанных остатков основных аминокислот; или остаток N--замещенной аминокислоты или остаток N--замещенного пептида, в которых атом водорода в N--положении аминокислотного остатка, находящийся на амино-конце указанного остатка основной аминокислоты или указанного остатка пептида, может быть заменен на ацильную группу или на группу замещенного тиокарбамоила; A₂ независимо представляет собой остаток аминокислоты, выбранной из Phe, Trp и Туr; А₃ независимо представляет собой остаток основной аминокислоты, выбранной из Аrg, Lys и Оrn; А₄ представляет собой -ОН (происходящий из карбоксильной группы) или -NH₂ (происходящий из группы кислого амида); Х представляет собой пептидный остаток из двух аминокислотных остатков, где в следующем положении одного остатка аминокислоты, выбранной из Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Met и Суs, одна из аминокислот из А₂ присоединена через пептидную связь; Y представляет собой пептидный остаток двух аминокислотных остатков, который состоит из комбинации остатка Gly и остатка одной аминокислоты, выбранной из А₃, или пептидный остаток двух аминокислотных остатков, который состоит из комбинации остатка Pro и остатка одной из аминокислот, выбранной из D-Arg, D-Lys и D-Orn; Z представляет собой пептидный остаток двух аминокислотных остатков, где в следующем положении одного остатка аминокислоты, выбранной из Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Met и А₂, Суs присоединен через пептидную связь; и остаток X-Y-Z, присоединенный через пептидную связь, присоединен к каждому аминокислотному остатку в 6-м и 10-м положениях через пептидные связи, или в результате конкурентной делеции Х и Z, остаток Y может быть присоединен напрямую к каждому аминокислотному остатку в 6-м и 10-м положениях через пептидные связи, где атом водорода находящейся в боковой цепи -аминогруппы D-Lys, L-Lys, D-Orn или L-Orn, являющийся составной частью аминокислоты из Y, может быть замещен -аминоацильной группой), а также касается соли указанного полипептида, в которой соль переходного металла является комплексной солью, и целью настоящего изобретения является посредством преобразования указанного полипептида формулы [I], имеющего высокую активность против ВИЧ, в продукт в виде соли, создать способ повышения и стабилизации активности этого полипептида.

Ранее не существовавшее соединение соли переходного металла с полипептидом согласно изобретению ниже описывается более подробно.

ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ Полипептид, показанный в формуле [I] настоящего изобретения, можно непосредственно получить известными способами, например с помощью метода твердофазного синтеза, описанного в "Solid Phase Peptide Synthesis", Stuart&Young, Pierce Chemical Co. , Rockford, Illinois (1984). В случае остатка N--ацилоаминокислоты или остатка N--ацилпептида, где атом водорода в N--положении на амино-конце остатка аминокислоты заменен ацильной группой в A₁ формулы [I] , полипептид с прямой цепью формулы [I] связывают с нерастворимым полимером, для того, чтобы получить полипептидный полимер, и осуществляют реакцию указанного полипептидного полимера с ангидридом карбоновой кислоты или с карбоновой кислотой, соответствующими ацильной группе, с использованием конденсирующего агента, для того, чтобы ацилировать указанную N-концевую аминогруппу и получить N-ацилированный полипептидный полимер. Затем этот нерастворимый полимер и защитные группы из аминокислот удаляют и получают полипептид с прямой цепью формулы [I]. В случае остатка N--замещенной тиокарбамоильной аминокислоты или остатка N--замещенного тиокарбамоильного пептида, где атом водорода в N--положении в аминном конце остатка аминокислоты заменен тиокарбамоильной группой в A₁ формулы [I], N-концевой N--замещенный тиокарбамоильный полипептид согласно изобретению может быть получен посредством реакции вышеупомянутого полипептида с соединением замещенного изотиоцианата, осуществленной в условиях слабощелочной среды.

У полученного таким образом полипептида карбоксильный конец аминокислотного остатка в 14-м положении может быть либо свободным (А₄ соответствует -ОН), либо преобразованным в кислый амид (А₄ соответствует -NH₂).

За исключением особо оговоренных случаев, индивидуальные аминокислоты, используемые в вышеупомянутом методе твердофазного синтеза, находятся в L-форме, а основная аминокислота, спаренная с пролином в 8-м положении, обозначенная через Y, ограничена D-формой.

В качестве альтернативы полипептид согласно изобретению может быть также получен способом, предусматривающим использование рекомбинантной ДНК. В соответствии с этим способом последовательности, кодирующие нуклеотиды для полипептида согласно изобретению, можно клонировать и экспрессировать посредством методов, хорошо известных специалистам в данной области техники.

См. , например, Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory anual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1991.

Полипептид согласно изобретению можно выделить и очистить с помощью методов, известных в области техники, связанной с полипептидами, например, таких как экстрация, перекристаллизация, различные виды хроматографии (гельфильтрационная, ионообменная, распределительная, адсорбционная хроматография, хроматография с обращенной фазой), электрофорез, метод противоточного распределения и т.п., и среди них наиболее эффективным является метод жидкостной хроматографии высокого разрешения с обращенной фазой.

В качестве примеров работ, в которых описаны такие способы изготовления, можно сослаться на следующие публикации: патент США 5571892 (международная заявка WO 92/04374); Патент США 5449752 (выложенная заявка на патент Японии 163298/1993) и международная публикация WO 95/10534.

Полипептид, показанный в формуле [I], содержит в своей молекуле остатки цистеина, аргинина и лизина, и согласно стереоструктурной информации, по меньшей мере, одна пара остатков цистеина или остатков аргинина принимает такую конформацию, что боковая цепь -SH или гуанидиновая боковая цепь непосредственно располагается на той же самой стороне в стереоструктуре, так что указанная боковая цепь способна стабильно образовывать комплексную соль с соединением переходного металла. Однако указанный полипептид обычно принимает окисленную форму -S-S, поэтому предпочтительно, чтобы указанный полипептид предварительно изменили до восстановленной (-SH) формы, что облегчит образование комплексной соли с переходным металлом.

Например, комплексную соль с переходным металлом можно получить путем добавления к водному нейтральному раствору указанной восстановленной формы полипептида, по меньшей мере, двух эквивалентов соли переходного металла, предпочтительно водорастворимой соли переходного металла и органической или неорганической кислоты (например, ацетата цинка).

Соединение соли переходного металла с полипептидом, показанным в формуле [I] настоящего изобретения, проявляет чрезвычайно сильную основность.

Благодаря этой сильной основности соль присоединения образуют путем добавления кислоты. Образуют соль с фармацевтически пригодной кислотой, например с неорганической кислотой, такой как соляная кислота, бромистоводородная кислота, фосфорная кислота, азотная кислота, серная кислота и подобные им, с органической карбоновой кислотой, такой как уксусная кислота, с галогенизированной уксусной кислотой, такой как трифторуксусная кислота, пропионовая кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, лимонная кислота, винная кислота, салициловая кислота и подобные им, с кислыми сахарами, такими как глюкуроновая кислота, галактуроновая кислота, глюконовая кислота, аскорбиновая кислота и подобные им, с кислыми полисахаридами, иногда включающими в себя сульфаты полисахаридов, такими как гиалуроновая кислота, хондроитинсульфаты, альгиновая кислота и подобные им, с органическими сульфоновыми кислотами, такими как метансульфоновая кислота, р-толуолсульфоновая кислота и подобные им. Соль переходного металла с полипептидами, показанными в формуле [I] настоящего изобретения, можно использовать для приготовления лекарственной композиции, в качестве соли присоединения с указанной фармацевтически пригодной кислотой.

ПРИМЕНЕНИЕ СОЕДИНЕНИЯ СОЛИ ПЕРЕХОДНОГО МЕТАЛЛА С ПОЛИПЕПТИДОМ СОГЛАСНО ИЗОБРЕТЕНИЮ Соединение соли переходного металла с полипептидом формулы [I] имеет свойство связывать эндотоксины, обладает антибактериальной активностью и способностью гемолизировать форменные элементы крови, чувствительные к эндотоксинам. Кроме того, соединение соли переходного металла с полипептидом согласно изобретению обладает чрезвычайно высокой антивирусной активностью. В конкретном варианте осуществления изобретения соединение соли переходного металла с полипептидом согласно изобретению обладает активностью против ВИЧ. Лекарство, в частности средство против ВИЧ, согласно изобретению можно приготовить в виде лекарственной композиции, включающей в себя соединение соли переходного металла с полипептидом, показанным в формуле [I], или соль присоединения указанного соединения соли переходного металла и полипептида с фармацевтически пригодной кислотой в качестве эффективного компонента, а также фармацевтически пригодный носитель, выбранный в соответствии со способом назначения и способом приема лекарственного средства. В качестве примеров фармацевтически пригодных носителей приведены физиологически совместимые буферы, такие как растворы Хэнкса или Рингера, физиологический раствор, физиологический раствор глюкозы или их смесь, а также гепаринизированный раствор из лимонной кислоты, цитрата натрия и декстрозы. Средство против ВИЧ согласно изобретению назначают для приема внутрь или для парентерального введения, в зависимости от объекта, против которого проводят лечение, или для дезинфекции от вирусной болезни внутри тела, либо для дезинфекции пораженных вирусом наружных участков тела, таких как поверхность тела, и его можно приготовить в такой препаративной форме как порошок, гранулы, раствор для инъекций или для приема внутрь, таблетки, суппозитории, пессарии, мазь, крем или аэрозоль, с использованием подходящего фармацевтически пригодного носителя, в соответствии со способом назначения и приема лекарственного средства.

В случае, когда средство против ВИЧ согласно изобретению назначают пациенту напрямую в виде инъекций, то полипептид или его соль согласно изобретению растворяют в физиологическом растворе и вводят постоянно или прерывисто в количестве от 10 до 5000 мг на кг веса тела человека в день или путем внутривенного вливания через капельницу.

ПРИМЕРЫ Ниже показаны примеры осуществления настоящего изобретения, которые не исчерпывают объема данного изобретения.

В нижеприведенных примерах описаны примеры получения солей переходного металла с полипептидом (1) и полипептидом (2) и приведены результаты анализов на активность против ВИЧ для солей переходного металла с полипептидом согласно изобретению, а также для известных полипептидов, обладающих сродством к эндотоксинам.

ПРИМЕР 1: ПОЛУЧЕНИЕ КОМПЛЕКСНОЙ СОЛИ ЦИНКА С ПОЛИПЕПТИДОМ (1) Следующий полипептид (1) (см. в конце описания) синтезировали и получили с помощью способа, описанного в патенте США 5571892 (международная публикация WO 92/04374) и в патенте США 5449752 (выложенная заявка на патент Японии 163298/1993).

1.1. ПОЛУЧЕНИЕ ВОССТАНОВЛЕННОЙ ФОРМЫ ПОЛИПЕПТИДА (1) Ацетат полипептида (1) (10,2 мг, 3,37 мкмоль), полученный в соответствии с вышеупомянутой международной публикацией РСТ, растворяли в очищенной воде (0,5 мл). К этому раствору добавляли дитиотрейтол (производства корпорации Сейкагаку) (26,0 мг, 169 мкмоль), в количестве 50-кратного эквивалента по отношению к полипептиду (1), промывали газообразным азотом и перемешивали в потоке азота при комнатной температуре в течение двух часов. Ход указанной реакции восстановления отслеживали с помощью ВЭЖХ, чтобы подтвердить окончание процесса восстановления.

После завершения реакции восстановления указанный реакционный раствор загружали в колонку (2,5 х 70 см) с сефадексом G-25 (тонкий), (производства компании фармация Биотех. К^o Лтд.), который предварительно уравновешивали водным раствором 25%-ной уксусной кислоты, извлекли из адсорбента с помощью того же самого водного раствора 25%-ной уксусной кислоты и затем подвергли фракционированию (1 фракция = 224 капли). Фракционные порции с номерами фракций 26 и 27, которые проявили положительную реакцию Элльмана (G.L.Ellman, Arch. Biochem. Biophys. , 82, 70 (1959); способ обнаружения тиоловых групп) и при реакции флуоресценции (A.M.Felix et al., J. Chromatogr., 89, 361 (1974), способ флуоресцентного обнаружения аминогрупп), собирали раствор указанных фракций, концентрировали в условиях вакуума и после разбавления водным раствором 10%-ной уксусной кислоты этот раствор подвергали лиофилизации и в результате получали желаемый ацетат восстановленной формы полипептида (1), что и требовалось.

Выход: 6,8 мг (67%).

1.2. АНАЛИЗ ВОССТАНОВЛЕННОЙ ФОРМЫ ПОЛИПЕПТИДА (1) Ацетат восстановленной формы полипептида (1), полученный в разделе 1.1, подвергали кислотному гидролизу в 4М метансульфоновой кислоте, содержащей 0,2% триптамина, при 115^oС в течение 24 часов, по методу Лю и др. (T.-Y. Liu et al. , J.Biol. Chem., 251, 1936 (1976)). Его аминокислотный состав хорошо согласовывался с аминокислотным составом восстановленной формы полипептида (1).

Удельное оптическое вращение []²⁰D полученного ацетата восстановленной формы полипептида (1) составило -26,0^o (с = 0,09, водный раствор 1М уксусной кислоты).

Более того, полученный ацетат восстановленной формы полипептида (1) показал единственный пик при анализе методом ВЭЖХ при нижеследующих условиях.

УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА МЕТОДОМ ВЭЖХ И ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ Колонка: TSK-гель ОДС - 120 Т (0,46 15 см) (Тосо К⁰., Лтд) + TSK жесткий гель ОДС - 120 Т (0,32 1,5 см) (Тосо К⁰., Лтд).

Градиентное элюирование: Элюенты: 10% ацетонитрил / 0,1% трифторуксусная кислота (раствор A).

80% ацетонитрил / 0,1% трифторуксусная кислота (раствор B).

Условия градиента: Время градиента: 1,0 мин; 29,4 мин; 35,0 мин.

Концентрация раствора В соответственно: 0%; 42%; 100%.

Концентрация раствора А соответственно: 10%; 39,4%; 80%.

Температура: 40^oС.

Расход: 0,8 мл/мин.

Обнаружение: 220 нм и 280 нм.

Использованное количество: 5 мкл (концентрация пептида: 1 мг/мл).

Время элюирования: ацетат восстановленной формы полипептида (I): 19,27 мин, ацетат полипептида (I): 18,24 мин.

1.3. ПОЛУЧЕНИЕ КОМПЛЕКСНОЙ СОЛИ ВОССТАНОВЛЕННОЙ ФОРМЫ ПОЛИПЕПТИДА (1) И ИОНА ЦИНКА (II) Ацетат восстановленной формы полипептида (1), полученный в разделе 1.1., растворяли в очищенной воде или в 1М буферном растворе ацетата аммония (рН 7.2).

К этому водному раствору или буферному раствору добавляли водный раствор 0,005 М ацетата цинка, соответствующий двум эквивалентам иона цинка (II) по отношению к восстановленной форме полипептида (1). Окончательную концентрацию полипептида довели до 5 мг/л и получили комплексный раствор восстановленной формы полипептида (1) и иона цинка (II).

1.4. ПОДТВЕРЖДЕНИЕ СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСНОЙ СОЛИ ВОССТАНОВЛЕННОЙ ФОРМЫ ПОЛИПЕПТИДА (1) И ИОНА ЦИНКА (II) С ПОМОЩЬЮ ИОННО-РАСПЫЛИТЕЛЬНОЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ Порцию комплексного раствора восстановленной формы полипептида (1) и иона цинка (II), полученного в разделе 1.3, использовали в качестве тестируемого раствора для структурного анализа и провели структурный анализ методом ионно-распылительной масс-спектрометрии при нижеследующих условиях.

УСЛОВИЯ ИОННО-РАСПЫЛИТЕЛЬНОЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ Оборудование: трехстадийный квадрупольный масс-спектрометр типа АР IIIE (изготовитель - Перкин-Эльмер Сайекс К⁰., Лтд., обслуживание - Такара Шузо К⁰., Лтд).

Инфузия образца: для инфузии образца со скоростью расхода в 5 мкл/мин использовали шприцевый насос для инфузии 22 Харвард Аппаратус (Саут Нейтик, МАСС).

Напряжение на диафрагме: 130 вольт.

Область масс-спектров и тому подобное: масса против электрического заряда (m/z) 600 - 1800 (в положительном режиме ионов, с шагом в 0,5 атомных единиц массы, в среднем из 30 циклов сканирования).

Анализ полученных данных проводили с помощью Масsрес 3/22 (Sciex).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИОННО-РАСПЫЛИТЕЛЬНОЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ Измеряли значения массы для состояния зарядов +2 и +3 (m/z: 1277,00 и 851,67 соответственно), и реконструированное значение массы (m/z: 2552,48) хорошо согласовывалось с расчетным значением массы для восстановленного полипептида (1) + Zn - 4Н (m/z: 2552,40).

Иначе говоря, было показано, что полипептид (1) и ион цинка (II) образуют комплекс, в котором соотношение пептид: Zn равно 1:1.

ОБСУЖДЕНИЕ Уже сообщалось, что структуру комплекса, состоящего из пептида или белка и металла, можно идентифицировать с помощью ионно-распылительной масс-спектрометрии или электрораспылительной масс-спектрометрии. Например, см. анализ цинков