Гибридома, обозначенная 199м, и моноклональное антитело, секретированное этой гибридомой

Гибридома, обозначенная 199м, и моноклональное антитело, секретированное этой гибридомой

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии и может быть использовано в иммуногистохимическом анализе для определения локализации _d. Гибридому получают путем иммунизации хомячка очищенным крысиным _d и трансфектированными крысиным _d СНО клетками с последующим слиянием силеноцитов с NS-1 миеломными клетками и скринингом целевых клеток. Гибридома продуцирует моноклональное антитело, реактивное с -субъединицей крысиного интегрина (_d). Изобретение позволяет определить локализацию _d в тканях. 2 с.п.ф-лы, 4 ил., 1 табл.

Эта заявка является продолжением части заявки США No. 08/362652, поданной 21 декабря 1994 г., которая ожидает решения, которая является продолжением части заявки США N 08/286889, поданной 5 августа 1994, которая опубликована как патент США 5470953 от 28 ноября 1995, которая в свою очередь является продолжением части заявки США N 08/173497, поданной 23 декабря 1993 г, которая опубликована как патент США 5437958 от 1 августа 1995.

Настоящее изобретение относится к клонированию и экспрессии полинуклеотидов, кодирующих новую человеческую ₂ интегриновую субъединицу, обозначенную _d, которая является структурно связанной с известными человеческими ₂ интегриновыми субъединицами, CD11a, CD11b, и CD11c. Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, выделенным из других видов, которые проявляют гомологию с человеческими кодирующими последовательностями.

Интегрины представляют класс мембранно-ассоциированных молекул, которые активно участвуют в клеточной адгезии. Интегрины представляют трансмембранные гетеродимеры, включающие субъединицу в нековалентной связи с субъединицей. До сего времени были идентифицированы по крайней мере четырнадцать субъединиц и восемь субъединиц [Обзор в Springer, Nature 346:425-434 (1990)] . Обычно субъединицы являются способными ассоциировать с более чем одной субъединицей, и гетеродимеры обменивающие общую субъединицу, были класифицированы как субсемейства внутри интегриновой популяции.

Один класс человеческих интегринов, затрудняющих экспрессию в белых кровяных клетках, характеризуется общей ₂ субъединицей, В результате этой клеточно-специфической экспрессии на эти интегрины обычно ссылаются как на лейкоцитовые интегрины, Leu-CAMs или лейкоинтегрины. Из-за общей ₂ субъединицы альтернативное обозначение этого класса представляет ₂ интегрины. ₂ субъединица (CD18) была выделена ранее в ассоциации с одной из трех четких субъединиц, CD11a, CD11b, и CD11c. Выделение с-ДНК, кодирующей человеческую CD18, описано у Kashimoto et.al., Cell 48: 681-690 (1987). В официальной WHO номенклатуре гетеродимерные белки относятся к CD11a/CD18, CD11b/CD18 или CD11C/CD18; в обычной номенклатуре они относятся к LFA-1, Мас-1, или Mol и р15095 или Leu M5, соответственно [Cobbold, относятся к LFA-1, Mac-1, или Mol и р15095 или Leu M5 соответственно [Cobbold, et.al., in Leukocyte Tiping 111, McMichael (ed), Oxford Press, p.788 (1987)]. Было продемонстрировано, что человеческие ₂ интегриновые субъединицы, CD11a, CD11b, и CDHc, мигрируют в условиях восстановления в электрофорезе с кажущимися молекулярными весами приблизительно 180 kD, 155 kD и 150 kD соответственно, и было проведено клонирование ДНК-т, кодирующих эти субъединицы [CD11a, Larson, et.al., J. Cell Biol. 108: 703-712 (1989); CD11b, Corbi, et.al., J.Biol.Chem. 263: 12403-12411 (1988) и CD11c Corbi, et.al. EMBO J. 6:4023-4028 (1987)]. Предполагаемые гомологи человеческих ₂ интегриновых и цепей, определенные с помощью приблизительной аналогии в молекулярном весе, были ранее идентифицированы в других видах, включающих обезьян и других приматов [Letvin, et.al., Blood 61:408-410 (1983)], мышей [Sanchez-Madrid, et.al., J.Exp.Med. 154:1517 (1981)] и собак [Moore, et.al., Rissue Antigens 36:211-220(1990)], Было показано, что абсолютные молекулярные веса предполагаемых гомологов из других видов значительно изменялись [смотри, например, Danilenko et.al., Tissue Antigens 40:13-21 (1992)], и отсутствие последовательной информации делает невозможным определенную корреляцию между человеческими интегриновыми субъединицами и субъединицами, идентифицированными в других видах. Однако между различными видами наблюдали изменение в количестве элементов в белковом семействе. Полагают, например, что было выделено больше IgA изотопов у кроликов, чем у людей [Burnett, et. al., EMBO J. 8:4041-4047 (1989) and Schneiderman, et. al. , Proc.Natl.Acad.Sci (USA) 86:7561-7565 (1989)]. Аналогично у людей были ранее идентифицированы по крайней мере шесть вариантов металлотионинового белка [Karin and Richards, Nature 299: 797-802 (1982) and Varshney, et. al., Mol.Cell.Biol, 6:26-37, (1986)], тогда как у мышей находятся в наличии только два таких варианта [Serle, et.al,, Mol.Cell.Biol. 4: 1221-1230 (1984)]. Поэтому существование множества элементов белкового семейства в одном виде не обязательно подразумевает, что соответствующие элементы семейства существуют в других видах.

В конкретном контексте ₂ интегринов у собак наблюдали, что преимущественно собачья ₂ часть, противоположная человеческой CD18, является способной образовывать димер с таким большим числом субъединиц, как четыре потенциально четких субъединицы [Danilenko, et.al., в печати]. Антитела, генерированные иммунизованной мышью с собачьими спленоцитами, приводили к моноклональным антителам, которые иммунопреципитировали белки, временно обозначенные как собачьи гомологи в человеческих CD18, CD11a, CD11b и CD11c в основном на основании подобия, но не идентичности молекулярных весов. Другое собачье спленоцитовое антитело, СаI18Н2, узнавало и иммунопреципитировало четвертую связь собачьей субъединицы, также способную к ассоцициации с ₂ субъединицей, но имеющую уникальный молекулярный вес и рестриктированное в экспрессии в субнаборе дифференцированных тканевых макрофагов.

Антитела, генерированные иммунизацией хомячков мышиными дендритными клетками, приводили к двум антиинтегриновым антителам [Metlay, et.al., J. Exp. Med. 171: 1753-1771 (1990)], Одно антитело, 2Е6, иммунопреципитировало преимущественно гетеродимер с субъединицами, имеющими приблизительные молекулярные веса 180 kD и 90 kD, дополнительно к небольшим полосам в области молекулярного веса 150-160 kD. Второе антитело, N418, преципитировало другой наблюдаемый гетеродимер, имеющий приблизительные молекулярные веса 150 kD и 90 kD. На основании исследований блокирования клеточной адгезии была высказана гипотеза, что антитело 2Е6 узнает мышиную часть, противоположную человеческой CD18. В то время как молекулярный вес N418 антигена подтвердил узнавание мышиного гомолога в человеческой CD11c/CD18, дальнейший анализ показал, что мышиный антиген обнаруживает картину распределения ткани, которая не согласуется с той, которая наблюдается для человеческой CD11с/CD18.

Антигены, узнанные собачьим СаI1.8Н2 антителом и мышиным N418 антителом, могут представлять вариант видов (например, гликозилирования или сплайс вариант) ранее идентифицированной собачьей или мышиной субъединицы. Или же эти антигены могут представлять уникальные собачьи и мышиные интегриновые субъединицы. При отсутствии конкретной информации, касающейся первичной структуры, не может быть проведено различие среди этих альтернативных вариантов.

У людей CD11a/CD18, экспрессируется на всех лейкоцитах. CD11b/CD18 и CD11с/CD18 ограничиваются по существу в экспрессии на моноцитах, гранулоцитах, макрофагах и естественных клетках-убийцах (NK), но CD11с/CD18 обнаруживается также на некоторых типах В-клеток. Вообще, CD11a/CD18 преобладает на лимфоцитах, CD11b/CD18 на гранулоцитах и CD11с/CD18 на макрофагах [смотри обзор Arnaout, Blood 75:1037-1050 (1990)]. Экспрессия цепей, однако, является изменяемой относительно состояния активации и дифференциации индивидуальных клеточных типов [смотри обзор, Larson and Springer, Immunol. Rev. 114:181-217(1990)].

Включение интегринов в человеческую иммунную и воспалительную реакции было продемонстрировано с использованием моноклинальных антител, которые являются способными к блокированию адгезии ₂ интегрин-ассоциированной клетки. Например, CD11a/CD18, CD11b/CD18 и CD11с/CD18 активно участвуют в связывании естественной клетки-убийцы (NK) в клетках лимфомы и аденокарциномы [Patarroyo, et.al., Immunol.Rev. 114:67-108 (1990)], аккумуляции гранулоцитов [Nourshargh, et.al., J.Immunol. 142:3192-3198 (1990)], гранулоцит-независимой утечки плазмы [Arford, et.al., в печати] и адгезии лейкоцитов в сосудистом эндотелии [Price, et.al., J.Immunol 139:4174-4177 (1987) и Smith, et.al., J.Clin.Invest. 83: 2008-2017 (1989)]. Фундаментальная роль ₂ интегринов в иммунных и воспалительных реакциях становится очевидной в клиническом синдроме, на который ссылаются как на дефицит адгезии лейкоцитов (LAD), где клинические проявления включают повторяющиеся и часто угрожающие жизни бактериальные инфекции. LAD является следствием гетерогенных мутаций в субъединице [Kishimoto, et.al., Cell, 50:193-202 (1987)] и тяжесть состояния заболевания является пропорциональной степени дефицита в экспрессии ₂ субъединицы. Образование полного интегринового гетеродимера ослабляется ₂ мутацией [Kishimoto, et.al., выше].

Интересно было показано, что по крайней мере одно антитело, специфичное для CD18, ингибирует человеческий вирус иммунодефицита типа 1 (HIV-1) образования синцития in vitro, хотя точный механизм этого ингибирования является неясным [Hildreth and Orentas, Science 244:1075-1078 (1989)]. Это наблюдение согласуется с открытием, что принципиальный противорецептор CD11a/CD18, IСАМ-1, является также поверхностным рецептором для большой группы риновирусных серотипов [Greve, et.al., Cell 56:839 (1989)].

Значение связывающей активности ₂ интегрина в человеческой иммунной и воспалительной реакциях подчеркивает необходимость развития более полного понимания этого класса поверхностных белков. Идентификация пока неизвестных элементов этого субсемейства, а также их противорецепторов и генерирование моноклональных антител или других растворимых факторов, которые могут изменять биологическую активность ₂ интегринов, будет обеспечивать практический путь для терапевтического вмешательства в ₂ интегрин-связанные иммунные и воспалительные реакции.

В одном из аспектов настоящее изобретение обеспечивает новые очищенные и выделенные полинуклеотиды (например, ДНК и РНК транскрипты, обоих типов кодируемых и некодируемых нитей), кодирующих новую человеческую ₂ интегриновую субъединицу, _d, и их варианты (т.е. делеции, аналоги присоединения или замещения), которые обладают связывающими и/или иммунологическими свойствами, присущими _d. Предпочтительные молекулы ДНК изобретения включают сДНК, геномную ДНК и полностью или частично синтезированные молекулы ДНК. Теперь предпочтительный нуклеотид представляет ДНК впредь в виде SEQ ID NO: 1, кодирующего полипептид SEQ ID NO:2, Обеспечивается также рекомбинантная плазмида и вирусные ДНК конструкции (экспрессионные конструкции), которые включают _d кодирующие последовательности, где _d кодирующая последовательность является оперативно связанной с гомологами или гетеролагами транскрипционального регуляторного элемента или элементов.

Настоящим изобретением обеспечивают также выделение и очистку мышиных и крысиных полинуклеотидов, которые проявляют гомологию к полинуклеотидам, кодирующим человеческую _d. Предпочтительный мышиный полинуклеотид представляется впредь в SEQ ID NO:52, а предпочтительный крысиный полинуклеотид представляет впредь в SEQ ID NO:54.

В качестве другого объекта изобретения обеспечивают прокариотические или эукариотические клетки-хозяева, транформированные или трансфекцированные ДНК последовательностями изобретения, которые экпрессируют _d полинуклеотид или его варианты. Клетки-хозяева изобретения являются особенно полезными для крупномасштабного производства _d полипептида, который может быть выделен либо из самой клетки-хозяина, либо из среды, в которой выращивается клетка-хозяин. Клетки-хозяева, которые экпрессируют _d полипептид на их внутриклеточной мембранной поверхности также являются полезными в качестве иммуногенов в производстве _d - специфических антител. Предпочтительно, чтобы клетки-хозяева, трансфекцированные _d, являлись бы сотрансфекцированными с экпрессией ₂ интегриновой субъединицы для того, чтобы позволить поверхностную экспрессию гетеродимера.

Настоящим изобретением обеспечивают также выделение и очистку _d полипептидов, фрагментов и их вариантов. Предпочтительный _d полипептид представляется впредь в SEQ ID NO:2. Новые _d продукты изобретения могут быть получены в виде выделенных из натуральных источников, но аналог с продуктами _d варианта предпочтительно производится с помощью рекомбинантных процедур, включающих клетки-хозяева изобретения. Полностью гликозилированные, частично гликозилированные и полностью дегликозилированные формы _d полипептида могут быть генерированы с помощью изменения клетки-хозяина, выбранной для рекомбинантного производства и/или обработки после выделения. Варианты _d полипептидов изобретения могут включать водорастворимые и не растворимые в воде _d полипептиды, включающие аналоги, где одна или больше аминокислот делегируются или заменяются: 1) без потери и предпочтительно с усилением одной или большего количества биологических активностей или иммунологических характеристик специфических для _d; или 2) со специфической неспособностью конкретного лиганда/рецептора к функции связывания или сигналирования. Обеспечиваются также составные полипептиды, где _d аминокислотные последовательности экспрессируются со смежными аминокислотными последовательностями из других полипептидов. Такие составные полипептиды могут обладать модифицированными биологическими, биохимическими и/или иммунологическими свойствами по сравнению с _d дикого типа. Рассматривается аналог полипептидов, включающий дополнительный аминокислотный (например, лизин или цистеин) остаток, который облегчает образование мультимера.

Настоящим изобретением рассматриваются также полипептиды и другие непептидные молекулы, которые специфически связываются с _d. Предпочтительные связывающие молекулы включают антитела (например, моноклональные или поликлональные антитела), противорецепторы (например, мембранно-ассоциированные и растворимые формы) и другие лиганды (например, молекулы естественного происхождения или синтетические молекулы), включающие те лиганды, которые конкурентно связывают _d в присутствии _d моноклональных антител и/или специфических противорецепторов. Связывающие молекулы являются полезными для очистки _d полипетидов и идентификации типов клеток, которые экспрессируют _d. Связывающие молекулы являются также полезными для модуляции (т.е. ингибирования, блокирования или стимулирования) in vitro связывающей или сигнальной трансдукционной активностей _d. Обеспечиваются также анализы для идентификации _d. связывающих молекул, включающие анализы иммобилизованных связывающих лигандов, анализы связывающих растворов, сцинтилляционные проксимальные анализы, ди-гибридные скринирующие анализы и им подобные.

Анализы in vitro для идентификации антител или других соединений, которые модулируют активность _d, могут включать, например, иммобилизацию _d или естественного лиганда, с которым связывается _d, обнаружимое мечение неиммобилизованного связывающего партнера, инкубирование связывающих партнеров вместе и определение влияния испытываемого соединения на количество связанных меток, где уменьшение в связанной метке в присутствии испытываемого соединения по сравнению с количеством связанной метки в отсутствие испытываемого соединения указывает на то, что испытываемый агент является ингибитором _d связывания.

Другой тип анализа для идентификации соединений, которые модулируют вазимодействие между _d и лигандом, включает иммобилизацию _d или ее фрагмента на твердую подложку (или импрегнированную агентом), покрытую флуоресцирующим агентом, мечение лиганда соединением, способным возбуждать флуоресцирующий агент, контактирование иммобилизованной _d с меченным лигандом в присутствии и отсутствие предполагаемого модулирующего соединения, обнаружение излучения света флуоресцирующим агентом и идентификацию модулирующего соединения как такого соединения, которое оказывает влияние на излучение света флуоресцирующим агентом по сравнению с излучением света флуоресцирующим агентом в отсутствие модулирующего соединения. Или же _d лиганд может быть иммобилизованным, и _d может быть меченным в анализе.

Изобретением рассматривается еще один способ для идентификации соединений, которые модулируют взаимодействие между _d и лигандом, включая трансформацию или трансфекцию соответствующих клеток-хозяев конструкцией ДНК, содержащей сообщаемый ген, под контролем промотора, регулируемого фактором транскрипции, имеющим ДНК связывающий домен и активирующий домен, экспрессируют в клетки-хозяева первую гибридную ДНК последовательность, кодирующую первую составную часть или все _d и либо ДНК связывающий домен, либо активирующий домен фактора транскрипции, который не вводится в первый гибрид, оценивают влияние предполагаемого модулирующего соединения на взаимодействие между _d и лигандом, за счет обнаружения связывания лиганда со второй гибридной ДНК последовательностью _d в конкретной клетке-хозяине за счет измерения продуцирования сообщаемого генного продукта в отсутствие модулирующего соединения. Теперь предпочтительными для использования в анализе являются промотор Lex A, Lex A ДНК связывающий домен, GaLI4 домен трансактивации, LacZ сообщаемый ген и дрожжевая клетка-хозяин.

Модифицированная версия вышеуказанного анализа может быть использована в выделении полинуклеотида, кодирующего белок, который связывает _d за счет трансформирования или трансфекцирования соответствующих клеток-хозяев конструкцией ДНК, включающей сообщаемый ген под контролем промотора, регулируемого фактором транскрипции, имеющим ДНК связывающий домен и активирующий домен, экспрессии в клетки-хозяева первой гибридной ДНК последовательности, кодирующей первую составную часть или все _d и либо ДНК связывающий домен, либо активирующий домен фактора транскрипции, экспрессии в клетки-хозяева библиотеки вторых гибридных ДНК последовательностей, кодирующих вторые гибриды части или всех предполагаемых _d связывающих белков и ДНК связывающего домена, или активирующего домена фактора транскрипции, который не вводится в первый гибрид, обнаружения связывания _d связывающего белка в _d в конкретной клетке-хозяине за счет обнаружения продуцирования сообщаемого генного продукта в клетке-хозяине, и выделении вторых гибридных ДНК последовательностей, кодирующих _d связывающий белок из конкретной клетки-хозяина.

Гибридомные линии клеток, которые продуцируют антитела, специфичные для _d, также рассматриваются изобретением. Приемы продуцирования гибридом, которые секретируют моноклональные антитела, являются хорошо известными специалистам в этой области. Гибридомные линии клеток могут быть генерированы после иммунизации животного очищенной _d, вариантами _d, или клетками, которые экспрессируют _d или ее варианты на экстраклеточной мембранной поверхности. Иммуногенные клеточные типы включают клетки, которые экспрессируют _d in vivo, или трансфекцированные прокариотические или эукариотические линии клеток, которые обычно не подвергаются нормальной экспрессии _d in vivo. Предпочтительные антитела изобретения секретируются теперь гибридомами, обозначенными 169А, 169В, 170D, 170F, 170Т, 170Х, 170Н, 188А, 188В, 188С, 188Е, 188F, 188G, 188I, 188К, 188L, 188М, 188N, 188Р, 188R, 188Т, 195А, 195С, 195D, 195Е, 195Н, 197А-1, 197А-2, 197А-3, 197А-4, 199А и 199М.

Выявляется значение информации, внесенной за счет раскрытия ДНК и аминокислотных последовательностей _d. В одной из серий примеров раскрытая _d СДНК последовательность делает возможным выделение человеческой _d геномной ДНК последовательности, включающей транскрипциональные элементы контроля для геномной последовательности. Рассматривается также идентификация _d аллельных вариантов и гетерологичных видов (например, крысы или мыши) ДНК-т. Выделение человеческой _d геномной ДНК и ДНК-т гетерологичных видов может достигаться за счет стандартных приемов ДНК/ДНК гибридизации при соответственно строгих условиях, с использованием всех или части _d сДНК последовательности в качестве пробы для скринирования всей библиотеки. Или же реакция полимеразной цепи (PCR) с использованием олигонуклеотидных праймеров, которые конструируются на основе известной сДНК последовательности, может быть использована для усиления и идентификации геномных _d сДНК последовательностей. Синтетические ДНК-ты, кодирующие _d полипептид, включающие фрагменты и другие их варианты, могут быть получены обычными синтетическими методами.

Информация о ДНК последовательности изобретения также делает возможным развитие за счет гомологичной рекомбинации или стратегий "нокаута" [смотри, например, Kapecchi, Science 244:1288-1292 (1989)], получать грызунов, которые не в состоянии экспрессировать функциональный _d полипептид или которые экспрессируют вариант _d пептида. Такие грызуны являются полезными в качестве моделей для изучения активностей _d и _d модуляторов in vivo.

ДНК и аминокислотные последовательности изобретения делают также возможным анализ _d эпитопов, которые активно участвуют в противорецепторном связывании, так же как и эпитопов, которые могут скорее регулировать, чем активно участвовать в связывании. Идентификация эпитопов, которые могут участвовать в трансмембранной сигнальной трансдукции, также рассматривается изобретением.

ДНК изобретения является также полезной для обнаружения клеточных типов, которые экпрессируют _d полипептид. Стандартные приемы ДНК/РНК гибридизации, которые используют _d ДНК для обнаружения _d РНК, могут быть использованы для определения представленного уровня _d транскрипции внутри клетки, так же как и изменений в уровне транскрипции в ответ на действие внутренних или внешних агентов. Идентификация агентов, которые модифицируют транскрипцию и/или трансляцию _d, может быть в свою очередь оценена для потенциальной терапевтической или профилактической цели. ДНК изобретения делает также возможной гибридизацию in situ _d ДНК в клеточной РНК для определения клеточной локализации _d специфических переносов внутри комплексных клеточных популяций и тканей.

ДНК изобретения является также полезной для идентификации нечеловеческих полинуклеотидных последовательностей, которые проявляют гомологию к человеческим _d последовательностям. Обладание нечеловеческими _d ДНК последовательностями позволяет проводить развитие животных моделей (включающих, например, трансгенные модели) человеческой системы.

В качестве другого аспекта изобретения рассматриваются моноклональные или поликлональные антитела, специфические для _d, которые могут быть применены в иммуногистохимическом анализе для локализации _d в субклеточных положениях или индивидуальных клетках внутри тканей. Иммуногистохимические анализы этого типа являются особенно полезными, когда используются в комбинации с гибридизацией in situ для локализации и _d mРНК и полинуклеотидных продуктов _d гена.

Идентификация клеточных типов, которые экспрессируют _d, может иметь значительные ответвления для развития терапевтических или профилактических агентов. Предполагается, что продукты изобретения, отнесенные к _d, могут быть применены в лечении заболеваний, где макрофаги являются существенным элементом процесса заболевания. Животные модели для многих патологических состояний, ассоциированные с макрофаговой активностью, были описаны в литературе. Например, у мышей макрофаговое пополнение в сайты хронических и острых воспалений сообщалось Jutila, et. al., J.Leucocyte Biol. 54:30-39 (1993). У крыс Adams, et.al.[Transplantation 53:1115-1119 (1992) and Transplantation 56: 794-799 (1993)] описывает модель для трансплантированных артериосклерозов после гетеротропной абдоминальной сердечной аллографической трансплантации. Rosenfeld, et.al., [Arteriosclerosis 7:9-23 (1987) and Arteriosclerosis 7:24-34 (1987)] описывает индуцированные атеросклерозы у кроликов, в рационе которых содержался дополнительной холестерин. Henenberg, et. al., [Diabetologia 32:126-134 (1989)] сообщал о спонтанном развитиии инсулинзависимого диабета у ВВ крыс. Yamada, et.al. [Gastroenterology 104: 759-771 (1993)] описали индуцированное воспалительное заболевание кишечника, хронические грануломатозные колиты, у крыс после инъекций стрептококковых пептидогликан-полисахаридных полимеров. Cromartie, et.al. [J.Exp. Med. 146: 1585-1602 (1977] and Schwab, et.al., [Infection and Immunity 59:4436-4442 (1991)] сообщали, что инъекция крысам белка стрептококковой клеточной стенки приводила к артритному состоянию, характеризующемуся воспалением периферийных суставов и последующему разрушению сустава. Наконец, Huitinga, et.al. [Eur. J.Immunol., 23:709-715, (1993)] описал экспериментальные аллергические энцефаломиелиты, модель для множественных склерозов у крыс Льюиса. В каждой из этих моделей _d антитела, другие _d связывающие белки или растворимые формы _d используются для ослабления состояния заболевания, преимущественно за счет инактивации макрофаговой активности.

Изобретением обеспечиваются фармацевтические композиции для лечения этих и других состояний заболевания. Фармацевтические композиции составляются с целью ингибирования взаимодействия между _d и его лигандом(ми) и включают различные растворимые и мембранно-ассоциированные формы _d связывающих белков (включающих антитела, лиганды и им подобные), внутриклеточные или внеклеточные модуляторы _d связывающей активности, и/или модуляторы _d и/или _d-лиганд полипептидной экспрессии, включающей модуляторы транскрипции, трансляции, посттрансляционного процессинга и/или внутриклеточного транспорта.

Изобретение рассматривает также способы лечения состояний заболевания, в которых подразумевается _d связывание, или локализованная аккумуляция клеток, которые экпрессируют _d, где пациент, страдающий от указанного состояния заболевания, обеспечивается количеством фармацевтической композиции изобретения, достаточной для модулирования уровней _d, связывания или для модулирования аккумуляции типов клеток, которые экспрессируют _d. Способ лечения согласно изобретению является подходящим для состояний заболевания, таких как, но не ограничивается ими, диабеты типа 1, атеросклерозы, множественные склерозы, астма, псориаз, воспаление легких, синдром острого респираторного растройства и ревматоидные артриты.

Многочисленные другие аспекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны при рассмотрении следующего описания, со ссылками на чертежи, где: Фиг. 1А - 1D включают расстановку человеческих аминокислотных последовательностей CD11b (SEQ ID NO:3), CD-He (SEQ ID NO:4) и _d (SEQ ID NO:2).

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами, касающимися выделения сДНК клона, кодирующего _d из человеческой селезенки сДНК библиотеки. Более конкретно Пример 1 иллюстрирует применение собачьего _TM1 антитела в попытке обнаружения гомологичного человеческого белка. Пример 2 детализирует очистку собачьего _TM1 и N-терминального секвенирования полипептида для конструирования олигонуклеотидных праймеров для PCR амплификации собачьего _TM1 гена. Пример 3 направлен на крупномасштабную очистку собачьего _TM1 для внутреннего секвенирования для того, чтобы сконструировать дополнительные PCR праймеры. Пример 4 описывает применение PCR и праймеров внутренней последовательности для амплификации фрагмента собачьего _TM1 гена. Пример 5 направлен на клонирование человеческой _d-кодирующей сДНК последовательности. Пример 6 описывает гибридизационный анализ Нозерн блоттинга человеческой ткани и клеток для экспрессии _d mРНК. Пример 7 детализирует конструкцию человеческих _d плазмид экспрессии и трансфекции COS клеток с получением плазмид. Пример 8 описывает анализ ELISA _d экспрессии в трансфекцированных COS клетках. Пример 9 описывает анализ FACS клеток COS, трансфекцированных человеческими _d плазмидами экспрессии. Пример 10 направлен на иммунопреципитацию CD18 совместно с _d в со-трансфекцированных COS клетках. Пример 11 относится к устойчивой трансфекции _d конструкций экспрессии в клетках яичников китайских хомячков. Пример 12 направлен на CDI8-зависимое связывание _d с внутриклеточной адгезией молекулы ICAM-R, с ICAM-R мутантным белком и комплементным фактом iC3b. Пример 13 описывает сцинтиляционные скринирующие анализы для идентификации ингибиторов или энхансеров (т.е. модуляторов) _d лиганд/антилиганд связывающих взаимодействий. Пример 14 направлен на конструирование плазмид экспрессии, которые кодируют растворимые формы _d, и анализы связывания продуктов экспрессии. Пример 15 относится к продуцированию _d-специфических поликлональных сывороток и моноклональных антител. Пример 16 описывает анализ _d распределения ткани, экспрессию _d в периферийных лейкоцитах крови и _d экспрессию в воспалительной и невоспалительной синовиальной оболочках с использованием анти-_d поликлональной синовиальной оболочки. Пример 17 описывает выделение крысиных сДНК последовательностей, которые проявляют гомологию к человеческим _d генным последовательностям. Пример 18 относится к конструкции крысиных _d плазмид экспрессии полной длины, крысиных _d I доменовых экспрессионных плазмид, включающих I домен/IgG составные белки, и продуцированию моноклональных антител полной длины и I доменовых составных белков. Пример 19 направлен на выделение мышиных сДНК последовательностей, которые проявляют гомологию к человеческим _d генным последовательностям. Пример 20 описывает выделение дополнительных мышиных _d сДНК клонов, используемых для подтверждения анализа последовательности. Пример 21 относится к гибридизационному анализу in situ различных мышиных тканей для определения тканевой и клеточной специфической экспрессии предполагаемого мышиного гомолога в человеческой