Способ регуляторного воздействия на первичные механизмы основных защитных реакций организма в норме и патологии: иммунной реакции, воспалительной реакции, свободнорадикального процесса, - с помощью вещества гамма- глутамилгистамин

Способ регуляторного воздействия на первичные механизмы основных защитных реакций организма в норме и патологии: иммунной реакции, воспалительной реакции, свободнорадикального процесса, - с помощью вещества гамма- глутамилгистамин

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, в частности к области фармакологии, к лекарственным веществам, применяемым для профилактики и лечения заболеваний, в механизмах патогенеза которых первичными биохимическими звеньями являются выброс из депо гистамина и/или гиперактивация свободнорадикального процесса. Для этого используют гамма-глутамилгистамин в дозах 0,01-250 мг/кг веса тела в сутки. Заявляемый способ по сравнению с известными позволяет сочетать иммунокорригирующее, антиаллергическое, ранозаживляющее, противовоспалительное и антиоксидантное воздействие на организм. Предлагаемое средство нетоксично, при минимальных дозах обладает значительной широтой терапевтического действия. 4 з.п.ф-лы, 15 ил., 7 табл.

Изобретение относится к области фармакологии. Сущность изобретения - способ регулировки активности первичных биохимических защитных систем организма в норме и патологии с помощью вещества гамма-глутамилгистамин. В частности, регулирование интенсивности иммунной реакции, воспалительного процесса, свободнорадикального процесса, с помощью гамма-глутамилгистамина, без влияния последнего на рецепторные системы, на сердечно-сосудистую систему, без системных осложнений и токсических эффектов.

Нарушения механизмов регуляции иммунного ответа приводят к развитию аллергических заболеваний, которыми страдает 25% населения; наблюдается тенденция к усилению степени их тяжести и увеличению частоты встречаемости, в особенности пищевыми аллергиями [1, 2, 3]. Воспалительный процесс является ведущим звеном в патогенезе многих заболеваний и первичным звеном в патогенезе посттравматических и послеоперационных состояний. Выход из-под контроля организма свободнорадикального процесса является ключевым звеном в механизмах патогенеза радиационных и химических поражений, эндо- и экзогенных интоксикаций, в патогенезе раннего увядания кожи; свободнорадикальный процесс принимает также участие в патогенезе основных заболеваний человека [4, 5].

Клиническими аналогами заявляемого способа являются способы медикаментозной профилактики и лечения указанных групп заболеваний. В этих способах используют химические вещества, относящиеся к различным классам химических соединений. Общность между этими способами состоит: в их воздействии на вторичные, отсроченные этапы в механизмах развития патологических состояний; в однонаправленном характере их воздействия на защитные реакции, что приводит, например, к подавлению как деструктивной, так и конструктивной фаз воспалительной реакции; в использовании в качестве действующих веществ ксенобиотиков, активирующих свободнорадикальные реакции, обладающих достаточно высокой токсичностью, ярко выраженными побочными эффектами, в том числе инициирующих язвообразование в желудочно-кишечном тракте, имеющими широкий круг противопоказаний, проявляющих фармакологические эффекты, как правило, в относительно высоких дозах и обладающих невысоким терапевтическим диапазоном.

Отличие заявляемого способа от существующих способов состоит в том, что в заявляемом способе: воздействие оказывается на ключевые, первичные этапы в механизмах запуска патологических реакций, воздействие носит регуляторный характер, то есть усиливается конструктивная фаза и ослабляется деструктивная фаза защитной реакции, используемое нексенобиотическое вещество препятствует гиперактивации свободнорадикального процесса, проявляет фармакологическую активность в низких дозах и не проявляет токсические эффекты в физически осуществимых максимальных дозах, не обладает выявленными противопоказаниями, защищает от химического язвообразования желудочно-кишечного тракта.

При аллергических заболеваниях применяют конкурентные ингибиторы Н1-рецепторов гистамина. Фармакологический эффект проявляется при условии блокировки достаточно большого числа рецепторов от связывания с гистамином, выбрасываемым из депо. Примеры препаратов: вещество хлорпирамина гидрохлорид (препарат "Супрастин"), его побочное действие - седативный эффект, противопоказания - осуществление деятельности требующей повышенного внимания.

Для лечения воспалительных заболеваний применяют стероидные и нестероидные препараты. Стероидные препараты вызывают тяжелые нарушения гормональной регуляции и в данном сравнении не используются. Примеры нестероидных препаратов: вещество ибупрофен (препараты "Ибупрофен", "Ламидон"), вещество диклофенак натрия (препараты "Диклофенак", "Диклофенак натрия", "Ортофен", "Вольтарен"). Побочные действия - аллергические реакции, повышение артериального давления, головокружение, нарушение функционирования желудочно-кишечного тракта. Противопоказания - язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки и др.

Для лечения ран применяют две основных группы препаратов. С одной стороны, это - препараты, стимулирующие собственно заживление ран, как правило, сложные препараты биологического происхождения, например "Солкосерил". И с другой стороны, препараты и средства, предназначенные для очистки ран от дебриса и серозного выпота, а также антимикробные препараты.

Для профилактики и лечения заболеваний и поражений, в механизмах патогенеза которых ведущую роль играет гиперактивация свободнорадикального процесса: радиационные поражения, раннее увядание кожи и др. - используют так называемые "ловушки", "чистильщики", "уборщики" (scavenger) уже образованных свободных радикалов: антиоксиданты с полиненасыщенными связями, например витамин Е, или хелатные соединения ионов металлов с переменной валентностью [4, 5].

Вещество гамма-глутамилгистамин было обнаружено ранее в организмах млекопитающих и беспозвоночных животных [6, 7, 8, 9].

Биологическая роль вещества гамма-глутамилгистамин и возможность его фармакологического применения неизвестны.

Автор настоящего изобретения постулировал и экспериментально подтвердил регуляторное воздействие вещества гамма-глутамилгистамин на первичные звенья биохимических механизмов основных защитных реакций организма иммунной реакции, воспалительной реакции, свободнорадикального процесса.

Вещество гамма-глутамилгистамин и его дихлоридная соль, по заказу автора, синтезированы группой члена-корреспондента АН СССР Евстигнеевой Р.П. методом химического пептидного синтеза [10, 11, 12] с некоторыми модификациями. По заказу и под руководством автора выполнены исследования индивидуальности и чистоты партии вещества гамма-глутамилгистамин, переданной на фармакологические испытания. Индивидуальность препарата установлена методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (см. фиг. 1 и 2) и методом тонкослойной хроматографии с регистрацией результатов на компьютерном денситографе CDS-200 фирмы Beckman /США/. Методом атомно-эмиссионной спектрометрии на приборе GI-70 фирмы Glben-Ivon /Франция/ установлено, что содержание тяжелых металлов и токсичных элементов в весовых процентах (%) составляет кальций - 0,1, свинец, бор, медь, серебро, цинк, мышьяк, алюминий - не более 0,01, марганец, стронций, хром, кадмий, кобальт, магний, железо, никель - не более 0,001.

ПРИМЕРЫ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ОСНОВНЫХ ЗАЩИТНЫХ СИСТЕМ С ПОМОЩЬЮ ВЕЩЕСТВА ГАММА-ГЛУТАМИЛГИСТАМИН 1. Регуляторное воздействие вещества гамма-глутамилгистамин на первичные звенья биохимических механизмов инициации/сдерживания защитных реакций.

1.1. Подавление накопления в депо и выброса из депо гистамина - первичного биохимического медиатора иммунологической и воспалительной реакций.

Исследования выполнены на крысах Вистар массой 150-200 грамм и морских свинках-самцах массой 250-300 грамм. Использованы куриный овальбумин производства Олайненского НПО "Биохимреактив", однократно перекристаллизованный нами, и ампульный препарат "Супрастин" производства фирмы "Reanal" /ВНР/.

Влияние гамма-глутамилгистамина in vivo на содержание гистамина в тучных клетках и в базофилах и на способность тучных клеток отвечать аллерген-стимулированной секрецией гистамина при их контакте с аллергеном изучена на крысах, сенсибилизированных к овальбумину по методу Gushchin I.S. et al. [13] . На одиннадцатый, двенадцатый и тринадцатый дни эксперимента животным вводили внутрибрюшинно раствор гамма-глутамилгистамина в дозах 50 мкг/кг или "Супрастин" по 1000 мкг/кг или плацебо. На 14-й день сенсибилизации по методу Fredholm В.В. et al. [14] выделяли взвесь тучных клеток из перитонеальной жидкости и индуцировали выделение гистамина, воздействуя на клетки веществом "48/80". Для индуцирования секреции гистамина аллергеном, 1000000-2000000 тучных клеток в 2 мл инкубировали с овальбумином (200 мкг/мл).

Влияние гамма-глутамилгистамина in vivo на содержание гистамина в базофилах крови изучено на морских свинках, сенсибилизированных к овальбумину по методу Шатерникова В. А. и соавт. [15]. На 14-й день сенсибилизации раствор гамма-глутамилгистамина на физиологическом растворе вводили внутрибрюшинно в дозе 50 мкг/кг за 1 час до забора крови. 1 мл крови из сердца брали в гепарин, центрифугировали. К осадку клеток приливали 9 мл дистиллированной воды и через 20 секунд - 1 мл 10-кратного раствора Хенкса. Суспензию фильтровали через хлопковую вату, трижды отмывали в среде Игла и затем - в трис-буфере.

Содержание гистамина измеряли спектрофлуориметрическим методом в реакции с ортофталевым альдегидом [16]. Секрецию гистамина оценивали с учетом величины спонтанной секреции, которая составляла 2-9%.

Статистическая обработка результатов выполнена с использованием критерия Стьюдента.

Результаты отражены на фиг. 3. Установлено, что гамма-глутамилгистамин статистически достоверно снижает аллерген-индуцированную секрецию гистамина из тучных клеток в 3,65 раза (0,318 мкг гистамина на 1000000 клеток против 1,161 мкг в контроле, Р<0,01) и препарат сравнения "Супрастин" - в 1,74 раза (0,666 мкг гистамина на 1000000 клеток против 1,161 мкг в контроле, Р<0,05). Установлено, что гамма-глутамилгистамин статистически достоверно снижает содержание гистамина в 1,36 раза в тучных клетках (1,79 мкг гистамина на 100000 клеток против 2,435 мкг в контроле, Р<0,05) и в 1,5 раза - в базофилах (0,695 мкг гистамина на 1 мл клеточной суспензии против 1,04 мкг/мл в контроле, Р<0,01), "Супрастин" снижает содержание гистамина в 1,48 раза в тучных клетках (1,645 мкг гистамина на 100000 клеток против 2,435 мкг в контроле, Р<0,05).

Влияние гамма-глутамилгистамина и "Супрастина" in vivo на состояние системы цитохромов Р450 изучали на морских свинках с массой тела 250-300 г. Гамма-глутамилгистамин и "Супрастин" вводили внутрибрюшинно в дозах 50 и 1000 мкг/кг, соответственно. Активность микросомальной системы печени оценивали по длительности гексеналового сна. Гексенал вводили внутрибрюшинно в физиологическом растворе в дозе 30 мг/кг. Активность цитохромов измеряли по методу Omuro N., Sato R. [17] в микросомальной фракции, выделенной методом дифференциального центрифугирования. Фракционное содержание водорастворимых и липидорастворимых цитохромов определяли по методу Изотова М.В. и соавт. [18] . Содержание микросомального белка определяли модифицированным методом Лоури [19]. Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрических критериев Мана-Уитни и углового преобразования Фишера [20] .

Результаты отражены на фиг. 4. Установлено, что гамма-глутамилгистамин статистически достоверно повышает удельную активность цитохрома Р450 в 1,53 раза (Р<0,01), удельную активность цитохрома b5 - в 1,64 раза (Р<0,01), удельную активность водорастворимой фракции цитохрома Р450 в 1,67 раза (Р<0,01), соотношение водорастворимой и липидорасторимой фракций цитохрома Р450 в 1,7 раза (Р<0,01). Установлено, что гамма-глутамилгистамин статистически достоверно снижает длительность гексеналового сна в 1,75 раза (Р<0,01).

Эксперимент выполнен на крысах с массой тела 200 г. Очаг хронического воспаления формировали, путем внутримышечного введения в левую лапку культуры золотистого стафилококка (штамм "375") в количестве 5000000000000 бактериальных тел в объеме 0,5 мл. В мышцу другой лапки вводили раствор солянокислой соли гамма-глутамилгистамина на физиологическом растворе. На девятый день животных забивали, получали сыворотку крови. В сыворотке крови определяли содержание малонового диальдегида в реакции с тиобарбитуровой кислотой. К 0,2 мл сыворотки прибавляли 1,5 мл 8,1% раствора додецилсульфата натрия, 3,5 мл 30% раствора уксусной кислоты (рН 3,0), 1,5 мл 0,8% раствора тиобарбитуровой кислоты, приготовленного на 30% растворе уксусной кислоты. Смесь инкубировали 60 минут при 96 градусах Цельсия, охлаждали при комнатной температуре, центрифугировали 5 минут при 1000 оборотах в минуту. Спектрофотометрию супернатанта осуществляли при 535 нанометрах и при 560 нанометрах. Пробу, содержащую биологический материал, фотометрировали против пробы, не содержащей биологического материала. Содержание малонового диальдегида выражали в условных единицах (Е_535нм-Е_560нм) х 100.

Результаты отражены на фиг. 15. Установлено, что инфицирование приводит к двукратному статистически достоверному повышению количества малонового диальдегида. Солянокислая соль гамма-глутамилгистамина в диапазоне доз 12,60-22,07 мкг/кг приводит к снижению количества диальдегида в 1,42 - 6,99 раз. Установленный факт хорошо согласуется с представленным выше повышением активности системы противорадикальной защиты - цитохромов Р450 под влиянием гамма-глутамилгистамина.

3. Регуляторный характер влияния вещества гамма-глутамилгистамин на активность иммунной системы в норме и патологии.

3.1. Активация веществом гамма-глутамилгистамин первичного иммунного ответа интактного организма на гетерогенные антигены.

3.1.1. Активация В-клеточно-опосредованного гуморального ответа немедленного типа.

Исследования выполнены на половозрелых мышах-самках линии BALB с массой тела 18-20 г, выращенных в питомнике "Столбовая" АМН СССР. Мышей иммунизировали внутрибрюшинно субоптимальной дозой (50000000) эритроцитов барана (ЭБ). Затем перорально вводили контрольным животным - физиологический раствор (n= 10), а опытным животным - раствор гамма-глутамилгистамина на физиологическом растворе (n=10). На пятый день эксперимента животных забивали цервикальным смещением позвонка. Из крови получали сыворотку Селезенку гомогенизировали в охлажденной среде "Хенкса". В экспериментах использовали индивидуальные клеточные суспензии спленоцитов с жизнеспособностью не менее 85-90% по тесту с 0,1% раствором красителя трипановый синий.

Влияние гамма-глутамилгистамина на количество антигенсвязывающих клеток оценивали по тесту розеткообразования. 500000 спленоцитов в 0,5 мл суспензии прибавляли к равному объему суспензии ЭБ (50000000 ЭБ). Смесь инкубировали 18 часов при 4 градусах Цельсия. Затем подсчитывали число розеткообразующих клеток с пятью или более эритроцитами в препаратах раздавленной капли с помощью микроскопа "Дженавел" при увеличении 25 х 0,50. В каждом исследуемом образце подсчитывали также число ядросодержащих клеток, с целью исключения неспецифической оценки состояния клеток.

Влияние гамма-глутамилгистамина на количество антителообразующих клеток оценивали по тесту локального гемолиза ЭБ в геле агарозы. Суспензию спленоцитов (1000000 клеток /мл) смешивали с суспензией ЭБ (0,5%), распределяли тонким слоем на чашках Петри диаметром 100 мм, инкубировали 90 минут при 37 градусах Цельсия, добавляли комплемент и инкубировали при 37 градусах Цельсия не менее часа. Подсчет числа зон гемолиза проводили с помощью лупы "МБС-9".

Влияние гамма-глутамилгистамина на количество синтезированных антител-гемагглютининов оценивали методом титрации. Сыворотку крови декомплементировали, последовательно двукратно разводили с помощью микротитратора "Такачи". Разведения смешивали в лунках планшета с 0,9 процентной суспензией ЭБ. Агглютинацию учитывали визуально через 24 часа. За титр исследуемой сыворотки принимали наибольшее разведение, при котором наблюдалась агглютинация, и выражали величиной двоичного логарифма.

Вариационно-статистический анализ выполнен с использованием критерия достоверности по Стьюденту.

Результаты отражены на фиг. 5. Установлено, что гамма-глутамилгистамин в дозах 25 мкг/кг веса тела и 250 мкг/кг повышает число антителообразующих клеток в 2,7 раза (Р<0,02) и в 2,2 раза (Р<0,05), соответственно, и повышает титр гемагглютининов в 1,3 раза (Р<0,01) и в 1,2 раза (Р<0,05), соответственно, не влияя при этом на численность антигенсвязывающих клеток и ядросодержащих клеток.

3.1.2. Активация веществом гамма-глутамилгистамин Т-клеточно-опосредованного клеточного ответа замедленного типа у интактного организма.

Исследования выполнены на беспородных мышах и мышах линии BALB весом 18-20 г. Мышей иммунизировали внутрибрюшинно субоптимальной дозой специфического антигена - 5000000 ЭБ. Затем перорально или внутрибрюшинно вводили раствор гамма-глутамилгистамина на физиологическом растворе или физиологический раствор. На пятый день эксперимента в подушечки задних лап вводили разрешающую дозу (100000000) ЭБ в 50 мкл физиологического раствора. Через 24 часа интенсивность гиперчувствительности замедленного типа оценивали по степени увеличения объема подушечек с помощью микрометра "МК-0-25". Численность групп - по 10 животных. Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия Стьюдента.

Результаты представлены на фиг. 6. Как видно, у интактных, практически здоровых животных гамма-глутамилгистамин при обоих способах введения статистически достоверно повышает гиперчувствительность замедленного типа к гетерогенным антигенам, в частности при оральном введении дозы 25 мкг/кг - в 2,2 раза (Р<0,01), дозы 250 мкг/кг - в 2,5 раза (Р<0,01), при внутрибрюшинном введении дозы 250 мкг/кг - в 2,1 раза (Р<0,02). У мышей линии BALB при оральном введении дозы 250 мкг/кг - в 2,5 раза (Р<0,02), при внутрибрюшинном введении дозы 250 мкг/кг - в 2,1 раза (Р<0,01).

3.2.1. Подавление веществом гамма-глутамилгистамин аллергических реакций немедленного типа.

Исследования выполнены на крысах Вистар массой 150-200 г и на морских свинках массой 250-300 г. Сенсибилизацию крыс осуществляли куриным овальбумином [13]. На первый и пятый дни эксперимента в область шеи подкожно вводили 20 мкг овальбумина в 0,5 мл физиологического раствора, содержавшего также 200000 микробных тел коклюшной вакцины. На пятнадцатый день вызывали активный анафилактический шок путем внутривенного введения 20 мг овальбумина в 0,5 мл физиологического раствора.

Сенсибилизацию морских свинок осуществляли овальбумином или цельным пастеризованным коровьим молоком. Овальбумин вводили перорально в течение первых трех дней эксперимента в дозах по 50 мкг/кг, на пятнадцатый день вводили внутривенно разрешающую дозу овальбумина (7 мг в 0,5 мл физиологического раствора). Молоко вводили перорально в течение трех дней по 3,6 мл. Для получения разрешающей дозы молоко центрифугировали и использовали фракцию, свободную от липидов и клеточных элементов, дозу 0,5 мл (7 мг белка) вводили внутривенно на пятнадцатый день. Тяжесть активного анафилактического шока оценивали по уровню летальности, количеству судорожных проявлений (или состоянию прострации у крыс) и по величине анафилактического индекса [21].

У морских свинок, сенсибилизированных овальбумином и получавших гамма-глутамилгистамин в течение трех дней до введения разрешающей дозы аллергена, непосредственно перед разрешающим введением аллергена получали кровь. Из последней получали сыворотку. В сыворотке твердофазным иммуноферментным методом определяли содержание Ig G к овальбумину. К адсорбированному в лунках микроплат овальбумину добавляли исследуемые сыворотки, отмывали, вносили конъюгированные с пероксидазой хрена кроличьи антитела против Ig G морской свинки, инкубировали, отмывали. Активность пероксидазы определяли в реакции с о-фенилендиамином (0,04% о-фенилендиамина, 0,04% перекиси водорода, цитратный буфер с рН 5,9), через 20 минут реакцию останавливали пятинормальной серной кислотой и измеряли оптическую плотность при 492 нм. Стандартную кривую получали с помощью разведений гипериммунной антисыворотки морской свинки, иммунизированной овальбумином.

Количество животных в группах, способы введения и дозы лекарственных препаратов приведены в подрисуночных подписях. Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрических критериев Мана-Уитни и углового преобразования Фишера [20].

Результаты исследования представлены на фиг. 7.1-7.5. Установлено, что гамма-глутамилгистамин начинает проявлять антианафилактическую активность в дозе 5 мкг/кг. На обоих видах животных, при обоих аллергенах, при различных способах введения, в том числе при профилактических и лечебных схемах введения, дозы 50 мкг/кг приводят, статистически достоверно, к подавлению летальности в 0,6-4,0 раза, к уменьшению частоты судорог в 1,75-2,4 раза, к уменьшению анафилактического индекса в 1,6-2,3 раза. При этом препарат сравнения Супрастин (H1-блокатор) проявляет существенно меньшую защитную активность (см. фиг. 7.1-7.5).

Кроме того, гамма-глутамилгистамин (50 мкг/кг 3 раза, внутрибрюшинно) вызывает статистически достоверное (Р<0,05) снижение содержания Ig G к аллергену - овальбумину (lg [С]: 2,880,19 /n=30/ в опыте против 3,190,14 в контроле /n=28/). Супрастин (1 мг/кг 3 раза, через рот) вызывает снижение lg [С] от 3,210,10 в контроле /n=43/ до 2,920,06 в опыте /n=30/, (Р<0,05). При других условиях эксперимента снижения содержания Ig G не наблюдается гамма-глутамилгистамин (5 мкг/кг 3 раза, внутрибрюшинно) - 3,160,09 в опыте /n= 30/ и 3,190,14 в контроле /n=28/, супрастин (1 мг/кг 3 раза, внутрибрюшинно) - 3,120,18 в опыте /n=30/ и 3,190,14 в контроле /n=28/, гамма-глутамилгистамин (50 мкг/кг 3 раза, через рот) - 3,150,11 в опыте /n=33/ и 3,210,10 в контроле/n=43/.

3.2.2. Влияние вещества гамма-глутамилгистамин на хроническую воспалительную реакцию, вызванную гиперчувствительностью замедленного типа.

Исследования выполнены на белых инбредных крысах-самцах массой 140-160 г. Для воспроизведения адъювантного артрита полный адъювант Фрейнда (5 мг БЦЖ/мл препарата) в дозах по 0,1 мл вводили внутрикожно в основание хвоста в течение 22 дней. Суставы подвергали онкометрии. Тяжесть артрита выражали через показатель артритного индекса - прироста объема пораженных суставов по отношению к исходному в процентах. Функцию суставов проверяли по способности крыс удерживаться на наклонной металлической решетке. Гамма-глутамилгистамин вводили в дозах 50 мкг/кг внутримышечно ежедневно. Противовоспалительный препарат Ибупрофен вводили в дозах 30 мг/кг внутрижелудочно ежедневно. Растворитель лекарственных препаратов - физиологический раствор - вводили контрольным животным ежедневно. В группах было по 10 животных.

Установлено, что на пике развития адъювантной болезни (22-й день) артритный индекс составляет (Мm): в контроле - 166,23,9%, в опыте у животных, получавших гамма-глутамилгистамин - 139,86,4%, в опыте у животных, получавших Ибупрофен - 126,65,8%. То есть степень снижения составила 26,4% и 39,6% соответственно. Таким образом, гамма-глутамилгистамин проявляет антиартритную активность, но несколько меньшую, чем препарат сравнения Ибупрофен.

4. Регуляторный характер влияния вещества гамма-глутамилгистамин на острую воспалительную реакцию.

Исследования, в основном, выполнены согласно "Методическим рекомендациям" Фармакологического Комитета МЗ СССР, 1986 [22].

4.1. Снижение активности острого экссудативного процесса химического генеза на моделях отека подкожной клетчатки и асептического перитонита.

Острое экссудативное воспаление лапки крыс вызывали путем субплантарного введения белым беспородным интактным или адренал-эктомированным крысам (180-200 г) по 0,1 мл 1% раствора каррагенина, или 2% раствора формалина, или 0,1% раствора гистамина. Адреналэктомию осуществляли за три дня до начала эксперимента. Раствор гамма-глутамилгистамина на физиологическом растворе или физиологический раствор вводили за 4 часа до введения флогогенного агента с целью выявления профилактического эффекта или ежедневно в течение пяти дней с целью выявления лечебного эффекта. Объем лапки измеряли онкометрически на плетизмографе "Ugo Basil" /Италия/. Активность фармакологического препарата выражали в процентах уменьшения отека по сравнению с контролем, принятым за 100%. В каждой группе было не менее 10 животных.

Модель асептического перитонита воспроизведена на беспородных белых мышах (20-22 г) и крысах (200-240 г), которым вводили внутрибрюшинно по 0,1 мл 0,2% раствора нитрата серебра и через 6 часов измеряли количество асцитической жидкости. Раствор гамма-глутамилгистамина на физиологическом растворе или физиологический раствор вводили за 40 минут до инокуляции нитрата серебра.

Установлено, что гамма-глутамилгистамин уменьшает количество асцитической жидкости в 4 раза у мышей и в 3 раза у крыс (см. фиг. 8.1 и 8.2). Гамма-глутамилгистамин в дозах 15-50 мкг/кг и при разных способах введения уменьшает отек лапки крыс на 50-80% (см. фиг. 9). Антиэкссудативная активность гамма-глутамилгистамина проявляется и у адреналэктомированных животных. Следовательно, эта активность развивается через механизмы, не затрагивающие известные механизмы подавления воспалительной реакции стероидными гормонами. Эффективность гамма-глутамилгистамина в дозах до 50 мкг/кг сравнима с таковой для препарата Ортофен, примененного в дозе 8 мг/кг.

4.2. Уменьшение объема альтерации тканей химического генеза на модели цистеаминовой язвы желудка и двенадцатиперстной кишки.

Животных содержали в индивидуальных клетках с проволочным полом. За сутки до эксперимента животных лишали пищи, сохраняя доступ к воде. Модель острой химической язвы желудка и двенадцатиперстной кишки воспроизводили у белых беспородных самок крыс с массой тела 170-245 г путем трехкратного (в 10, в 14 и в 18 часов суток) внутрижелудочного введения раствора цистеамина в дозе 300 мкг/кг. За 1 час до каждого введения цистеамина животным опытной группы внутрижелудочно вводили раствор гамма-глутамилгистамина (20 мкг/кг 3 раза) на физиологическом растворе, а животным контрольной группы - физиологический раствор. Забой животных осуществляли через 48 часов после первого введения цистеамина. Раскрытые по большой кривизне препараты желудков с прилегающими сегментами двенадцатиперстной кишки фиксировали в течение 10 минут в 2% растворе формалина. Длину язвенных повреждений измеряли с помощью бинокулярной лупы при 8-кратном увеличении.

Острую резерпиновую язву желудка крыс воспроизводили на инбредных белых крысах-самках с массой тела 115-170 г. Резерпин вводили внутрибрюшинно в дозе 8 мг/кг. Гамма-глутамилгистамин (20 мкг/кг 2 раза) в физиологическом растворе вводили внутрижелудочно дважды за 5 часов до введения резерпина и одновременно с введением резерпина. Забой животных осуществляли через 18 часов после введения резерпина.

Хроническую ацетатную язву крыс воспроизводили у беспородных белых крысах-самок с массой тела 135-195 г. 50 мкл ледяной уксусной кислоты через пропиленовую трубку диаметром 6 мм апплицировали в течение 30 секунд на передневерхнюю часть железистой области желудка. Со второго дня эксперимента ежедневно в течение десяти дней по два раза в день (в 9 и в 16 часов) внутрижелудочно вводили контрольным животным - физиологический раствор (5 мл/кг) и опытным животным - гамма-глутамилгистамин (20 мкг/кг) в адекватном количестве физиологического раствора. На двенадцатый день эксперимента животных забивали.

Секреторную активность изучали на инбредных белых крысах-самках с массой тела 195-255 г. Привратник желудка перевязывали под легким эфирным наркозом. Сразу после перевязки внутридуоденально вводили контрольным животным - физиологический раствор (5 мл/кг) и опытным животным - гамма-глутамилгистамин (100 мкг/кг) в аналогичном объеме физиологического раствора. Через 4 часа осуществляли забой животных. Содержимое желудка центрифугировали (4000 об/мин, 20 мин). Объем содержимого желудка измеряли в градуированных центрифужных пробирках. Кислотность содержимого измеряли путем титрования 1 мл образца раствором 0,2 N NaOH до рН 7,0 на ионометре "ЭВ-74".

Установлено, что на модели цистеаминовой язвы применение гамма-глутамилгистамина приводит к четырехкратному снижению количества животных, пораженных язвами, и к девятикратному уменьшению длины образованных язв 0,310,28 мм против 2,810,90 мм в контроле /Р<0,02/ (см. фиг. 10.1, 10.2).

В то же время, гамма-глутамилгистамин не влияет на развитие язв желудка и двенадцатиперстной кишки как на модели острой резерпиновой язвы желудка у крыс: длина язв составляет 19,61,9 мм в опыте и 20,43,7 мм в контроле, тяжесть повреждений по трехбалльной шкале 2,100,23 в опыте (n=10) и 1,800,33 в контроле (n=10), - так и на модели хронической ацетатной язвы у крыс площадь повреждений в миллиметрах квадратных составляет 32,18,2 в опыте (n=6) и 43,113,4 в контроле (n=6).

Гамма-глутамилгистамин не влияет также на секреторную активность желудочно-кишечного тракта крыс: показатели скорости секреции желудочного содержимого /мкл/ч/ равняются 48053 в опыте и 58151 в контроле, кислотность /мэкв/мл/ равняется 81,15,7 в опыте и 89,94,3 в контроле, скорость секреции Н /мкэкв/ч/ равняется 42,58,0 в опыте и 52,55,2 в контроле.

Таким образом, защита от цистеаминовой язвы объясняется, по-видимому, не противоязвенным действием как таковым, но антирадикальным действием гамма-глутамилгистамина через систему цитохромов.

4.3. Уменьшение интенсивности болевого синдрома на модели химического ожога брюшной полости.

Болевую реакцию "корчи" у белых беспородных мышей-самцов (20-22 г) вызывали внутрибрюшинным введением 2% раствора уксусной кислоты. Гамма-глутамилгистамин на физиологическом растворе или физиологический раствор вводили за 30 минут до введения кислоты. Численность групп - по 10 животных. Выраженность защитного эффекта препарата оценивали по уменьшению числа "корчей" (в процентах к контролю) в течение 20 минут наблюдения.

Установлено, что гамма-глутамилгистамин уменьшает количество "корчей" на 70% при внутрибрюшинном введении дозы 20 мкг/кг, на 50% при внутрижелудочном введении дозы 20 мкг/кг, на 35% при внутримышечном ведении дозы 50 мкг/кг. Препарат сравнения Вольтарен уменьшает количество "корчей" на 50% при внутрижелудочном введении дозы 25 мг/кг. В связи с тем что гамма-глутамилгистамин не влияет на нейротрансмиттерные системы (см. раздел 6.4), эффект обезболивания на модели "корчей" объясняется, возможно, его противорадикальной активностью.

4.4. Увеличение под влиянием гамма-глутамилгистамина активности лизосомальных ферментов в тканях, окружающих зону альтерации на модели инфаркта миокарда.

Инфаркт миокарда воспроизводили у белых беспородных крыс с массой тела 250-300 г. Перевязывали нисходящую ветвь левой коронарной артерии в участке сердца, находящемся в 2-3 мм выше границы ушка левого желудочка. Операция выполнялась под эфирным наркозом. Смертность животных после создания ишемического некроза составляла около 50%. Гамма-глутамилгистамин вводили внутривенно ежедневно в дозах по 100 мкг/кг в течение 2 недель (5 крыс). В контроле было также 5 крыс.

Через указанные сроки на холоду извлекали миокард. Его отмывали, очищали от соединительных тканей, удаляли предсердия, выделяли участки, окружающие зону некроза, из левого желудочка и участки из правого желудочка, взвешивали, измельчали ножницами и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвейма с тефлоновым пестиком (зазор 0,21 мм) в течение 180 секунд при 40 оборотах в минуту в ледяном буферном растворе 0,6 М KCl (х. ч.), 0,25 М сахароза (х. ч.), 10 мМ имидазол ("Серва", ФРГ), 1мМ ЭДТА ("Серва", ФРГ), рН 7,25. Соотношение масс ткани и среды в гомогенате составляло 1:10.

На ультрацентрифуге "Beckman" /США/ гомогенат подвергали дифференциальному центрифугированию. В супернатанте (цитозоле) определяли активность растворившихся лизосомальных ферментов. Фракцию осадка ресуспендировали 1:1 в буферном растворе (0,7 М сахароза, 1 мМ ЭДТА, рН 7,0) и разделяли ее на две части, в одной из них определяли доступную для субстрата активность ферментов неразрушенных лизосом, другую часть подвергали замораживанию-оттаиванию в жидком азоте с целью разрушения лизосом и определяли в ней общую активность лизосомальных ферментов.

Определение активности N-ацетил--D-глюкозаминидазы проводили с субстратом 4-нитрофенил-М-ацетил--D-глюкозаминид (5 мМ) в 0,2 М ацетатном буфере, 0,7 М сахароза, рН 5,5. К 100 мкл инкубационной смеси добавляли 20 мкл исследуемого материала, инкубировали 20 минут при 37 градусах Цельсия. Реакцию останавливали 0,5 мл 0,5 М раствора NaOH. Фотоколориметрию выполняли на спектрофотометре "DH-8B"/"Beckman", США/ при длине волны 405 нм. Удельную активность фермента выражали в наномолях освобожденного за 1 минуту 4-нитрофенола на 1 мг белка. Белок определяли по методу Лоури.

Результаты представлены на фиг. 11. Установлено, что гамма-глутамилгистамин статистически достоверно повышает активность фермента в лизосомах. В периинфарктной зоне активность во фракции разрушенных лизосом составляет в опыте 2,640,08 Ед. (диапазон разброса 2,26-2,87 Ед.) против 1,40,01 Ед. (1,38-1,42 Ед. ) в контроле, то есть активность увеличилась на 89%. На 45% увеличилась активность во фракции цитозоля: 1,130,06 Ед. (0,94-1,23 Ед.) против 0,780,02 Ед. (0,73-0,83 Ед.). На 22% увеличилась активность в тесте на проницаемость мембран для субстрата 1,110,05 Ед. (0,98-1,24 Ед.) против 0,91+0,05 Ед. (0,77-1,04 Ед.).

В правом желудочке также наблюдается изменение активности фермента. Во фракции дезинтегрированных лизосом - повышение на 28%: 2,43 0,20 Ед. (2,07-3,08 Ед.) против 1,90,05 Ед. (1,78-2,06 Ед.) в контроле. Несмотря на это повышение, активность растворимого фермента в опытной группе /0,700,04 Ед. (0,62-0,82 Ед. )/ практически одинакова уровню такового в контрольной группе /0,720,03 Ед. (0,63-0,79 Ед.)/. А проницаемость мембран лизосом для субстрата уменьшилась на 39%: 0,520,06 Ед. (0,36-0,65 Ед.) против 0,840,05 Ед. (0,72-0,96 Ед.).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о системном воздействии гамма-глутамилгистамина на лизосомальный аппарат, выражающемся, с одной стороны, в повышении мощности лизосомального гидролитического аппарата и, с другой стороны, в усилении контроля над этим аппаратом со стороны лизосомальных мембран.

4.5. Уменьшение под влиянием гамма-глутамилгистамина смертности животных, площади ран, подавление серозного выпота, ускорение самоочистки ран от дебриса на модели химического ожога кожи.

Исследования, в целом, выполнены согласно "Методическим рекомендациям по экспериментальному (доклиническому) изучению нестероидных противовоспалительных фармакологических веществ (Официальное издание)"/. В кн. "Руководящие материалы по экспериментальному и клиническому изучению новых лека