Гептапептидные аналоги окситоцина

Гептапептидные аналоги окситоцина

Реферат

 

Изобретение относится к гептапептидным аналогам окситоцина общей формулы S-Z, где S представляет собой гексапептидную группировку, a Z представляет собой -NR-CH(Q)-CH₂ОH, Q представляет собой (CH₂)-NH-A, n представляет собой число от 1 до 6, А представляет собой Н, и R представляет собой СН₃ или С₂Н₅, обладающие активностью антагонистов окситоцина. Предлагаемые соединения имеют улучшенную стабильность в водной среде при сохранении селективности и терапевтической эффективности. Описан также способ их получения, фармацевтическая композиция, содержащая аналоги окситоцина, способ получения фармацевтической композиции и способ лечения преждевременных родов. 5 с. и 24 з.п. ф-лы, 6 табл.

Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к новым гептапептидным аналогам (т.е. гептапептидам, в которых N-концевой остаток деаминирован и С-конец восстанавлен до спирта), проявляющим активность антагониста окситоцина, полезную, в частности, для уменьшения или блокирования сокращения мышц матки, связанного с преждевременными родами и менструальной болью. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим эти пептидные аналоги, и к их использованию.

Предпосылки изобретения Окситоцин представляет собой пептидный гормон. Он стимулирует сокращение мышц матки. Полагают, что по этой причине он вовлечен в этиологию преждевременных родов и менструальной боли. Кроме того, полагают, что антагонисты окситоцина могли бы быть полезны для контроля этих состояний. Известны пептиды-антагонисты окситоцина достаточной силы и селективности для терапевтического использования. Их часто назначают для введения в водном растворе. Производство готовых к применению доз таких антагонистов требует того, чтобы эти растворы были стабильными в течение длительных периодов, что не всегда соответствует действительности. В таких случаях, лекарство должно быть приготовлено непосредственно перед применением, например, из лиофилизированного пептида или его фармацевтически приемлемой соли. Этот способ обработки неудобен и вызывает риск контаминации.

Задачи изобретения Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить новые антагонисты окситоцина, которые представляют собой гептапептидные аналоги, обладающие улучшенной стабильностью в водной среде, при сохранении достаточной силы и селективности для терапевтической эффективности.

Другая задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить фармацевтические композиции, содержащие указанные новые гептапептидные аналоги-антагонисты окситоцина и обладающие улучшенными стабильностью и, следовательно, сроком хранения.

Другая задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ лечения медицинского состояния, связанного с чрезмерным или нежелательным маточным сокращением, который представляет собой введение фармацевтической композиции, содержащей указанный гептапептидный аналог.

Резюме Данное изобретение включает в себя класс соединений, которые представляют собой гептапептидные аналоги, фармацевтические композиции, содержащие такие аналоги, и использование этих композиций, которое представляет собой лечение маточных сокращений, особенно в связи с преждевременными родами и менструальной болью.

Гептапептидные аналоги по изобретению, обладающие активностью антагониста окситоцина, имеют общую формулу S-Z, включающую в себя N-концевую гексапептидную группировку S и С-концевой -аминоспирт Z, который, как считают в дальнейшем, является формальным эквивалентом седьмой аминокислоты гептапептида. Группировка S имеет структуру где Мра, Ile, Asn и Abu имеют следующие значения: Мра - остаток 3-меркаптопропионовой кислоты (иначе называемый дезаминоцистеином); Ile - остаток изолейцина; Asn - остаток аспарагина; Abu - остаток -аминомасляной кислоты; и где Х представляет собой ароматическую D-D--аминокислоту и Y представляет собой алифатическую -аминокислоту. Аминоспирт 2 имеет структуру где R представляет собой метил или этил, и Q представляет собой -(CH₂)_n-NH-A, где n представляет собой число от 1 до 6, и А представляет собой Н.

Соединения по изобретению могут образовывать соли, образованные присоединением кислоты, и в той степени, в которой эти соли являются фармацевтическим приемлемыми, их включают в объем данного изобретения.

Соединения могут быть включены либо в твердые, либо в жидкие составы. Примеры таких составов включают в себя таблетки, капсулы, растворы и суспензии. Другие компоненты таких составов могут включать в себя, например, разбавители, диспергаторы, консерванты, буферные агенты, корригенты и агенты, регулирующие осмотическое давление. Твердые составы особенно пригодны для перорального введения, тогда как растворы наиболее пригодны для инъекций (внутривенно, внутримышечно или подкожно) или интраназального введения. Особенное достоинство соединений по изобретению заключается в том, что их растворы более стабильны при длительном хранении, чем растворы ранее известных соединений сопоставимой силы.

Приготовленный фармацевтический препарат полезен для контроля маточных сокращений. Два показания, когда такой контроль, вероятно, является необходимым, представляют собой преждевременные роды и менструальную боль. Когда фармацевтические препараты используют при оказании помощи при преждевременных родах, их можно использовать в качестве экстренных токолитических агентов вслед за началом родов и в качестве поддерживающей терапии для предотвращения повторения таких эпизодов.

Подробное описание изобретения В соответствии с настоящим изобретением описываются гептапептидные аналоги, проявляющие терапевтически полезную активность антагониста окситоцина и обладающие улучшенной стабильностью в водной среде.

Согласно данному изобретению предложен гептапептидный аналог, обладающий активностью антагониста окситоцина, общей формулы S-Z, где S представляет собой гексапептидную группировку, и Z представляет собой С-концевой -аминоспиртовой остаток, связанный с группировкой S амидной связью, при этом -аминоспирт Z представляет собой где Q представляет собой (CH₂)_n-NH-A, n представляет собой число от 1 до 6, и А представляет собой Н, и где R представляет собой СН₃ или C₂H₅; а группировка S представляет собой где Мра, Ile, Asn и Abu имеют следующие значения: Мра - остаток 3-меркаптопропионовой кислоты; Ile - остаток изолейцина; Asn - остаток аспарагина; Abu - остаток -аминомасляной кислоты; и где Х представляет собой D-ароматическую -аминокислоту; а Y представляет собой алифатическую -аминокислоту; или его фармацевтически приемлемая соль.

Под ароматической -аминокислотой подразумевают -аминокислоту, в которой боковая цепь включает в себя ароматическую кольцевую систему. Такая система может быть карбоциклической или гетероциклической, моноциклической или конденсированной. Примеры ароматических -аминокислот включают в себя (но не ограничиваются ими) фенилаланин, тирозин, (О-этил)тирозин, триптофан, -(2-нафтил)аланин и фенилглицин. Следует отметить, что остаток Х представляет собой остаток в неестественной D-конфигурации в соединениях по изобретению.

Под алифатической -аминокислотой подразумевают -аминокислоту, в которой боковая цепь имеет лишь углеродные и водородные атомы. Такие боковые цепи будут включать в себя алкильные и циклоалкильные группы. Они могут быть ненасыщенными, но могут не включать в себя ароматические остатки. Включены боковые цепи, состоящие из атомов углерода в количестве от 1 до 12, хотя предпочтительный диапазон составляет от 3 до 7 атомов углерода. Примеры алифатических -аминокислот включают в себя (но не ограничиваются ими) аланин, валин, лейцин, циклогексилглицин и адамантилаланин. Остаток Y имеет естественную L- конфигурацию.

В структуре гексапептидной группировки аналога S линия, связывающая остатки Мра и Abu, имеет свое обычное значение. Она означает, что существует ковалентная связь, соединяющая концы боковых цепей этих двух остатков. В этом случае, атом серы остатка Мра связан ковалентной связью с - (или 4-м) атомом углерода остатка Abu.

Аминоспиртовая группировка Z включает в себя стереогенный центр и, таким образом, может существовать в двух эпимерных формах, R и S, соответствующих D и L изомерам родственных аминокислот. Гептапептидные аналоги с любым из этих изомеров включены в объем данного изобретения, так же как и смеси эпимеров. Предпочтительно аминоспиртовая группировка присутствует в виде единственного эпимера, и предпочтительно он имеет S конфигурацию.

В контексте настоящего изобретения считают, что остаток Мра и аминоспирт Z являются формальными эквивалентами -аминокислот, и соединения по изобретению соответственно называют гептапептидными аналогами.

В предпочтительном воплощении изобретения, Х представляет собой либо остаток D-триптофана, либо остаток -(2-нафтил)-D-аланина.

В другом предпочтительном воплощении изобретения Y представляет собой остаток одного из: валина, лейцина, изолейцина, аллоизолейцина, циклогексилаланина и (,-диэтил)аланина.

В другом предпочтительном воплощении изобретения n находится в диапазоне от 2 до 4.

В более предпочтительном воплощении изобретения Х представляет собой либо остаток D-триптофана, либо остаток -(2-нафтил)-D-аланина, и Y представляет собой остаток одного из: валина, лейцина, изолейцина, аллоизолейцина, циклогексилаланина и (,-диэтил)аланина.

Особенно предпочтительное воплощение по изобретению представляет собой пептидный аналог, выбираемый из (см. в конце описания).

Наиболее предпочтительное воплощение по изобретению представляет собой пептидный аналог Соединения по изобретению содержат основной центр (амин) и, следовательно, могут образовывать соли с кислотами, которые сохраняют фармакологические свойства свободных оснований. Соответственно, такие соли включены в объем данного изобретения. Примеры таких солей включают в себя (но не ограничиваются ими) гидрохлорид, гидробромид, сульфат, ацетат, цитрат, бензоат, трифторацетат и метилсульфонат. Также в соответствии с изобретением раскрыты фармацевтические композиции, которые включают в себя фармакологически эффективное количество по меньшей мере одного из гептапептидных аналогов-антагонистов окситоцика, описанных выше. Композиции могут также включать в себя фармацевтически приемлемые добавки, такие как консерванты, разбавители, диспергаторы, агенты, способствующие всасыванию через слизистую оболочку (примеры которых описаны Merkus, F. W. Н. М. и др., J. Controlled Release 24, 201-208, 1993, и которые включают в себя поверхностно-активные вещества, желчные кислоты, фузидаты, фосфолипиды и циклодекстрины), буферные агенты и корригенты. Такие композиции можно приготовить в твердом виде (например, в виде таблеток, капсул или порошков) или в виде жидкостей (например, в виде растворов или суспензий), которые здесь используют для включения паст и мазей для перорального или парентерального введения. Пероральное (включая подъязычное и трансбуккальное), интраназальное, легочное, чрескожное, ректальное, вагинальное, подкожное, внутримышечное и внутривенное введение могут все быть подходящими путями для введения дозы.

Предпочтительные композиции в соответствии с изобретением представляют собой стерильный водный раствор гептапептидного аналога, как описано, и особенно изотонический солевой раствор, пригодный для интраназального введения или внутривенной инъекции. Этот раствор может содержать буферный агент для поддержания рН раствора в диапазоне 3,0-7,0 и предпочтительно в диапазоне 3,5-5,5. Буфер представляет собой, например, фосфат/цитратный буфер.

Другая предпочтительная композиция в соответствии с изобретением представляет собой таблетку для перорального введения. Особенно предпочтительна таблетка, которая покрыта веществом, которое по существу не растворимо при низком рН, таком, как в желудке, но которое растворяется при более нейтральном рН тонкой кишки для высвобождения пептидного аналога для всасывания. Примеры таких покрытий описаны в PCT/SE94/00244 и в PCT/SE95/00249, которые включены в описание настоящего патента путем ссылки.

Дальнейшее описание изобретения представляет собой способ уменьшения или прекращения нежелательных сокращений мышц матки. Этот способ представляет собой введение субъекту эффективного количества одного из гептапептидных аналогов-антагонистов окситоцина по изобретению, предпочтительно приготовленного в виде композиции, как описано выше. Очевидно, что это описание изобретения равносильно описанию использования этих соединений и составов по изобретению.

Особенно предпочтительное воплощение по изобретению представляет собой способ прекращения сокращений матки при преждевременных родах. Вслед за первоначальным вмешательством, которое включает период от 1 до 3 дней, лечение может быть продолжено для предотвращения повторения родов до того времени, которое считает подходящим лечащий врач. Таким образом, существуют два аспекта этого воплощения, экстренное токолитическое применение и поддерживающее терапевтическое использование.

Другое предпочтительное воплощение по изобретению представляет собой способ уменьшения болезненых сокращений матки, связанных с менструацией.

Количество гептапептидного аналога, которое составляет терапевтически эффективную дозу, будет зависеть от ряда факторов. Путь введения будет важным фактором. Внутривенная инъекция вероятно является наиболее эффективным путем доставки, тогда как можно ожидать, что интраназальное введение является более эффективным, чем пероральное введение дозы. Соответственно, меньше соединения потребуется для разовой внутривенной дозы, чем для разовой интраназальной дозы, и больше соединения потребуется для разовой пероральной дозы. Лечащий врач должен также учитывать такие факторы, как возраст, масса и состояние здоровья пациента. Для контроля менструальной боли также вероятно требуется меньше соединения, чем для контроля преждевременных родов. Количество соединения, которое составляет разовую эффективную дозу для внутривенного лечения женщины среднего возраста при преждевременных родах, составляет от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 500 мг и предпочтительно от приблизительно 1 мг до приблизительно 200 мг в течение 24 ч.

Гептапептидные аналоги по настоящему изобретению селективно подавляют сокращения мышц матки при отсутствии нежелательных свойств агонистов окситоцина. Они также обладают незначительным или не обладают антидиуретическим, гипотензивным или гипертензивным действиями, которые потенциально могли бы быть побочными эффектами аналогов окситоцина и родственного гормона вазопрессина. Они сравнимы по силе с теми соединениями, известными из уровня техники, с которыми они наиболее структурно схожи. Они отличаются от этих соединений, которые описаны в WO 95/02609, по природе С-концевого остатка. Эти известные соединения имеют карбамоильную функциональную группу (-CONH₂), где соединения по настоящему изобретению имеют первичный спирт (-СН₂OН). Соединения по настоящему изобретению превосходят соединения по W095/02609 в отношении их стабильности, особенно в водной среде. Когда соединения необходимо приготовить в виде водного раствора, который, следовательно, будет иметь более длинный срок хранения и менее строгие требования для замораживания, то это, очевидно, является преимуществом, но это также является преимуществом в процессах производства и приготовления, которые включают в себя периоды, когда соединения находятся в растворе даже если конечное соединение представляет собой твердое вещество.

Хотя ранее было отмечено, что соединения по изобретению особенно полезны при контроле сокращений мышц матки, для специалиста в данной области техники будет понятно, что возможно другое терапевтическое использование антагонистов окситоцина. Например, другой мешенью действия окситоцина является молочная железа, в которой он способствует выделению молока. Соединения по изобретению можно, следовательно, использовать для контроля нежелательной лактации. Они также могут быть полезны для контроля некоторых опухолей, особенно опухолей молочной железы и вторичных метастазов, происходящих из первичной опухоли молочной железы. Гиперплазия простаты возможно является дополнительной терапевтической мишенью. Также предположили, что окситоцин вовлечен в развитие желтого тела и облегчение транспорта сперматозоидов после коитуса. Из этого можно заключить, что соединения по изобретению возможно являются полезными в качестве контрацептивных или регулирующих фертильность агентов. Еще одной периферической мишенью окситоцина является иммунная система. Антагонисты окситоцина, следовательно, потенциально полезны в качестве иммуномодулирующих и противовоспалительных агентов. Окситоцин также присутствует в головном мозге, где, как предполагают, играет роль в этиологии таких разнообразных состояний, как психогенная эректильная дисфункция, шизофрения и нейрофизиологические недостаточности, вызванные алкоголем. У некоторых видов, как было показано, он оказывает действие на комплексное социальное поведение. Соответственно, соединения по изобретению возможно использовать в качестве, например, антипсихотических или агентов, усиливающих познавательную способность. Предполагается, что использование соединений по изобретению при любом из этих терапевтических состояний находится в объеме данного описания.

В последующем, изобретение будет описано в общем и при помощи конкретных примеров. Следует понимать, что предполагают, что это описание не ограничивает объем данного изобретения и что такие воплощения, как те, которые известны из уровня техники и которые практикующий врач мог бы рассматривать как эквивалентные, в равной степени находятся в объеме данного изобретения.

Общие способы синтеза Химические превращения, необходимые для осуществления синтеза соединений по изобретению, хорошо известны из уровня техники. Методики химии пептидов как в растворе, так и на твердых носителях являются особенно уместными. Способы синтеза пептидов в растворах описываются в следующих ссылках: Law, Н. В. и Du Vigneaud, V., J. Am. Chem. Soc. 82, 4579-4581, 1960; ZhuZe, A. L. и др., Coil. Czech. Chem. Comm. 29, 2648-2662, 1964; и Larsson, L.-E. и др., J. Med. Chem. 21, 352-356, 1978.

Твердофазные способы обсуждаются в: Merrifield, R. В., J. Am. Chem. Soc. 85. 2149, 1963; Mezzifield, R. B., Biochemistry 3, 1385, 1964; и Konig, W. и Geiger, R., Chem. Ber. 103, 788, 1970.

Путь, использованный изобретателями, обсуждают в общих чертах ниже и затем подкрепляют примерами. Для специалистов в практической химии пептидов является очевидным, что последовательность, в которой проводятся некоторые из превращений, может быть изменена. Такие очевидные варианты находятся в рамках данного изобретения.

Наиболее часто, исходное вещество будет представлять собой защищенную N-алкиламинокислоту общей формулы 1 R и n выбирают из возможностей, кратко изложенных ранее. Р¹ представляет собой защитную группу азота. Особенно предпочительно, когда Р¹ представляет собой 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc).

Когда А в заявленном соединении представляет собой Н, то либо Р² представляет собой защитную группу азота, отличную от Р¹ (например, бензилоксикарбоксил), и Р³ представляет собой Н или то же самое, что и Р², либо Р² и Р³ вместе представляют собой двухвалентную защитную группу азота (например, фталоил).

Когда защищенные N-алкиламинокислоты общей формулы 1 не являются комерчески доступными, их можно получить способами, описанными в литературе, или способами, аналогичными им.

Предполагая, что должны быть использованы твердофазные способы, аминокислоту 1 присоединяют к подходящей смоле с образованием 3 в качестве первого промежуточного соединения где Res представляет собой полимерную смолу, Р¹ отщепляют и FmocAbu (SCH₂CH₂CO₂t-Bu)OH присоединяют с образованием 4 Пептид удлиняют последовательным присоединением FmocAsn, FmocY, Fmoclle и затем ВосХ. Когда Х представляет собой D-Тгр, то было бы полезно защитить индольный азот путем образования его формильного производного. Использование защиты при помощи Вос для этой аминокислоты позволяет осуществить одновременное отщепление трет-бутилового эфира и N-концевой защитой группы. На этой стадии присутствует промежуточное соединение 5 Пептид отщепляют от смолы, используя подходящие стандартные условия, и затем этерифицируют, например, путем обработки бензилбромидом с образованием бензилового эфира 6 (Это можно записать в виде Группа Воc и трет-бутиловый эфир отщепляют при помощи обработки кислотой и полученные амино и кислотную группы конденсируют с образованием макроцикла. Бензиловый эфир затем восстанавливают с образованием первичного спирта заявленного соединения, например, путем реакции с борогидридом натрия в водном изопропаноле. Удобным образом удаление оставшихся защитных групп можно также осуществить во время этого превращения. Если этого не происходит, то необходима конечная стадия снятия защитной группы. Продукт выделяют и очищают, используя стандартные способы.

Следующие конкретные примеры были получены в соответствии с этой общей схемой. Они являются представителями соединений по настоящему изобретению. Используют следующие сокращения: TBTU - 2-(1-Н-бензотриазол-1-ил)-1, 1, 3,3-тетраметилуронийтетрафторборат Воc - трет-бутилоксикарбонил Fmoc - 9-флуоренилметилоксикарбонил TFA - трифторуксусная кислота DMF - диметилформамид DBU - 1,8-диазабицикло(5, 4, 0)ундек-7-ен Вn - бензил Orn - орнитин Pht - фталоил Защищенные аминокислоты получали в соответствии со следующим: FmocAbu(SCH₂CH₂CO₂t-Bu) получали в соответствии с Prochazka, E. и др., Coll. Czech. Chem. Comm. 57, 1335, 1992; FmocNMeOrn(Pht) получали аналогично способу, использованному для производных лизина по Freidinger, R. М. и др., J. Оrg. Chem. 48, 77, 1983; Fmoc-аллоllе получали в соответствии с Ten Kortenaar, Р. В. W. и др., Int. J. Peptide Protein Res. 27, 398, 1986; FmосА1а(3,3-диэтил) получали в соответствии с Eisler, К. и др., Coll. Czech. Chem. Comm. 31, 4563, 1966; Boc-D-Trp(CHO); Boc-D-Nal; FmocAsn; Fmoclle; FmocVal; FmocLeu; FmocCha все получены от Bachem (Швейцария и США).

Пептид la синтезировали, используя твердофазную методику, на ортохлортритиловой смоле и с использованием Fmoc.

Первую аминокислоту FmocNMeOrn(Pht)OH, присоединяли к смоле. Отщепление группы Fmoc достигали при помощи 2% DBU в DMF. Другие остатки последовательно присоединяли, заканчивая Вос-D-Тгр(СНО)ОН. Пептид, присоединенный к смоле, обрабатывали смесью уксусная кислота/трифторэтанол/дихлорметан (1:2: 7), затем смесь фильтровали и фильтрат выпаривали и сушили вымораживанием. Полученную кислоту пептида этерифицировали взаимодействием с бензилбромидом (2 экв.) и дииозпропилэтиламином (2,5 экв.) в DMF в течение 27 ч. Растворитель выпаривали и остаток лиофилизировали из уксусной кислоты N концевую группу Вос и трет-бутиловый эфир 1а отщепляли обработкой 95% TFA/2,5% анизола/2,5% воды в течение 1,5 ч при комнатной температуре. TFA выпаривали и продукт осаждали добавлением диэтилового эфира. Пептид циклизовали обработкой TBTU (1 экв.) и М-метилморфолином (17 экв.) в DMF при комнатной температуре. Растворитель выпаривали и пептид Iб очищали обращеннофазной хроматографией Очищенный бензиловый эфир Iб обрабатывали NaBH₄ (7 экв.) в растворе в смеси изопропанол/вода (6: 1) при комнатной температуре в течение 22 ч в атмосфере инертного газа. Добавляли уксусную кислоту (18 экв.) и смесь нагревали при 80^oС в течение 6 ч. Растворитель выпаривали и продукт реакции, пептид 1 в ( "пептид I") очищали обращеннофазной жидкостной хроматографией: неподвижная фаза; Kromasil 13 мкм или 5 мкм, 100 А^o, C₁₈ или С₈ (ЕКА Nobel, Швеция): подвижная фаза; ацетонитрил/ 0,1% TFA в воде. Выход 14 мг. Масс-спектрометрия (электрораспылительная ионизация, анализ ионного захвата, позитивный режим) свидетельствовала о соответствии молекулярной массы предполагаемой структуре (обнаружено m/z = 830, 5 [МН⁺]; рассчитано для [C₄₀Н₆₃N₉О₈S+Н⁺] m/z =830.5).

Примеры II-VII Используя тот же самый способ, как в примере I, и замещением подходящих защищенных аминокислот на Boc-D-Trp(CHO)OH и Fmoc-аллоllеОН, получили пептиды, перечисленные в таблице 1 (см. в конце описания).

Некоторое количество амидов эталонных пептидов получили способами, описанными в WO 95/02609 для того, чтобы сравнить свойства настоящего изобретения со свойствами тех, что известны из уровня техники. Эти эталонные пептиды перечислены в таблице 2 (см.в конце описания).

Пример VIII Используя способ примера I, но замещая N-этилорнитин на N-метиламинокислоту, получали следующий пептид (VIII) (обнаружено m/z = 855,1 [MH⁺], рассчитано для [C₄₁H₆₅N₉O₈S+H⁺] m/x = 855,5).

Пример IX Биологическая оценка соединений Соединения по настоящему изобретению можно оценить в нескольких биологических системах in vitro и in vivo. Эти тестовые системы выбирают таким образом, чтобы они были настолько уместны по отношению к предполагаемому пациенту-человеку, насколько это возможно.

1. Анализ связывания окситоцинового рецептора Рекомбинантные окситоциновые рецепторы человека экспрессировались либо в клетках яичника китайского хомячка, либо в клетках НЕК293, используя стандартные способы молекулярной биологии. Получали мембранную фракцию и инкубировали в присутствии [¹²⁵l ]-окситоцина и варьирующих концентраций гептапептидного аналога. Мембраны затем выделяли фильтрацией и измеряли на радиоактивность для определения связывания окситоцина. Константу ингибирования K_j определяли для аналога. Полученные результаты представлены в таблице 3 (см. в конце описпания).

2. Действие антагониста in vitro на модели матки человека Мышечную ткань матки, взятую у женщины, находящейся в поздней стадии беременности, подвергнутой кесареву сечению, резали на узкие полоски, которые помещали в ванну для ткани, наполненую буфером Кребса-Рингера, и оксигенировали газом карбогеном (95% O₂ + 5% СO₂). Изменения в изометрическом напряжении мышц, выявляемые при помощи датчика, записывали на полиграфе Грасса.

Записывали кривую зависимости "концентрация-эффект" для окситоцина. Эффект, измеренный в этом случае, соответствует суммарному значению интегральной кривой сокращения в течение периода 10 минут вслед за введением агониста (т.е. окситоцина). Выбрали концентрацию окситоцина, обеспечивающую по меньшей мере половину максимального ответа. Эту концентрацию агониста вводили в ткань в присутствии различных концентраций гептапептидного аналога-антагониста и ответ записывали. Концентрацию антагониста, необходимую для уменьшения этого ответа на 50% от его контрольной величины, определяли путем регрессионного анализа, и она здесь приведена в виде величины IC₅₀. [величина IC₅₀ = концентрации антагониста, необходимой для уменьшения эффекта заданной дозы агониста на 50%]. Результаты приведены в таблице 4 (см. в конце описания).

3. Модель крысы in vivo Крыс Sprague Dawley (около 250 г), находящихся в естественном эструсе, анестезировали Инактином (Inactin) (0,5 мг/100 г веса тела, интраперитонеально). Активность миометрия измеряли при помощи катетера, фиксированного в полости матки и наполненного модифицированным раствором Локеса. Катетер соединяли с динамометрическим датчиком Statham P23d и сокращения записывали на полиграфе Грасса (модель 7D).

Записывали кривую зависимости "доза-ответ" для окситоцина (2х10^-4 -5х10^-3 мкмоль/кг). В этом случае ответ количественно оценивали интегрированием кривой в течение 15 минут после инъекции агониста. Выбирали дозу окситоцина, обеспечивающую эффект, соответствующий внутриполостному давлению сокращения 10-30 мм рт. ст., и в пределах линейного участка кривой. Эту дозу окситоцина вводили животным вместе с по меньшей мере двумя различными дозами антагониста и эффект записывали. Дозу антагониста, которая уменьшает эффект агониста на 50% от его контрольной величины, определяли интерполяцией, и здесь ее приводят в виде величины ID₅₀ [величина ID₅₀ = дозе антагониста, необходимой для уменьшения эффекта заданной дозы агониста на 50%]. Результаты приведены в таблице 5.

Продолжительность действия антагонистов также определяли в этой модели. Выбирали дозу окситоцина (2х10^-4 - 5х10^-3 мкмоль/кг), обеспечивующую эффект, соответствующий половине максимального эффекта (эта доза представляет собой ED₅₀). Этот эффект, определенный здесь, является таким же, как для определения ID₅₀, описанного выше. Дозу антагониста выбирали (8х10^-4 - 4х10^-3 мкмоль/кг) так, чтобы получить по меньшей мере 50% подавление ответа агониста. В начале эксперимента совместно вводили разовые дозы агониста и антагониста. После этого через 20-минутные интервалы вводили дозы одного агониста (без антагониста) и ответ измеряли. Время, необходимое для подавления эффекта агониста так, чтобы снизить его до 25% от его начальной величины, определяли интерполяцией, и здесь приводят в виде величины t₇₅ [ величина t₇₅ = периоду времени, необходимому для снижения эффективности разовой дозы на 75%]. Результаты представлены в таблице 5 (см. в конце описания).

Очевидно из результатов, представленных в таблицах 3-5, что соединения по настоящему изобретению по меньшей мере так же хороши, как предыдущие соединения на модели крысы, как в терминах силы, так и продолжительности действия, и то, что они превосходят предыдущие соединения на более уместной модели человека.

Пример Х Фармацевтические составы Раствор в изотоническом забуференном солевом растворе для внутривенной инъекции.

Готовили следующие растворы: Раствор А (0,02 М лимонная кислота) моногидрат лимонной кислоты - 0,42 г Дистиллированная вода - До 100 мл Раствор Б (0,04 М вторичный кислый ортофосфат натрия) Na₂HPO₄ 2Н₂O - 0,712 г Дистиллированная вода - До 100 мл К 27 мл раствора А добавлют 23 мл раствора Б, 0,81 г NaCl и 0,322 г ацетата пептида I. рН доводят до 4,5 раствором А, затем добавляют дистиллированную воду с получением общего объема 100 мл. Наконец, смесь фильтруют через Sterivex-GV 0,22 мкм. Получают изотонический раствор, содержащий 0,3 мг/мл пептида I (рассчитанного на свободное основание), подходящего для внутривенной инъекции.

Таблетки для перорального введения Составляли следующие компоненты: Ацетат пептида I - 108 мг Маннит - 7,7 г Лактоза - 6,0 г Микрокристаллическая целлюлоза - 6,0 г Поперечносшитая карбоксиметилцеллюлоза - 200 мг Тальк - 800 мг Стеарат магния - 200 мг Поливинилпирролидон/этанол - До связывания Перемешаную смесь формовали в таблетки, используя стандартные способы. Смесь достаточна для приготовления 100 таблеток, содержащих 1 мг пептида (рассчитанного на свободное основание) каждая.

Энтеросолюбильная таблетка для перорального введения 25 из вышеупомянутых таблеток были покрыты распылением сжатым воздухом 100 мг фталата ацетата целлюлозы (4 мг на таблетку).

Также полезной в изобретении является композиция, описанная в WO 95/25534 в которой активный агент (десмопрессин, например) можно заместить соединениями по настоящему изобретению. Адаптация этой композиции к обработке больших количеств активных агентов, которые необходимо включить в таблетку, легко доступна для специалистов в данной области техники.

Пример XI Оценка стабильности Растворы гептапептидных аналогов по настоящему изобретению получали из композиций, представляющих собой водные составы. Растворы хранили в течение нескольких недель при 50^oС и аликвоты периодически отбирали для анализа при помощи ВЭЖХ. Эталонные пептиды изучали параллельно. Разложение определяли как потерю пептида (% по массе в неделю), независимо от природы продуктов разложения. Результаты представлены в таблице 6 (см. в конце описания).

Результаты, представленные выше, ясно свидетельствуют, что соединения по изобретению более стабильны в растворе, чем ранее описанные соединения. На практике это увеличенная стабильность означает, что водные составы будут обладать более длинным сроком хранения и у них будет меньше требований к необходимости хранения в замороженном состоянии. Помимо вытекающих финансовых сбережений, будет наблюдаться выгода как в отношении удобства, так и в отношении безопасности, так как уменьшится необходимость приготавливать индивидуальные дозы непосредственно перед введением.

Производственные процессы также будут выгодны, так как соединения будут более устойчивы к разложению во время и после очистки.

Формула изобретения

1. Гептапептидный аналог, обладающий активностью антагониста окситоцина, общей формулы S-Z где S представляет собой гексапептидную группировку, и Z представляет собой С-концевой -аминоспиртовой остаток, связанный с группировкой S амидной связью, при этом -аминоспирт Z представляет собой где Q представляет собой (СН₂)_n-NH-А, n представляет собой число от 1 до 6, и А представляет собой Н, и где R представляет собой СН₃ или С₂Н₅; а группировка S представляет собой где Мра, Ile, Asn и Abu имеют следующие значения: Мра - остаток 3-меркаптопропионовой кислоты; Ile - остаток изолейцина; Asn - остаток аспарагина; Abu - остаток -аминомасляной кислоты; и где Х представляет собой D-ароматическую -аминокислоту; а Y представляет собой алифатическую -аминокислоту; или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Гептапептидный аналог по п. 1, где Х представляет собой аминоацильный остаток D-триптофана или -(2-нафтил)-D-аланина.

3. Гептапептидный аналог по п. 2, где Y представляет собой аминоацильный остаток лейцина, валина, изолейцина, аллоизолейцина, ,-диэтилаланина, циклогексилаланина или циклогексилглицина.

4. Гептапептидный аналог по п. 1, где Y представляет собой аминоацильный остаток лейцина, валина, изолейцина, аллоизолейцина, ,-диэтилаланина, циклогексилаланина или циклогексилглицина.

5. Гептапептидный аналог по п. 4, в котором n представляет собой число 2,3 или 4.

6. Гептапептидный аналог по п. 1, в котором n представляет собой число 2,3 или 4.

7. Гептапептидный аналог по п. 6, где Х представляет собой аминоацильный остаток D-триптофана или -(2-нафтил)-D-аланина.

8.