Фотосенсибилизатор и способ его получения

Фотосенсибилизатор и способ его получения

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и касается фотосенсибилизатора для фотодинамической терапии и способа его получения, включающего щелочные соли хлорина е₆, пурпурина 5 и хлорина р₆, характеризующегося оптимальной скоростью накопления в опухоли и выведения его из опухоли, а также высокой стабильностью. 2 с. и 7 з.п. ф-лы, 18 ил., 3 табл.

Изобретение относится к химии биологически активных соединений в области фотодинамической терапии (ФДТ).

Фотосенсибилизаторы (ФС) находят применение при ФДТ в качестве терапевтических средств и при фотодинамической диагностике (ФДД) в качестве флюоресцентных меток.

Известен ФС тетранатриевая соль моно-L-аспартил хлорина e₆ "Npe6" [1]: Данный ФС обладает активностью при ФДТ.

Его недостатками являются большая трудоемкость получения, чрезмерно ускоренная динамика накопления в опухоли и выведения из нее, что сокращает время эффективного воздействия на опухоль, а также сравнительно низкая степень накопления в злокачественных новообразованиях вследствие значительной гидрофильности, что задействует только один из нескольких возможных механизмов разрушения опухоли в процессе ФДТ, а именно только поражение кровеносных сосудов.

Известен ФС тринатриевая соль лизил-хлорина р₆ "LCP" [2]: Данный ФС обладает выраженной активностью при ФДТ.

Его недостатком является высокая трудоемкость получения, а также то, что он представляет собой смесь моноамидов по 13 и 15 положениям в соотношении примерно 10: 1, что может приводить к его неоднозначному биораспределению и выведению.

Известен ФС - натриевая соль феофорбида a [3]: Данный ФС обладает способностью селективно накапливаться в злокачественных новообразованиях и активностью при ФДТ.

Его недостатками являются высокая склонность к окислению (химическая нестабильность) при хранении в растворе, неполная растворимость после хранения в твердом виде, гидрофобность и, как следствие, - медленное выведение из организма, что приводит к длительной фоточувствительности кожных покровов.

Известны ФС - производные хлорина е₆ [4]: где R = гидрофобный углеводородный заместитель, насыщенный или ненасыщенный, прямой или разветвленный, содержащий от 4 до 25 атомов углерода.

ФС, у которого R = гексил, обладает тропностью в отношении злокачественных опухолей и является эффективным средством для ФДТ.

Его недостатками являются трудоемкость выделения и очистки в препаративных количествах, высокая гидрофобность и, как следствие, медленное накопление в опухоли и низкая стабильность водных растворов лекарственных форм при хранении (прототип).

Известен способ получения ФС, а именно композиции хлоринов в виде солей со щелочным металлом, предназначенной для медицинского применения, заключающийся в том, что растительную биомассу экстрагируют смесью углеводорода, содержащего 6-12 углеродных атомов, и спирта, содержащего 2-10 углеродных атомов, взятых в объемном соотношении от 2:1 до 8:1, упаривают полученный раствор хлорофиллов при атмосферном давлении, добавляют спирт, содержащий меньшее количество углеродных атомов, чем взятый для экстракции, полностью отгоняют из смеси углеводород при атмосферном давлении, постепенно прибавляют к спиртовому раствору хлорофиллов спиртовой раствор щелочи при температуре кипения спирта, но менее 120^oС, до рН 11,5-11,8, охлаждают, выдерживают 4 часа, фильтруют, экстрагируют смесь углеводородом, содержащим 6-12 углеродных атомов, отделяют спиртовую фазу, содержащую магниевые комплексы хлоринов, упаривают спирт при атмосферном давлении, прибавляют к остатку соляную кислоту до рН 3,5, выдерживают до прекращения выделения осадка хлоринов, отфильтровывают его, растворяют в метаноле, прибавляют спиртовой раствор щелочи до рН 8,5, фильтруют раствор ФС и упаривают его в вакууме [5].

Недостатком указанного способа является использование высоких температур при удалении растворителей из экстракта, использование спиртов, в особенности метилового, приводящее к алломеризации экзоцикла Е и образованию из феофитинов и феофорбидов большого числа разнообразных продуктов окисления [6] , что приводит к сложной смеси неопределенного и трудно воспроизводимого состава.

Известен способ получения ФС, а именно натриевой соли хлорина е₆, согласно которому 1N раствор NaOH прибавляют к раствору триметилового эфира хлорина е₆ в тетрагидрофуране, затем реакционную массу перемешивают 2 суток при комнатной температуре в атмосфере азота и добавляют воду, далее органический растворитель экстрагируют хлористым метиленом, удаляя следы последнего барботированием азота через раствор соли хлорина е₆ [4].

Недостатками данного способа являются труднодоступность значительных количеств исходного триметилового эфира хлорина е₆, длительность процесса получения из него ФС ввиду химической инертности сложноэфирного остатка в 13-м положении тетрапиррольного макроцикла и нестабильность лекарственных форм ФС при хранении в виде водного раствора по причине неполного омыления сложноэфирной группы в 13-м положении макроцикла.

Известен способ получения ФС, а именно фотосенсибилизатора для фотодинамической терапии "LCP" (тринатриевой соли лизил-хлорина р₆), заключающийся в том, что обрабатывают биомассу 2-3 раза ацетоном для извлечения хлорофилла а, отфильтровывают биомассу или центрифугируют ее, упаривают экстракт, обрабатывают экстракт кислотой для удаления из молекулы хлорофилла иона магния и гидролиза фитиловой эфирной группы с добавлением метилового спирта для одновременной этерификации, обрабатывают реакционную массу водой, экстрагируют производное феофорбида а хлористым метиленом, экстракт нейтрализуют, промывают водой, упаривают, хроматографируют на окиси алюминия, метилфеофорбид а кристаллизуют из смеси хлористый метилен-метанол и вводят полученное производное феофорбида а в реакцию с сильным неорганическим основанием в присутствии кислорода в пиридине - диэтиловом эфире - н-пропаноле, обрабатывают реакционную массу водой, подкисляют водную фазу до рН 4, экстрагируют "нестабильный хлорин" хлористым метиленом, упаривают экстракт, перерастворяют "нестабильный хлорин" в тетрагидрофуране, упаривают раствор, повторяют до прекращения роста поглощения при 700 нм, растворяют полученный пурпурин 18 в тетрагидрофуране, этерифицируют диазометаном, смешивают метиловый эфир пурпурина 18 с водным раствором лизина в хлористом метилене в присутствии пиридина, перемешивают смесь 12 часов при комнатной температуре, удаляют растворители в высоком вакууме, далее полученный сырой продукт очищают с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ, удаляют растворители лиофильной сушкой, растворяют ФС в фосфатном буфере с целью получения инъекционного раствора для ФДТ, прибавляют 0,1 N раствор NaOH, доводят раствор до физиологического значения рН 7,35 с помощью 0,1 N HC1 и фильтруют через микропористый фильтр [2] (прототип).

К недостаткам данного способа следует отнести плохую воспроизводимость, трудоемкость (использование высокого вакуума, кристаллизации, колоночной хроматографии и ВЭЖХ, длительное время протекания реакции с лизином), применение высокотоксичных и огнеопасных реагентов (диазометан, пиридин, метанол, тетрагидрофуран, диэтиловй эфир), что делает его малопригодным для фармацевтического производства. Кроме того, полученный водорастворимый целевой продукт устойчив в водном растворе только 24 часа при 4^oС в темноте и в твердом виде только до 4-х месяцев при 4^oС в темноте, а необходимо, согласно требованиям фармакопеи, не менее 6 месяцев [7]. Более того, с точки зрения химии, данный ФС представляет собой смесь моноамидов по 13 и 15 положениям в соотношении примерно 10:1, что может приводить к его неоднозначному биологическому распределению и выведению из организма.

Задачей настоящего изобретения является ФС, характеризующийся простотой выделения и очистки в препаративных количествах, сбалансированной гидрофобностью-гидрофильностью и, как следствие, оптимальной скоростью накопления в опухоли и выведения (из опухоли и из организма в целом), а также высокой стабильностью водных растворов лекарственных форм при хранении.

Данная задача решена путем создания ФС, содержащего хлорин в виде соли со щелочным металлом, причем в качестве хлорина взяты хлорин е₆ (13-карбокси-17-[2-карбоксиэтил] -15-карбоксиметил-17,18- транс-дигидро-3-винил-8-этил-2,7,12,18-тетраметилпорфирин) в количестве 80-90%, пурпурин 5 (13-карбокси-17-[2-карбоксиэтил]-15-формил-17,18-транс-дигидро-3-винил-8-этил-2,7,12,18-тетраметилпорфирин) в количестве 5-20%, а также пурпурин 18 - хлорин р₆ (13-карбокси-17-[2-карбоксиэтил] -15-карбокси-17,18-транс-дигидро-3-винил-8-этил-2,7,12,18-тетраметилпорфирин) в количестве - остальное, так что указанные компоненты образуют композицию, а в качестве щелочного металла могут быть использованы натрий или калий.

Задачей настоящего изобретения также является достижение в способе получения ФС высокой воспроизводимости, простоты, отсутствия токсичных реагентов, химической стабильности лекарственных форм ФС в течение не менее 1 года, совокупности физико-химических и биологических свойств ФС, которые обеспечат его эффективность при ФДТ.

Сущность способа получения ФС заключается в том, что обрабатывают биомассу Spirulina ацетоном до полного извлечения хлорофилла а, отфильтровывают биомассу или центрифугируют ее, обрабатывают экстракт кислотой для удаления из молекулы хлорофилла иона магния, нейтрализуют экстракт и отфильтровывают выпавший феофитин а, далее гидролизуют феофитин а в смеси соляная кислота-ацетон-гексан, причем на каждый 1 г неочищенного феофитина а берут 6-16 мл ацетона, 0,6-6 мл гексана и 5-10 мл концентрированной соляной кислоты, нагревают смесь до температуры 40-60^oС и перемешивают 20 мин - 1 час, далее прибавляют гексан (6-16 мл) и промывают органическую фазу смесью ацетона и концентрированной соляной кислоты (2-10):1, водную фазу промывают гексаном, далее нейтрализуют водную фазу, содержащую феофорбид а, избытком водного раствора цитрата натрия (трех-, двух- или однозамещенного), отделяют выпавший феофорбид а путем фильтрации, промывают его водой, переосаждают его из смеси ацетон-вода, сушат на воздухе до постоянного веса, далее растворяют феофорбид а в ацетоне, прибавляют сильное неорганическое основание в виде водного раствора с концентрацией 0,05-1,00%, перемешивают при 30-60^oС в течение 5-30 мин, прибавляют дополнительное количество сильного неорганического основания в виде водного раствора с концентрацией 1-50%, нагревают при 40-60^oС в течение 20-90 мин, нейтрализуют смесь разбавленной соляной кислотой, отделяют осадок хлорина е₆ центрифугированием, промывают его дистиллированной водой до исчезновения кислой реакции, получают 55-80% хлорина е₆, переосаждают хлорин е₆ из ацетона для отделения линейных тетрапирролов, отфильтровывают хлорин е₆ и промывают его дистиллированной водой, нагревают хлорин е₆ в герметичной емкости в интервале температур 40-100^oС в течение 1 часа - 30 суток, охлаждают и прибавляют раствор сильного основания до рН 7,5-8,5 и юстируют водой апирогенной для инъекций до содержания фотосенсибилизатора 6,5-7,5 мас.%.

Кроме того, в способе получения ФС после того, как прибавят раствор сильного основания до рН 7,5-8,5, смесь может быть подвергнута гель-фильтрации до содержания хлорина е₆ - 80-90%, пурпурина 5 - 5-20% и пурпурина 18 - остальное, далее прибавлен разбавленный раствор соляной кислоты до выпадения осадка фотосенсибилизатора, отъюстирован водой апирогенной для инъекций до содержания фотосенсибилизатора 6,5-7,5 мас. % и получен "Жидкий экстракт хлоринов".

Кроме того, в способе получения ФС, после гель-фильтрации к раствору фотосенсибилизатора может быть прибавлен разбавленный раствор соляной кислоты до выпадения осадка фотосенсибилизатора, этот осадок отфильтрован или отделен центрифугированием, прибавлены разрешенные Государственной Фармакопеей РФ добавки до рН 7,5-8,5 и вода апирогенная для инъекций до содержания фотосенсибилизатора 0,1-1 мас.% и отфильтровано от бактерий.

Кроме того, в способе получения ФС после гель-фильтрации к смеси может быть прибавлен разбавленный раствор соляной кислоты до выпадения осадка фотосенсибилизатора, этот осадок отфильтрован или отделен центрифугированием, отъюстирован водой апирогенной для инъекций до содержания фотосенсибилизатора 6,5-7,5 мас.%, диспергируют "Жидкий экстракт хлоринов" в гелевой основе из расчета: 0,5-12 мас.% "Жидкого экстракта хлоринов", 5-20 мас.% диметилсульфоксида, остальное - вода, разрешенные Государственной Фармакопеей РФ добавки и гелевая основа.

Кроме того, в способе получения ФС после гель-фильтрации к смеси может быть прибавлен разбавленный раствор соляной кислоты до выпадения осадка фотосенсибилизатора, этот осадок отфильтрован или отделен центрифугированием, отъюстирован водой апирогенной для инъекций до содержания фотосенсибилизатора 6,5-7,5 мас.%, и полученный "Жидкий экстракт хлоринов" растворен в диметилсульфоксиде из расчета: 0,5-12 мас.% "Жидкого экстракта хлоринов" и остальное - диметилсульфоксид.

Указанный способ реализуется с помощью стандартного лабораторного химического пилотного оборудования: обрабатывают биомассу в бидонах алюминиевых емкостью 10-50 л, оснащенных механической мешалкой, отфильтровывают биомассу на нутч-фильтрах емкостью 5-20 л с вакуумным масляным насосом и охлаждаемой жидким азотом ловушкой, центрифугируют биомассу с использованием напольной центрифуги со стаканами 4х1 л с охлаждением и скоростью вращения до 6000 об/мин, обрабатывают экстракт кислотой в стеклянных бутылях емкостью 20 л, отфильтровывают выпавший феофитин а на нутч-фильтрах емкостью 5-10 л с вакуумным масляным насосом и охлаждаемой жидким азотом ловушкой, гидролизуют феофитин а в трехгорлых круглодонных колбах емкостью 0,1-0,5 л, оснащенных обогревом, механическим перемешиванием, обратным холодильником и загрузочным отверстием с пробкой, промывают растворы с использованием делительных воронок емкостью 2 л, нейтрализуют в стаканах химических емкостью 2-5 л, отфильтровывают феофорбид а на нутч-фильтрах емкостью 2-5 л с вакуумным масляным насосом и охлаждаемой жидким азотом ловушкой, переосаждают в колбах плоскодонных химических емкостью 0,25-1 л, растворяют феофорбид а в ацетоне и прибавляют сильное неорганическое основание в в трехгорлых круглодонных колбах емкостью 0,5-2 л, оснащенных обогревом, механическим перемешиванием, обратным холодильником и загрузочным отверстием с пробкой, отделяют осадок хлорина е₆ центрифугированием с использованием напольной центрифуги со стаканами 4х0,5 л с охлаждением и скоростью вращения до 6000 об/мин, переосаждают хлорин е₆ с использованием колб плоскодонных химических емкостью 0,25-0,5 л 2-5 л, отфильтровывают хлорин е₆ а на нутч-фильтрах емкостью 1-2 л с вакуумным масляным насосом и охлаждаемой жидким азотом ловушкой, нагревают хлорин е₆ в круглодонных химических колбах из термостойкого стекла емкостью 0,05-0,1 л, прибавляют раствор сильного основания и юстируют в химических стаканах емкостью 0,1-1 л с использованием стандартного рН-метра и спектрофотометра, смесь подвергают гель-фильтрации на колонке диаметром 50-100 мм и высотой 100-150 мм, отфильтровывают от бактерий с использованием стандартных микропористых фильтров типа Millipore с диаметром пор 0,22 мкм, диспергируют "Жидкий экстракт хлоринов" в гелевой основе с использованием ножевого или шарикового гомогенизатора, кроме того, для приготовления навесок, растворов и образцов используют конические колбы с пробками емкостью от 0,01 до 10 л, цилиндры емкостью от 0,005 до 2 л, стаканы емкостью от 0,05 до 2 л, бутыли емкостью 20 л, весы с диапазоном взвешивания 1-1000 г, магнитные мешалки; для регенерации ацетона и гексана - круглодонные колбы емкостью 5 л с термометром и прямоточным водяным холодильником; для быстрого удаления растворителей при пониженной температуре - ротационный вакуумный испаритель.

В способе получения ФС концентрированной соляной кислотой считают насыщенный раствор хлороводорода в воде при температуре 20^oС, который обыкновенно содержит 36-37 мас.% хлороводорода.

При превращении феофитина а в феофорбид а диапазон количеств гексана и ацетона (6-16 мл ацетона и 0,6-6 мл гексана) связан с тем, что при меньшем количестве растворителей феофитин а растворяется не полностью, а при большем - получают раствор, недостаточно концентрированный для быстрого протекания гидролиза. Диапазон количеств соляной кислоты (5-10 мл) связан с тем, что при меньшем количестве соляной кислоты уменьшается выход феофорбида а, а при большем - селективность реакции, так как образуется много побочного продукта - пирофеофорбида а. Диапазон значений температуры 40-60^oС связан с тем, что при более низкой температуре уменьшается выход феофорбида а, а при более высокой - снижается селективность реакции вследствие образования побочного продукта - пирофеофорбида а. Диапазон значений времени реакции - 20 мин - 1 час - связан с тем, что при меньшем времени уменьшается выход феофорбида а, а при более высокой - снижается селективность реакции вследствие образования побочного продукта - пирофеофорбида а. Количество прибавляемого далее гексана - 6-16 мл - связано с тем, что при меньшем его количестве от реакционной массы неэффективно отделяется один из продуктов реакции - фитол, использование же большего количества гексана нецелесообразно.

При очистке феофорбида а промывают органическую фазу смесью ацетона и концентрированной соляной кислоты, взятых в соотношении от 2:1 до 10:1. При соотношении менее 2:1 из смеси выделяется хлопьевидный осадок примесей, который плохо отделяется от водной фазы, содержащей целевой феофорбид а. При соотношении более 10:1 водная фаза пересыщается ацетоном, и в нее переходят примеси из гексановой фазы, загрязняя целевой феофорбид а.

При превращении феофорбида а в хлорин е₆, концентрацию сильного основания задают в интервале 0,05-1,00%, причем нижняя его граница - минимум, необходимый для протекания реакции раскрытия циклопентанонового кольца (кольца Е) феофорбида а, a при концентрации щелочи больше 1% протекает реакция алломеризации (окисления) кольца Е, что ведет вместо целевого хлорина е₆ к "нестабильному хлорину", а затем - к пурпурину 18 и далее - к хлорину р₆.

Далее в способе прибавляют дополнительное количество сильного неорганического основания в виде водного раствора с концентрацией 1-50%. При концентрации щелочи менее 1% происходит неполное омыление сложноэфирного остатка в 13 и/или 15 положении. При использовании щелочи в концентрации более 50% тетрапиррольный макроцикл ФС в части случаев раскрывается.

Реакционную массу перемешивают далее при 30-60^oС в течение 5-30 мин, причем меньшая температура способствует облегчению процесса алломеризации кольца Е, а большая - разложению хлорина е₆ до хлорина е₄. Меньшее время проведения процесса недостаточно для протекания реакции раскрытия кольца Е, а большее - увеличивает выход побочного хлорина е₄. При прибавлении дополнительного количества сильного неорганического основания интервал температур - 40-60^oС, а времени реакции - 20-90 мин. При меньших значениях температуры и времени не успевает гидролизоваться метиловый эфир по положению 15², при больших - увеличивается выход побочного хлорина е₄.

При превращении хлорина е₆ в "Жидкий экстракт хлоринов" протекает процесс окисления и последующих термолитических процессов дегидратации и декарбоксилирования ФС с окисленной метиленовой группой в положении 15¹ в пурпурин 5: При превращении хлорина е₆ в "Жидкий экстракт хлоринов" использование температуры ниже 40^oС требует продолжительного времени проведения процесса, что технологически неоправданно. Использование температуры выше 100^oС приводит к ускоренному разложению субстанции.

Проведение процесса менее чем за 1 час требует использования температур выше 100^oС, либо приводит к субстанции, имеющей низкую биологическую активность.

Проведение процесса более чем за 30 суток сопровождается необратимым изменением (разложением) субстанции.

Оптимальной температурой проведения процесса является 45-70^oС (фиг. 1).

Оптимальным временем проведения процесса являются 2-9 суток при 70^oС (фиг. 2) или 1-48 часов при 100^oС (фиг. 3), приводящие к 5-20% пурпурина 5 в смеси.

Субстанция, содержащая 5-20% пурпурина 5 и 80-95% хлорина е₆ в составе действующего начала (ФС), пригодна для получения водорастворимых инъекционных лекарственных форм. Если субстанция содержит менее 5% пурпурина 5, она имеет низкую биологическую активность. Если субстанция содержит более 20% пурпурина 5, ее растворимость в воде ухудшается, что неблагоприятно сказывается на стабильности лекарственных форм при хранении и ухудшает способность к фильтрации через микропористые фильтры. Последнее свойство необходимо для стерилизации лекарственных форм, так как лекарственные формы тетрапирролов нельзя стерилизовать нагреванием или УФ-лучами ввиду высокой вероятности протекания химических реакций.

Присутствие в субстанции 80-95% хлорина е₆ необходимо для поддержания пурпурина 5 в водорастворимом состоянии.

Используемый диапазон значений рН обусловлен тем, что его нижняя граница - рН 7,5 - является нижним пределом растворимости хлоринов в водных растворах с получением концентраций, пригодных для использования в фармацевтике, без добавления солюбилизаторов. Верхняя граница этого диапазона - рН 8,5 - является пределом биологической переносимости концентраций гидроксид-ионов, [ОН^-].

Интервал концентраций хлорина е₆ 6,5-7,5% обусловлен использованием технологических приемов центрифугирования или фильтрации на стадии отделения осадка хлорина е₆, дающих продукт в этом диапазоне концентраций.

Изобретение поясняется чертежами, на которых фиг. 1 относится к способу и показывает образование пурпурина 5 в зависимости от температуры при выдерживании в течение 30 сут; фиг. 2 отражает зависимость содержания пурпурина 5 от времени выдерживания при температуре 70^oС; фиг. 3 отражает зависимость содержания пурпурина 5 от времени выдерживания при температуре 100^oС; фиг. 4 иллюстрирует фармакокинетику субстанции "Жидкого экстракта хлоринов", использованной в виде лекарственной формы "Радахлорин, 0,5%-ный раствор для инъекций" ("Фотохлорин") у опухолевых мышей при внутривенном введении в дозе 20 мг/кг; фиг. 5а показывает наличие метаболита хлорина е₆ (формула I), а именно пурпурина 5 (формула II) в крови, причем кривые, обозначенные как "1", сняты для ФС в 0,01 М боратном буфере с рН 9,18, а кривые, обозначенные как "2", сняты для ФС в крови; фиг. 5б подтверждает метаболизм хлорина е₆ (формула I) в пурпурин 5 (формула II) в печени; на фиг. 6 изображен ПМР-спектр субстанции "Жидкий экстракт хлоринов", полученной в примере 2; на фиг. 7 представлен масс-спектр субстанции "Жидкий экстракт хлоринов", полученной в примере 2; фиг. 8 дает спектр поглощения в видимой области субстанции "Жидкий экстракт хлоринов", полученной в примере 2, спектр снят в этаноле для 5 мкг/мл субстанции; на фиг. 9 представлен ПМР-спектр хлорина е₆; фиг. 10 содержит масс-спектр хлорина е₆; фиг. 11 показывает спектр поглощения в видимой области хлорина е₆, спектр снят в этаноле, конц. хлорина е₆, 15 мкг/мл (полоса Соре - 5 мкг/мл); на фиг. 12 приводится ПМР-спектр пурпурина 5; на фиг. 13 дается масс-спектр пурпурина 5; фиг. 14 содержит спектр поглощения в видимой области пурпурина 5; спектр снят в этаноле, конц. пурпурина 5-15 мкг/мл (полоса Соре - 5 мкг/мл): фиг. 15 дает ПМР-спектр диметилового эфира пурпурина 5; на фиг. 16 представлен масс-спектр диметилового эфира пурпурина 5; на фиг. 17 дан спектр поглощения в видимой области диметилового эфира пурпурина 5, спектр снят в этаноле, конц. ДМЭ пурпурина 5-15 мкг/мл (полоса Соре - 5 мкг/мл).

ФС иллюстрируется примером 1, примеры реализации способа даны в примерах 2, 3, частные случаи реализации способа проиллюстрированы в примерах 4-9.

ФС с точки зрения химии содержит три циклических тетрапиррола хлориновой природы (с гидрированным кольцом D) - хлорин е₆ (формула I), пурпурин 5 (формула II, пример 10) и пурпурин 18, который в щелочной среде (при хранении) постепенно превращается в хлорин р₆ (формула III).

ФС с точки зрения физической химии обладает способностью поглощать свет в видимой области, результатом чего является его фотоактивация и последующая релаксация возбужденного состояния с переносом энергии на растворенный в тканях молекулярный кислород и органические субстраты. Последнее приводит к окислительным и свободно-радикальным процессам в биологических тканях и их повреждению и последующему разрушению (некрозу). Наиболее предпочтительной для ФДТ полосой возбуждения является длинноволновая полоса (табл. 1), т.к. с ростом длины волны растет проникающая способность света в биологические ткани. Таким образом, ФС способен разрушать биологические объекты после возбуждения светом с длиной волны 654-670 нм на глубину до 10 мм.

ФС с точки зрения фармацевтики является субстанцией "Жидкого экстракта хлоринов" (жидкими принято считать экстракты с содержанием действующего вещества менее 20%). Экстрактом данная субстанция является в связи с необходимостью ее извлечения из биомассы с использованием органических растворителей.

Соединение формулы II обладает способностью селективно накапливаться в злокачественных новообразованиях и инфицированных очагах, но плохо растворяется в воде, а соединение формулы I, наряду с выраженной фотодинамической активностью, является солюбилизирующим средством для соединения формулы II.

С точки зрения фармакологии (фиг. 4, пример 11), однозначность фармакокинетических показателей достигается тем, что ФС формулы (I) в организме медленно превращается в ФС формулы (II), что поддерживает концентрацию последнего на постоянном уровне с момента введения в организм до момента выведения из опухоли, в течение промежутка времени, достаточного для эффективного проведения ФДТ. После введения в организм мышей-опухоленосителей предлагаемой композиции ФС, она попадает в кровоток и за счет циркуляции в крови прежде всего соединения формулы (I) в первые 3 часа после введения в районе опухоли достигается высокая и стабильная концентрация ФС - 0,27-0,32 M, достаточная для эффективного проведения ФДТ в интервале 0,5-4 часа. Высокая контрастность в этот промежуток времени достигается за счет наличия в составе композиции 5-20% соединения формулы (II), которое обладает свойством с высокой контрастностью накапливаться в опухоли, причем максимум накопления приходится на 3 часа после введения ФС в организм животных (индекс контрастности составляет 14,5 по коже и 2,9 по мышцам). За это время соединение формулы (I) превращается в организме в соединение формулы (II), обеспечивая высокую стабильную концентрацию ФС в районе опухоли в интервале 3-5 часов после инъекции, которая постепенно снижается, оставаясь терапевтически достаточной вплоть до 18 часов после инъекции. Соединение формулы (II) далее распадается в организме до нетоксичных продуктов, которые выводятся через печень.

Превращение хлорина е₆ формулы (I) в пурпурин 5 формулы (II) подтверждается спектрами флюоресценции образцов органов и тканей экспериментальных животных (фиг. 5). При добавлении лекарственной формы "Радахлорин, 0,5%-ный раствор для инъекций" ("Фотохлорин") к гомогенату крови [фиг. 5а, (1)] в концентрации 10 M с последующим спектрофотометрическим исследованием наблюдается изменение спектра флюоресценции в виде уширения в 1,2 раза и сдвиг максимума интенсивности флюоресценции в длинноволновую часть спектра на 8 нм. При добавлении "Фотохлорина" в меньшей концентрации (С=1 M) отмечен только сдвиг спектра без уширения, что демонстрирует эффект дозы при образовании метаболита [фиг. 5а, (2)].

Фиг. 5а, (3) демонстрирует результат исследования гомогената крови, полученного через 3 часа после введения "Фотохлорина" мышам. Здесь наиболее выражен показатель уширения спектра в 1,5 раза при максимальном сдвиге полосы в длинноволновую часть спектра на 4 нм, из чего следует, что в исследуемом образце крови присутствует смесь "Фотохлорина" и метаболита.

При добавлении "Фотохлорина" в пробирку с гомогенатом печени [фиг. 5б, (1)] в концентрации 10 M изменение спектральных характеристик выражено прежде всего в сдвиге максимума интенсивности флюоресценции в длинноволновую часть спектра на 9 нм. Уширение спектра отсутствует.

Аналогичная картина наблюдается при добавлении "Фотохлорина" в меньшей концентрации С=1 M [фиг. 5б, (2)].

При изучении гомогената ткани печени, полученного через 3 часа после введения препарата животным, спектрофотометрическая картина исследуемого образца аналогична двум предыдущим [фиг. 5б, (3)].

Таким образом, полученные данные демонстрируют наличие метаболита "Фотохлорина" в гомогенатах печени.

Оптимальное по селективности для фотодинамического действия накопление пурпурина 5 в опухолях экспериментальных животных наблюдают в интервале 3-18 часов после внутривенного или внутрибрюшинного введения. В случаях, когда необходимо также задействовать субстанцию хлоринов, циркулирующую в кровотоке, оптимальным временем облучения является 0,5-4 часа после внутривенного введения. В общем случае, для проведения ФДТ с субстанцией "Жидкого экстракта хлоринов" интервал между введением препарата и облучением составляет 0,5-18 часов.

Биологическую активность лекарственной формы "Радахлорин, 0,5%-ный раствор для инъекций" ("Фотохлорин"), содержащей 0,5% безводной субстанции "Жидкого экстракта хлоринов", оценивают in vitro и in vivo.

Сбалансированность ФС по амфифильности подтверждают стандартным экспериментом in vitro [8] (табл. 2, пример 12). Коэффициент распределения ФС в 1-октаноле/фосфатном буфере, рН 7,4 (К_р), равен 1,40. Это означает, что заявляемый ФС одинаково хорошо растворим как в водной, так и в липидной фазе и доказывает липофильность ФС, которая позволяет этому соединению перераспределяться из воды в комплексы с транспортными белками и липопротеинами, быстро проникать в клетки и накапливаться в цитоплазматических внутриклеточных мембранах и микросомах, либо проникать в клетки путем диффузии через плазматическую мембрану этих клеток. После лазерного облучения таким образом депонированное соединение выделяет синглетный кислород внутри клетки, убивая ее.

Противоопухолевую активность заявляемого ФС в отношении различных типов раковых клеток подтверждают результатами, полученными в эксперименте in vitro, в котором использовали 3 линии культивируемых опухолевых клеток: феохромоцитомы крысы PC 12, невриномы Гассерова узла крысы НГУК1 и крысиной гепатомы 27 (Нер27) (табл. 2, пример 13).

Для исследования дозовозависимой цитофототоксической (после облучения лазером) и биологической "темновой" активности ФС используют следующие методы: 1. МТТ-тест, который позволяет точно определить число живых клеток после их обработки ФС и облучения лазером для расчета цитотоксического и цитофототоксического индексов ФС. Этот же тест позволяет оценить дозовозависимую цитотоксическую и биологическую "темновую" активность ФС [9].

2. Определение числа клеток после окрашивания клеточного монослоя кристалл-виолетом в конце эксперимента. Этот метод менее трудоемкий и дорогой, чем МТТ-тест, также позволяет рассчитать цитотоксический и цитофототоксический индексы ФС [10], но он менее точный, т.к. кристалл-виолет окрашивает и мертвые клетки.

3. Сравнительное генотоксическое и генофототоксическое действие ФС оценивают по степени ингибирования синтеза ДНК в клетках. Величину синтеза ДНК определяют по уровню включения в ДНК ¹⁴С-тимидина, используя стандартные радиометрические методы [11].

Все три исследованные линии клеток высокочувствительны к действию лазерного облучения после их обработки ФС (данные МТТ-теста). По степени чувствительности к облучению лазером клеточные линии располагаются следующим образом: НГУК1>РС12>Нер27.

При длительном действии ФС в концентрации 5 на клетки в темноте выживало 96,5-86,2% PC-12, 103,7-93,0% НГУК1 и 109,7-87,9% Нер27 (МТТ-тест - кристалл-виолет, соответственно). В этих же условиях синтез ДНК практически не изменялся у клеток PC-12 и был снижен в клетках Нер27 и НГУК1 на 21,2 и 22,2% соответственно. Наблюдаемое увеличение числа клеток НГУК1 и Нер27 при действии 5 M ФС на клетки в темноте связано скорее всего с индукцией ФС пролиферативной активности клеток. В целом для ФС в отсутствие облучения более характерно проявление цитотоксической активности, чем индукция пролиферативной.

После лазерного облучения клеток, обработанных ФС, наблюдается их гибель. Обнаружено дозовозависимое цитофототоксическое действие препарата, что позволяет рассчитать ЕС₅₀, т.е. определить концентрацию ФС, при которой погибает 50% клеток. Эти данные приведены в таблице 2. Следует отметить, что ФС, у которых ЕС₅₀ меньше 20 M, считают эффективными для подавления опухолевого роста.

При определении генофототоксичности после обработки клеток 5 M ФС и облучения лазером получают резкое снижение синтеза ДНК (на 96,5% по сравнению с только облученным контролем) у клеток PC-12. У клеток Нер27 и НГУК1 при низких концентрациях ФС после облучения лазером наблюдают стимуляцию синтеза ДНК, который значительно снижается в присутствии 5 M BX. Наблюдаемое увеличение синтеза ДНК можно объяснить высокой способностью синтезировать ДНК и восстанавливать свою популяцию выживших при низких концентрациях ФС трансформированных клеток печени и глии.

Таким образом, ФС является высокоцитофототоксичным препаратом для разных типов опухолевых клеток. В высоких концентрациях (>5 M) он является умеренным ингибитором опухолевого роста и без облучения. Высокая генофототоксичность ФС позволяет считать его сильным ингибитором опухолевого роста при облучении.

В экспериментах in vivo изучают токсические свойства ФС (пример 14). LD₅₀ составляет в среднем, с учетом весового коэффициента, 210,5322,2 мг/кг, а доза, вызывающая гибель 10% испытуемых животных (LD₅₀), составляет 169,87 мг/кг. Проведенные исследования позволяют классифицировать ФС как "Малотоксичное вещество".

В экспериментах in vivo изучают биораспределение ФС (пример 11). При введении ФС внутрибрюшинно мышам с эмбриокарциномой Т36, перевитой в мышцу задней ноги, наблюдаются следующие закономерности в распределении соединений. После введения ФС попадает в кровь, а затем перераспределяется в органы и ткани животных (табл. 3).

Как видно из табл. 3, максимум накопления в опухоли (0,70 M) достигается через 5 часов после внутрибрюшинного введения в дозе 40 мг/кг и длительно сохраняется (18-24 часа). Опухолевая концентрация через 18 ч после введения составляет 0,48 M, что в 1,5 раза меньше, чем в абсолютном максимуме накопления, при высокой селективности накопления. Отношение опухоль/мышечная ткань составляет 32, а опухоль/кожа - 44.

После внутривенного введения в дозе 20 мг/кг достигнут максимум накопления в опухоли через 0,5 часа (0,32 M), который также длительно сохраняется (до 5 часов). Максимальная контрастность накопления при внутривенном введении проявляется через 3 часа и составляет для опухоли/мышечной ткани 3, а опухоли/кожи - 4. ФС выводится из организма через сутки на 98%.

Результаты оценки эффективности действия препарата при ФДТ рака в экспериментах in vivo на мышах (пример 15) поз