Модифицированные ингибиторы протеиназы

Модифицированные ингибиторы протеиназы

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции организмов, например растений. Цистатиновый ингибитор протеиназы (оризацистатин 1), имеющий делецию аспарагиновой кислоты в положении 86, и гибридный ингибитор протеиназы, включающий цистатин и ингибитор протеиназы, используют для борьбы с патогенами, паразитами или вредителями. Трансформация организма молекулой ДНК, кодирующей ингибиторы протеиназы, придает ему устойчивость к протеолитическому расщеплению. Ингибиторы протеиназ могут быть также получены с использованием праймеров. 7 с. и 11 з.п. ф-лы, 6 ил., 4 табл.

Изобретение относится к ингибиторам протеиназы, в частности к новым ингибиторам протеиназы, способам их получения и к содержащим их продуктам и процессам.

Протеиназы - это разрушающие белки ферменты, весьма значительно различающиеся по избирательности к субстратам, что препятствует их использованию как основы для классификации. Как правило, лучше классифицировать эти ферменты, руководствуясь природой катализируемых ими реакций. Так, протеиназы разделяют на четыре группы, определяемые как сериновые, цистеиновые, аспарагиновые протеиназы и металлопротеиназы. Сериновые и цистеиновые протеиназы широко распространены и весьма разнообразны. Их находят в организмах и прокариот, и эукариот, включая растения и животных. В отличие от них аспарагиновые протеиназы, по-видимому, были выявлены только в организмах эукариот. Поскольку эти ферменты служат для разрушения белков, их полезность или вредность для данного организма обусловлена их происхождением и/или локализацией. К примеру, вредны ферменты, используемые патогенами, паразитами или вредителями для разрушения ткани клеточной стенки хозяина.

Такие патогены, паразиты или вредители, как бактерии, грибы, растения, насекомые, нематоды и так далее, продуцируют протеиназы, разрушающие ткань клеточной стенки хозяина, принося ему вред.

К примеру, причиняемые грибами ежегодные глобальные потери урожая превышают миллиард фунтов. Патоген Botrytis cinerea имеет ведущее экономическое значение, поскольку вызывает заболевания у культурных растений тридцати видов, способен нанести серьезный вред в тепличном хозяйстве, в виноградарстве и вследствие порчи фруктов и овощей после уборки. Этот важный патоген может быть подавлен фунгицидами, но к сожалению, их использование связано с рядом недостатков, а именно, с финансовыми потерями, потенциальной опасностью для окружающей среды при применении токсичных фунгицидов и соответствующим беспокойством потребителя, а главное - с проблемой устойчивости патогенов к фунгицидам. Кроме того, многие фунгициды эффективны только против ограниченного ряда патогенных грибов.

Указанные недостатки имеют место и при применении синтетических продуктов, производимых для борьбы с другими патогенами, паразитами или вредителями, такими как насекомые или определенные их виды, бактерии или определенные их виды и другие эукариотические организмы, включая таких простейших, как амебы, кишечные жгутиковые и реснитчатые, таких геможгутиковых, как лейшмании или трипаносомы, таких споровиков, как возбудители малярии, передаваемые членистоногими, таких гельминтов, как трематоды или плоские черви, цестоды, акантоцефалы, нематоды, трихурии, трихины, анкилостомы, филярии, спируроиды, таких членистоногих, как акарины или клещи, разнокрылые клещи, вши, блохи; таких двукрылых, как переносящие болезни мухи, включая комаров, личинки и миаз, но не ограничиваясь ими.

Известно, что ингибирование протеиназ обычно имеет место после заражения патогеном. Например, было показано (1), что после заражения Phytophthora infestans томаты ряда сортов способны сопротивляться грибам, повышая продуцирование ингибиторов протеиназ. Эту связь между устойчивостью и способностью продуцировать ингибиторы протеиназ используют для достижения положительного эффекта в борьбе с заболеваниями, вызванными патогенами, вредителями и паразитами. Например, из большинства известных заявителю публикаций по этому вопросу ясно, что с вредителями растений можно бороться с помощью ингибитора протеиназы на основе животного цистатина белка куриного яйца (CEWC), рекомбинанатно встроенного в такие однодольные растения, как хлебные злаки, фуражные или газонные травы, или такие двудольные, как овощи, трубчатые или сахароносные культуры (ЕР 0 348 348). Аналогично, с растительными нематодами боролись, применяя ингибитор протеиназы растительного происхождения, а именно, ингибитор трипсина из вигны китайской, который был рекомбинантно встроен в табак, томат, хлопок, рапс, овощные культуры или декоративные растения (ЕР 0 502 730). Также было предложено применять ингибиторы протеиназ как антипаразитарные белки, которые идеально могут быть введены хозяйским видам в составе либо лекарства, либо пищи (заявка на патент Великобритании 94 03819.7).

Далее, известно применение ингибиторов протеиназ для нейтрализации действия протеиназ и, таким образом, для борьбы с результатами действия патогенов, паразитов или вредителей. В частности, известны трансгенные растения, которые снабжены таким специфическим ингибитором протеиназы, как ингибитор цистеиновой протеиназы.

Тем не менее, в основу изобретения положена задача создать модифицированные ингибиторы протеиназ, которые обладали бы большей эффективностью в сравнении с их немодифицированными аналогами или природными ингибиторами протеиназ, или альтернативно - синтетически изготовить и усовершенствовать ингибиторы протеиназ с тем, чтобы создать, согласно одному из воплощений, гибридные ингибиторы протеиназ.

В одном аспекте этого изобретения авторы сконцентрировались на группе ингибиторов протеиназ, известных как цистатины. Примерно для 25 из них известны последовательности аминокислот. Это позволило провести сравнительный анализ их первичных последовательностей для создания основы для идентификации структурных аналогий и выяснить, что между растительными и животными цистатинами существует довольно много различий, подтвердив необходимость раздельной классификации обеих групп. Так, сравнение растительного цистатина, Оризацистатина I - Ос-I, структура ДНК-последовательности которого приведена на фиг.3, и с животного цистатина, цистатина белка яйца, показало значительные различия и небольшое сходство их общего аминокислотного состава. Более того, животные и растительные цистатины существенно различны по связывающим свойствам. Например, константа диссоциации Ki для цистатина белка яйца составляет 510^-12 M, а растительного цистатина Ос-I из риса - 310^-8 М.

Данные сравнительного анализа первичной структуры ряда цистатинов представлены на фиг.1. Аминокислоты пронумерованы от 1 до 181. Из этих данных можно видеть, что имеется сохраняемый ингибирующий сайт в положениях от 100 до 104 выравненных аминокислотных последовательностей, представленный мотивом QVVAG (или QLVAG), и, далее, что имеется сохраняемый PW-мотив в положениях 160 и 161 выравненных аминокислотных последовательностей.

Это сохранение проявляется примерно в двух третях известных последовательностей, а на основании структурных исследований считается, что оно обеспечивает функционирование белка и, следовательно, ингибирование протеиназ. Однако, в некоторых цистатинах с низким значением Ki этот PW-мотив отсутствует, а потому его роль в функционировании цистатина неясна.

В других работах описаны полученные рекомбинацией новые цистатины. Например, был изменен ингибитор человеческой цистеиновой протеиназы - цистатин С, который участвует во внутриклеточном катаболизме белков и пептидов, в протеолитической конверсии прогормонов, во внеклеточном разложении коллагена и в проникновении злокачественных клеток в нормальные ткани. Разработчики модифицировали цистатин С заменой одной или более аминокислот в положениях 5-17, 55-59 и/или 68 на другие аминокислоты при сохранении структурной последовательности 120 аминокислот. Модификацию провели для создания животного цистатина С с постоянной активностью (WO 88/09384).

Было неожиданно обнаружено, что сайт-направленная модификация растительного цистатина, например, Оризацистатина I (Oc-I), может улучшить его связывающие свойства и таким образом повысить эффективность фермента по ингибированию протеиназ. Указанная модификация состоит в удалении аминокислоты (аспарагиновой кислоты) в положении 86 в структуре последовательности аминокислот растительного цистатина и повышает Ki в 13 раз - до 2,310^-9 М. Эта модификация представлена удалением аспарагиновой кислоты (символ D) в положении 163 в последовательности выравненных аминокислот на фиг.1.

Ясно, что это улучшение растения не обеспечивает доведения значения Ki растительного цистатина до Ki животного цистатина, в частности цистатина белка яйца. Однако, это усиливает интерес к более свободному подходу к трансгенной гибридизации. Это подразумевает введение в ген одного вида целого неповрежденного фрагмента из гена другого вида, к примеру, введение в растения человеческих генов, кодирующих человеческие белки, и наоборот. Пока наши представления о последствиях манипуляций с генами неполны, следует проявлять осторожность и предусмотрительность, учитывая возможность ошибки, и проявлять более рациональный подход к этим манипуляциям. Так, для борьбы с встречающимися в мире болезнями растений можно предложить применение белков растительного происхождения или альтернативно - подобных им белков с такими же или существенно подобными структурными, биохимическими и физиологическими функциями. Последняя категория включает, но без ограничения, гибридные молекулы.

Далее, многие животные цистатины с низкими Ki имеют в молекулах несколько дисульфидных мостиков, которые не найдены в изученных растительных цистатинах. Поэтому для правильного построения белковой молекулы благоразумно использовать, хотя бы частично, растительный цистатин в растительных системах. Так, предложенная сайт-направленная модификация растительных ингибиторов протеиназ, в частности, растительного цистатина, и предложенные гибридные ингибиторы протеиназ, включающие по меньшей мере часть растительного ингибитора протеиназы, обеспечивают получение новых улучшенных белков для использования предпочтительно, но не исключительно в растительных системах.

Поскольку при сравнительном анализе структур аминокислотных последовательностей, как представлено на фиг.1, установлено, что выше выравненной аминокислоты 104 в них очень мало общего, постольку наши наблюдения кажутся еще более поразительными. Предыдущие работы по сайт-направленной модификации цистатинов были сконцентрированы на хорошо сохраняемом упомянутом мотиве QVVAG, но его модификация всегда приводила к отрицательным результатам (12).

Как следует из изложенного, задачей этого изобретения является создание нового ингибитора протеиназы с улучшенной, по меньшей мере по способности связываться с протеиназой, эффективностью.

Далее, в задачу изобретения также входит создание нового ингибитора протеиназы с улучшенной в идеале эффективностью, но также содержащего гибридную молекулу, которая предпочтительно, но не исключительно содержит часть ингибитора протеиназы одного вида и часть ингибитора протеиназы другого вида.

В задачу изобретения входит создание продуктов, включающих весь новый белок или его часть, или же всю молекулу ДНК или ее часть, кодирующую этот белок, и применение этого нового белка и/или ДНК.

Согласно первому аспекту изобретения предложен ингибитор протеиназы, модифицированный или изготовленный таким образом, что он в сравнении с его природным аналогом является более эффективным при ингибировании протеиназы, с которой он взаимодействует.

В идеале этот ингибитор протеиназы сильнее связывается с этой протеиназой.

Соответственно предложен синтетический ингибитор протеиназы с Ki по меньшей мере в 10 раз меньше, чем у природного аналога. Например, изменение Ki от 310^-8 М до 310^-9 М считается ее улучшением.

В соответствии со вторым аспектом изобретения предложен ингибитор протеиназы с сайт-направленной делецией и/или заменой по меньшей мере одной аминокислоты с понижением KL белка минимум в 10 раз.

Предпочтительно белок является цистатином, а сайт-направленная делеция или замена относится к делеции аспарагиновой кислоты в положении 86 структуры аминокислотной последовательности Ос-I, либо альтернативно, делеции аспарагиновой кислоты в положении 163 в приведенной на фиг.1 структуре выравненных аминокислотных последовательностей выравненного ингибитора протеиназы такого как цистатин, либо альтернативно, к делеции ее функционального аналога в родственных ингибиторах протеиназы или цистатинах.

В другом случае сайт-направленная модификация состоит в замене указанной аспарагиновой кислоты в указанном положении на другую аминокислоту, свойства которой противоположны функциональным свойствам исключаемой аспарагиновой кислоты.

Соответственно третьему аспекту изобретения предложена вся структура ДНК-последовательности, представленная на фиг.2, или ее часть, которая кодирует белок согласно первому аспекту изобретения.

Все белки согласно изобретению или соответствующие им ДНК-последовательности применяют в борьбе с заболеваниями, симптомы которых хотя бы частично обусловлены или заключаются в продуцировании протеиназы. Поэтому новые белки и соответствующие им ДНК-последовательности могут быть прямо или косвенно применены для предотвращения, облегчения или ослабления таких болезненных состояний. Например, поражения организма-хозяина, вызванные патогенами, вредителями или паразитами и обусловленные разложением белков протеиназами, могут быть облегчены применением по меньшей мере одного белка согласно изобретению. Лечение может быть проведено либо непосредственным воздействием такого белка на заболевший организм, к примеру, в виде химического препарата типа пестицида, фунгицида и так далее, или лекарства, либо введением кодирующей такой белок генетической структурной последовательности в геном организма-хозяина, что обеспечивает экспрессию указанного белка по изобретению таким организмом и приобретение им способности бороться с заболеванием.

Так, как описано выше, можно применять любой или несколько белков согласно изобретению. Например, произвольная комбинация таких белков, включающая сайт-направленно модифицированые и/или гибридные белки, может быть применена для противодействия эффектам одной или нескольких протеиназ.

В идеале трансформированным организмом является растение.

Далее предложен способ повышения устойчивости к протеолитическому повреждению, при котором модифицируют или трансформируют организм-хозяин таким образом, что он экспрессирует белок согласно изобретению.

Предложен также конструкт, включающий всю или часть ДНК-последовательности согласно изобретению и могущий быть плазмидой или вектором.

Предусмотрено также применение белка или ДНК-последовательности согласно изобретению в качестве лекарственного средства для лечения протеолитических состояний, вызванных патогенами, паразитами или вредителями.

Далее, предложена композиция, включающая в себя белок согласно изобретению, эффективная против вызванных патогенами, паразитами или вредителями болезней.

Согласно еще одному аспекту изобретения, предложено трансгенное растение, трансформированное ДНК, кодирующей белок по изобретению, и в идеале ДНК, показанной на фиг. 2, сшитой с подходящей промоторной последовательностью так, что возможна экспрессия белка согласно изобретению. В идеале эта экспрессия происходит либо во всем растении, либо в местах воздействия на него патогенов, паразитов или вредителей. Например, в (13) предусмотрены общие методы идентификации промоторов, полученных из мест действия вредителей, паразитов или патогенов в растении. В ином или дополнительном случае экспрессия может быть задана так, чтобы она происходила в нужный момент времени.

Предпочтительно указанными трансформированными растениями являются зерновые, овощные, масличные, сахароносные культуры, фуражные или газонные травы, волокнистые, пряные, фруктовые и любые декоративные растения.

Далее, предложен трансформированный организм, растение или иной организм, который включает в себя кодирующую белок согласно изобретению ДНК, а в идеале - ДНК, показанную на фиг.2, так что указанный белок может быть получен с целью обеспечения его источников.

Предпочтительно, когда указанный конструкт снабжен подходящими промоторами, гарантирующими экспрессию белка согласно изобретению.

Предложен также способ борьбы с патогеном, паразитом и вредителем, при котором на указанного патогена, паразита или вредителя воздействуют белком согласно изобретению.

Далее, предложено применение белка согласно изобретению для борьбы с патогеном, паразитом или вредителем.

Предусмотрен также один или большее число праймеров, представленных в таблице 2, или праймеров сходной природы, имеющих в себе добавки, делеции или модификации, которые все же дают этим праймерам возможность функционировать так как описано выше.

Модифицированные ингибиторы протеиназ согласно изобретению могут также включать новые комбинации ингибиторов протеиназ, происходящих из того же самого или другого царства, типа, класса, отряда, семейства, рода или вида. Например, фрагмент(ы) ингибитора протеиназы животного происхождения могут быть объединены с фрагментом(ами) ингибитора протеиназы растительного происхождения, по меньшей мере один, несколько или все из которых могут быть или не быть модифицированы для повышения эффективности, как описано выше. Иначе говоря, возможно как получение новых растительных ингибиторов протеиназ комбинированием различных сортов и типов растительных ингибиторов протеиназ, так и получение новых ингибиторов протеиназ комбинированием разных сортов и типов животных ингибиторов протеиназ, по меньшей мере один, несколько или все из которых могут быть или не быть модифицированы для повышения эффективности, как описано выше.

Далее, согласно изобретению предложен белок и/или ДНК-последовательность, содержащие первую часть из первого ингибитора протеиназы и по меньшей мере одну другую часть из по меньшей мере одного другого ингибитора протеиназы.

В предпочтительном воплощении изобретения ДНК-последовательность предусмотрена в таком конструкте, что соответствующий белок может продуцироваться в ткани-мишени, например в клеточных тканях хозяина.

Согласно еще одному аспекту изобретения предложена ткань-мишень или клеточная ткань хозяина, трансформированная ДНК-последовательностью согласно еще одному аспекту изобретения.

Кроме того, согласно изобретению предложен белок, содержащий первую часть из первого цистатина и по меньшей мере одну другую часть из по меньшей мере одного другого цистатина.

В предпочтительном воплощении изобретения указанная первая часть указанной ДНК-последовательности или указанного белка содержит ДНК или белок растительного цистатина, соответственно, а указанная по меньшей мере одна другая часть содержит ДНК или белок животного цистатина, соответственно.

В идеале указанные ДНК или белок животного происхождения соответствуют ДНК или белку из активного сайта животного цистатина, и, предпочтительно, указанные ДНК или белок, происходящие из растительного цистатина, соответствуют ДНК или белку из структурного сайта или нескольких структурных сайтов указанных растительных цистатинов.

В одном из вариантов указанные ДНК-последовательность или белок содержат различные сорта или типы растительных цистатинов.

В другом варианте указанные ДНК-последовательность или белок содержат различные сорта или типы животного цистатина.

И, наконец, согласно изобретению предложены белок и/или ДНК-последовательность, относящиеся к новому ингибитору протеиназы, включающие вышеупомянутый гибридный ингибитор протеиназы и вышеупомянутую сайт-направленную модификацию.

Все ингибиторы протеиназ согласно изобретению применимы для противодействия эффектам протеиназ и для использования в способах такого противодействия.

Таким образом, в широком плане суть изобретения состоит в создании белков с повышенной функциональной активностью. Сайт-направленные модификации состоят в замене области последовательности аминокислот либо соответствующей областью белка (из любого организма), который проявляет нужные свойства, либо задуманной синтетической последовательностью. Аминокислотный остов исходного белка идеально сохраняется в полученной гибридной молекуле.

Сущность изобретения далее поясняется примерами со ссылками на приложенные графические материалы, где: На фиг. 1 представлен сравнительный анализ первичных структур последовательностей нескольких цистатинов; На фиг.2 представлена ДНК-последовательность нового белка согласно изобретению; На фиг. 3 представлена ДНК-последовательность рисового ингибитора цистеиновой протеиназы оризацистатина Ос-I; На фиг.4 представлено влияние экспрессии цистатина на рост самок G.pallida, паразитирующих на А. rhizogenes-трансформированных корнях томатов (размеры тела нематод даны как площади их контура в мкм², причем а - контроль, б и в - результат экспрессии соответственно Ос-I и Oc-IdeltaD86); На фиг. 5 представлено подавление роста грибов из спор на агаре через 6 суток после добавления 45 мкг PI(s) в центральные лунки; На фиг.6 представлено относительное (в %) ингибирование соответствующих протеиназ под действием различных гибридных ингибиторов протеиназ.

В таблице 1 приведены константы диссоциации Ki различных цистатинов как в нативном виде, так и после специфической модификации.

В таблице 2 приведены последовательности 23 олигонуклеотидных праймеров (Р1-23), применяемых в ПЦР-реакциях, и два линкера (L1-2), используемых при клонировании.

В таблице 2а приведены последовательности праймеров (Р24-39), используемых в ПЦР-реакциях при получении гибридных молекул.

В таблице 3 показана природа полученных гибридных молекул. Решетка отображает длину белка Ос-I, а темные зоны представляют области, замененные аминокислотной последовательностью CEWC.

Материалы и методы Штаммы и векторы Получение ДНК и операции с нею Плазмидную ДНК выделяли от культур Е-соli методом щелочного лизиса (2). Реакции рестрикции и лигирования провели по рекомендациям производителя. Фрагменты ДНК выделяли из агарозных гелей в ячейке для электроэлюирования (IВI) согласно рекомендациям изготовителя. Олигонуклеотиды синтезировали с помощью установки Applied Biosystems 381 А, дальнейшей очистке с помощью СОР хроматографического картриджа с обращенной фазой (Cruachem. Glasgow, UK) подвергли только олигонуклеотиды, использовавшиеся в протоколах "Altered Sites II" сайт-направленного мутагенеза. ДНК-секвенирование двунитевой плазмидной ДНК проводили с использованием Sequenase version 2,0 (Amersham) согласно инструкции производителя.

Клонирование цистатинов и ингибитора протеиназы C.elegans Oc-I был амплифицирован из геномной ДНК Oriza sativa L. japanica с помощью определенных по опубликованным данным о последовательностях (3) праймеров Р1 и Р2 (см. таблицу 2) и с добавлением сайтов ферментативной рестрикции для облегчения клонирования. Интрон удаляли методом ПЦР для SOEing генов (4а и 4б), при котором пары праймеров Р1/Р3 и Р2/Р4 использовали для амплификации двух экзонов. Эти продукты затем совместно подвергли операции SOEn путем амплификации с праймерами Р1 и Р4, а продукт клонировали в pBluescript, подвергнутый Sma I/Eco R1 рестрикции. Последовательность клонированной кодирующей области была подтверждена сравнением с известными данными для Oc-I (3). Амплификацию и удаление интронов гена цистеиновой протеиназы C. elegans, gcp-1, проводили аналогичным образом с использованием определенных по информации о последовательности (5) праймеров Р5-8 (таблица 2). Конечный ПЦР-продукт клонировали в pBluscript и проконтролировали анализом последовательности.

Информацию о ДНК-последовательности ингибитора цистеиновой протеиназы из вигны китайской, CCPI (6), использовали для создания олигонуклеотидных праймеров Р9 и Р10 (таблица 2). Эти праймеры вместе с клоном кДНК, несущим ген CCPI (любезно предоставленный проф. П.Шеври), использовали для ПЦР-амплификации продукта, который клонировали непосредственно в экспрессирующий вектор pQE30 (Quigen, California, USA) с использованием введенных в ПЦР-праймеры сайтов по Bam H1 и Hind III. Гены клонировали в экспрессирующие векторы типа IV pQE (Qiagen, California, USA) (Bam HI/Hind III), а белки экспрессировали в штамме F-coli M15[pREP4].

Мутагенез а) N-концевые делеции Для получения обширной делеции размером 72 п.н. с 5'-конца Ос-I, обозначенной pdelta240c-I, pQE30/Oc-I подвергали рестрикции с использованием Sma I и Hinc II, крупный фрагмент выделяли из агарозного геля и собирали. Для получения делеции 63 п.н. (обозначаемой pdelta21Оc-I) pQE30/Oc-I подвергали рестрикции, используя Bam HI и Hinc II, и выделяли из геля. Область 9 п.н., расположенную непосредственно на 5' относительно сайта Hinc II, вместе с последовательностью, кодирующей сайт узнавания энтерокиназы, вводили путем лигирования подвергнутых отжигу олигонуклеотидных линкеров L1 и L2 с выделенным фрагментом.

б) С-концевые делеции Осуществляли делеции экзонуклеаза III/нуклеаза фасоли золотистой (2) для получения делеции размером 24, 27, 30 и 33 п.н. на 3'-конце гена.

в) Точечные мутации Для создания конструктов, экспрессирующих перестройки единичных кодонов, использовали стратегию "Элиминация уникальных сайтов" ("Unique Site Elimination" (USE)) (Farmacia, Upsalla, Sweden) с применением праймеров P11-P20 (таблица 2), получая в результате вариантные формы Ос-I, имеющие следующие изменения аминокислотного состава: а) вставка лейцина между положениями 81 и 82; б) делеция Е13, D86, А74, М85, в) замена (с, , на): D86N, E89L, Q91L, Р83А, W84A. Систему "Altered Sites II" (Promega, Madison, USA), включающую субклонирование Oc-I в вектор pALT-Ex2, (Promega, Madison, USA) использовали для создания мутантов, в которых кодоны для Р83, W84, D86 были заменены на терминирующий амбер-кодон (TAG). Для этого использовали олигонуклеотиды Р-21-Р23 согласно таблице 2, где терминирующие амбер-кодоны выделены жирным шрифтом, а точечная мутация для удаления сайта Sac I (GAGCTC) обозначена обычным шрифтом (эти изменения не меняют аминокислотную последовательность). Отсутствие сайта Sac I используют как диагностический тест для мутанта. Метод "Interchange" (Promega, Madison, USA) применяли для получения аминокислотных замен на цистеин, глутаминовую кислоту, фенилаланин, глицин, гистидин, пролин, аргинин, лизин, глутамин, серин и тирозин по терминирующему амбер-кодону введением мутантных клонов в 12 определенных штаммов амбер-супрессоров.

Экспрессия Ос-I и дср-1 в E.coli Кодируемый вектором Ос-I, экспрессированный из pQE30 (система "QIAexpression"), для придания способности к образованию одноступенчатых хелатов с никелем содержал шесть N-концевых остатков гистидина. Белок Ос-I был выделен и очищен из 11 культур E.coli M15 [pREP4], содержащих экспрессирующую плазмиду на основе pQE30. 20 мл ночной культуры инокулировали в 1 литр LB-среды и выращивали при 37^oС до А₆₀₀, равного 0,7-0,9. Затем добавили изопропилтиогалактозид (IPTG) до конечной концентрации 2 мМ, и рост культуры продолжался в течение еще 2 часов. Клетки отделили центрифугированием при 10000 g в течение 10 мин, ресуспендировали в 12 мл буфера для обработки ультразвуком (50 мМ Na₂HPO₄, 300 мМ NaCl) и выдержали в течение ночи при -20^oС. Образец взболтали, отобрали аликвоты в три 15 мл пробирки и при охлаждении льдом подвергли короткопериодной ультразвуковой обработке (3х30 с). Клеточный дебрис осадили центрифугированием (10000 g), в каждую пробирку внесли примерно по 0,5-0,75 мл суспензии смолы Ni-NTA (Qiagen, Califonia, USA) и осторожно перемешали на льду в течение часа. Смолу отделили (1000 g в течение 1 минуты) и промыли 5 раз по 5 мл буфера (50 мМ Na₂HPO₄ с рН 6,0, 500 мМ NaCl, 40 мМ имидазола при 4^oС в течение получаса). Белок элюировали 1 мл буфера для элюции (50 мМ Na₂HPO₄, 300 мМ NaCl, 100 мМ EDTA) и затем смолу переосадили при 1000 g в течение 1 минуты, после чего элюирование провели еще дважды.

Протеиназу glp-1 из C.elegans экспрессировали идентичным образом.

Delta21Оc-I содержал последовательность узнавания энтерокиназы (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) между шестью N-концевыми гистидинами (6х His-хвост) и N-концевым остатком усеченного Ос-I белка. Энтерокиназу (Boeringer) использовали для отсечения 6х His-хвоста от Delta21Оc-I, который был очищен от 6х His-хвоста посредством хроматографии по сродству к никелю. "Centricon 10s'" (Amicon) использовали согласно инструкциям для отделения Ос-I от примесей энтерокиназы.

Определение Ki Для определения Ki цистатинов осуществляли биохимические анализы согласно процедуре Barrett (7), величины Ki рассчитывали, как описано Abe et al. (3).

ДДС-ПААГ и вестерн-блоттинг анализ Все очищенные белки проанализировали с помощью ДДС-ПААГ (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) (8). Вестерн-блоттинг проводили согласно протоколу для "mini protein II'" (Biorad, Hertfordshire, UK), применяя PVDF-мембрану (Millipore, Massachusetts, USA).

Получение антител Поликлональные антитела против Oc-I были наработаны в самцах крыс Wistar (возраст 6 недель). Три внутрибрюшинные инъекции 100 мкг Oc-I общим объемом 300 мл выполнили с интервалами четыре недели. При первой инъекции вводили эмульсию белка с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1 по объему, вторая и третья инъекции были аналогичными, но использовали неполный адъювант Фрейнда. Спустя 10 суток после последней инъекции собрали кровь, скоагулировали ее при 4^oС и центрифугировали при 5000 g в течение 10 минут. Полученную сыворотку собрали и хранили в 50%-ном (по объему) глицерине при -70^oС. Сыворотка дает оптимальные результаты в ELISA-тесте при разведении 1/10000 и распознает как нативный, так и денатурированный белок Oc-I.

ELISA-тесты Тесты ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) применили для определения уровня экспрессии цистатинов в трансгенных корнях, примерно двухмиллиметровые сегменты которых измельчили в жидком азоте, перенесли в Falcon-пробирку объемом 15 мл, добавили 1 мл 0,5хЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор) и встряхивали при 4^oС в течение 15 минут для растворения растворимой белковой фракции. Затем белок осадили ацетоном и осадок ресуспендировали в буфере для сенсибилизации поверхности (15 мМ Na₂HPO₄, 34 мМ МаНСО₃, рН 9,6). Концентрацию белка определяли по стандартной методике (14). В лунки титрационного микропланшета Maxisorb внесли по 100 мг белка на 48 часов при 4^oС. Планшеты блокировали антителами против Ос-I (разведение 1/10000). Активность определяли добавлением субстрата, поглощение образцов измеряли при 405 нм после развития окраски.

Различные количества Ос-I добавили к аликвотам по 100 мг общего белка, экстрагированного из нетрансформированных корней, и вместе с неизвестными образцами использовали в анализах ELISA для создания внутренних стандартов в пределах 0-2% Oc-I в общем растворимом белке.

Культивирование C.elegans Caenorhaboditis elegans культивировали на NGM-агаре с газоном клеток Е. coli OP50, как описано Wood (9). Популяции выдерживали в течение 5 суток до переноса агарового слоя в свежую среду. При необходимости цистатины добавляли в среду в конечной концентрации 2,5 мг/л непосредственно перед полимеризацией. Отдельные нематоды были перенесены с не содержащих добавок агаровых чашек на чашки, содержащие Oc-I, DeltaD86Оc-I или БСА (бычий сывороточный альбумин). При необходимости для каждого вида обработки проводили десять повторений.

Культивирование трансгенных корней томатов Гены, происходящие из Oc-I, клонировали в вектор рВ1М19 и затем электротрансформацией ввели в Agrobacterium rhizogenes штамм LBA9402 для использования в трансформации Licopersicon esculentum сорт Ailsa Craig no стандартной методике (15). Затем в ходе предварительного отбора корни культивировали на твердой среде с основной смесью солей 0,5х Murashige & Skoog с добавкой Gamborgs B5 витаминов, 3% (масс./о) сахарозы, 0,2% фитагеля (масс. /о), 100 мг/л канамицина. Для подтверждения присутствия Ос-I или его мутантных форм в предположительно трансформированных корнях использовали вестерн-блоттинг.

Контрольное заражение корней с помощью Globodera pallida Из цист G.pallida были получены J2, которые были тщательно простерилизованы перед использованием. Цисты вымачивали в проточной водопроводной воде в течение 2-3 дней, затем в течение ночи в 0,1%-ном (о/о) растворе малахитового зеленого при комнатной температуре, промывали проточной водопроводной водой в течение 8 часов и вымачивали в течение ночи при 4^oС в растворе антибиотиков (8 мг/мл сульфата стрептомицина, 6 мг/мл пенициллина G, 6,13 мг/мл полимицина В, 5 мг/мл тетрациклина и 1 мг/мл амфотерицина В). Далее цисты промывали стерилизованной фильтрованием водопроводной водой и помещали в стерилизованный фильтрованием диффузат корней картофеля для дальнейшего развития. По истечении ночи выводок J 12 был подсчитан и простерилизован последовательно в течение 10 минут следующими антибиотиками: 0,1%-ным сульфатом стрептомицина, 0,1%-ным пенициллином G, 0,1%-ным амфотерицином В и 0,1%-ным цетилтриметиламмонийбромидом (Cetavlon). Между стадиями обработки нематоды отделяли непродолжительным микроцентрифугированием. Их интенсивно промывали в стерилизованной фильтрованием водопроводной воде и немедленно использовали. Корни трансформированных линий культивировали в течение 4 недель, затем корни длиной 2 см перенесли в свежую среду. Спустя еще 3-4 суток аликвоты по 5 мл, содержащие по 35 J12, были пипетированы на каждый активно растущий корень приблизительно в 1 см от его верхушки. Для облегчения заражения каждый участок покрыли кусочком стерильной фильтровальной бумаги марки GFA площадью 1 см², который удалили через 24 часа.

Собранные инфицированные корни удалили из чашек Петри, промыли водой и погрузили на 2 минуты в 1%-ный (масс./о) раствор гипохлорита натрия и сразу же после этого на 1 минуту корни погрузили в кипящий 0,1%-ный водный кислый фуксин, промыли водой и выдержали в течение ночи в подкисленном глицерине при 60^oС для облегчения визуализации нематод. Через некоторое время их можно было обнаружить визуально без окрашивания и вырезать из корней. Нематод определяли под микроскопом (DBRM, Leica) при увеличении 50-200х, площадь поперечных срезов измеряли с использованием присоединенного к микроскопу анализатора изображения (Quantimet 5000C, Leica).

Демонстрация антигрибной активности Авторы показали, что Pls (ингибиторы протеиназ), выделенные после экспрессии в pQE30 (смотри выше), проявляют антигрибную активность. 45 мкг выделенного РI в концентрации 1 мкг/мкл ввели в центральную лунку на агаровых пластинках, содержащих споры B.cinerea (2,210⁴/пластинку). Споры не прорастали и грибам не удавалось вырасти в тех случаях, когда из центральной лунки в агар диффундировали CPTI или Ос-I. Сильный эффект наблюдали в течение многих недель, при этом он усиливался при совместном применении ингибиторов сериновой и цистеиновой протеиназ. Особенно важно, что Oc-IdeltaD86 был более эффективен, чем нативная форма Ос-I (фиг.3). Также установлено, что Pls эффективны в отношении других микроорганизмов, включая Aspergillus fumigatus (грибной патоген млекопитающих; фиг. 5) и Erwinia carotovora (бактериальный патоген растений). Этим продемонстрированы два главных положения, на которых основана эта заявка: 1) этот подход имеет высокую перспективность в борьбе против самых разнообразных грибов, 2) белковая инженерия может увеличить антигрибную эффективность Pls.

Получение гибридных генов Цистатин белка куриного яйца (CEWC) является более мощным ингибитором, чем Ос-I или Ос-ID86. Авторы заменили фрагменты Ос-I соответствующими последовательностями CWEC с целью получить ген по существу растительного происхождения, но со значительно более сильными ингибирующими свойствами.

Материалы и методы Замена N-конца ос-I соответствующей областью cewc Были синтезированы два олигонуклеотидных перекрывающихся своими 3'-концами праймера (Р24 и Р25). Их подвергли отжигу и произвели достраивание с помощью ДНК-полимеразы I (фрагмент Кленова) для получения двухцепочечной полноразмерной последовательности, кодирующей N-конец зрелой