Способ высокоуровневой экспрессии, способ очистки и способ переукладки поринового протеина внешней мембраны менингококка группы в или слитого с ним протеина, высокоочищенный пориновый протеин (варианты), высокоочищенный пориновый слитый протеин (варианты), вакцина для предупреждения бактериального менингита группы в, способ получения конъюгата протеина менингококка группы в и полисахарида, способ предупреждения бактериального менингита, штамм е.coli (варианты)

Способ высокоуровневой экспрессии, способ очистки и способ переукладки поринового протеина внешней мембраны менингококка группы в или слитого с ним протеина, высокоочищенный пориновый протеин (варианты), высокоочищенный пориновый слитый протеин (варианты), вакцина для предупреждения бактериального менингита группы в, способ получения конъюгата протеина менингококка группы в и полисахарида, способ предупреждения бактериального менингита, штамм е.coli (варианты)

Реферат

 

Изобретение относится к генной инженерии. В штамм Е. coli трансформируют вектор. Вектор включает селективный маркер и ген, кодирующий зрелый пориновый протеин или зрелый пориновый протеин, слитый с аминокислотами 1-22 капсидного протеина 10. Последний кодируется геном Т7. Ген Т7 связан функционально с промотором Т7. Трансформированный штамм Е. coli выращивают в среде. Индуцируют экспрессию указанного протеина. Экспрессированный таким образом протеин составляет более 2% от общего экспрессированного протеина. На стадии индуцирования лизируют Е. coli. Выделенный в виде нерастворимых включений протеин промывают буфером. Суспендируют и растворяют указанные включения в водном растворе денатуранта, разбавляют детергентом и очищают гель-фильтрацией и ионообменной хроматографией. Высокоочищенный пориновый протеин и слитый протеин имеют аминокислотную последовательность, приведенную в описании, и кодируют ДНК с последовательностью, приведенной в описании. Вакцина содержит пориновый протеин внешней мембраны или слитый с ним протеин в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель. Полученный переуложенный протеин конъюгируют с полисахаридом Neisseria meningitidis. Особи вводят в эффективном количестве пориновый протеин менингококка группы В или слитый с ним протеин. Штамм Е. coli BL21(DE3) ompA предназначен для получения рекомбинантных штаммов-продуцентов поринового протеина менингококка группы В или слитого с ним протеина. После трансформации данного штамма плазмидным вектором рЕТ, несущим ген, кодирующий пориновый протеин или слитый с порином протеин, он продуцирует пориновый протеин или слитый с ним протеин. Изобретение позволяет на более высоком уровне производить выделение пориновых протеинов наружной мембраны менингококков группы В и связанных с ними протеинов. 16 с. и 8 з.п. ф-лы, 11 ил., 1 табл.

Изобретение относится к области рекомбинантной генетики, экспрессии протеина и созданию вакцин. Изобретение также включает методы выделения поринового протеина наружной мембраны менингококка группы В в рекомбинантной клетке-хозяине. Изобретение включает и методы очистки и переукладки рекомбинантного протеина.

Наружные мембраны вида Neisseria в большей степени, чем другие грам-отрицательные бактерии, обладают полупроницаемой мембраной, позволяющей свободно проникать в обоих направлениях - как в клетку, так и из клетки субстанциям с низкомолекулярной массой, но задерживать молекулы большего размера (Heasley, F.A., et al., "Reconstitution and characterization of the N. gonnorrhoeae outer membrane permeability barrier", в Genetics and Immunobiology of Neisseria gonorrhoeae, Daniellson and Normark, eds., University of Umea, Umea, pp12-15 (1980); Douglas J.T. et al., FEMS Microbiol. Lett. 12:305-309 (1981). Одним из механизмов, позволяющих осуществлять транспорт молекул из и в клетку, является включение в мембрану протеинов, называемых пориновыми. Порины состоят из трех идентичных полипептидных цепей (Jones R.B. et al., Infect. Immun. 30: 773-780 (1980); Mc Dade Jr. and Jhonston, J. Bacteriol. 141: 1183-1191 (1980)), имеют нативную трехмерную конформацию, формируют насыщенные водой вольтаж-зависимые каналы, находящиеся в наружной мембране или других мембранах бактерии, в которые и включены порины (Linch, E.C., et al. , Biophys. J. 41:62 (1983); Linch, E.C. et al., Biophys. J. 45:104-107 (1984); Young J.D.E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:3831-3835 (1983); Mauro.A., et al., Proc. Natl.Acad. Sci USA 85:1071-1075 (1988); Young J.D.E. , et al. , Proc. Natl. Acad. Sci USA 83:150-154 (1986)). В связи с большим количеством протеинов, находящихся в составе наружной мембраны, в зависимости от протеиновых антигенов бактерии подразделены на подгруппы Neisseria meningitidis и Neisseria gonorrhoeae, которые в свою очередь подразделены на серотипы в эпидемиологических целях (Frasch, С. Е. et al., Rev. Infect. Dis. 7: 504-510 (1985); Knapp, J. C., et al., "Overview of epidemiological and clinical applications of auxtore/serovar classification N. gonorrhoeae", The Pathogenic Neisseriae, Schoolinck G.K.,ed., American Society of Microbiology, Washington, pp 6-12 (1985)). Многие из этих протеинов, принадлежащих как гонококку, так и менингококку, были очищены (Heckels, J.E., J. Gen. Microbiol. 99: 333-341 (1977); James and Heckels, J. Immunol. Meth. 42:223-228 (1981); Jadd R.C., Anal. Biochem. 173:307-316 (1988); Blake and Gotschlich, Infect. Immun. 36: 277-283 (1982); Wetzler L.M. et al., J. Rxp. Med/168: 1883-1897(1988)), клонированы и упорядочены (Gotschlich E.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8135- 8139 (1987); McGuinness, В., et al., J. Exp. Med. 171: 1871-1882 (1990); Carbonetti and Sparling, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 9084- 9088 (1987); Feavers, I.M., et al., Infect. Immun. 60:3620-3629 (1992); Murakami, К., et al, Infect. Immun. 57:2318-2323 (1989); Wolff and Stern, FEMS Microbiol. Lett. 83: 179-186 (1991); Ward M.J., et al., FEMS Microbiol., Lett. 73:283-289 (1992)).

Пориновые протеины вначале были изолированы вместе с липополисахаридами. Они были названы "эндотоксин- ассоциированные протеины". Изучения поринов природных штаммов показали, что полная агрегация и олигомеризация не возможны до тех пор, пока в окружающей клетку среде присутствует липополисахарид (ЛПС) соответствующего бактериального штамма (Holcenburg et al., Biochemistry 28:4187-4193 (1989); Sen and Nicaido, J. Biol. Chem. 266:11295-11300 (1991).

Менингококковые порины были подразделены на три большие классификации, которые в предшествующей номенклатуре были известны как Класс 1, 2 и 3 (Frasch, C.E., et al., Rev. Infect. Dis. 7:504-510 (1985)). Каждый изученный менингококк содержит один из аллелей поринового гена Класса 2 или 3, но не оба аллеля (Feavers, I.M. et al., Infect. Immun. 60:3620-3629 (1992); Murakami, К., et al., Infect. Immun. 57:2318-2323 (1989)). Наличие или отсутствие гена Класса 1 не является обязательным. Так же все изученные гонококки содержат только один ген порина, имеющий сходство с аллелями 2 или 3 класса (Gotschlich, E. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8135-8139 (1987); Carbonetti and Sparling, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 9084-9088 (1987)). Обнаружено, что у N. gonorrhoeae полностью отсутствует аллель класса 1. Полученные данные о генах позволяют предположить, что пориновые протеины нейссерии имеют по крайней мере 70% гомологичности друг с другом с различными вариантами основного предмета (Feavers, I.M. et al., Infect. Immun. 60: 3620-3629 (1992)). Было предположено, что различия между пориновыми протеинами нейссерий обусловлены иммунологическим влиянием, вызванным во время инвазии патогенного микроорганизма в человеческий организм. Вместе с тем, очень мало известно, как изменения последовательностей пориновых протеинов влияют на функциональную активность этих белков.

Как было сказано выше, изолированные гонококковые порины аллельного типа Класса 2 по электрофизиологическим свойствам отличаются от изолированных поринов гонококка класса 3, это было показано при изучении их липидной мембраны в отношении ионной селективности и вольтаж-зависимости (Lynch,E.C. et al. , Biophys. J. 41:62 (1983); (Lynch, E.C. et al., Biophys. J, 45:104-107 (1984)). Способность различных пориновых протеинов проникать в двойной липидный слой интактных бактерий коррелирует не только с типом порина, но и с видом нейссерии, из которой они были получены (Linch, E.C., et al., Biophys. J. 45:104-107 (1984)). Как оказалось, некоторые функциональные признаки могли быть отнесены к различным областям последовательности порина. Одна такая функциональная зона, ранее идентифицированная у всех гонококковых класс 2-подобных протеинов - участок расщепления химотрипсином. При расщеплении химотрипсином этот класс поринов теряет способность к ответу на потенциал напряжения и к закрытию каналов мембраны. Класс 3-подобные порины гонококка, так же как и менингококковые порины, не содержат последовательности, чувствительной к воздействию химотрипсина, однако и они не способны отвечать при воздействии потенциального напряжения закрытием мембранных каналов (Greco, F. "The formation of channels in lipid bilayers by gonococcal major outer membraine protein" тезисы, The Rockfeller University, New York (1981); Greco, F. et al., Fed. Proc. 39:1813 (1980)).

Трудности во время исследований возникли вследствие необходимости возможности для легкого манипулирования генами порина с помощью новых молекулярных технологий и при получении достаточно очищенного протеина для биофизической характеристики измененных пориновых протеинов. Как было ранее изучено, клонированные и экспрессированные в Е. coli гены порина нейссерии оказались смертельными для самой Е. coli (Carbonetti and Sparling, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 9084-9088 (1987); Carbonetti, N.H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 6841- 6845 (1988); Barlow, A.K., et al., Infect. Immun. 55: 2734-2740 (1987)). Таким образом, многие из этих генов были клонированы и упорядочены, как части целого гена, или помещены в плазмиды с небольшим числом копий под контролем экспрессии (Carbonetti N.H., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 85: 6841-6845 (1988)). В таких условиях, даже если весь ген порина экспрессирован, лишь небольшое количество накопленных протеинов может быть получено и очищено для характеристики этих протеинов.

Другая сторона проблемы - клонирование генов порина в низкокопийный плазмид с контролируемой экспрессией, введение модификаций в ген порина и затем вновь введение модифицированной последовательности назад в Neisseria (Carbonetti N. H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6841-6845. (1988)). Вместе с тем, возникла проблема ограничения эндонуклеазной системы, присутствующей в Neisseria, особенно в гонококках (Davies, J.K., Clin. Microbiol. Rev. 2:S78-S82 (1989)).

Настоящее изобретение направлено на преодоление описанных выше трудностей. Последовательность ДНК зрелых протеинов класса 2, 3 и связанных с ними протеинов может быть амплифицирована с использованием хромосомы менингококковой бактерии в качестве шаблона для реакции полимерразных цепей (РПЦ-реакция. Амплифицированная последовательность порина была связана и клонирована в экспрессионный вектор, содержащий Т7 промотор. Штамм BL21 Е. coli, являющийся лизогенным для DE3 лямбда фага (Studier and Moffatt, J. Mol. Biol. 189: 113-130 (1986)), модифицированный для элиминации ompА гена, был отобран в качестве экспрессионного хозяина для плазмида рЕТ-17b, содержащего ген порина. Во время индукции большое количество поринового протеина скопилось в Е. coli без какого-либо летального воздействия на бактерию-хозяина. Экспрессированные порин-протеины менингококка были экстрагированы и подвергнуты стандартной процедуре, а затем очищены методом хроматографии молекулярного сита и ионообменной хроматографии. При оценке протеинового профиля методом молекулярного сита, пориновые протеины были элюированы из колонки и определены как тримеры. Для уверенности в том, что никаких РПЦ артефактов не было внесено в менингококковый ген порина, учитывая высокий уровень экспрессии, была определена последовательность внесенного Por В гена. Были использованы исследования ELISA ингибиции для того, чтобы убедиться, что полученный рекомбинантный пориновый протеин имел природную антигенную структуру и тримерную конформацию.

Порины различных штаммов и видов Нейссерии различаются по первичной аминокислотной последовательности и по биофизическим характеристикам, как было замечено во время функциональных исследований. При изучении того, как изменения в первичной аминокислотной последовательности поринов Neisseria коррелируют с изменением биофизических свойств, были встречены определенные трудности, связанные с возможностью легко манипулировать клонированными генами порина при помощи новых молекулярных технологий и получить достаточное количество экспрессированного модифицированного поринового протеина для очистки его и применения в функциональных биофизических исследованиях. В данном изобретении ген, кодирующий зрелый Por В протеин, отсутствующий промотор нейссерии и сигнальная последовательность были клонированы в экспрессионный плазмид рЕТ-17b и трансформированы в Е. coli. При индукции было продуцировано большое количество Por В протеина.

Экспрессированный пориновый протеин был восстановлен с получением его нативной тримерной структуры, а затем очищен. Достаточно очищенный рекомбинантный пориновый протеин был получен как в качестве антигена, так и для получения биофизических характеристик. Таким образом, исследование ставит цели, где биофизические характеристики могут быть изучены более детально.

Общим объектом изобретения является обеспечение методом выделения поринового протеина менингококка группы В, в особенности относящегося к классу 2 и 3.

Специальным объектом изобретения является обеспечение методом выделения поринового протеина менингококка группы В класса 2 и 3 в Е. coli, включающим: (a) трансформация Е. coli вектором, включающим избранный маркер и ген, кодирующий протеин, выбранный из группы, насчитывающей: (i) зрелый пориновый протеин; (ii) связанный протеин, включающий зрелый пориновый протеин, включенный в аминокислоты от 1 до 20 гена Т7 10 капсидного протеина; указанный ген связан с Т7 промотором; (b) выращивание трансформированной Е. coli в среде, содержащей слективный агент, и (c) индуцирование экспрессии указанного протеина; протеин составляет более чем 2% от общего протеина, экспрессированного в Е. coli.

Другим специальным объектом изобретения является обеспечение методом очистки и переукладывания поринового протеина менингококка группы В и связанного с ним протеина, полученных методами, описанными выше.

Дальнейшим объектом изобретения является получение вакцины, содержащей пориновый протеин и связанный с ним протеин менингококка группы В, полученных описанными выше методами, являющейся достаточно эффективно вызывающей выработку защитных антител у животных к N. meningitidis; а также получение фармацевтически приемлемого растворителя, носителя и эксципиента для вакцины.

Другим специфическим объектом исследования является обеспечение методом эффективной профилактики бактериального менингита у животных, включающего назначение животным вакцины, содержащей пориновый протеин и связанный с ним протеин менингококка группы В, полученные в соответствии с методами, описанными выше.

Другой специальный объект изобретения - получение обеспечения методом, позволяющим приготовить полисахаридный конъюгат, включающий: получение вышеуказанным методом поринового и связанного с ним протеина менингококка группы В; получение полисахарида из N. meningitidis; конъюгацию поринового и связанного с ним протеина менингококка группы В с полисахаридом.

Следующий специальный объект изобретения - получение метода очистки поринового и связанного с ним протеина менингококка группы В, включающего: лизирование трансформированной Е. coli для высвобождения поринового и связанного с ним протеина менингококка группы В, как части нерастворимых включений в организм-хозяин; отмывание включений буфером для удаления загрязняющих клеточных протеинов, принадлежащих Е. coli; взвешивание и растворение включений в водном растворе денатуранта; дилюция полученного раствора детергентом и очистка растворенного порина и связанного с ним протеина гель-фильтрацией и ионообменной хроматографией.

Следующий специальный объект изобретения - получение метода переукладки порина и связанного с ним протеина менингококка группы В, описанных выше, включающего: лизирование трансформированной Е. coli для высвобождения поринового и связанного с ним протеина менингококка группы В, как части нерастворимых включений в организм-хозяин; отмывание включений буфером для удаления загрязняющих клеточных протеинов, принадлежащих Е. coli; взвешивание и растворение включений в водном растворе денатуранта; дилюция полученного раствора детергентом и очистка растворенного порина и связанного с ним протеина гель-фильтрацией для получения переуложенного протеина в элюанте.

Следующий специфический объект изобретения - обеспечение штаммом BL21 Е. coli (DE3) дельтаompА клетки-хозяина, включающего вектор, содержащий ДНК молекулу, кодирующую пориновый протеин или связанный с ним протеин менингококка группы В, молекула ДНК присоединена к Т7 промотору вектора.

Следующий специфический объект изобретения - обеспечение штаммом BL21 (DE3) дельта omp E. coli.

Следующие объекты и цели изобретения будут ясны из дальнейшего описания.

Фиг. 1: Диаграмма, показывающая последующую стратегию Por В гена. РПЦ- продукт, описанный в примере 1 (Materials and Methods section), были соединены в BamHI-Xhol сайт экспрессионного плазмида рЕТ-17. Начальная протяженность двойной закрученной спирали была получена с использованием олигонуклеотидной последовательности, направленной противоположно BamHI сайту и перпендикулярно Xhol сайту рЕТ-17b плазмида. Добавочная последовательность была получена путем делеций 3 конца гена, используя экзонуклеаза III/фасолевая нуклеаза реакцию. После повторного связывания и трансформации обратно в Е. coli, несколько клонов было отобрано по размеру вставки и упорядочены.

Упорядочение происходило всегда с 3' конца гена с использованием олигонуклеотидного начала перпендикулярно Bpu11021 сайту.

Фиг.2: Гель-электрофорез, показывающий продукты РПЦ-реакции (электрофорез происходит в 1% агарозе с использованием ТАЕ буфера). Фиг.3 (а) и (б): рис (а): SDS-PAGE анализы лизатов клетки Е. coli, содержащей контрольный рЕТ-17b плазмид без вставки и клона Е. coli, содержащего рЕТ-17b плазмид, включающий вставку из полученного путем РПЦ-реакции продукта, описанного в материалах и методах секции выше. Обе культуры растут в O.D. of 0,6 to 600 nm, добавлен IPTG и инкубированы при t 37^oС в течение 2 часов. 1,5 mls каждой культуры отцентрифугировано и бактериальная пилюля растворена в 100 (I) SDS-PAGE приготовленного буфера. Ряд А показывает профиль протеинов, полученный при использовании 10 (I) контрольного образца, ряды В (5(I) и С (10 (I) показывают протеиновый профиль Е. coli как клетки-хозяина, экспрессирующей Por В протеин.

рис (б): Western блот анализ лизатов всей клетки Е. coli, содержащей контрольный плазмид без вставки после 2-часовой индукции с IPTG- ряд А 20 (I); и соответствующий клон E.coli, содержащий porВ-рЕТ-17b плазмид - ряд В (5(I); ряд С 10 (I) и ряд D 20 (I). Моноклональное антитело 4D11 было использовано, как первичное антитело, и метод вестерн блот был проведен, как и описано выше.

Фиг. 4: Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO.1) и транслированная аминокислотная пocлeдoвaтeльнocть (SEQ ID NO.1) зрелого PorВ гена клонированы в экспрессионный плазмид рЕТ-17b. Два нуклеотида, которые отличны от описанного выше серотипа 15 PorВ, подчеркнуты.

Фиг. 5: График, демонстрирующий профиль элюции Сефакрил S-300 колонки дикого типа протеинов класса 3, изолированных из менингококкового штамма 8765 и рекомбинантного протеина класса 3, продуцированного BL21(DE3) - дельта ompА штаммом Е. coli, содержащим r3рЕТ-17b (является ли это копией - это в примерах не указано) плазмид, и как показано при поглощении 280 nm и при помощи SDS-PAGE анализа. Пустой объем колонки показан стрелкой. Фракции, содержащие менингококковый порин и рекомбинантный порин, как определено SDS-PAGE, обозначены линией.

Фиг.6: График, изображающий результат ингибиции ELISA исследований, показывает способность гомологичного дикого типа (wt) PorВ вызывать выработку реактивных антител в 6 человеческих иммунных сыворотках. Арифметическое значение показано рельефной линией.

Фиг. 7: График, изображающий результаты ингибиции ELISA исследований, показывает способность очищенного рекомбинантного PorВ протеина вызывать выработку реактивных антител в 6 человеческих иммунных сыворотках. Арифметическое значение ингибиции показано рельефной линией.

Фиг. 8: График, показывающий сравнение двух значений ингибиции, полученных у wt рекомбинантного Por В протеина.

Фиг. 9А и 9В: Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO.3) и транслированная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO.4) зрелого гена порина класса II клонированы в экспрессионный плазмид рЕТ-17b.

Фиг. 10А и 10В: Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO.5) и транслированная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO.6), связанных с геном порина класса II, клонированы в экспрессионный плазмид рЕТ-17b.

Фиг.11 ((а) и (б)): Фиг (а) изображает рестрикционную карту плазмида рЕТ-17b. Фиг.(б) показывает нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO.7 и SEQ ID NO. 9) между BgIII b Xhol сайтами рЕТ-17b плазмида. Последовательность, обеспеченная плазмидом, находится на нормальной линии, в то время как внесенная из РПЦ - продукта изображена на рельефной линии. Аминокислоты (SEQ ID NO. 8 и SEQ ID NO.10), которые происходят из плазмида, находятся на нормальной линии, в то время как аминокислоты из вставки - на рельефной. Стрелки отграничивают, где последовательность начинает соответствовать последовательности фиг.4 и где заканчивает.

В отличие от пориновых протеинов Е. coli и некоторых других грам-негативных бактерий, сравнительно мало известно поринах Neisseria, в частности о том, как влияет изменение первичной последовательности в порине на его ионоселективность, вольтаж- зависимость и другие биофизические функции. Кристаллические структуры двух поринов Е. coli: OmpF и PhoЕ были растворены в 2,4 А и 3,0 А, соответственно (Cowan, S.W. et al., Nature 358: 727-733 (1992)). Оба порина были хорошо изучены благодаря их необычайной стабильности, поэтому было возможно проведение молекулярно-генетических исследований. Данные, полученные генетиками, хорошо коррелировали с кристаллической структурой обоих поринов. Хотя, как было показано в различных экспериментах с моноклональными антителами для отбора поринов нейссерии, топология поверхности клетки Neisseria имеет близкое сходство с обоими указанными поринами Е. coli (van der Ley, P., et al., Infect. Immun. 59: 2963-2971 (1991)). Практически отсутствует информация о том, как изменения в аминокислотной последовательности в специфических областях поринов нейссерии влияют на их биофизические характеристики, в то время как о поринах Е. coli такие данные есть (Cowan, S.W. et al., Nature 358: 727-733 (1992)).

Для проведения таких исследований существуют две большие проблемы: (1) невозможность проводить с легкостью генетические манипуляции с Neisseria с помощью молекулярных технологий и (2) неспособность экспрессировать достаточное количество поринов в Е. coli для их дальнейшей очистки с целью получения данных для биофизической и биохимической характеристики. Большинство данных о последовательности ДНК менингококковых и гонококковых поринов были получены клонированием частично совпадающих участков гена порина и затем восстановлением информации для выявления всей последовательности гена (Gotschlich, E. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8135-8139 (1987); Murakami, К. et al., Infect. Immun. 57: 2318-2323 (1989)). Carbonetti et al. были первыми, кто клонировал гонококковый ген порина в Е. coli с использованием контролируемого рТ7-5 экспрессионного плазмида. Результаты этих исследований показали, что когда произошла индукция гена порина, накопилось небольшое количество пориновго протеина. Экспрессия этого протеина оказалась летальной для Е. coli (Carbonetti and Sparling, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 9084-9088 (1987)). Дополнительные эксперименты показали, что изменения в гене порина гонококка могут быть получены в системе Е. coli и затем вновь перенесены в гонококк (Carbonetti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6841-6845 (1988)). Тем не менее оказалось, что возможности легкого проведения данных манипуляций для получения достаточного количества порина с целью биохимической и биофизической характеристики ограничены.

Feavers и соавт. описали метод, при помощи которого амплификация происходит методом РПЦ-реакции поринового гена нейссерии из различных источников, используя два синтезированных олигонуклеотида к общим доменам 5 - конца и 3 - конца поринового гена соответственно (Feavers, I.M. et al., Infect. Immun. 60: 3620-3629 (1992)). Олигонуклеотиды были созданы так, что амплифицированная ДНК могла быть принудительно клонирована в плазмиды, используя рестрикцию эндонуклеаз Bgl II и Xho I.

Используя описанную Feavers ПЦР- систему ДНК, последовательность зрелого PorВ протеина менингококкового штамма 8765 серотипа 15 была амплифицирована и связана в BamHI-Xhol сайт Т7 экспрессионного плазмида рЕТ-17b. Это разместило PorВ протеиновую последовательность в рамках позади Т7 промотора и 20 аминокислот 10 протеин, включая первую последовательность. При добавлении PTG к культуре Е. coli, содержащей этот плазмид, большое количество PorВ протеина накапливается внутри бактерии. Полное объяснение, почему эта конструкция не явилась летальной для Е. coli и произошла экспрессия большого количества протеинов, ожидается при проведении дальнейших изучений. Тем не менее существует одно возможное объяснение замены промотора нейссерии и сигнальной последовательности - на Т7 и 10 соответственно приводит к тому, что продуцированный порин направляется в цитоплазму, а не к наружной мембране. Henning и соавт. обнаружили, что когда E.coli OmpA протеин и его фрагменты экспрессированы, то эти продукты, обнаруженные в цитоплазме, гораздо менее токсичны, чем те, которые направлены в периплазматическое пространство (Klose M., et al., J. Biol. Chem. 263: 13291-13296 (1988); Klose M., et al., J. Biol. Chem. 263: 13297-13302 (1988); FreudI, R., et al., J. Mol. Biol. 205: 771-775 (1989)). Все же каким бы ни было объяснение, но экспрессированный PorВ протеин легче изолировался, подвергался очистке и реформировался в тримерную конформацию, чем нативный протеин. Результаты по исследованию ингибиции ELISA с использованием человеческой иммунной сыворотки дают основание предполагать, что PorВ протеин, полученный способом, описанным выше, обладает почти всеми (если не всеми) антигенными характеристиками протеина PorВ дикого типа, очищенного из менингококка. Эта система дает возможность легкого манипулирования геном порина нейссерии с помощью новых молекулярных технологий. Эта система позволяет получать большое количество чистого поринового протеина для характеристики его. Эта система так же позволяет изучить и охарактеризовать гены из большого числа штаммов как гонококков, так и менингококков.

Таким образом, настоящее изобретение относится к методу выделения поринового протеина наружной мембраны менингококка группы В, в особенности поринов, относящихся к классу 2 и 3.

В одном из вариантов, настоящее изобретение относится к методу выделения поринового протеина менингококка группы В в Е. coli, включающему: (a) трансформацию Е. coli вектором, включающим избранный маркер и ген, кодирующий протеин, выбранный из группы насчитывающей: (i) зрелый пориновый протеин, (ii) связанный протеин, включающий зрелый пориновый протеин, включенный в аминокислоты от 1 до 20 или 22 гена Т7 10 капсидного протеина; указанный ген связан с Т7 промотором; (b) выращивание трансформированной Е. coli в среде, содержащей селективный агент, и (c) индуцирование экспрессии указанного протеина; протеин составляет более чем 2% от общего протеина, экспрессированного в Е. coli.

В предпочтительном варианте экспрессированный пориновый протеин менингококка группы В и связанный с ним протеин составляли около 5% от общего белка, экспрессированного в Е. coli. В другом исследовании оба экспрессированных протеина составили около 10% от общего количества протеинов, экспрессированных в Е. coli. И, наконец, в другом эксперименте пориновый протеин менингококка группы В и связанный с ним протеин составляют 30% от общих протеинов, экспрессированных в Е. coli.

Примеры плазмидов, которые содержат Т7 индуцирующий промотор, включают экспрессионные плазмиды рЕТ-17b, pET-11a, pET-24a-d(+) и рЕТ-9а, все они являются коммерчески доступными из Novagen (565 Science Drive, Madison, WI 53711). Эти плазмиды включают в последовательности Т7 промотор, необязательно как оператор, рибосомо связывающий сайт, рестрикционные сайты, позволяющие вставить структуральный ген и Т7 терминальную последовательность (см. Novagen каталог, стр 36-43 (1993)).

В предпочтительном варианте, использовался штамм BL21 (DE3) дельта ompA E. coli. Как был отмечено выше, плазмиды могут трансформироваться в этот штамм или в "дикий" штамм BL21 (DE3). Штамм BL (DE3) дельта ompA E. coli предпочтительнее, так как другие OmpA протеины, продуцируемые штаммом, могут загрязнить очищенный порин и создать нежелательные побочные иммуногенные эффекты.

Трансформированная E. coli растет в среде, содержащей селективный агент, например какой-либо бетта-лактам, к которому чувствительная E. coli, такой как ампициллин, рЕТ экспрессионный вектор обеспечивает селективным маркером, который передает резистентность к антибиотикам трансформированному организму.

Высокий уровень экспрессии поринового протеина менигококка группы В может быть токсичным для E. coli. Тем не менее, настоящее изобретение позволяет E. coli экспрессировать протеин на уровне 30% и даже 50% от общего числа клеточных протеинов.

В другом предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к вакцине, включающей пориновый протеин наружной мембраны менингококка группы В и связанный с ним протеин, полученные в соответствии с методами, описанными выше, а также фармакологически приемлемые дилюэнт, носитель и эксципиент, в совокупности с которыми вакцина может быть назначена в количестве, эффективном для вызывания выработки защитных антител у животных к Neisseria meningitidis. В предпочтительном варианте живые существа были выбраны из группы, включающей человека, крупный рогатый скот, овец, свиней и цыплят. В другом предпочтительном варианте был выбран человек.

Другой предпочтительный вариант изобретения - описанная выше вакцина, в которой указанный порин наружной мембраны менингококка и связанный с ним протеин конъюгированы с капсульным полисахаридом (СР), принадлежащим так же менингококку группы В. Этот капсульный полисахарид может быть приготовлен, как описано у Ashton, F.E. et al., Microbiоl. Pathog. 6: 455-458 (1989); Jennings, H.J. et al., J. Immunol. 134: 2651 (1985); Jennings, H.J. et al., J. Immunol. 142: 3585-3591 (1989); Jennings, H.J. "Capsular Polysaccharides as Vaccine Candidates" в Carrent Topics in Microbiology and Immunology, 150: 105-107 (1990).

Предпочтительно, чтобы капсульный полисахарид изолирован методом, предложенным Frasch, C.E. et al., "Production and Control of Neisseria meningitidis Vaccines" in Bacterial Vaccines, Alan R. Liss, Inc., стр. 123-145 (1990), содержание чего полностью представлено ниже: - выращивание организмов на модифицированной среде Франца от 10 до 20 ч, затем; - в течение 10 мин содержание культуры при 55^oС, убивающей микроорганизм, затем; - удаление инактивированных клеток путем центрифугирования, затем; - добавление Цетавлона до 0,1%; - преципитация капсульного полисахарида из культурального бульона; - добавление кальция хлорида 1М; - растворение капсульного полисахарида, затем центрифугирование для удаления клеточных остатков; - добавление этилалкоголя 25%; - удаление преципитированной нуклеиновой кислоты центрифугированием; - добавление этилалкоголя 80%; - преципитация неочищенного капсульного полисахарида и удаление алкоголя.

Неочищенный капсульный полисахарид в дальнейшем подвергается очистке методом гель-фильтрационной хроматографии, после частичной деполимеризации разведенной кислотой, например ацетиловой кислотой, муравьиной кислотой и трифлюроацетиловой кислотой (0,01-0,05 N), для получения смеси полисахаридов, имеющих среднюю величину молекулярного веса от 12,000 до 16,000. Затем капсульный полисахарид подвергается N-деацилированию с помощью борогидрида и N-пропионилируется с получением N-Pr-GBMP. Таким образом, капсульный полисахарид, используемый для конъюгата вакцины настоящего изобретения, может являться фрагментом капсульного полисахарида(СР), N-деацилированным капсульным полисахаридом или его фрагментом, а также N-Pr капсульным полисахаридом и его фрагментом. При использовании этих фрагментов как части СР- порин-протеинового конъюгата, капсульный полисахарид может индуцировать иммунную активность (см. примеры).

В дополнительном предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к методу приготовления полисахаридного конъюгата, включающего: получение вышеописанным методом поринового и связанного с ним протеина наружной мембраны менингококка группы В; получение капсульного полисахарида из менингококка; конъюгирование протеина и капсульного полисахарида.

Конъюгаты настоящего изобретения могут быть получены путем реакции сведения концевых групп капсульного полисахарида к первичным аминогруппам порина с помощью редуктивного аминирования. Восстановленные группы могут быть получены с помощью селективного гидролиза или специфического окислительного расщепления или комбинации обоих способов. Предпочтительно получение конъюгата капсульного полисахарида с порином методом Jennings et al., U.S. Patent 4, 356, 170, содержание которого находится в сноске, который включает контролируемое окисление капсульного полисахарида с использованием периодата, следующее за редуктивным аминированием поринового протеина.

Вакцина настоящего изобретения представляет собой пориновый протеин и связанный с ним протеин менингококка группы В или конъюгированную вакцину, в количестве, зависящем от способа назначения. Хотя подкожный и внутримышечный способы введения являются предпочтительными, пориновый протеин и связанный с ним протеин менингококка группы В, находящиеся в вакцине в настоящем изобретении, могут быть назначены интраперитонеально и внутримышечно. Лица, сведущие в данной области, будут признательны, если дозы, назначаемые для определенных протоколов лечения, могут быть окончательно определены без каких-либо незаконных, нежелательных экспериментов. Подходящие дозы вакцин могут быть в пределах от 2 микрограмм протеина на кг веса тела до 100 микрограмм на кг вес тела.

Вакцина настоящего изобретения может применяться в таких формах, как капсулы, жидкие растворы, суспензии или эликсиры для орального применения, либо стерильные жидкие формы, такие как растворы или суспензии. Инертными носителями, которые являются предпочтительными для вакцины, являются солевые растворы, фосфатно-буферные солевые растворы, или другие носители, в которых пориновый протеин и связанный с ним протеин менингококка группы В растворим. Вакцина может быть в виде препарата с однократной дозировкой или во флаконах с несколькими дозами, которые могут быть использованы для программ по осуществлению массовых вакцинаций. Ссылка на Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, Osol (ed) (1980) и New Trends and Developments in Vaccines, Voller et al., (eds), University Park Press, Baltimore, MD (1978) о методах приготовления и использования вакцин.

Пориновый и связанный с ним протеин менингококка группы В или конъюгированная вакцина настоящего изобретения в дальнейшем могут использоваться с включением адъюванта, который усиливает продукцию порин-специфических антител. Такими адъювантами могут являться, например, Freund s комплит-адъювант (CFA), стеарил-тирозин (ST, см. U.S. Patent 4.258,029), дипептид, известный как MDP, сапонин, алюминия гидрохлорид и лимфатические цитокины.

Freund s адъювант это эмульсия минерального масла и воды, которая смешана с иммуногенной субстанцией. Хотя данный адъювант обладает сильным действием, он, как правило, не назначался людям. Напротив, адъювант алюм (алюминия гидрохлорид) или ST мог быть использован для назначения людям. Пориновый протеин менингококка группы В или конъюгированная вакцина могут быть абсорбированы алюминием гидрохлоридом, из которого вакцина медленно высвобождается после инъекции. Порин менигококка группы В или конъюгированная вакцина могут также быть инкапсулированы с липосомами в соответствии с Fullerton, U.S. Patent 4235877.

В другом предпочтительном варианте изобретения, настоящее изобретение относится к методам профилактики бактериальных менингитов у живых существ, включая назначение живым существам поринового и связанного с ним протеина менигококка группы В или конъюгированной вакцины, произведенной в соответствии с методами, описанными выше в дозах, эффективных для предупреждения заболевания бактериальным менингитом.

Дополнительный вариант изобретения относится к методам очистки описанного выше поринового протеина и связанного с ним протеина наружной мембраны менингококка группы В с использованием: лизиса трансформированной Е. coli для высвобождения порина и связанного с ним протеина менингококка группы В как части нерастворимых включений; отмывания включений буфером для удаления загрязняющих Е. coli клеточных протеинов; суспензирование и растворение включений в водном растворе денатуранта; дилюции полученного раствора в детергенте и очистки растворенного порина менингококка группы В методом гель-фильтрации.

Первый шаг (лизис) может быть выполнен в соответствии с методами, известными лицам, сведущим в данной области науки, например: разрушение ультразвуком, разрушение ферментами или осмотический шок и др.

Включения могут быть отмыты буфером, который способен растворять клеточные протеины Е. coli без растворения включений, к которым относятся и пориновые протеины менингококка группы В. К данным буферам относятся TEN - буфер (50 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, рН 8,0), Tricine, Bicine и HEPES и др.

Денатуранты, которые могут быть использованы в практике изобретения, включают 2М-8М мочевину или 6М гуанидин HCl, более предпочтительно 4-8 М мочевина или 4-6 М гуанидин HCl, еще более предпочтительны около 8М мочевины и около 6М гуанидина HCl.

Примерами детергентов, которые могут быть использованы для разведения растворимых пориновых протеинов менингококка группы В, являются ион-детергенты, такие как - SDS и цетавлон (Calbiochem); неионные детергенты: Твин, Тритон X, Бридж 35 и октил глюкозид; цвиттерионные детергенты: 3,14 -Цвиттергент, эмпиген ВВ и Чэмпс.

Наконец, растворимый пориновый протеин наружной мембраны мен