Новые способы характеризации соединений, стимулирующих экспрессию stf-1 в клетках панкреатических островков

Новые способы характеризации соединений, стимулирующих экспрессию stf-1 в клетках панкреатических островков

Реферат

 

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии. Сущность изобретения состоит в способе тестирования соединений, которые могут индуцировать транскрипцию JTF-I. Для этого клетки панкреатических островков, экспрессирующие гибридный ген STF- 1/lacZ, выделяют, а затем оценивают влияние различных соединений на экспрессию ТГ-1 путем добавления к ТГ-1/lacZ - экспрессирующим клеткам представляющего интерес соединения. Затем с помощью колометрического анализа проводят количественную оценку lаcZ-активности в контрольных и обработанных клетках. С использованием этого способа может быть скринировано большое число соединений и STР-1-индуцирующие соединения могут быть легко идентифицированы. Другой аспект изобретения - способ использования промотора STF-I для мечения инсулинпродуцирующих клеток панкреатических островков in vivo. В этом способе в качестве индикатора используют белок с флуоресценцией в зеленой области спектра. Введение свиньям трансгена "STF-I - белок с зеленой флуоресценцией" дает возможность быстро и эффективно выделять инсулинпродуцирующие клетки из поджелудочной железы. Технический результат - расширение арсенала средств для регулирования нейроэндокринной системы. 2 с. и 7 з.п. ф-лы, 9 ил.

Область техники, к которой относится изобретение В общих чертах настоящее изобретение относится к области биохимической эндокринологии, молекулярной биологии и химии белков. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новым способам характеризации соединений, которые стимулируют экспрессию STF-1 в клетках панкреатических островков.

Описание предшествующего уровня техники Глюкозный гомеостаз требует согласованного действия многочисленных нейроэндокринных систем. Панкреатические островки рассматриваются как первичный "глюкозный сенсор" у млекопитающих. Панкреатические островки содержат четыре популяции клеток, которые характеризуются, главным образом, как клетки, продуцирующие инсулин, глюкагон, соматостатин или панкреатический полипептид. Из этих клеток преобладающими являются инсулинпродуцирующие -клетки. Секреция и продуцирование инсулина стимулируется возрастанием глюкозы в сыворотке, то есть событием, необходимым для последующего поглощения глюкозы в некоторых тканях. Поэтому дисфункция или деструкция -клеток приводит к повышенным уровням глюкозы в сыворотке и, в конечном счете, к развитию сахарного диабета.

Анализ на генетическую связь указывает, что наследственные факторы сильно влияют на восприимчивость организма к развитию диабетического статуса. Например, по крайней мере, 18 генетических локусов до некоторой степени связаны с инсулин-зависимым сахарным диабетом (IDDM). Один из локусов восприимчивости к этому заболеванию, обозначаемый (IDDM2), включает ген инсулина человека и ассоциируется с модифицированной транскрипционной регуляцией функции инсулинового промотора. Следовательно, нарушение процессов, регулирующих экспрессию гена инсулина, может быть частично ответственно за развитие диабета. Согласно этой гипотезе, нарушение функции -клеток является наиболее общим признаком диабета.

Инсулин-независимый сахарный диабет (NIDDM) развивается в результате влияния как внешних факторов, так и комплексных генетических факторов. Интересно отметить, что аллельные варианты в инсулиновом локусе сами были ассоциированы с этим заболеванием. Очевидно, что эти варианты содержат нормальный ген инсулина, но обладают измененными свойствами по отношению к транскрипционной регуляции.

По оценкам специалистов, вплоть до 20 миллионов американцев могут страдать инсулин-независимым сахарным диабетом (Типа II). Для развития этого заболевания, очевидно, необходимо как влияние факторов окружающей среды, так и присутствие определенных, пока еще, по большей части, не идентифицированных генов восприимчивости к диабету, которые могут вносить свой вклад в периферическую инсулинорезистентность диабета Типа II, где ткани теряют способность к утилизации глюкозы в ответ на инсулиновый сигнал. Альтернативно, генетические факторы могут быть ответственны за снижение восприимчивости к глюкозе инсулинпродуцирующих панкреатических -клеток у этих индивидуумов. Конечным результатом таких физиологических состояний является выраженная гипергликемия, которая представляет собой главный признак диабета.

Транскрипционный контроль гена инсулина осуществляется посредством короткой области фланкирующей ДНК, которая взаимодействует с клетко-специфическими и глюкозо-специфическими сигнальными молекулами. Конкретная природа этой регуляторной организации остается не совсем ясной, хотя в общих чертах известно, что решающими компонентами транскрипционного механизма, управляющего -клетко-специфической экспрессией инсулина являются основной элемент "спираль-петля-спираль" (bHLH) и гомеодомен-содержащие факторы. Островково-специфический основной комплекс "спираль-петля-спираль" взаимодействует с проксимальным Е-боксом, который иногда обозначают Nir, IEB1 или ICE; причем этот элемент дважды повторяется в гене крысиного инсулина, но в гене крысиного инсулина II и в гене инсулина человека он встречается лишь один раз.

Экспресс-анализ инсулинпродуцирующих клеточных линий позволяет предположить, что Е-бокс-связывающие факторы обладают синергическим действием вместе с белками, которые связываются с соседней АТ-богатой последовательностью, называемой FLAT и несущей признаки гомеодомен-узнающей последовательности. Было показано, что некоторые охарактеризованные гомеодоменные белки связываются с FLAT-элементом, включая белки Is1-1, lmx-1, cdx-3 и STF-1. Кроме того, последний из них соответствует главной связывающей активности в эволюционно консервативной АТ-богатой последовательности, называемой Р-элементом. Isl-1 слабо связывается с FLAT-элементом и, очевидно, отсутствует в FLAT-связывающих комплексах, обнаруженных с помощью экстрактов из инсулинпродуцирующих клеток. Современные данные подтверждают, что Isl-1 играет более важную роль в развитии нервной ткани. Гомеодоменные факторы lmx-1 и cdx-3 обладают интересными трансактивирующими свойствами по отношению к функции инсулинового промотора в гетерологичных клетках, однако их распределение в клетках и FLAT-связывающая способность внутри -клеток остаются неясными. Кроме того, имеется немного данных, касающихся непосредственно функции этих факторов в -клеточных линиях.

Из группы факторов, обладающих способностью связываться с инсулиновым промотором, STF-1, вероятно, является наиболее "обещающим" кандидатом на истинного регулятора функции инсулинового промотора. У мышей STF-1 был впервые обнаружен, главным образом, у 8,5-дневных эмбрионов в ядре примордиальных клеток, которые образуются в поджелудочной железе незадолго до самой ранней детектируемой стадии экспрессии инсулина в этой области. В последующем процессе развития эндокринной поджелудочной железы STF-1 и инсулин экспрессируются, главным образом, совместно. Кроме того, в экстрактах, полученных от инсулинпродуцирующих клеточных линий, STF-1 является, очевидно, компонентом эндогенной ДНК-связывающей активности в обоих FLAT- и Р-элементах в инсулиновом промоторе. STF-1 обладает также сильным синергическим действием в сочетании с Е-бокс-связывающим фактором Рап-1, как, впрочем, и ожидалось от FLAT-связывающего фактора. Однако анализ на связывание ДНК показывает, что другие неизвестные факторы из -клеточного экстракта также могут вносить значительный вклад в обнаруживаемую FLAT-связывающую активность. Однако остается неясным, требует ли FLAT-опосредованная инсулинстимулирующая активность присутствия всего набора указанных обнаруженных факторов или только одной их субпопуляции.

Хотя STF-1 первоначально экспрессируется как в экзокринных, так и эндокринных клетках развивающейся поджелудочной железы, однако продуцирование STF-1 постепенно ограничивается инсулин- и соматостатинпродуцирующими островковыми клетками. Очевидно, что в этих клетках действие STF-1 играет важную роль для поддержания высокого уровня экспрессии как генов соматостатина, так и генов инсулина.

STF-1 распознает два хорошо определенных островково-специфических элемента на инсулиновом промоторе, обозначаемых FLAT и Р. При связывании с этими сайтами, STF-1 стимулирует транскрипцию инсулина, вместе с Е47, белком, содержащим структуру "спираль-петля-спираль" и распознающим два Е-бокс-элемента, обозначаемых Far и Nir. Аналогично, STF-1 регулирует экспрессию соматостатина в островковых клетках посредством двух островково-специфических элементов, обозначаемых TSEI и TSEII.

Было обнаружено, что гомеодоменные белки, такие как STF-1, играют важную роль в формировании клеток или сегментной идентичности. В противоположность их специфическим и различным эффектам in vivo большинство гомеодоменных белков обнаруживают низкую и перекрывающуюся специфичность к ДНК-связыванию in vitro. Однако недавние исследования показали, что некоторые белковые кофакторы действуют как детерминанты ДНК-связывающей специфичности гомеодоменов in vivo. Так, например, было показано, что в дрозофиле экстрадентикль (exd) модулирует активность гомеозисных белков, не изменяя характера их экспрессии. Вернее, экстрадентикль стимулирует, по-видимому, селекцию гена-мишени путем усиления ДНК-связывающей специфичности гомеодоменных белков. Действительно, экстрадентикль является в высокой степени консервативным у позвоночных и его последовательность имеет значительное сходство с последовательностью (71%) протоонкогена Pbxl человека.

В большинстве случаев, было установлено коммитирование клеток в специфические линии дифференцировки в процессе их развития благодаря относительной экспрессии различных гомеодоменных (НОХ) белков-селекторов, которые опосредуют активацию различных генетических программ. Однако механизмы, с помощью которых отдельные НОХ-гены сами направляются для экспрессии в клетках различных типов, остаются, в основном, невыясненными.

Поджелудочная железа позвоночных состоит из эндокринных и экзокринных компонентов, которые образуются из общих клеток-предшественников в дуоденальном зародыше (1). В эндокринном компоненте поджелудочной железы плюрипотентная клетка-предшественник, которая первоначально экспрессирует множество островковых гормонов, подвергается прогрессивной рестрикции с образованием четырех субпопуляций клеток, составляющих островки Лангерганса взрослых: клетки, продуцирующие инсулин, соматостатин, глюгакон и панкреатический полипептид (2, 3). Механизм, благодаря которому активируется этот путь развития, пока неясен, однако данные, полученные в последнее время, дают основание предположить, что гомеобокс-фактор STF-1 (IPF-1/IDX-1) является важным и решающим фактором в этом процессе. Действительно, необходимость присутствия STF-1 в процессе развития подтверждается исследованиями гомологичной рекомбинации, в которых целевое разрушение гена STF-1/IPF-1 приводило к врожденному отсутствию поджелудочной железы (4). Экспрессия STF-1 (обозначаемого также Pdxl) была сначала детектирована у 8,5-дневного эмбриона, в зародышевых клетках поджелудочной железы и в плюрипотентных клетках-предшественниках. При кратковременной экспрессии в эндокринных и экзокринных компонентах развивающейся поджелудочной железы продуцирование STF-1 постепенно ограничивается образованием инсулин- и соматостатинпродуцирующими островковыми клетками (5, 6). В этих клетках STF-1, очевидно, регулирует гены инсулина и соматостатина путем связывания с функциональными элементами в каждом промоторе (5, 7-16).

В настоящее время отсутствуют какие-либо эффективные способы регуляции экспрессии гомеодоменного белка STF-1 в панкреатических клетках. Настоящее изобретение позволяет решить эту давно назревшую проблему.

Краткое описание изобретения Хотя STF-1 является важным регулятором панкреатических генов, механизм, с помощью которого происходит самонаправленная экспрессия STF-1 в панкреатических клетках, остается невыясненным. Настоящее изобретение продемонстрировало, что 6, 5-т.п.о.-фрагмент промотора STF-1 является достаточным для регуляции островково-специфической экспрессии гена-репортера -галактозидазы у трансгенных мышей, а также в культивированных дуоденальных клетках. В этом 6,5-т.п.о-фрагменте особенно важную роль в промоторной активности STF-1 играет Е-бокс-элемент, расположенный у-104 по отношению к сайту инициации трансляции. Этот элемент распознается расположенным выше активатором, который играет главную роль в экспрессии STF-1 в островковых клетках. Действительно, этот промотор STF-1 является в 20-100 раз более активным в отношении усиления направленной экспрессии STF-1 в островковых клетках. Делекция проксимальной последовательности Е-бокса у-104 полностью прекращает экспрессию STF-1 в клетках HIT. Кроме того, антисыворотка против USF (вышерасположенного фактора) ингибирует образование С1, С2 и С3, что свидетельствует о том, что эти белки образованы белком USF.

Кроме того, энхансерный элемент STF-1 был обнаружен в области 530 п.о., которая простирается на 600 п. о. выше от сайта инициации транскрипции. Промоторные конструкции, содержащие этот 530 п.о.-фрагмент, полностью подавлялись путем обработки дексаметазоном, однако при минимальной конструкции промотора STF-1, содержащей сайт распознавания широко распространенного USF-1, такого не наблюдалось. 530 п.о.-область обнаруживала в 5-10 раз большую активность в клетках HIT-T15 по сравнению с клетками COS-7, что свидетельствовало о том, что этот фрагмент обладает островково-специфичной активностью. Поэтому для скрининга соединений, которые усиливают экспрессию STF-1 в клетках панкреатических островков, в настоящем изобретении был использован гибридный ген STF-1-lacZ. Соединения, которые стимулируют продуцирование STF-1, усиливают В-клеточную функцию панкреатических островков, то есть продуцирование инсулина. Так, например, соединения, идентифицированные методом, описанным в настоящем изобретении, были, в частности, использованы для лечения пациентов с сахарным диабетом Типа II, у которых непереносимость к глюкозе была обусловлена ограничением функции островковых клеток.

В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к способу тестирования соединений, индуцирующих транскрипцию STF-1.

Линию клеток панкреатических островков, которая экспрессирует гибридный ген STF-1/lacZ, выделяли путем совместного осаждения фосфатом кальция. Для оценки влияния различных соединений на экспрессию STF-1 соединение, представляющее интерес, добавляли к клеткам, экспрессирующим STF-1/lacZ. Затем контрольные и обработанные клетки подвергали количественной оценке на lacZ-активность путем колометрического анализа. С использованием этого метода может быть скринировано большое число соединений, и STF-1-индуцирующие соединения могут быть легко индентифицированы.

В одном из вариантов своего осуществления настоящее изобретение относится к способу использования промотора STF-1 для in vivo-мечения инсулинпродуцирующих клеток панкреатических островков. Для этого в качестве индикатора служил белок с флуоресценцией в зеленом диапазоне (GFP). Экспрессия белка с зеленой флуоресценцией может быть детектирована без разрушения структуры, как описано Ogawa et al. , Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92: 11899-11903. Для облегчения выделения -клеток из поджелудочной железы животного промотор STF-1 присоединяли к гену, кодирующему GFP. Введение трансгена "STF-1 - белок с зеленой флуоресценцией" свиньям позволяет быстро и эффективно выделить инсулинпродуцирующие клетки из поджелудочной железы. Короче говоря, у свиней вырезают поджелудочную железу и обрабатывают коллагеназой для диспергирования клеток. Инсулинпродуцирующие островковые клетки эффективно выделяются методом сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS), основанным на экспрессии трансгена "STF-1 - белок с зеленой флуоресценцией". Очищенная популяция -клеток может быть использована для клеточной терапии пациентов, страдающих диабетом.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу определения способности испытуемых соединений стимулировать клетки панкреатических островков для индуцирования транскрипции STF-1, где указанный способ включает следующие стадии: получение вектора, содержащего энхансер STF-1, имеющий последовательность, выбранную из SEQ ID No: 1 или SEQ ID No: 2 или их фрагментов, промотор и ген-репортер, находящийся под транскрипционным контролем указанного энхансера STF-1 и указанного промотора, где указанный ген-репортер способен сообщать детектируемый сигнал указанной клетке-хозяину; перенос указанного вектора в указанную клетку-хозяина; культивирование указанной клетки-хозяина в присутствии тестируемого соединения с целью определения способности указанного тестируемого соединения стимулировать продуцирование указанного сигнала в указанной клетке-хозяине; и анализ этого сигнала для определения способности указанного тестируемого соединений стимулировать в указанной клетке-хозяине продуцирование указанного детектируемого сигнала, где присутствие указанного сигнала свидетельствует о том, что указанное тестируемое соединение стимулирует индуцирование транскрипции STF-1 в клетках панкреатических островков, и где отсутствие указанного сигнала свидетельсвует о том, что указанное тестируемое соединение не стимулирует индуцирование транскрипции STF-1 в клетках панкреатических островков. В предпочтительном варианте осуществления этой цели настоящего изобретения в качестве гена-репортера используют фермент, в более предпочтительном варианте, этот фермент выбирают из люциферазы и -галактозидазы.

В другом варианте настоящего изобретения указанную стадию переноса осуществляют путем введения трансгена животным методом трансфекции или микроинъекции.

Другой целью настоящего изобретения является разработка способа мечения инсулинпродуцирующих клеток панкреатических островков in vivo, включающего следующие стадии: получение вектора, содержащего промотор STF-1, и ген-репортер, находящийся под транскрипционным контролем указанного промотора, где указанный ген-репортер способен сообщать детектируемый сигнал указанной клетке-хозяину; введение указанного вектора в качестве трансгена в эмбрион животного; выращивание указанного эмбриона в животном, имеющем клетки панкреатических островков; и анализ на детектируемый сигнал с целью определения способности каких-либо клеток панкреатических островков указанного животного экспрессировать указанный ген-репортер, где присутствие указанного сигнала свидетельствует о присутствии инсулинпродуцирующих клеток панкреатических островков и где отсутствие указанного сигнала свидетельствует об отсутствии инсулинпродуцирующих клеток панкреатических островков.

В предпочтительном варианте осуществления этой цели изобретения ген-репортер продуцирует флуоресцентный белок, а указанный способ, кроме того, включает стадию сортировки инсулинпродуцирующих клеток панкреатических островков от инсулиннепродуцирующих клеток панкреатических островков методом клеточного сортинга с активацией флуоресценции (FACS).

Другие и дополнительные аспекты, отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения будут понятны из нижеследующего описания предпочтительных вариантов осуществления изобретения.

Краткое описание чертежей Для того, чтобы указанные выше отличительные признаки, преимущества и цели настоящего изобретения могли быть достигнуты и были более понятны, ниже приводится подробное описание настоящего изобретения, которое было кратко изложено выше, со ссылками на конкретные варианты его осуществления, проиллюстрированные прилагаемыми чертежами. Эти чертежи являются частью описания изобретения. Однако следует отметить, что прилагаемые чертежи иллюстрируют предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, а поэтому не должны рассматриваться как некое ограничение его объема.

Фиг. 1 иллюстрирует локализацию гена STF-1 в хромосоме. На фиг.1А показано, что ген STF-1 кодируется гомеобокс-содержащим геном "орфаном", расположенным в дистальной области хромосомы 5 (мыши); на схематической диаграмме показано положение STF-1 (обозначенного Pdxl) по отношению к другим маркерам на мышиной хромосоме 5. Справа указана шкала в сантиморганах (сМ). На фиг. 1В представлена таблица, иллюстрирующая частоту рекомбинации между STF-1 и различными маркерами на хромосоме 5. В левой колонке указаны маркеры, используемые для обозначения распределения на хромосоме. На этом чертеже STF-1 обозначен Pdx1.

Фиг. 2 иллюстрирует промотор STF-1, который не имеет ТАТА-фрагмента и в котором используются множественные сайты инициации транскрипции. На фиг.2 схематически представлен геномный 15 п.о.-клон STF-1 с указанной наверху шкалой в тысячах пар оснований (т.п.о). На чертеже показаны 6,5 т.п.о 5'-конца, 4 т.п.о.-интрон и 3 т.п.о 3'-конца. IVS относится к 4 т.п.о-интрону, который прерывает экзоны I (заштрихован и обозначен I) и II (заштрихован и обозначен II). На фиг.2В показана нуклеотидная последовательность 5'-фланкирующей области гена STF-1. Сайты инициации транскрипции, картированные путем защиты от РНКазы (заштрихованые стрелкой) и удлинения праймера (незаштрихованные стрелки), обозначены S1 (главный сайт инициации, подчеркнут), S2 и S3. Потенциальные сайты связывания вышерасположенного фактора для bHLH/bHLH-ZIP-белков (Е-бокс)/ CTF/NF-1 (СААТ) и с/ЕВР подчеркнуты и помечены в месте их локализации по отношению к главному старт-сайту. На фиг.3 проиллюстрирован анализ РНК Тu6 на защиту от РНКазы (Tu6, дорожка 2) или контрольной дрожжевой тРНК (дрожжи, дорожка 3) с использованием антисмыслового по отношению к STF-1 РНК-зонда. Негидролизованный зонд показан слева (дорожка 1). На фиг.2D показаны результаты анализа на удлинение праймеров, проведенные на дрожжах (дорожка 4), мРНК Тu6 (дорожка 5) или мРНК RIN (дорожка 6) с использованием антисмыслового по отношению к STF-1 праймера. Ступенчатое секвенирование показано справа (GATC, дорожки 7-10). Отмечено соответствие между защищенными от РНКазы продуктами и продуктами удлинения праймера и показаны первые три старт-сайта, обозначенные S1, S2 и S3 (см. также внизу на фиг.2В).

Фиг. 3 иллюстрирует 6,5 т.п.о-фрагмент промотора STF-1, регулирующего направленную экспрессию гена-репортера -галактозидазы в островковых клетках трансгенных мышей. Характерные криосрезы зрелой поджелудочной железы от трансгенных (вверху) и контрольных (внизу) детенышей были оценены на lacZ-активность с использованием Xgal в качестве хромогенного субстрата. Стрелки указывают на клетки панкреатических островков.

Фиг.4 демонстрирует, что дистальные и проксимальные элементы в промоторе STF-1 направляют экспрессию STF-1 в клетки панкреатических островков. На фиг. 4А показана активность плазмиды, содержащей -6500-область "STF-1-люциферазный репортер", после ее трансфекции в клетки панкреатических островков (TC3, HIT) по сравнению с неостровковой клеточной линией (РС12, COS, HeLa). Репрезентативный анализ иллюстрирует активность промотора STF-1 в клетках HIT (100%) по отношению к другим клеточным линиям после ее нормализации ко-трансфецированной контрольной плазмидой RVS-CAT. Этот анализ повторяли, по крайней мере, три раза. На фиг.4В проиллюстрирован репрезентативный анализ промоторной конструкции "STF-1 - люцифераза" (STF - luc) после трансфекции в клетки HIT. Эти конструкции обозначали в соответствии с границей 5'-промотора по отношению к главному сайту инициации транскрипции (S1, см. фиг.2А и 2В).

На схематичной диаграмме показано положение потенциальных сайтов связывания для нуклеарных факторов, где главный сайт инициации транскрипции обозначен заштрихованной стрелкой. Звездочкой отмечена неохарактеризованная связывающая активность в дистальных 3 т.п.о. Для каждой конструкции после нормализации за эффективность трансфекции с использованием RVS-CAT в качестве внутреннего контроля вычисляли активность по отношению к -6500 STF Luc. Анализ повторяли, по крайней мере, в течение четырех раз.

Фиг. 5 демонстрирует, что проксимальный элемент Е-бокс в промоторе STF-1 связывается с вышерасположенным фактором USF. На фиг.5 показаны результаты анализа на защиту от ДНКазы с использованием ³²Р-меченного фрагмента промотора STF-1, простирающегося от -182 до -37 (145 пар оснований). Авторадиограмма показывает характер гидролиза в отсутствие экстракта (дорожки 1 и 4), в присутствии нуклеарных экстрактов от клеток HIT или HeLa (дорожки 2 и 3 соответственно) или в присутствии рекомбинантного USF-1 (дорожка 5).

Фиг.5 иллюстрирует анализ на сдвиг электрофоретической подвижности нуклеарного экстракта HIT, инкубированного с ³²P-меченным двухцепочечным олигонуклеотидом, содержащим Е-бокс STF-1 (-118/-95)(дорожка 1). Немеченные конкурентные олигонуклеотиды (в 50-кратном молярном избытке) добавляли для проведения реакции связывания, как показано на чертеже (дорожки 2-5): Е-бокс STF-1 представляет собой олигонуклеотид Е-бокса STF-1 дикого типа; STF-E MUT обозначает мутантный олигонуклеотид STF-E, содержащий замены в мотиве Е-бокса на участке -106 (С/А) и -103 (T/G). Ins-1 (P) представляет собой Р-элемент инсулинового промотора I; a Ga14 обозначает сайт распознавания Ga14.

Фиг. 5С, слева, иллюстрирует результаты анализа на сдвиг в геле экстрактов нуклеарных клеток HIT с использованием STF-Е-бокса в качестве зонда (дорожка 1). Добавление антитела против USF или TFE-3 к реакционной смеси проводили, как показано на чертеже (дорожки 2 и 3). Комплексы C1, C2, С3 помечены. На фиг.5С, справа, показаны результаты анализа на сдвиг в геле для HIT-экстрактов (дорожки 1-3) с использованием STF-E в качестве зонда. Добавление специфической антисыворотки против USF-1 и USF-2 к реакционной смеси проводили, как показано на чертеже.

Фиг. 6 иллюстрирует, что связывание USF с -104 Е-боксом имеет важное значение для активности промотора STF-1. На фиг.6А показано действие мутаций Е-бокса на USF-связывющую активность. Показаны результаты анализа на сдвиг в геле для нуклеарных HIT-экстрактов, проведенного с использованием в качестве зондов Е-бокса STF-1 дикого типа (E-WT) или мутантного Е-бокса STF-1 (E-MUT), где последовательности зонда дикого типа и мутантного зонда от -106 до -102 показаны внизу. С1-3 означает комплексы C1, C2 и С3. На фиг.6В показано действие мутаций Е-бокса на STF-1-промоторную активность в клетках HIT. Проиллюстрирован репрезентативный анализ клеток HIT, трансфецированных Е-боксом STF-1 дикого типа, мутантным Е-боксом STF-1 или делетированными (-118/-95) мотивами Е-бокса STF-1 в окружении ("контексте"), 6500 п.о. или 190 п.о. промотора STF-1. Показана активность репортера по отношению к конструкции -6500 STF-1 Luc дикого типа (100%) после ее нормализации за эффективность трансфекции ко-трансфецированной контрольной плазмидой RVS-САТ. Анализы повторяли, по крайней мере, три раза.

Фиг.7 демонстрирует, что гликокортикоиды подавляют экспрессию STF-1 посредством островково-специфического энхансера в 5'-фланкирующей области гена STF-1.

Фиг. 7А иллюстрирует активность конструкции промотора STF-1 после обработки клеток HIT-T15 дексаметазоном (10^-7М) или контрольным этаноловым наполнителем в течение 18-24 часов. Активность -6,2/-5,67-STF-1 Luc-репортера составляла 100%. Все конструкции оценивали в "контексте" векторной "STF-1- люцифераза" (STF-1 Luc)- последовательности, которая содержит 120 оснований 5'-фланкирующей области. Последовательности STF-1, встроенные в ген-репортер STF-1 Luc, обозначены номерами нуклеотидов. Так, например, -6,2/-5,67-STF-1 Luc содержит последовательности от -6500 до -6200, присоединенные к проксимальным 120 основаниям 5'-фланкирующей области STF-1. Дистальные области, которые содержат активирующие элементы, показаны овалами и квадратами, а минимальный промотор STF-1 показан прямоугольниками. Стандартные ошибки обозначены блоками. Анализы повторяли, по крайней мере, три раза. Активность STF-1-репортера была нормализована за эффективность трансфекции с использованием ко-трансфецированной контрольной плазмиды CMV--gal. Фиг. 7В (вверху) иллюстрирует результаты анализа кратковременной трансфекции конструкции STF-1-репортер в клетках HIT T15. Активность -6500 STF Luc-конструкции, содержащей 6500 оснований 5'-фланкирующей последовательности, составляла 100%. Каждый анализ повторяли в дубликатах, по крайней мере, четыре раза. Стандартные ошибки были такими, как показано на чертеже. (Внизу) Показана активность плазмиды, содержащей конструкцию "STF-1 - люцифераза-репортер", после кратковременной трансфекции в клетки COS-7. Промоторная активность была нормализована за контрольную активность CMV--gal, что позволило провести прямое сравнение с активностью конструкции "STF - репортер" в клетках HIT.

Фиг. 7С иллюстрирует нуклеотидную последовательность минимального островково-специфического энхансера в гене STF-1, который простирается от -6,2 до -5,6 т.п.о. HNF-3 и Е-бокс-связывающие мотивы указаны и подчеркнуты.

Фиг. 8 демонстрирует, что островково-специфичный энхансер в гене STF-1 содержит связывающие сайты для HNF-3 и ВЕТА-2.

Фиг. 8А иллюстрирует результаты анализа на защиту от ДНКазы неочищенных нуклеарных экстрактов, полученных от островковых клеток HIT T15, HeLa или COS-7 с использованием ³²Р-меченного STF-1-зонда, простирающегося от -5870 до -6100 промотора STF-1 крысы. NONE: контрольная реакция без добавления экстракта; HNF-3: реакция с использованием рекомбинантного протеина.

Фиг. 8В иллюстрирует результаты анализа на сдвиг подвижности в геле для неочищенных экстрактов от HeLa, HepG2, глюкагон-продуцирующей клеточной линии TC, или инсулинпродуцирующих клеточных линий HIT и RIN, как показано на каждой дорожке. Анализ проводили с использованием ³²Р-меченного олигонуклеотидного STF-1-зонда, содержащего Н-элемент. Ниже показаны нуклеотидная последовательность Н-элемента дикого типа (WT) и мутантная последовательность (МТ) Н-элемента. Добавление 100-кратного избытка немеченного дикого типа ДНК-конкурента или мутантного ДНК-конкурента проводили, как показано на дорожках.

Фиг. 8С иллюстрирует результаты анализа на сдвиг подвижности в геле неочищенного нуклеарного экстракта от инсуломы HIT (HIT NE) и первичных культивированных островковых клеток взрослой крысы (ISLET NE) с использованием ³²Р-меченного олигонуклеотидного STF-зонда, содержащего Н-элемент и простирающегося от -5907 до -5927. Добавление антисыворотки против HNF-3 , , или в реакционную смесь показано на каждой дорожке - антисыворотку не добавляли. I и II: комплексы белок - ДНК и антитело со сверхсдвигом соответственно.

Фиг. 8D иллюстрирует результаты анализа на сдвиг подвижности в геле неочищенного нуклеарного экстракта от клеток HIT T15 с использованием ³²Р-меченного зонда, содержащего В-элемент и простирающегося от -5963 до -5981 промотора STF-1. Добавление антисыворотки против BETA-2, E2A или STF-1 к реакции для связывания показаны на каждой дорожке. Добавление 100-кратного избытка немеченной последовательности дикого типа (WT: 5'-TCAGTGACAGATGGAGTCCT -3') или мутантной последовательности (МТ: 5'-TCAGTGAAAGACGGAGTCCT-3') ДНК конкурента проводили, как показано на чертеже. Связывающая активность, полученная от лизата ретикулоцитов, запрограммированная кДНК ВЕТА-2 и Е-47, показана на дорожке 7. Верхняя полоса на дорожке 7 является характерной для лизата ретикулоцитов.

Фиг. 9 демонстрирует, что глюкокортикостероиды ингибируют экспрессию STF-1 путем блокирования воздействия HNF-3 на островково-специфический энхансер.

Фиг. 9А иллюстрирует результаты анализа на кротковременную трансфекцию плазмид, содержащих конструкцию STF-1- репортер, в клетках инсулиномы HIT T15. Активность конструкции -6,2/-5,67-STF Luc, содержащей минимальный островково-специфический энхансер (от -6200 до -5700), достигает 100 %. Конструкции, содержащие точковые мутации в Н- и В-элементах, которые разрушают связывание HNF-3 и ВЕТА/Е2А, обозначены Х в овале или квадрате. Точковые мутации, соответствующие мутациям в Е-бокс- и Н-элементах, использовали в анализе на сдвиг подвижности в геле (см. фиг.8).

Фиг.9В демонстрирует влияние сверхэкспрессии HNF-3 на активность конструкции -6,2/-5,67-STF Luc, содержащей дикого типа (заштрихованные блоки) и мутантный (светлые блоки) Н-элемент в контрольных (-) и обработанных дексаметазоном (+) клетках HIT-T15. Активность конструкции -6,2/-5,67-STF Luc, содержащей минимальный островково-специфический энхансер (от -6200 до -5700), достигает 100 %. Стандартные ошибки показаны соответствующими блоками. Эксперименты повторяли, по крайней мере, четыре раза.

Фиг. 9С иллюстрирует влияние возрастающих уровней эффекторной плазмиды HNF-3 на активность конструкции "STF-1 (-6500 STF-1 Luc) - репортер" дикого типа в клетках HIT-T15. Количество HNF-3 эффекторной плазмиды в (мкг) показано ниже у каждого столбца. Полное количество эффекторной плазмиды в каждом анализе поддерживалось постоянным путем уравновешивания пустым вектором экспрессии CMV. Показаны контрольные клетки (ЕТОН) и клетки, обработанные дексаметазоном (DEX).

Подробное описание изобретения В настоящем изобретении продемонстрировано, что STF-1, гомеодоменный белок, который участвует в панкреатическом морфогенезе и в глюкозном гомеостазе, кодируется гомеоблоксодержащим геном "орфаном", локализованным на мышиной хромосоме 5. При присоединении его к гену-репортеру -галактозидазы, геномный 65 т. п.о.-фрагмент 5'-фланкирующей последовательности гена STF-1 обнаруживает специфичную в отношении панкреатических островков активность у трансгенных мышей. Два различных элемента в промоторе STF-1 необходимы для ограниченной островковой экспрессии дистальной энхансерной последовательности, расположенной между -3 и -6,5 т.п.о, и проксимальной последовательности Е-бокса, расположенной у нуклеотида -104, которая, главным образом, распознается нуклеарным фактором USF, содержащим структуру "спираль-петля-спираль (bHLH)/-лейциновая молния (ZIP)". Поскольку точковые мутации в-104 Е-боксе нарушают связывание USF и соответственно блокируют активность промотора STF-1, то настоящее изобретение продемонстрировало, что USF является важным компонентом регуляторного аппарата, который направляет экспрессию STF-1 в клетки панкреатических островков. Кроме того, было обнаружено, что глюкокортикоиды возможно подавляют экспрессию гена STF-1 путем блокирования активности дистальной области островково-специфического энхансера, который распознает два эндодермальных фактора: HNF-3 и ВЕТА-2/Е47. Мутации в энхансере STF-1, которые блокируют связывание либо HNF-3, либо ВЕТА-2/Е47 соответственно, разрушают активность промотора STF-1. Способность НМР-3-экспрессирующего вектора "спасать" активность энхансера STF-1 в обработанных глюкокортикоидом клетках свидетельствует о том, что HNF-3 действительно является важным регулятором экспрессии STF-1.

Одной из целей настоящего изобретения является разработка способа тестирования соединений, которые индуцируют транскрипцию STF-1. Клеточные линии панкреатических островков, экспрессирующие гибридный ген STF-1/lacZ, выделяли путем совместного осаждения с использованием фосфата кальция. Для оценки влияния различных соединений на экспрессию STF-1 к STF-l/lacZ-экспрессирующим клеткам добавляли соединение, представляющее интерес. Количественную оценку lacZ-активности в контрольных и обработанных клетках проводили с помощью колориметрического анализа. С использованием этот метода может быть скринировано большое число соединений, и SТF-1-индуцирующие соединения могут быть легко идентифицированы.

Другой це