Способ селективной амплификации, олигонуклеотид и набор для селективной амплификации

Способ селективной амплификации, олигонуклеотид и набор для селективной амплификации

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для идентификации рестрикционных фрагментов ДНК. Из исходной ДНК получают рестрикционные фрагменты и лигируют их с двунитевым синтетическим адаптером. ПЦР-Амплификацию фрагментов рестрикции осуществляют с помощью праймеров длиной 10-50 нуклеотидов. Праймеры включают постоянные последовательности с нуклеотидами, комплементарными части адаптерной последовательности и части последовательности сайта рестрикции, и на 3'-конце 1-10 случайно выбранных нуклеотидов. Изобретение позволяет амплифицировать рестрикционные фрагменты ДНК с неопределенными 5'- и 3'-концами и идентифицировать их. 3 с. и 35 з.п. ф-лы, 18 ил.

Изобретение касается применений ДНК-фингерпринтинга и использования ДНК-маркеров в ряде различных областей, включая (не ограничиваясь) селекцию растений и животных, идентификацию сортов или культиваров, диагностическую медицину, диагностику заболеваний животных и растений, идентификацию генетически наследуемых заболеваний людей, анализ семейного родства, судебный анализ и микробное типирование.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к методам ДНК-фингерпринтинга и определения специфических ДНК-маркеров в геномах в диапазоне от микроорганизмов до высших растений, животных и людей. Изобретение также касается синтетических ДНК-молекул и продуктов на их основе, которые используются в методах предлагаемого изобретения в различных областях применения.

2. ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ 2.1. ДНК-фингерпринтинг ДНК-фингерпринтинг или ДНК-типирование, а также другие методы анализа генотипирования, профиля и идентификации ДНК касаются охарактеризования любых аналогий, либо одного или более отличительных признаков в организации генетического материала или генома индивидуума, сорта или породы, либо целого вида. Общее правило состоит в том, что чем ближе генетическое родство, тем выше идентичность или более подходящее сходство геномов, и следовательно, тем реже встречаются в геноме отличительные признаки. Эти сходные или отличительные признаки могут быть выявлены анализом ДНК организма после расщепления ДНК эндонуклеазой рестрикции. Эндонуклеазы рестрикции представляют собой ферменты, которые распознают короткие последовательности нуклеотидов, обычно длиной от 4 до 8 пар оснований, и расщепляют две нити ДНК, тем самым продуцируя фрагменты ДНК дискретной длины. Из-за своей высокой степени специфичности последовательностей эндонуклеазы рестрикции расщепляют молекулы ДНК весьма специфичным образом. В результате этого получается репродуцируемый набор ДНК-фрагментов. ДНК-фрагменты можно фракционировать в соответствии с их длиной на пористых матрицах или гелях с получением типичных характеров исчерченности, что составляет ДНК-фингерпринт организации генетического материала организма.

2.2. ДНК-полиморфизмы При сравнении фингерпринтов видов, сортов или пород, имеющих очень высокую степень родства, ДНК-фингерпринты могут быть идентичными или весьма сходными. Когда различия наблюдаются в пределах по-иному идентичных ДНК-фингерпринтов, такие различия называются ДНК-полиморфизмами: это новые ДНК-фрагменты, которые появляются в фингерпринте. В этом положении ДНК называют полиморфной, и новый ДНК-фрагмент может быть использован в качестве ДНК-маркера. ДНК-полиморфизмы, обнаруженные в ДНК-фингерпринтах, полученных расщеплением ферментами рестрикции, могут возникнуть в результате любой из числа следующих альтераций в ДНК-последовательности: мутаций, упраздняющих сайт-мишень рестрикционной эндонуклеазы, мутаций, создающих новые сайт-мишени, инсерций, делеций или инверсий между двумя сайтами рестрикции. Такие ДНК-полиморфизмы обычно упоминаются как RFLP, то есть Полиморфизмы (Длин) Рестрикционных Фрагментов (Restriction Fragment Length Polymorphisms). Эти мутационные изменения ведут себя как bona fide (добросовестные) генетические маркеры, когда они унаследованы менделевским образом. Следовательно, ДНК-полиморфизмы могут быть использованы в качестве генетических маркеров во многом таким же образом, что и другие генетические маркеры: в анализе родства, в генетических исследованиях по наследованию признаков, при идентификации индивидуумов.

2.3. Методики ДНК-фингерпринтинга В отношении почти всех живых организмов за исключением вирусов рестрикционные перевары полной геномной ДНК организмов приводят к созданию такого большого количества полос, что невозможно подсчитать отдельные полосы. Поэтому все методы ДНК-фингерпринтинга основаны на том принципе, что только небольшая часть ДНК-фрагментов поддается визуализации с тем, чтобы можно было создать простой характер исчерченности, составляющий ДНК-фингерпринт.

Наиболее широко используемый метод предусматривает переваривание ДНК организма рестрикционными эндонуклеазами, фракционирование рестрикционных фрагментов гель-электрофорезом, перенос и привязывание фракционированных ДНК-фрагментов на мембрану и гибридизацию мембран со специфическим ДНК-фрагментом ("зондом"). ДНК-фрагмент образует молекулы двунитевой ДНК с ДНК-фрагментом (или фрагментами) на мембране, который (которые) имеет (имеют) комплементарные нуклеотидные последовательности. Когда зонд помечен визуализируемым маркером, можно визуализировать ДНК-фрагмент, к которому присоединен зонд. Эту методику обычно называют "гибридизацией по Саузерну". Когда наблюдаются различия в размерах соответствующих рестрикционных фрагментов, к которым зонд присоединяется в близкородственных молекулах геномной ДНК, эти различия называют ДНК-полиморфизмами, более конкретно полиморфизмами длин рестрикционных фрагментов. Различия в длине рестрикционных фрагментов соответствуют разным аллельным формам генетического локуса, узнаваемого ДНК-зондом. Хотя метод гибридизации по Саузерну для ДНК-фингерпринтинга используется повсеместно, он представляет собой трудоемкий процесс и требует много времени.

Кроме того, метод имеет низкое разрешение и поэтому может быть использован лишь для подсчета единичных локусов или нескольких локусов, самое большее в единичной реакции.

2.4. Полимеразно-цепьевая реакция Методика полимеразно-цепьевой реакции (ПЦР) представляет собой метод, предназначенный для синтезирования in vitro специфических ДНК-фрагментов. Методика основана на использовании специфических олигонуклеотидов, которые присоединяются к уникальным последовательностям на молекуле ДНК и термостабильной ДНК-полимеразе. Олигонуклеотиды построены таким образом, чтобы они могли ренатурироваться с противоположными нитями ДНК и служить в качестве праймеров в реакции синтеза ДНК таким образом, чтобы каждый направлял синтез новых ДНК-нитей. Отсюда в одном раунде синтеза между праймерами образуется полная копия ДНК-молекулы так, что ДНК удваивается между праймерами. Каждый раунд ДНК-синтеза приводит к удваиванию количества ДНК, что приводит к амплификации ДНК, содержащейся между двумя праймерами. Следовательно, методика ПЦР позволяет синтезировать точный ДНК-сегмент, используя небольшое количество "субстрактной ДНК".

3. КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ В предлагаемом изобретений использован новый способ амплификации с помощью метода ПЦР рестрикционных фрагментов, полученных после расщепления ДНК организма по крайней мере одним рестрикционным ферментом. В этом новом применении метода ПЦР используемые олигонуклеатиды не направлены против известной ДНК последовательности, а сконструированы так, чтобы они распознавали концы рестрикционных фрагментов. Для этой цели необходимо модифицировать концы рестрикционных фрагментов путем добавления к концам олигонуклеотидных линкеров (или адаптеров). Причиной этого является то, что концы рестрикционных фрагментов имеют только несколько нуклеотидов, то есть от 2 до 8 нуклеотидов, что слишком мало для использовании при построении праймеров для ПЦР-амплификации.

Предлагаемое изобретение основано на использовании нового применения методики полимеразно-цепьевой реакции (ПЦР) для амплификации одного или более рестрикционных фрагментов из комплексных смесей ДНК-фрагментов, полученных перевариванием молекул геномной ДНК рестрикционными эндонуклеазами. Одно конкретное преимущество предлагаемого технического решения заключается в осуществлении амплификации рестрикционных фрагментов ДНК в ситуациях, когда не определена нуклеотидная последовательность 5'- и 3'-концов рестрикционных фрагментов. В таких случаях нельзя определить обычные последовательность-специфичные праймеры, гибридизирующиеся к каждой нити рестрикционного фрагмента, подлежащей амплификации, и поэтому нельзя использовать методы, известные в данной области техники, с целью амплификации.

Метод предлагаемого технического решения может быть использован, например, двумя различными способами, приводящими к двум различным типам применений: (1) Методам ДНК-фингерпринтинга геномов путем произвольного отбора субпопуляций одного или более рестрикционных фрагментов, подлежащих амплификации с помощью методики ПЦР. Изобретение также охватывает синтетические олигонуклеотиды для использования в указанных методах, и некоторыми применениями указанных методов могут быть судебное типирование, микробная идентификация, сортовая идентификация, родословный (педигри) анализ и скрининг ДНК-маркеров, связанных с генетическими признаками; (2) Методам идентификации одного или более предварительно отобраных ДНК-фрагментов, которые могут быть полиморфными, с помощью ПЦР-амплификации. Изобретение также охватывает специфические синтетические олигонуклеотиды для использования в указанных методах, и некоторыми применениями указанных методов могут быть скрининг генетически наследуемых заболеваний у людей, контроль за наследованием агрономических признаков при селекции растений и животных, а также обнаружение возбудителей заражения при заболеваниях.

4. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ Фиг. 1 представляет собой графическое изображение общего метода ПЦР-амплификации меченых рестрикционных фрагментов, полученных перевариванием молекул геномной ДНК рестрикционным ферментом.

Фиг. 2 изображает лигирование адаптеров к разным концам рестрикционных фрагментов: одноуровневым концам и ступенчатым концам.

Фиг. 3 изображает ПЦР-амплификацию меченых рестрикционных фрагментов. Блочные участки изображают адаптеры, которые лигируют к рестрикционному фрагменту, и праймеры, которые используют при ПЦР-амплификации. Стрелки указывают направление синтеза ДНК.

Фиг. 4 представляет собой графическое изображение ПЦР-амплификации меченых рестрикционных фрагментов.

Фиг. 5 показывает общую картину селективных праймеров, используемых при ПЦР-амплификации меченых рестрикционных фрагментов. Селективность праймеров проиллюстрирована на двух примерах, где имеют место соответственно совершенная совместимость и полная несовместимость между селективной последовательностью оснований и той же последовательностью матричной ДНК рестрикционных фрагментов.

Фиг. 6 показывает принцип селективной ПЦР-амплификации с использованием ПЦР-праймера, который отбирает молекулы матричной ДНК, имеющие тринуклеотидную последовательность, смежную с последовательностью адаптера.

Фиг. 7 изображает селективную ПЦР-амплификацию меченых рестрикционных фрагментов.

Фиг. 8 показывает принцип фрагмент-специфической амплификации с использованием комбинации двух ПЦР-праймеров, каждый из которых содержит шесть селективных пар. Каждый праймер образует двунитевую структуру в каждой нити рестрикционного фрагмента, тем самым образуя праймерно-матричный комплекс, из которого может быть инициирован синтез ДНК (представлен стрелками).

Фиг.9 изображает общие элементы последовательности, которые распознаются методом селективной амплификации рестрикционных фрагментов, включающие две нуклеотидные последовательности, которые узнаны, и дистанцию, разделяющую две последовательности.

Фиг. 10 изображает типы вариантов нуклеотидных последовательностей, которые обнаруживают в методе идентификации полиморфизмов длин амплифицированных фрагментов.

Фиг. 11 показывает 1,0% агарозный гель с анализом результатов амплификации ДНК томатов, рестрицированной с помощью PstI при использовании праймеров повышенной селективности.

Фиг. 12 показывает 1,0% агарозный гель с анализом результатов специфической амплификации трех разных фрагментов PstI ДНК томатов с использованием фрагмент-специфических праймеров.

Фиг.13 показывает 2,5% полиакриламидный/1,0% агарозный гель с ДНК-фингерпринтами, полученными селективной амплификацией рестрикционных фрагментов (SRFA) двух линий томатов.

Фиг. 14 показывает часть 4,5% денатурирующего полиакриламидного геля с ДНК-фингерпринтами четырех линий томатов с использованием SRFA с комбинацией ферментов PstI/MseI.

Фиг. 15 показывает часть 4,5% денатурирующего полиакриламидного геля с ДНК-фингерпринтами десяти линий Lactuca с использованием SRFA с комбинацией ферментов PstI/MseI.

Фиг. 16 показывает часть 4,5% денатурирующего полиакриламидного геля с ДНК-фингерпринтами двух линий кукурузы с использованием SRFA с комбинацией ферментов PstI/TagI и EcoRI/TagI.

Фиг. 17 показывает часть 4,5% денатурирующего полиакриламидного геля с ДНК-фингерпринтами с 26 штаммов Xanthomonas campestris с использованием SRFA с комбинацией ферментов ApaI/TagI.

Фиг. 18 показывает часть 4,5% денатурирующего полиакриламидного геля с ДНК-фингерпринтами различных индивидуумов четырех домашних животных: цыпленка, свиньи, коровы и лошади с использованием SRFA с комбинацией ферментов SseI/MseI.

5. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 5.1 Определения В описании изобретения и последующих примерах используется ряд терминов.

Для получения ясного представления об описании и формуле изобретения приведены следующие определения.

- Рестрикционные Эндонуклеазы: рестрикционная эндонуклеаза или рестрикционный фермент представляет собой фермент, который распознает специфическую последовательность оснований (сайт-мишень) в молекуле двунитевой ДНК и расщепляет обе нити ДНК-молекулы в каждом сайте-мишени.

- Рестрикционные Фрагменты: молекулы ДНК, полученные перевариванием рестрикционными эндонуклеазами, называются рестрикционными фрагментами. Любой данный геном переваривается определенной рестрикционной эндонуклеазой в дискретный набор рестрикционных фрагментов. ДНК-фрагменты, полученные в результате расщепления рестрикционными эндонуклеазами, разделяют и определяют гель-электрофорезом.

- Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов (RFLP): геномные ДНК двух родственных организмов, например, проявляют различия в составе их нуклеотидных последовательностей во многих сайтах. Когда эти различия встречаются в сайте-мишени для рестрикционной эндонуклеазы, модифицированный сайт-мишень в данный момент не расщепляется. Аналогичным образом вариация последовательностей нуклеотидов может вводить новый сайт-мишень, когда не существует в другом организме, вызывая в этот момент разрезание ДНК рестрикционным ферментом. Альтернативно инсерции или делеции нуклеотидов, встречающиеся в одном организме между двумя сайтами-мишенями для рестрикционной эндонуклеазы, модифицируют расстояние между этими сайтами-мишенями. Вследствие этого переваривание ДНК двух организмов приводит к получению фрагментов разной длины. В результате возникает полиморфизм в длине рестрикционных фрагментов, полученных перевариванием ДНК двух организмов.

- Гель-Электрофорез: для определения рестрикционных фрагментов требуется аналитический метод фракционирования двунитивых молекул ДНК на основе размера. Наиболее широко используемым методом достижения такого фракционирования является электрофорез в гелях. Скорость, с которой фрагменты ДНК движутся в таких гелях, зависит от их размера; так, пройденные расстояния уменьшаются по мере увеличения длины фрагментов. ДНК-фрагменты, фракционированные гель-электрофорезом, можно визуализировать непосредственно с помощью метода окрашивания, если незначительно число фрагментов, включенных в структуру.

- Синтетические Олигонуклеотиды: однонитевые молекулы ДНК, имеющие предпочтительно около 10-50 оснований, которые можно синтезировать химически, называются синтетическими олигонуклеотидами. Вообще эти синтетические ДНК-молекулы строят таким образом, чтобы они имели уникальную последовательность нуклеотидов, хотя можно синтезировать семейства молекул, имеющих родственные последовательности и различные композиции нуклеотидов в специфических положениях в пределах нуклеотидной последовательности. Термин синтетический олигонуклеотид будет использован в отношении ДНК-молекул, имеющих уникальную нуклеотидную последовательность. Термин "смешанные синтетические нуклеотиды" будет использован в отношении семейств родственных синтетических олигонуклеотидов.

- Лигирование: ферментативная реакция, катализируемая ферментом лигаза, когда две двунитевые молекулы ДНК ковалентно связаны одна с другой, называется лигированием. Вообще-то обе нити ДНК ковалентно связаны одна с другой, однако также можно предотвратить лигирование одной из двух нитей путем химической или ферментативной модификации одного из концов. В этом случае ковалентное связывание будет происходить только в одной из двух нитей ДНК.

- Адаптеры: короткие двунитевые молекулы ДНК с ограниченным числом пар оснований, например, длиной от 10 до 30 пар оснований, которые построены таким образом, чтобы их можно было лигировать к концам рестрикционных фрагментов. Адаптеры выполнены из двух синтетических олигонуклеотидов, которые имеют нуклеотидные последовательности, частично комплементарные друг другу. При смешивании двух синтетических олигонуклеотидов они образуют двунитевую структуру в растворе при соответствующих условиях. Один из концов молекулы адаптера построен таким образом, чтобы его можно было лигировать к концу рестрикционного фрагмента, тогда как другой конец построен без возможности быть лигированным.

- Полимеразно-Цепьевая Реакция (ПЦР): ферментативная реакция, в которой фрагменты ДНК синтезируют in vitro из субстратной ДНК, называется ПЦР. Реакция предусматривает использование двух синтетических олигонуклеотидов, которые комплементарны нуклеотидным последовательностям в молекуле ДНК, разделенным коротким расстояниям от нескольких сотен до нескольких тысяч пар оснований, и использование термостабильной ДНК-полимеразы. Реакция цепи состоит, например, из ряда 10-30 циклов. В каждом цикле субстратную ДНК вначале денатурируют при высокой температуре. После охлаждения синтетические олигонуклеотиды, присутствующие в большом избытке, образуют двунитевые структуры с молекулами субстратной ДНК в растворе в специфических сайтах на молекуле субстратной ДНК, которая имеет комплементарные нуклеотидные последовательности. Комплексы олигонуклеотидов субстратной ДНК затем служат в качестве инициирующих сайтов для реакции синтеза ДНК, катализируемой ДНК-полимеразой, которая приводит к получению новой нити ДНК, комплементарной нити субстратной ДНК.

- ДНК-Амплификация: термин ДНК-амплификация будет использован для обозначения синтеза in vitro двунитевых молекул ДНК с использованием Полимеразно-Цепьевой Реакции (ПЦР). Продукты реакции ПЦР будут называться амплифицированными ДНК-фрагментами.

- Праймеры: вообще термин праймер относится к нити ДНК, которая может примировать синтез ДНК. ДНК-полимераза не может синтезировать de novo ДНК без праймеров: они могут лишь удлинять существующую нить ДНК в реакции, в которой комплементарную нить используют в качестве матрицы для того, чтобы руководить порядком нуклеотидов, подлежащих сборке. В данном описании праймерами называются молекулы синтетических олигонуклеотидов, которые используются в реакции ПЦР.

- Методика Саузерн-Гибридизации: целью методики Саузерн-гибридизации, упоминаемой также как Саузерн-блоттинг, является физический перенос ДНК, фракционированной агарозным гель-электрофорезом, на такой носитель, как найлоновая мембрана или бумага нитроцеллюлозного фильтра, с одновременным удержанием относительных положений ДНК-фрагментов, которые получены в результате фракционирования. Методология, используемая для выполнения переноса из агарозного геля на носитель, заключается в том, чтобы вытянуть ДНК из геля на носитель путем капиллярного действия.

- Нуклеиновокислотная Гибридизация: нуклеиновокислотную гибридизацию используют для обнаружения родственных ДНК-последовательностей путем гибридизации однонитевой ДНК на таких носителях, как найлоновая мембрана или бумага нитроцеллюлозного фильтра. Молекулы нуклеиновых кислот, которые имеют комплементарные пары оснований, реформируют двунитевую структуру, если смешаны в растворе при надлежащих условиях. Двунитевая структура образуется между двумя комплементарными однонитевыми нуклеиновыми кислотами, даже если одна иммобилизирована на носителе. В методике Саузерн-гибридизации встречается последняя ситуация.

- Гибридизационный зонд: для обнаружения конкретной ДНК-последовательности в методике Саузерн-гибридизации меченая молекула ДНК или гибридизационный зонд подвергается взаимодействию с фракционированной ДНК, привязанной к такому носителю, как найлоновая мембрана или бумага нитроцеллюлозного фильтра. Участки на фильтре, которые несут ДНК-последовательности, комплементарные меченому ДНК-зонду, сами становятся мечеными в результате реакции повторного отжига. Гибридизационный зонд получают, как правило, молекулярным клонированием специфической формы ДНК-последовательности генома кукурузы.

5.2. Описание предпочтительных вариантов изобретения Настоящее изобретение относится более конкретно к способу и средствам, позволяющим применять полимеразно-цепьевую реакцию (ПЦР) для определения полиморфизмов рестрикционных фрагментов (RFP), включая полиморфизмы длин. Настоящее изобретение включает методы определения RFP, синтетические олигонуклеотиды для использования в методах изобретения, наборы, содержащие средства определения RFP, и применения способов и методик изобретения для селекции растений и животных, диагностики генетически наследуемых заболеваний, идентификации организмов, а также судебного типирования и т.д.

В частности, настоящее изобретение предлагает способы идентификации или отдельных геномных рестрикционных фрагментов, или наборов геномных рестрикционных фрагментов из любых организмов, микроорганизмов, растений, животных или человека, которые в отдельности генетически связаны с одним или более конкретными признаками или которые сообща создают фингерпринт генома, который может быть использован для идентификации организма, вариетета либо индивидуума.

Общий метод в соответствии с изобретением для получения и идентификации рестрикционных фрагментов предусматривает использование рестрикционных эндонуклеаз, лигирование синтетических олигонуклеотидов к рестрикционным фрагментам и ПЦР-амплификацию рестрикционных фрагментов (Фиг.1). Рестрикционные эндонуклеазы расщепляют молекулы геномной ДНК в специфических сайтах, сайтах-мишенях, тем самым генерируя рестрикционные фрагменты.

ПЦР-амплификацию рестрикционных фрагментов, неважно, известна или не известна нуклеотидная последовательность концов рестрикционных фрагментов, можно осуществить в соответствии с изобретением путем первоначального лигирования синтетических олигонуклеотидов (адаптеров) к концам рестрикционных фрагментов, получая тем самым рестрикционный фрагмент с двумя общими метками, которые служат в качестве якорного основания для праймеров, используемых при ПЦР-амплификации.

Обычно рестрикционные ферменты продуцируют или одноуровневые концы, в которых терминальные нуклеотиды обеих нитей спарены в основаниях, или ступенчатые концы, в которых одна из двух нитей выступает с образованием короткого однонитевого удлиняющего сегмента (Фиг.2). В случае если рестрикционные фрагменты имеют одноуровневые концы, адаптеры используются также с одноуровневым концом. В случае если рестрикционные фрагменты имеют ступенчатые концы, используют адаптеры, которые имеют однонитевый удлиняющий сегмент, комплементарный однонитевому удлиняющему сегменту рестрикционного фрагмента. Следовательно, для каждого типа рестрикционного фрагмента используются специфические адаптеры, которые отличаются только в одном из концов так, чтобы адаптер можно было лигировать к рестрикционному фрагменту. Обычно используемые адаптеры состоят из двух синтетических олигонуклеотидов, которые частично комплементарны друг другу и, как правило, имеют приблизительно 10-30 нуклеотидов в длину, предпочтительно 12-22 нуклеотидов, и которые образуют двунитевые структуры, когда смешаны в растворе. При использовании фермента лигаза адаптеры лигируют к смеси рестрикционных фрагментов. При использовании большого молярного избытка адаптеров по сравнению с рестрикционными ферментами гарантируется то, что все рестрикционные фрагменты, полученные с помощью данного метода, называют мечеными рестрикционными фрагментами, а метод называется мечением рестрикционных фрагментов.

Теперь адаптеры могут служить в качестве матриц для праймеров, имеющих определенные выше характеристики, которые применяются в последующей реакции ПЦР-амплификации. В предпочтительном варианте изобретения рестрикционный фрагмент, несущий тот же адаптер с обоих концов и один ПЦР-праймер, может быть использован для амплификации рестрикционного фрагмента, как показано на Фиг.3. Поскольку в таком случае все рестрикционные фрагменты метят одинаковым путем, очевидно, что ПЦР-амплификация смеси меченых рестрикционных фрагментов приведет к амплификации всех рестрикционных фрагментов синхронным образом. В другом варианте с использованием двух разных рестрикционных ферментов для расщепления ДНК два разных адаптера лигируют к концам рестрикционного фрагмента. В этом случае два разных ПЦР-праймера можно использовать для амплификации таких рестрикционных фрагментов. В другом варианте осуществления настоящего изобретения с использованием двух рестрикционных ферментов адаптер для одного из ферментов биотинилируют. Это позволяет отобрать в комплексной смеси рестрикционных фрагментов те рестрикционные фрагменты, которые несут по крайней мере один конец для такого рестрикционного фермента, с использованием обычных методов выделения биотинилированных молекул. Эта стадия снижает сложность исходной смеси рестрикционных фрагментов и порождает следующую стадию обогащения перед ПЦР-амплификацией, тем самым снижая в некоторых случаях фон. Одновременную амплификацию нескольких различных фрагментов часто называют множественной ПЦР.

Принцип множественной амплификации рестрикционных фрагментов проиллюстрирован на Фиг.4.

Настоящее изобретение также основано на определении специфически построенных праймеров и специфических методах направления реакции ПЦР-амплификации таким образом, чтобы существовала возможность проведения управляемой амплификации, а в особом варианте изобретения таким путем, чтобы можно было амплифицировать лишь малую субпопуляцию меченых рестрикционных фрагментов.

Вообще-то перевары геномной ДНК рестрикционной эндонуклеазой, в частности животной, растительной и человеческой геномной ДНК, приводят к получению очень больших количеств рестрикционных фрагментов. Число рестрикционных фрагментов зависит от размера генома и частоты встречаемости сайта-мишени рестрикционной эндонуклеазы в геноме, что в свою очередь определяется, главным образом, числом нуклеотидов в сайте-мишени. Число нуклеотидов в сайтах-мишенях традиционно используемых рестрикционных эндонуклеаз варьируется от 4 до 8. Размеры генома организмов варьируются в широких пределах от нескольких миллионов пар оснований в случае микроорганизмов до несколько миллиардов пар оснований в случае животных и растений. Отсюда число рестрикционных фрагментов, полученных после расщепления молекул геномной ДНК рестрикционным ферментом, может варьироваться от нескольких сотен до нескольких миллионов. Как правило, число рестрикционных фрагментов так высоко, что невозможно идентифицировать отдельные рестрикционные фрагменты в переварах геномной ДНК, фракционированных с помощью гель-электрофореза. Такие перевары обычно продуцируют пятно полос.

ПЦР-амплификация меченых рестрикционных фрагментов, таким образом, также должна продуцировать пятно полос, поскольку все фрагменты должны совместно амплифицироваться синхронно в ПЦР-реакции. В предпочтительном варианте осуществления изобретения применительно к геномным ДНК больших размеров заявитель использовал общий принцип ограничения числа рестрикционных фрагментов, подлежащих амплификации. Это сделано за счет предварительного отбора субпопуляции меченых рестрикционных фрагментов так, чтобы во время реакции ПЦР-амплификации амплифицировалось лишь относительно небольшое количество меченых рестрикционных фрагментов.

Селективный принцип, определенный в этом варианте изобретения, состоит в конструировании олигонуклеотидов, которые используются в качестве праймеров для ПЦР-амплификации, как показано на Фиг.5.

Меченые рестрикционные фрагменты имеют общую структуру в следующем виде: вариабельную ДНК-последовательность (соответствующую рестрикционному фрагменту перед мечением), фланкированную с обеих сторон инвертированной ДНК-последовательностью (константной последовательностью). Инвертированная ДНК-последовательность (константная ДНК-последовательность) состоит из части последовательности-мишени рестрикционной эндонуклеазы и последовательности адаптера, присоединенной к обоим концам рестрикционного фрагмента. Вариабельные последовательности рестрикционных фрагментов, содержащиеся между константными ДНК-последовательностями, обычно неизвестны и поэтому имеют хаотический состав последовательности, фланкирующие константную ДНК-последовательность, являются полностью разупорядоченными в большой смеси рестрикционных фрагментов.

Настоящее изобретение поэтому также предлагает специфические ПЦР-праймеры, которые содержат часть нуклеотидной последовательности, а в варианте изобретения, относящемся к амплификации ограниченной субпопуляции полученных рестрикционных фрагментов, содержит часть вариабельной последовательности. В части константной последовательности нуклеотидная последовательность построена таким образом, чтобы праймер надлежащим образом создавал пары оснований с константной последовательностью ДНК одной из нитей ДНК у конца рестрикционного фрагмента. Часть вариабельной последовательности содержит выбранную наугад нуклеотидную последовательность, имеющую от 1 до 10 отобранных оснований.

Выражение "вариабельная последовательность" более точно означает последовательность, состоящую из отобранных нуклеотидов, образующих последовательность, которая затем остается константной для целей амплификации субпопуляций рестрикционных фрагментов. В конкретном варианте настоящего изобретения можно использовать несколько последовательностей выбранных оснований с тем, чтобы определить несколько различных праймеров. В таком случае праймеры могут иметь одну и ту же константную последовательность и вариабельные последовательности, выполненные из отобранных оснований, которые разные у образованных таким образом праймеров.

Именно добавление этих вариабельных (отобранных) последовательностей к 3'-концу праймеров руководит предварительным отбором меченых рестрикционных фрагментов, которые будут амплифицированы на стадии ПЦР: при осуществлении реакции ПЦР в соответствующих условиях праймеры только инициируют ДНК-синтез на тех меченых рестрикционных фрагментах, в которых вариабельная ДНК-последовательность создает надлежащим образом пары оснований с матричной нитью меченого рестрикционного фрагмента, как показано на Фиг.5.

Отбор определяется числом нуклеотидных остатков в части вариабельной последовательности праймера: селективность праймеров возрастает с числом нуклеотидов в части вариабельной (отобранной) последовательности. Заявитель также использует термин "селективные основания" для обозначения нуклеотидов в части вариабельной последовательности, показывая тем самым, что отбор этих оснований придает селективцость праймеру. Следует понять, что меченый рестрикционный фрагмент будет амплифицирован лишь в том случае, когда селективные основания праймеров узнают обе комплементарные последовательности у концов фрагмента. В случае если праймер совмещается только с одним концом, амплификация становится линейной, а не экспоненциальной и продукт остается необнаруженным.

Существует возможность предварительной оценки степени селективности, полученной при использовании вариабельных последовательностей с различным количеством селективных оснований, за счет использования общей формулы 4²ⁿ, где n равно количеству селективных оснований: с использованием 1 селективного основания можно амплифицировать один из 16 меченых фрагментов; с использованием 2 селективных оснований можно амплифицировать один из 256 меченых фрагментов; с использованием 3 селективных оснований можно амплифицировать один из 4096 меченых фрагментов; с использованием 4 селективных оснований можно амплифицировать один из 65536 меченых фрагментов и так далее. Один предпочтительный вариант настоящего изобретения позволяет, таким образом, селективно амплифицировать разупорядоченную субпопуляцию меченых рестрикционных фрагментов из любого перевара геномной ДНК независимо от числа фрагментов, продуцированных с использованием рестрикционного фермента. В предпочтительном варианте число селективных нуклеотидов выбирают таким образом, чтобы количество амплифицируемых рестрикционных фрагментов было ограничено пределом от 5 до 200. Хотя это количество можно вычислить путем деления числа фрагментов на 4²ⁿ, точный прогноз невозможен, так как не все рестрикционные фрагменты могут быть амплифицированы с равной эффективностью. Поэтому на практике можно найти меньше фрагментов амплификации, чем ожидается теоретически. Следует также отметить, что можно использовать смеси двух (или более) праймеров. Это позволяет осуществить амплификацию фрагментов, распознаваемых каждым праймером и, кроме того, фрагментов, распознаваемых двумя праймерами. Наконец, следует отметить, что отбор на основе спаривания оснований между двумя селективными нуклеотидами праймера и комплементарной матрицей подвержен большому влиянию температуры, выбранной для стадии ренатурации в ПЦР-реакции. Когда эта температура находится ниже или близка к температуре плавления праймерно-матричного комплекса, праймеры ренатурируют несовершенно спаренные темплатные последовательности, вызывая в комплексе ошибочное спаривание. Этого следует избегать, так как может произойти амплификация намного большего числа фрагментов, нежели предсказано, что приводит к вариабельным результатам.

ПЦР-продукты, полученные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть идентифицированы с использованием стандартных методов фракционирования для выделения ДНК-молекул в соответствии с размером с последующим окрашиванием ДНК-молекул при помощи пригодных агентов. Альтернативно праймеры, используемые для ПЦР-амплификации, могут быть помечены пригодным радиоактивным или флуоресцентным хромофором, что позволяет идентифицировать продукты реакции после фракционирования по размерам. В предпочтительном варианте осуществления изобретения ПЦР-продукты фракционируют гель-электрофорезом с использованием стандартных гельных матриц, таких как, например, агарозная, полиакриламидная или смешанная агарозно/полиакриламидная. ПЦР-продукты, полученные в соответствии с настоящим изобретением, далее будут обозначены термином Амплифицированные Рестрикционные Фрагменты (ARF).

Средства и метод настоящего изобретения могут быть использованы для