Штамм bacillus anthracis km 91 - основа для генетического конструирования продуцентов сибиреязвенных антигенов

Патент 2180350

Авторы

Классы МПК

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии, генетике, конструировании продуцентов сибиреязвенных антигенов и других биологически активных веществ, входящих в состав химических сибиреязвенных вакцин и диагностических препаратов. Получен стабильный аспорогенный штамм B.anthracis с низкой активностью протеолитических ферментов и отсутствием антибиотикорезистентности для использования в качестве основы при конструировании продуцентов сибиреязвенных антигенов и других биологически активных веществ. Штамм сохраняет свойства при хранении, культивировании на питательных средах и в результате пассажей через организм лабораторных животных. Аспорогенность штамма дает преимущество при дальнейшем использовании сконструированных на его основе продуцентов сибиреязвенных антигенов и других биологически активных веществ, так как отсутствует вероятность обсеменения рабочих помещений, лабораторного и промышленного оборудования спорами возбудителя сибирской язвы. Штамм обладает низкой активностью протеолитических ферментов, разрушающих белковые препараты на этапах их выделения и очистки, что обеспечивает оптимальный выход белковых сибиреязвенных антигенов и исключает необходимость применения ингибиторов протеаз. Штамм характеризуется отсутствием резистентности к антибиотикам, что может быть важным при генетическом конструировании и последующем использовании аспорогенных штаммов B.anthracis.

Известны примеры конструирования штаммов, синтезирующих сибиреязвенные антигены, на основе бесплазмидных штаммов Bacillus anthracis. Так Barnard J. и Friedlander А. использовали в качестве основы для конструирования продуцентов протективного антигена (основного антигена, входящего в состав сибиреязвенных вакцин) бесплазмидные штаммы В. anthracis DeltaANR и В. anthracis DeltaSterne (Barnard J., Friedlander A. // Infect. Immun. - 1999. - V. 67. - Р. 562-567).

Известны примеры конструирования штаммов-продуцентов сибиреязвенного протективного антигена на основе гетерогенного бесплазмидного штамма Bacillus subtilis WB600 (Baillie L., Moir A., Manchee R. // J. Appl. Microbiol. - 1998. - V. 84. - P. 741 - 746; Miller J., McBride В., Manchee R., Moore P., Baillie L. // Lett. Appl. Microbiol. -1998. - V. 26. - Р. 56-60). Особенностью штамма В. subtilis WB600 является низкая активность протеолитических ферментов, разрушающих протективный антиген на этапах выделения и очистки.

Однако перечисленные выше штаммы - основы для генетического конструирования, как и все представители рода Bacillus, являются спорообразующими. Способность сибиреязвенного микроба к образованию спор при культивировании в лабораторных или промышленных условиях требует соблюдения строгих правил безопасности работы, пренебрежение которыми может привести к обсеменению помещения и оборудования спорами В. anthracis - возбудителя опасного инфекционного заболевания, сибирской язвы. Споры - основная форма сохранения В. anthracis в объектах внешней среды. В воде они сохраняются до 18 лет, в почве - до 300 лет и более. При температуре 120-140^oС споры погибают только через 2-3 ч. Обычные обеззараживающие средства, принятые для работы с необразующими спор видами, на них не действуют. При попадании в благоприятные условия споры прорастают и образуют полноценные вегетативные клетки. Следовательно, использование в качестве основы для генетического конструирования продуцентов биологически активных веществ, в том числе сибиреязвенных антигенов, штамма В. anthracis, не способного к образованию спор (аспорогенного), более целесообразно.

Известен пример клонирования гена сибиреязвенного протективного антигена в аспорогенном бесплазмидном штамме В. anthracis (Farchaus J., Ribot W., Jendrek S., Little S. // Appl. Environ Microbiol. - 1998. - V. 64. - P. 982-991).

Однако данный аспорогенный штамм обладает высокой активностью протеолитических ферментов, разрушающих синтезируемые белковые антигены. Активность протеолитических ферментов, приводящая к частичной потере выделяемого белка, является серьезной проблемой получения и очистки белковых препаратов. Для купирования разрушающего действия протеолитических ферментов на белковый препарат необходимо использование ингибиторов протеаз и специальных сред выращивания, что усложняет и удорожает процесс выделения.

Задачей изобретения является получение стабильного аспорогенного штамма В. anthracis с низкой активностью протеолитических ферментов и отсутствием антибиотикорезистентности для использования в качестве основы при конструировании продуцентов сибиреязвенных антигенов и других биологически активных веществ.

Сущность изобретения заключается в получении стабильного аспорогенного штамма - основы для конструирования продуцентов сибиреязвенных антигенов и других биологически активных веществ.

Заявляемый штамм возбудителя сибирской язвы получен на основе бесплазмидного производного вакцинного штамма В. anthracis СТИ1 с использованием разработанного нами способа получения аспорогенного штамма В. anthracis.

Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" (Саратов) под номером КМ91.

Основные свойства штамма В. anthracis KM91: - аспорогенность - аспорогенность штамма дает преимущество при его использовании в качестве продуцентов сибиреязвенных антигенов и других биологически активных веществ - компонентов сибиреязвенных вакцин и диагностических препаратов, так как отсутствует вероятность обсеменения рабочих помещений, лабораторного и промышленного оборудования спорами возбудителя сибирской язвы; - авирулентность - не содержит плазмид возбудителя сибирской язвы, где располагаются структурные и регуляторные гены синтеза двух основных факторов патогенности В. anthracis - токсина и капсулы; - низкая активность протеолитических фермеров, разрушающих белковые препараты на этапах их выделения и очистки - это обеспечивает оптимальный выход белковых сибиреязвенных антигенов и исключает необходимость применения ингибиторов протеаз; - отсутствие резистентности к антибиотикам (заявляемый штамм - спонтанный аспорогенный мутант), что может быть важным при генетическом конструировании и последующем использовании аспорогенных штаммов В. anthracis; - стабильность - сохраняет свойства при хранении, культивировании на питательных средах и в результате пассажей через организм лабораторных животных.

Морфологические признаки: грамположительные, необразующие спор палочки, капсулы не имеют.

Культуральные признаки: на твердых питательных средах клетки штамма образуют колонии с гладкой поверхностью и ровным краем (в S-форме). При выращивании в жидких питательных средах - равномерное помутнение с придонным осадком.

Биохимическая активность штамма и другие свойства: обладает низкой протеолитической и гемолитической активностями, не сорбирует конго красный, не синтезирует и не экскретирует в среду культивирования желтый пигмент. Оптимальная температура роста - 37^oС, оптимум рН 7,2.

Питательные потребности: является ауксотрофом, зависим в росте от метионина, треонина и тиамина.

Плазмидный состав: не содержит в составе генома плазмид В. anthracis (рХО1^-рХО2^-).

Пример 1 - определение способности к спорообразованию.

Колонии с посевов, инкубировавшихся при температуре 37^oС в течение 5 сут на агаре Хоттингера, суспендируют в физиологическом растворе. В качестве контроля используют спорообразующий штамм В. anthracis Sterne 34F2. Пробирки с культурой помещают в водяную баню и прогревают при температуре 65^oС в течение 30 мин или при 80^oС - 10 мин. Наличие роста до прогрева и отсутствие роста после прогрева при высеве по 0,1 мл культуры на агар Хоттингера свидетельствует о неспособности клеток сибиреязвенного микроба к образованию полноценных спор.

Дополнительно способность к образованию спор проверяют при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных фуксином Циля. В качестве контроля используют спорообразующий штамм В. anthracis Sterne 34F2. В опытном мазке отмечается отсутствие характерно окрашенных спор.

Пример 2 - определение стабильности свойства аспорогенности.

Штамм несколько раз (не менее трех) пассируют на питательной среде (L-aгap) при температуре 37^oС. После последнего пассажа делают высев на L-aгap и проверяют способность к спорообразованию у 20 изолированных клонов. Отсутствие спорообразования у всех тестированных клонов свидетельствует о стабильности признака. После трех пассажей на питательной среде проводят три пассажа через организм лабораторных животных. Для этого белой мыши вводят подкожно 0,2 мл клеточной суспензии штамма в концентрации 10 млн. спор. У павшей особи делают высев из головного мозга и выделяют чистую культуру В. anthracis. Выделенной чистой культурой возбудителя сибирской язвы в той же концентрации проводят заражение следующей мыши и так повторяют всего 3 раза. Затем проверяют признак спорообразования по изложенной выше схеме. Отсутствие способности к образованию спор свидетельствует о стабильности признака.

Пример 3 - определение протеолитической активности.

Субстратами для определения активности протеолитичеких ферментов являются казеин и бычий сывороточный альбумин.

Казеиновая среда для определения протеолитической активности содержит (г/л): бакто-агар - 15,0, казеин - 2,0, трис - 1,21, К₂НРО₄ - 0,5, MnSО₄7H₂O - 0,05, MgSО₄ - 0,2, CaCl₂ - 0,08, ZnSО₄7Н₂О - 0,005, CuSО₄5H₂O - 0,005, (NH₄)₂SО₄ - 2,0.

Изолированные колонии с помощью петли наносят бляшкой на поверхность казеиновой среды и выращивают в термостате при 37^oС в течение 24 ч. На каждую чашку наносят не более 16 колоний. На мутном фоне среды вокруг колоний штамма с высокой активностью протеолитических ферментов образуются зоны просветления шириной до 10 мм. Зоны просветления у штамма с низкой активностью протеолитических ферментов до 1 мм.

Альбуминовая среда для определения протеолитической активности - состав, способ приготовления и применения среды указан в "Методическом пособии по генетике возбудителя сибирской язвы" - Саратов, 1991, с.28-30 (утверждено заместителем начальника главного эпидемического управления Минздрава СССР Онищенко Г.).

Таким образом, получен стабильный аспорогенный штамм В.anthracis KM90, обладающий низкой активностью протеолитических ферментов и отсутствием антибиотикорезистентности, который рекомендуется в качестве основы для конструирования продуцентов сибиреязвенных антигенов и других биологически активных веществ - компонентов химических вакцин и диагностических препаратов.

Формула изобретения

Штамм Bacillus anthracis КМ91 - основа для генетического конструирования продуцентов сибиреязвенных антигенов.