Способ обнаружения вируса гепатита с (варианты), набор, способ определения образца крови, реагент

Способ обнаружения вируса гепатита с (варианты), набор, способ определения образца крови, реагент

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для диагностики вируса гепатита С в биологических средах. Получены реагенты для выделения, амплификации и детекции вируса гепатита С. Такими реагентами являются олигомеры, состоящие из полинуклеотидных последовательностей, которые способны формировать гибридные структуры с ВГС-полинуклеотидными последовательностями в области мишени. Изобретение позволяет повысить качество и надежность диагностики ВГС в биологических пробах. 5 с. и 5 з.п. ф-лы, 4 ил. , 3 табл.

Изобретение относится к материалам и методическим рекомендациям по регулированию распространения инфекции вируса гепатита ни-А, ни-В (ВГНАНВ) и, в частности, относится к этиологическому агенту гепатита ни-А, ни-В (ГНАНВ), вирусу гепатита С (ВГС) и полинуклеотидам и их аналогам для диагностики ВГС в биологических средах.

Гепатит ни-А, ни-В (ГНАНВ) - трансмиссивное заболевание или группа заболеваний, которое, как полагают, индуцируется вирусами и дифференцируется с другими заболеваниями печени, индуцированными такими известными вирусами, как вирус гепатита А (ВГА), вирус гепатита В (ВГВ) и дельта-вирус гепатита (ВГД), а также с гепатитом, индуцированным цитомегаловирусом (ЦМВ) или вирусом Эпштейна-Барр (ЭБВ). Впервые ГНАНВ был идентифицирован у индивидуумов, которым производились трансфузии. Передача инфекции от человека шимпанзе и перенос от них возбудителя на других шимпанзе позволяет отнести ГНАНВ к трансмиссивной инфекции, переносимой одним или несколькими переносчиками болезни.

Эпидемиологические данные показывают, что возможны три пути передачи ГНАНВ: водный путь, парентеральный путь (через кровь и иглы взятия крови) и спорадические случаи инфицирования групп людей. Однако число этиологических типов, которые могут привести к заболеванию ГНАНВ, остается невыясненным.

Имеется ряд переносчиков ГНАНВ. См. информацию о них, например, в трудах Принс (1983), Фаинстон и Хуфнагель (1984), Оверби (1985, 1986, 1987), Иварсон (1987). Однако доказательств того, что какой-то из них является этиологическим агентом ГНАНВ не имеется.

Важным является требование к асертике при проведении специфичных методов выявления и идентификации носителей ВГНАНВ, крови и препаратов крови, инфицированных этим вирусом. В 10% случаев гемотрансфузии приводят к пострансфузионному гепатиту (ПТГ), причем около 90% данного заболевания обусловлено ГНАНВ. Главной проблемой этой болезни остается большая частота хронизации процесса поражения печени (25-55%).

Необходимость ухода за больными и предупреждения передачи инфекции ГНАНВ через кровь и ее препараты или через бытовой контакт обусловливают повышение требований к надежности скрининга, диагностики и прогноза с целью выявления нуклеиновых кислот, антигенов и антител, относящихся к ВГНАНВ.

Известны способы выявления определенных полинуклеотидов путем проведения гибридизационных анализов. См. работы, например, Мэттюз и Крика, кн. "Аналитическая биохимия", 1988, т. 169, стр. 1, Ландегрен и соавт., журн. "Сайенс", т. 242, стр. 229: и Миттлин, журн. "Клиническая химия", 1989, т. 35, стр. 1819, патент США 4868105, 9.09.1989, публ. ЕРО 225807, 16.07.1987.

До открытия ВГС заявителем способы выделения и/или детекции определенных полинуклеотидов гибридизацией не могли применяться для скрининга ВГС. В настоящем изобретении представлены материалы и способы получения вирусных геномных последовательностей (см. ниже, а также в межд. публ. РСТ/90/ 14436).

Отличительной особенностью изобретения является процесс выявления ВГС-последовательности в аналит-цепи, имеющей, как полагают, ВГС-полинуклеотид, в которой указанный ВГС-полинуклеотид содержит взятую выборочно область-мишень, содержащий: а) этап формирования олигомера(ов), способного гибридизировать ВГС-последовательность в аналит-полинуклеотидной цепи, в которой указанный олигомер содержит полинуклеотидную последовательность, взятую выборочно из группы олигонуклеотидов, комплементарных следующим районам ВГС-генома (как показано на фиг. 1): 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 и 457-486; b) этап инкубации аналит-цепи с олигомером(ами) (а), дающий возможность сформировать специфические гибридные дуплексы между последовательностью предполагаемой области-мишени и последовательностью выбранной области-мишени; и d) этап детекции гибридов, сформированных между областью-мишенью, если таковая имеется, и указанным олигоме-ром(ами).

Другой особенностью изобретения является процесс выявления ВГС-последовательности в аналит-цепи, имеющей, как полагают, ВГС-полинуклеотид, в которой указанный ВГС-полинуклеотид содержит взятую выборочно область-мишень, содержащий: а) этап формирования олигомера(ов), способного гибридизировать ВГС-последовательность в аналит-полинуклеотидной цепи, в которой указанный олигомер содержит полинуклеотидную последовательность, взятую выборочно из группы олигонуклеотидов, комплементарных следующим районам ВГС-генома (как показано на фиг. 1): 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 и 457-486, b) этап инкубации аналит-цепи с олигомером(ами) в (а), дающий возможность сформировать специфические гибридные дуплексы между последовательностью предполагаемой области--мишени и последовательностью выбранной области-мишени, и d) этап детекции гибридов, сформированных между областью-мишенью, если таковая имеется, и указанным олигомером(ами), с другим олигомером(ами), в котором другой олигомер(ы) содержит полинуклеотидную последовательность, взятую выборочно из группы олигонуклеотидов, комплементарных следующим районам ВГС-генома (как показано на фиг.1): 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 и 457-486.

Следующей особенностью изобретения является способ приготовления крови, не инфицированной ВГС, содержащий: а) этап получения аналит-нуклеиновых кислот из пробы крови, содержащей, как полагают, область-мишень ВГС-последовательности; b) этап формирования олигомера(ов), способного гибридизировать ВГС-последовательность в аналит-полинуклеотидной цепи, в которой указанный олигомер содержит полинуклеотидную последовательность, взятую выборочно из группы олигонуклеотидов, комплементарных следующим районам ВГС-генома (как показано на фиг. 1): 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 и 457-486, с) этап проведения реакции (а) с (b) в условиях, при которых возможно формирование полинуклеотидного дуплекса между последовательностями предполагаемой области-мишени и выбранной области-мишени, если таковые имеются, d) этап детекции дуплекса, сформированного в (с), если таковой имеется, и е) этап сохранения крови, препараты комплексного действия которой не были детектированы в (d).

Очередной особенностью изобретения является способ приготовления крови, не инфицированной ВГС, содержащий: a) этап получения аналит-нуклеиновых кислот из пробы крови, содержащей, как полагают, область-мишень ВГС-последовательности, b) этап формирования олигомера(ов), способного гибридизировать ВГС-последовательность в аналит-полинуклеотидной цепи, если таковая имеется, в которой указанный олигомер содержит полинуклеотидную последовательность, c) этап проведения реакции (а) с (b) в условиях, при которых возможно формирование полинуклеотидного дуплекса между последовательностями предполагаемой области-мишени и выбранной области-мишени, если таковые имеются, d) этап детекции дуплекса, сформированного в (с), если таковой имеется, с другим олигомером(ами), в котором другой олигомер(ы) содержит полинуклеотидную последовательность, и е) этап сохранения крови, препараты комплексного действия которой не были детектированы в (d).

На фиг.1 показана составленная сДНК-последовательность ВГС от описанного в данной заявке клона и от составленной сДНК-последовательности, описанной в РCТ/ W 090/14436. Клоны, от которых получена указанная последовательность, представлены в следующем виде: 5'-клон 32, b 114а, 18g, аg 30g, СА205а, СА290а, СА216а, рi 14а, СА167b, СА156е, СА84а, СА59а, К9-1 (также назыв. к9-1), 26j, 13i, 12j, 14i, 11b, 7j, 7е, 8h, 33с, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25с, 14с, 8f, 33f, 33g, 39с, 35f, 19g, 26g, 15е, b5а, 16jh, 6к и р131jh. На фиг. показаны три горизонтальных штриха над последовательностью, обозначающих предполагаемую позицию инициатора метионина кодона. На фиг. показана кроме того аминокислотная последовательность предполагаемого полипротеина, закодированного в сДНК ВГС. Гетерогенности в клонированных ДНК-цепях ВГС1 обозначены аминокислотами над предполагаемой закодированной последовательностью протяженной открытой рамкой считывания (ОРС). Наличие скобок указывает на то, что гетерогенность детектировалась около или в 5'-конце или 3'-конце сДНК ВГС в клоне.

На фиг.2 показаны консенсусные последовательности для пяти различных ВГС изолятов из различных географических районов (Япония и США), где аминокислоты, кодируемые протяженной ОРС ВГС1, обозначены над ДНК-последовательностями.

На фиг. 3 показаны последовательности маркированных зондов для детекции РНК ВГС в биологических средах, примененных в примере 3.

На фиг. 4 показано выравнивание зондов на фиг.3 с ВГС1 в соответствии с нумерацией фиг.1.

Способы осуществления изобретения Термин "вирус гепатита С" (ВГС) использовался специалистами в данной области в качестве резервного для до сих пор неизвестного этиологического агента ГНАНВ. Изолят-прототип ВГС идентифицирован в пат. заявке США 122714 (см. также европ. пат. публ. ЕРО 318216). Кроме того, термин ВГС включает новые изоляты тех же самых вирусных видов. С целью расширения значения данного термина болезнь, инфицированная ВГС и обозначавшаяся прежде как "сывороточный" гепатит ни-А, ни-В, называется гепатит С. В данной заявке термины ГНАНВ и гепатит С понимаются как равнозначные.

ВГС - вид вируса, патогенные штаммы которого вызывают сывороточный ГНАНВ. Кроме того, могут иметь место ослабленные штаммы или полученные от них дефектные интерференционные частицы. Как показано ниже, геном ВГС состоит из РНК. Известно, что РНК-содержащие вирусы имеют относительно высокие величины спонтанной мутации, т.е., как полагают, порядка 10^-3-10^-4 на инкорпорированный нуклеотид (Филдс и Кнайп, 1986). Следовательно, поскольку РНК-вирусам свойственны гетерогенность и флуидность, имеют место сложноструктурные штаммы/изоляты, которые в пределах ВГС-вида могут быть вирулентными или авирулентными. Композиции и способы, описанные в данной заявке, обеспечивают возможность распространения, идентификации, детекции и выявления различных штаммов и изолятов ВГС.

Идентифицирован ряд различных штаммов/изолятов (см. РСТ/ W 090/14436), относящихся к ВГС. Один из таких штаммов или изолятов получил наименование CDC/HCVI (также назыв. HCVI ). Информация, полученная от одного штамма или изолята, например, о частичной геномной последовательности, вполне достаточна, чтобы дать возможность специалистам в данной области, используя стандартные методы и приемы, выделить новые штаммы/изоляты и определить являются ли эти новые штаммы/изоляты вирусами гепатита С. Так, например, ниже описывается ряд различных штаммов/изолятов. Эти штаммы, полученные от ряда сывороток человека (притом из разных географических регионов), были выявлены за счет информации, полученной от геномной последовательности ВГС1.

Используя методику, описанную в РCТ/ W 090/14436, были сделаны выводы о геномной структуре и нуклеотидной последовательности РНК-генома ВГС1. Геном, по-видимому, представляет собой одноцепочечную РНК приблизительно из 10000 нуклеотидов. Геном имеет позитивную структуру цепи, непрерывную трансляционную открытую рамку считывания (ОРС), которая кодирует полипротеин до 3000 аминокислот. В ОРС структурный протеин(ы), по-видимому, кодируется приблизительно в первой четверти N-конца участка, с большинством полупротеинов, ответственных за неструктурные протеины. При сравнении со всеми известными вирусными последовательностями наблюдаются небольшие, но важные колинейные гомологии, имеющие неструктурные протеины семейства флавивирусов и пестивирусов (которые в настоящее время также рассматриваются как часть семейства флавивирусов).

Полипротеин флавивируса имеет на участке от амино-конца до карбокси-конца нуклеокапсид протеин (С), матричный протеин (М), протеин оболочки (Е) и неструктурные протеины (NS) 1,2 (а + b ), 3,4 (а+b) и 5. Основываясь на предполагаемых аминокислотах, закодированных в нуклеотидной последовательности ВГС1, в самом конце N-участка полипротеина ВГС появляется небольшой домен, схожий как по размерам, так и по высокому содержанию основных остатков с нуклеокапсид протеином (С), находящимся в конце N-участка флавивирусных полипротеинов. Неструктурные протеины 2,3,4 и 5 (NS 2-5) ВГС и вируса желтой лихорадки (ВЖЛ), по-видимому, имеют аналоги, схожие по размерам и типу гидроманипуляции, хотя имеет место дивергенция аминокислотных последовательностей. Однако регион ВГС, который обычно соответствует регионам ВЖЛ-протеинов, содержащих протеины М, Е и NSI, не только отличается по сиквенсу, но, по-видимому, сильно различим и по размерам, и по гидроманипуляциям. Поэтому, хотя здесь и называются определенные геномные ВГС-домены, такие, например, как NSI или NS 2, следует учитывать, что эти обозначения следует рассматривать как гипотетические; между семейством ВГС и флавивирусами могут быть значительные различия, степень которых еще предстоит выяснить.

Можно предполагать, что в сравнении с ВГС1 различные штаммы, изоляты и подвиды ВГС представляют разновидности аминокислоты и нуклеиновых кислот. Можно также ожидать, что многие изоляты в сравнении с ВГС1 будут показывать большую часть (т.е. свыше 40%) гомологии в общей аминокислотной последовательности. Однако, может быть также показано, что могут иметь место другие, менее гомологичные ВГС-изоляты. Их можно было бы отнести к ВГС-изолятам, исходя из разных критериев, таких как, например, наличие ОРС в пределах приблизительно от 9000 нуклеотидов до приблизительно 12000 нуклеотидов, кодирование полипротеина, схожего по своим размерам с полипротеином ВГС1, закодированный полипротеин с гидрофобными и/или антигенными признаками, подобными признакам полипротеинов ВГС1, и наличие консервированных в ВГС1 колинейных пептидных последовательностей. Кроме того, предполагается, что геном имеет позитивно-цепочечную РНК.

Все ВГС-изоляты кодируют по меньшей мере один эпитоп, который иммунологически поддается идентификации (т.е. иммунологически кросс-реактивен) эпитопа, закодированного в сДНК ВГС, описанными в данной заявке. Эпитоп предпочтительно содержится в аминокислотной последовательности, описанной в данной заявке, и является уникальным по отношению к ВГС, если его сравнивать с ранее известными патогенами. Уникальность эпитопа может быть установлена по его иммунологической реактивности с анти-ВГС антителами, а также по отсутствию иммунологической реактивности с антителами в сравнении с известными патогенами.

Штаммы и изоляты ВГС эволюционно связаны друг с другом. Поэтому можно предполагать, что суммарная гомология геномов на уровне нуклеотида может составлять до 40% или более, с вероятностью до 50% или более, с вероятностью до 60% или более, и даже с большей вероятностью до 80% или более, и кроме того, можно ожидать, что будут иметь место соответствующие соприкасающиеся последовательности с по меньшей мере до 13 нуклеотидов. Следует отметить, что в пределах ВГС-генома имеются переменные и гиперпеременные районы, поэтому можно ожидать, что гомология этих районов будет значительно меньшей, чем гемология генома в целом. С помощью известных методик может быть установлена связь между геномной последовательностью предполагаемого штамма ВГС и, например, CDС /сДНК ВГС1-последовательностью. Эти связи могут, например, быть установлены путем непосредственного сравнения информации о последовательности полинуклеотида от предполагаемого ВГС и описанной в данной заявке информации о сДНК-последователъности ВГС. Кроме того, они могут определяться гибридизацией полинуклеотидов в условиях, при которых формируются устойчивые дуплексы между гомологичными районами (например, те, которые обычно используются до S1 ферментации), за которой следует ферментация путем воздействия однониточной специфичной нуклеазы, после чего определяются размеры фрагментов-стимуляторов.

Вследствие эволюционной зависимости штаммов или изолятов ВГС предполагаемые штаммы или изоляты идентифицируются за счет их гомологии на уровне полипептидов. ВГС-штаммы/изоляты предположительно будут гомологичными по меньшей мере на 40%, гомологичными более чем на 50%, гомологичными с вероятностью более чем на 70% и гомологичными даже с большей вероятностью более чем на 80%, а некоторые могут быть гомологичными более чем на 90% на полипептидном уровне. Известна методика определения гомологии аминокислотной последовательности. Например, аминокислотная последовательность может определяться непосредственно, а затем сравниваться с последовательностями, представленными в данной заявке. С другой стороны, возможно определение нуклеотидной последовательности геномного материала предполагаемого ВГС (обычно через сДНК-посредника), определение закодированной в данной заявке предполагаемой аминокислотной последовательности и сравнение соответствующих районов.

Выражение "полинуклеотид "производный от" указанной последовательности, употребляемое в данной заявке, относится к полинуклеотидной последовательности, которая состоит из последовательно расположенных по меньшей мере приблизительно 6 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере около 8 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере около 10-12 нуклеотидов и даже более предпочтительно по меньшей мере 15-20 нуклеотидов, соответствующих указанной области нуклеотидной последовательности. Термин "соответствующий" означает гомологичный или комплементарный указанной последовательности. Предпочтительно, последовательность района, из которого взят дериват полинуклеотида, является гомологичной или комплементарной последовательности, которая является уникальной ВГС-геному. Более предпочтительно, производная последовательность является гомологичной или комплементарной последовательности, которая является уникальной всем или большей части ВГС-изолятов. Вопрос о том, является ли последовательность уникальной для ВГС-генома, определяется методикой, известной специалистам данной области. Например, последовательность может сравниваться с последовательностями, выбранными из банков данных, например из банка Genebank, с тем, чтобы определить присутствует ли она у неинфицированного хозяина или в других организмах. Кроме того, последовательность может сравниваться с известными последовательностями других вирусных агентов, в том числе тех, которые известны как агенты, индуцирующие гепатит, например, ВГА, ВГВ и ВГД, а также с представителями флавивирусов. Кроме того, вопрос соответствия или несоответствия производной последовательности другим последовательностям может быть решен с помощью гибридизации, проводимой с соблюдением необходимых условий. Известны методика и порядок проведения гибридизации с целью определения комплементарности нуклеиновокислотных последовательностей (см. например, Маниатис и соавт., 1982). Методика гибридизации рассматривается ниже в данной заявке. Кроме того, мисматчи дуплексных полинуклеотидов, сформированных с помощью гибридизации, могут быть определены известными методами, такими как, например, ферментация нуклеазой, например, S1, которая специфично стимулирует одноцепочечные районы дуплексных полинуклеотидов. Районы, из которых могут быть выделены типовые ДНК-последовательности, включают, но не ограничиваются ими, например, районы, кодирующие специфичные эпитопы, а также нетранскрибированные и/или нетранслированные районы.

Выделенный полинуклеотид не обязательно физически выделен из показанной нуклеотидной последовательности, он может генерироваться любым способом, таким, например, как химический синтез или ДНК-репликация или обратная транскрипция или транскрипция. Кроме того, комбинации районов, соответствующих комбинациям указанной последовательности, могут модифицироваться известными способами, согласующимися с предполагаемым использованием.

Под термином "рекомбинантный полинуклеотид", употребляемым в данном контексте, понимается полинуклеотид, имеющий геномное, сДНК, полусинтетическое или синтетическое происхождение, который в силу своего происхождения или манипуляции: 1) не ассоциируется полностью или частично с тем полинуклеотидом, с которым он ассоциируется в природе, 2) связан с полинуклеотидом, кроме того полинуклеотида, с которым он связан в природе, или 3) не встречается в природе.

Термин "полинуклеотид", употребляемый в данном контексте, относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины, как рибонуклеотидов, так и дезоксирибонуклеотидов. Этот термин относится только к основной молекулярной структуре. Следовательно, этот термин включает как двухцепочечные, так и одноцепочечные ДНК и РНК. Кроме того, он включает известные виды модификаций, например, известные маркеры, метилирование, "шапки", замена аналогом одного или более встречающихся в природе нуклеотидов, межнуклеотидные модификации, такие, например, как модификации с нейтральными соединениями (напр. метилфосфанаты, фосфотриэфиры, фосфо-амидаты, карбаматы и др.), и с заряженными соединениями (напр. фосфоротиоаты, фосфородитиааты и др.), модификации с боковой составляющей пени, такие как, например, белки (в том числе, например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-L-лизины и др.), интеркалятор-содержащие модификации (напр. акридин, псорален и др.), хелатор-содержащие модификации (напр. металлы, радиоактивные металлы, борон, окислительные металлы и др.), алкилятор-содержащие модификации, модификации с модифицированными соединениями (напр. альфа аномерные нуклеиновые кислоты и др.), а также немодифицированные формы полинуклеотида.

Под термином "чувствительная цепь" нуклеиновой кислоты, употребляемым в данном контексте, понимается, что цепь содержит последовательность, имеющую гомологию сиквенса, относящуюся к мРНК-гомологии. Термин "античувствительная цепь" предполагает цепь, содержащую последовательность, комплементарную последовательности "чувствительной цепи".

Термин "позитивно-цепочечный геном" вируса, употребляемый в данном контексте, подразумевает полинуклеотид РНК- или ДНК-генома, который кодирует по меньшей мере один вирусный полипептид. Примерами позитивно-цепочечных РНК-вирусов являются тогавирусы, коронавирусы, ретровирусы, пикорнавирусы и калицивирусы. В эту группу включены также флавивирусы, которые прежде относились к тогавирусам. Эти вирусы обычно одноцепочечные (см. Филдс и Кнайп, 1986).

Термин "праймер", употребляемый в данном контексте, относится к олигомеру, который в соответствующих условиях способен взять на себя функцию инициатора синтеза полинуклеотидной цепи. Праймер будет полностью или в значительной мере комплементарным району полинуклеотидной цепи, подлежащей копированию. Следовательно, в условиях, благоприятных для гибридизации, праймер ренатурирует комплементарный район аналит-цепи. При добавлении соответствующих реагирующих веществ (напр. полимеразы, нуклеотидных трифосфатов и им подобных) праймер удлиняется с помощью полимеризационного агента и формирует копию аналит-цепи. Праймер может быть однониточным или наоборот частично или полностью двухниточным.

Термины "аналит-полинуклеотид" и "аналит-цепь" относятся к одно- и двухцепочечной молекуле нуклеиновой кислоты, которая, как полагают, содержит последовательность с избранной областью-мишенью и которая может присутствовать в биологической среде.

Термин "олигомер", применяемый в данном контексте, относится к праймерам и зондам. Термин "олигомер" не заключает в себе величину молекулы. Тем не менее, по длине обычные олигомеры не превышают 1000 нуклеотидов, более типичные из них не превышают 500 нуклеотидов, к еще более типичным из них относятся те, которые не превышают даже 250 нуклеотидов, они могут не превышать 100 нуклеотидов, 75 нуклеотидов, а также 50 нуклеотидов.

Термин "зонд", применяемый в данном контексте, относится к структуре, содержащей полинуклеотид, который образует гибридную структуру последовательности с выбранной областью-мишенью, вследствие комплементарности по меньшей мере одного сиквенса в зонде сиквенсу в области-мишени. Полинуклеотидные регионы зондов могут быть ДНК-содержащие, и/или РНК-содержа-щие, и/или содержащие аналоги синтетических нуклеотидов. В пределах зондов имеются т.н. "зонды поглощения" и "зонды"-маркеры". Предпочтительно зонд не содержит последовательность, комплементарную последовательности(ям), используемой для инициации полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Термин "область-мишень", применяемый в данном контексте, относится к региону нуклеиновой кислоты, который подлежит амплификации и/или детекции. Термин "последовательность области-мишени" относится к последовательности, с которой зонд или праймер образуют при соответствующих условиях стабильный гибрид.

Термин "зонд поглощения", применяемый в данном контексте, относится к полинуклеотиду, состоящему из одноцепочечного полинуклеотида, соединенного со связующим партнером. Одноцепочечный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность предполагаемой области-мишени, которая комплементарна последовательности выбранной области-мишени, подлежащей детекции в аналит-полинуклеотиде. Этот комплементарный регион имеет достаточную длину и комплементарность к сиквенсу области-мишени для обеспечения дуплекса стабильности, достаточного для иммобилизации аналита-полинуклеотида в твердой поверхности (через связывающих партнеров). Связующий партнер специфичен для второго связующего партнера, второй связующий партнер может быть прикреплен к поверхности твердой подложки или может быть косвенно, через другие структуры или связующих партнеров, соединен с твердой подложкой.

Термин "полинуклеотидная последовательность предполагаемой области-мишени", применяемый в данном контексте, относится к полинуклеотидной последовательности, которая содержит нуклеотиды, комплементарные нуклеотидной последовательности выбранной области-мишени, последовательность имеет достаточную длину и комплементарность к сиквенсу области-мишени для образования дуплекса, имеющего достаточную стабильность для осуществления поставленной цели.

Термин "связующий партнер", применяемый в данном контексте, относится к молекуле, способной связывать лиганд-молекулу с высокой степенью специфичности как, например, специфичные антиген и антитело. Специфичные связующие партнеры обычно должны связывать с достаточной степенью сродства для иммобилизации аналит-копии/ комплементарного ниточного дуплекса (в случаях, касающихся зондов поглощения) в условиях изоляции. Известны специфичные связующие партнеры, такие, например, как биотин и авидин или стрептавидин, аллотип IgGu протеин А, многочисленные известные рецепторно-лигандные пары и комплементарные полинуклеотидные цепи. В случае, касающемся комплементарных полинуклеотидных связующих партнеров, такие партнеры обычно имеют по меньшей мере до 15 оснований в длину и могут достигать по меньшей мере 40 оснований в длину. Кроме того, содержание G- и С-остатков у них по меньшей мере около 40% и вплоть до 60%. В состав полинуклеотидов могут входить ДНК, РНК или синтетические нуклеотидные аналоги.

Термин "связанный", применяемый в данном контексте, относится к фиксациям или сцеплениям, производимым с помощью ковалентных связей или сильных нековалентных взаимосвязей (напр. гидрофобные взаимодействия, водородные связи и др. ). К ковалентным связям могут, например, относиться сложные и простые эфиры, сложный фосфоэфир, амид, пептид, имид, углеродно-серные связи и подобные им.

Термин "подложка" относится к любой твердой или полутвердой поверхности, к которой может крепиться требуемый связующий партнер. Соответствующими подложками являются стекло, пластмасса, металл, полимерный гель и подобные им материалы, они могут иметь форму гранул, резервуаров, щупов, мембран и др.

Термин "маркер", применяемый в данном контексте, относится к любому атому или составляющей части, которые могут быть использованы для обеспечения диагностического (предпочтительно поддающегося количественному определению) сигнала, и которые могут крепиться к полинуклеотиду или полипептиду.

Термин "маркерный (меченый) зонд", применяемый в данном контексте, относится к олигомеру, который содержит полинуклеотидную последовательность предполагаемой области-мишени, комплементарную сиквенсу выбранной области-мишени, подлежащему детекции в аналитполинуклеотиде. Этот комплементарный регион имеет достаточную длину и комплементарность к сиквенсу выбранной области-мишени для того, чтобы дать возможность маркеру сдетектировать дуплекс, состоящий из "меченого зонда", и "последовательности выбранной области-мишени". Олигомер связывается с маркером как непосредственно, так и косвенно, через совокупность лиганд-молекул с высокой специфичностью друг к другу. Совокупности лиганд-молекул описаны выше, они также содержат мультимеры.

Термин "мультимер", применяемый в данном контексте, относится к линейным или разветвленным полимерам одной и той же повторяющейся одноцепочечной полинуклеотидной единицы или различным одноцепочечным полинуклеотидным единицам. По меньшей мере одна из единиц имеет сиквенс, длину и композицию, что позволяет ей осуществить целенаправленную гибридизацию представляющей интерес первой одноцепочечной нуклеотидной последовательности, обычно аналит или олигомер (напр. маркерный зонд), связанный с аналитом. Для достижения такой специфичности и стабильности эта единица должна иметь длину по меньшей мере до 15 нуклеотидов, обычно не более чем около 50 нуклеотидов в длину, и предпочтительно иметь длину до 30 нуклеотидов, более того, содержание G- и С-остатков обычно должно быть по меньшей мере около 40% и самое большее около 60%. Кроме указанной единицы(единиц) мультимер включает разнообразие единиц, способных к целенаправленной и стабильной гибридизации второго одноцепочечного нуклеотида, представляющего интерес, обычно меченого полинуклеотида или другого мультимера. Эти единицы обычно имеют примерно такие же размерения и композицию как и мультимеры, о которых говорилось выше. Когда мультимер подлежит гибридизации другим мулътиме-ром, первая и вторая олигонуклеотидные единицы становятся гетерогенными (разнородными) и друг с другом не гибридизуются в условиях выбранного теста. Таким образом, мультимеры могут быть либо мечеными зондами, либо лигандами, которые связывают маркер с зондом.

Термин "вирусная РНК", который включает ВГС РНК, относится к РНК вирусного генома, его фрагментов, транскриптов и мутантных сиквенсов, выделенных из него.

Термин "биологический образец" относится к пробам ткани или жидкости, взятым у индивидуума, включая, но не ограничиваясь ими, например, плазму, сыворотку, цереброспинальную жидкость, лимфатическую жидкость, наружные отсеченные участки кожи, дыхательные пути, кишечник, мочеполовые пути, слезы, слюну, молоко, клетки крови, опухоли, органы, а также образцы ингредиентов клеточных культур в условиях in vitro (включая, но не ограничиваясь условной средой, явившейся результатом роста клеток в среде клеточной культуры, клетки мнимоинфицированные вирусом, рекомбинантные клетки и компоненты клеток).

В практике настоящего изобретения используются, за исключением особо оговоренных случаев, обычные методы и приемы химии, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК, иммунологии, хорошо известные специалистам в данной области. Эти методы и приемы подробно исследованы в научной литературе. См. , например, кн. "Молекулярное клонирование. Руководство по лабораторным работам", авт. Маниатис, Фитш и Сэмбрук, 1982, кн. "ДНК-клонирование", тт. 1, 2, изд. Д.Н. Гловер, 1985, кн. "Синтез олигонуклеотидов", изд. М.Д. Гайт, 1984, кн. "Гибридизация нуклеиновых кислот", изд. Б.Д. Хеймс и С. Д. Хиггинс, 1984, статьи "Методы энзимологии", вып.154, 155, изд. By и Гроссман, Академик Пресс Инк. В настоящем описании даются ссылки на все патенты, пат. заявки и публикации, упоминаемые выше и ниже в тексте.

Применение на практике материалов и процессов, описанных в настоящем изобретении, становится возможным в связи с идентификацией ВГС как этиологического агента "сывороточного" ВГНАНВ и формированием семейства нуклеотидных последовательностей, выделенных из библиотек кДНК, содержащих кДНК-сиквенсы ВГС. Эти библиотеки кДНК были получены из нуклеиновокислотных последовательностей плазмы шимпанзе, инфицированных ВГС. Конструкция одной из таких библиотек, а именно библиотеки "с" (амер. фонд культур (АТСС) 40394) описана в РСТ/ W 090/14436.

Применение описанных выше кДНК-последовательностей ВГС, а также последовательностей, описанных в настоящем изобретении, дает возможность конструировать олигомеры для практического использования в качестве реагентов при детекции вирусных полинуклеотидов в биологических средах. Так, например, используя последовательности, можно синтезировать ДНК-олигомеры из 8-10 или большего количества нуклеотидов, которые можно использовать в качестве зондов гибридизации для детекции присутствия РНК ВГС, например, в донорской крови, фракциях крови, сыворотке трупов при вскрытии с подозрением на носителей вируса, или в системах клеточных культур, в которых реплицируется вирус. Кроме того, новые олигомеры, предложенные в данной заявке, позволяют продолжить изучение свойств ВГС-генома. Полинуклеотидные зонды и праймеры, выделенные из этих последовательностей, могут быть использованы для амплификации последовательностей, находящихся в фондах библиотек кДНК, и/или для скрининга библиотек сДНК с целью дополнительного наложения сДНК-последовательностей, которые, в свою очередь, могут использоваться для получения большего числа наложенных последовательностей. Как указывается в РCТ/ W 090/14436, геном ВГС, по-видимому, является РНК, содержащий главным образом протяженную открытую рамку считывания (ОРС), которая кодирует крупный полипротеин.

В дополнение к вышесказанному ниже приводится информация, которая позволит идентифицировать дополнительные штаммы и изоляты ВГС. Выделение и охарактеризование дополнительных штаммов и изолятов ВГС может быть осуществлено, например, выделением нуклеиновых кислот из компонентов организма, которые содержат вирусные частицы и/или РНК-вирусы, созданием библиотек кДНК, использующих олигомеры, основанные на последовательности ВГС1 для скрининга в библиотеках клонов, содержащих сДНК-последовательности ВГС, описанные ниже, и сравнением кДНК ВГС от новых изолятов с кДНК, описанными в РСТ/ W 0090/14436 и ниже в данном описании. Штаммы и изоляты, которые соответствуют параметрам ВГС, описанным в разделе данного описания, раскрывающем значения терминов и выражений (см. выше), легко идентифицируются. Другие способы идентификации штаммов ВГС будут очевидны специалистам в данной области с учетом информации, представленной в данном описании.

Выделение кДНК-последовательностей ВГС Олигомеры, описанные в изобретении, содержат регионы, которые формируют структуры гибридных дуплексов с последовательностями областей-мишеней в ВГС-полинуклеотидах. ВГС-полинуклеотидные гибридизационные районы олигомеров могут быть установлены из сДНК-последовательностей ВГС, описанных как в данном описании, так и в РCТ/ W 090/14436. На фиг.1 показан композиционный материал сДНК ВГС от ВГС1, прототипный ВГС. Композиционная последовательность базируется на информации по секвенированию, полученной от ряда кДНК-клонов ВГС, которые были выделены из ряда библиотек сДНК ВГС, в том числе из библиотеки "с" амер.колл. культур (АТСС) 40394, ламбда gt II ( gt II) и из сыворотки крови человека. Клоны кДНК ВГС были выделены способами, описанными в PCT/W 090/14436. Если изложить существо вопроса кратко, большинство выделенных клонов содержали последовательности из библиотеки "с" кДНК ВГС, которая была построена с использованием смешанной сыворотки от шимпанзе, инфицированных х