Реконструированное человеческое анти-нм1.24 антитело, днк, кодирующая н и l цепи человеческого анти-нм1.24 антитела, вектор, способ получения реконструированного человеческого анти-нм1.24 антитела, фармацевтическая композиция для лечения миеломы

Реконструированное человеческое анти-нм1.24 антитело, днк, кодирующая н и l цепи человеческого анти-нм1.24 антитела, вектор, способ получения реконструированного человеческого анти-нм1.24 антитела, фармацевтическая композиция для лечения миеломы

Реферат

 

Изобретение относится к области молекулярной биотехнологии. Представлено реконструированное человеческое анти-НМ 1.24 антитело, в котором С-участок Н и L-цепи и V-участок Н и L-цепи включают FR человека, a CDR получают из анти-НМ 1.24 моноклонального антитела. При этом CDR обладает низкой антигенностью. Получают реконструированное человеческое анти-НМ 1.24 антитело путем трансформации клетки-хозяина экспрессирующим вектором, который содержит ДНК, кодирующую антитело. Человеческое анти-НМ 1.24 антитело используется в качестве активного компонента для лечения миеломы. 12 с. и 5 з.п.ф-лы, 40 ил., 6 табл.

Область изобретения Изобретение относится к реконструированным человеческим анти-НМ 1.24 антителам и химерным анти-НМ 1.24 антителам, к кодирующим их генам, к способам получения указанных антител и к использованию указанных антител. Реконструированные человеческие антитела и химерные антитела по настоящему изобретению применимы в качестве терапевтических агентов, например для лечения миеломы.

Предпосылки изобретения Человеческие В-клетки проходят через различные процессы, которые классифицируются на основании типа экспрессируемых поверхностных антигенов, и в итоге созревают в продуцирующие антитела плазмоциты. На этой конечной стадии своей дифференцировки В-клетки, с одной стороны, приобретают способность продуцировать цитоплазматические иммуноглобулины, и, с другой стороны, исчезают связанные с В-клетками антигены, такие как иммуноглобулины клеточной поверхности, HLA-DR, CD20, Fc-рецепторы, С3-рецепторы системы комплемента и т. п. (Ling, N.R. et al., Leucocyte Typing III (1986), p. 320, Oxford, UK, Oxford).

К настоящему времени имеются сообщения о таких моноклональных антителах, как анти-РСА-1 (Anderson, К.С. et al., J. Immunol. (1983) 130, 1132), анти-РС-1 (Anderson, К. С. et al., J. Immunol. (1983) 132, 3172), анти-ММ4 (Tong, A.W. et al., Blood (1987) 69 238) и т.п., которые распознают антигены на клеточной мембране плазмоцитов. Однако анти-СD38 моноклональное антитело все еще используют для определения плазмоцитов и миеломных клеток (Epstein, J. et al. , N. Engl. J. Med. (1990) 322, 664, Terstappen, L.W.M.M. et al., Blood (1990) 76, 1739, Leo, R. et al., Ann. Hematol. (1992) 64, 132, Shimazaki, С. et al. , Am. J. Hematol. (1992) 39, 159, Hata, H. et al., Blood (1993) 81, 3357, Harada, H. et al., Blood (1993) 81, 2658, Billadeau, D. et al., J. Exp. Med. (1993) 178, 1023).

Однако анти-СD38 моноклональное антитело является антигеном, связанным скорее с активацией Т-клеток, нежели антигеном, связанным с дифференцировкой В-клеток, и экспрессируется на различных клетках помимо В-клеток. Кроме того, хотя CD38 не экспрессируется на некоторых лимфоплазмацитоидах, он сильно экспрессируется на клетках-предшественниках гемопоэза. По этой причине считают, что анти-СD38 моноклональное антитело не пригодно для исследования дифференцировки и созревания человеческих В-клеток или для лечения заболеваний, связанных с плазмоцитами.

Goto, Т. et al. сообщали о мышином анти-НМ 1.24 моноклональном антителе, которое распознает антиген с молекулярной массой от 29 до 33 кДа, который специфически экспрессируется на линиях В-клеток (Blood (1994) 84, 1922-1930). На основании того факта, что антиген, распознаваемый анти-НМ 1.24 моноклональным антителом, считается связанным с окончательной дифференцировкой В-клеток (Goto, Т. et al., Jpn. Clin. Immun. (1992) 16, 688-691), и что введение анти-НМ 1.24 моноклонального антитела мышам с трансплантированной плазмацитомой приводит к специфическому накоплению этого антитела в опухоли (Shuji Ozaki et al., The Program of General Assembly of the 19^th Japan Myeloma Study Meeting, general presentation 3), было высказано предположение, что меченое радиоизотопом анти-НМ 1.24 моноклональное антитело, можно использовать для диагностики локализации опухоли, для направленной терапии, такой, как радиоиммунотерапия и т.п.

Кроме того, в указанной выше статье, опубликованной в Blood, описано, что анти-НМ 1.24 моноклональное антитело обладает комплементзависимой цитотоксической активностью по отношению к миеломной клеточной линии человека RPMI8226.

Миелома представляет собой неопластическое заболевание, характеризующееся накоплением моноклональных плазмацитов (миеломных клеток) в костном мозге. Миелома является заболеванием, при котором окончательно дифференцированные В-клетки, которые продуцируют и секретируют иммуноглобулины, или плазмоциты, моноклонально пролиферируют, главным образом, в костном мозге, и соответственно, моноклональные иммуноглобулины или составляющие их компоненты, L-цепи или Н-цепи, определяются в сыворотке (Masaaki Kosaka et al., Nippon Rinsho (1995) 53, 91-99).

Обычно для лечения миеломы использовали химеотерапевтические средства, но не было найдено эффективных терапевтических средств, которые могли бы привести к ремиссии у больных миеломой и к продлению срока жизни больных миеломой. Поэтому давно существует необходимость в создании лекарств, которые оказывали бы терапевтическое воздействие на миелому.

Мышиные моноклональные антитела обладают высокой иммуногенностью (иногда называемой "антигенностью") у людей. Соответственно, медицинская терапевтическая ценность мышиных моноклональных антител для применения у людей ограничена. Так, например, мышиное антитело, введенное человеку, может метаболизироваться как чужеродное вещество, так что срок полураспада мышиного антитела в организме человека относительно мал, и поэтому оно не может полностью продемонстрировать ожидаемый эффект. Кроме того, человеческие антимышиные антитела, которые вырабатываются против введенного мышиного антитела, могут запустить иммунологические реакции, которые неблагоприятны и опасны для пациентов, такие как заболевания сыворотки, другие аллергические реакции или т.п. Поэтому мышиное моноклональное антитело нельзя часто вводить людям.

Для решения этих проблем был разработан способ снижения иммуногенности антител, полученных не от человека, таких как полученные из мышей моноклональные антитела. Одним из таких примеров является способ получения химерного антитела, в котором вариабельный участок (V-участок) антитела получен из исходной мыши, а его константный участок (С-участок) получен из подходящего человеческого антитела.

Так как полученное таким образом химерное антитело содержит вариабельный участок исходного мышиного антитела в интактной форме, ожидается, что оно будет связываться с антигеном со специфичностью, идентичной специфичности исходного мышиного антитела. Кроме того, в химерном антителе количество аминокислотных последовательностей, полученных из организма, отличного от человеческого, существенно снижено, и поэтому ожидается, что такое антитело будет обладать пониженной иммуногенностью по сравнению с исходным мышиным антителом. Химерное антитело может связываться с антигеном таким же образом, как и исходное мышиное моноклональное антитело, и может включать иммунологические реакции против вариабельного участка мышиного антитела, несмотря на то, что его иммуногенность понижена (LoBuglio A.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4220-4224, 1989).

Второй способ снижения иммуногенности мышиного антитела, хотя и гораздо более сложный, позволяет еще более снизить потенциальную иммуногенность мышиного антитела. В этом способе лишь участок, определяющий комплементарность (CDR) вариабельного участка мышиного антитела трансплантируют в вариабельный участок человеческого антитела, получая вариабельный участок "реконструированного" человеческого антитела.

Однако для того чтобы сделать структуру вариабельного участка реконструированного человеческого антитела как можно более близкой к структуре исходного мышиного антитела, необходимо, чтобы часть аминокислотной последовательности каркасного участка (FR), который поддерживает CDR, можно было бы трансплантировать из вариабельного участка мышиного антитела в вариабельный участок человеческого антитела. Затем этот V-участок гуманизированного реконструированного человеческого антитела связывают с константным участком человеческого антитела. Часть, которая получена из отличной от человеческой аминокислотной последовательности в окончательно реконструированном гуманизированном антителе является CDR, и составляет лишь часть FR. CDR состоит из гипервариабельной аминокислотной последовательности, которая не содержит видоспецифических последовательностей. Таким образом, гуманизированное антитело, содержащее мышиный CDR, не должно быть более иммуногенным, нежели природное человеческое антитело, содержащее CDR человеческого антитела.

Относительно гуманизированного антитела см. Riechmann, L. et al., Nature, 332, 323-327, 1988; Verhoeye, M. et al., Science, 239, 1534-1536, 1988; Kettleborough, С.A. et al., Protein Engng., 4, 773-783, 1991; Meada, H. et al., Human Antibodies and Hybridoma, 2, 124-134, 1991; Groman, S.D. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4181-4185, 1991; Tempest, P.R. et al., Bio/Technology, 9, 266-271, 1991; Co, M.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2869-2873, 1991; Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992; Co, M.S. et al., J. Immunol., 148, 1149-1154, 1992; и Sato, К. et al. Cancer Res., 53, 851-856, 1993.

Queen et al. (публикация международной заявки WO 90-07861) раскрывает способ получения гуманизированного антитела из антитела против рецептора IL-2 Anti-Tac. Однако трудно полностью гуманизировать все антитела, даже следуя способу, раскрытому в WO 90-07861. Так, WO 90-07861 не раскрывает общий способ гуманизации антител, а просто описывает способ гуманизации антитела Anti-Tac, которое является одним из антител против рецептора IL-2. Кроме того, даже если полностью следовать способу WO 90-07862, оказывается затруднительным получить гуманизированное антитело, которое обладает активностью, полностью идентичной активности исходного мышиного антитела.

Вообще, аминокислотные последовательности CDR/FR отдельных антител отличаются. Соответственно, определение аминокислотного остатка, который следует заменить для создания гуманизированного антитела, и выбор аминокислотного остатка, которым следует заменить указанный аминокислотный остаток, меняются для каждого отдельного антитела. Поэтому способ получения гуманизированных антител, представленный ранее в WO 90-07861, нельзя применить для гуманизации всех антител.

Queen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1989) 86, 10029-10033 сделал то же самое открытие, что изложено в WO 90-07861. В этой ссылке указано, что только одна треть активности исходного мышиного антитела достигается для гуманизированного антитела, полученного по способу, изложенному в WO 90-07861. Другими словами это показывает, что способ WO 90-07861 сам по себе не может привести к продуцированию полностью гуманизированного антитела, которое обладало бы активностью, равной активности исходного мышиного антитела.

Со et al.. Cancer Research (1996) 56, 1118-1125 опубликовано группой вышеуказанных Queen et al. В этой ссылке указано, что гуманизированное антитело, обладающее активностью, равной активности исходного мышиного антитела, нельзя сконструировать даже способом получения гуманизированных антител, как это изложено в WO 90-07861. Этот факт не только свидетельствует, что способ WO 90-07861 сам по себе не может привести к получению полностью гуманизированного антитела, обладающего активностью, равной активности исходного мышиного антитела, но что этот способ конструирования гуманизированного антитела, как это представлено далее в WO 90-07861, нельзя применить к гуманизации всех антител.

Ohtomo et al., Molecular Immunology (1995) 32, 407-416 описывает гуманизацию мышиного ONS-M21 антитела. Из этой ссылки следует, что аминокислотный остаток, который предлагался для гуманизации анти-Тас антитела в WO 90-07861, не имеет отношения к активности, и способ в том виде, как он изложен, в WO 90-07861, не применим.

Kettleborough et al. Protein Eng. (1991) 4, 773-783 указывает, что было сконструировано несколько гуманизированных антител из мышиного антитела в результате замены аминокислотных остатков. Однако при этом требуется замещение большего числа остатков, нежели предлагается в способе гуманизации анти-Тас антитела, как указано в WO 90-07861.

В приведенных выше ссылках указано, что способ получения гуманизированных антител, как предложено далее в WO 90-07861, представляет собой методику, которая применима только к описанному там анти-Тас антителу, и что даже использование указанной методики не приведет к достижению активности, равной активности исходного мышиного антитела.

Исходные мышиные антитела, описываемые в этих ссылках, содержат аминокислотные последовательности, отличающиеся от последовательности анти-Тас антитела, описанного в WO 90-07861. Соответственно, этот способ конструирования гуманизированного антитела, который можно было применить к анти-Тас антителу, нельзя применить к другим антителам. Аналогично, так как мышиное анти-НМ 1.24 моноклональное антитело по настоящему изобретению имеет аминокислотную последовательность, отличающуюся от последовательности анти-Тас антитела, нельзя применить способ конструирования гуманизированного антитела для анти-Тас антитела. Кроме того, успешно сконструированное гуманизированное антитело по настоящему изобретению имеет аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности гуманизированного анти-Тас антитела, описанного в WO 90-07861. Этот факт также указывает на то, что один и тот же способ нельзя использовать для гуманизации антител с различными CDR-FR последовательностями.

Таким образом, даже если исходное гуманизированное мышиное антитело известно, идентичность CDR-FR последовательности гуманизированного антитела, обладающего активностью, подтверждается только методом проб и ошибок. В WO 90-07861 не упоминается о FR последовательности, которая объединена в гуманизированном антителе, сконструированном в настоящем изобретении, а также о том факте, что активное гуманизированное антитело можно получить из комбинации с FR, гораздо меньшей последовательности CDR.

Как было указано выше, гуманизированные антитела, как ожидают, должны быть полезны для терапевтических целей, но гуманизированные анти-НМ 1.24 моноклональные антитела не известны и даже не предложены. Кроме того, не существует доступного стандартного способа, который можно было бы применить к любому из антител для получения гуманизированного антитела, и необходимы различные ухищрения для конструирования и гуманизации антитела, которое демонстрировало бы достаточную активность связывания, активность ингибирования связывания и нейтрализующую активность (например, Sato, К. et al., Cancer Res., 53, 851-856, 1993).

Описание изобретения В настоящем изобретении предложены реконструированные антитела анти-НМ 1.24 антитела. Далее в настоящем изобретении предложены человеческие/мышиные химерные антитела, которые можно использовать в процессе конструирования указанных реконструированных антител. В настоящем изобретении предложены фрагменты реконструированных антител. Далее в настоящем изобретении предложена экспрессионная система для получения химерных антител, реконструированных антител и их фрагментов. В настоящем изобретении предложены способы получения химерных антител из анти-НМ 1.24 антитела и его фрагментов, а также способы получения реконструированных антител из анти-НМ 1.24 антитела и его фрагментов.

Более конкретно, в настоящем изобретении предложены химерные антитела и реконструированные антитела, которые специфически распознают полипептид с аминокислотной последовательностью, представленной далее в Последовательности ИД 103 кДНК, которая кодирует указанный полипептид, была встроена между XbaI сайтами расщепления вектора pUC19, и таким образом, была получена как плазмида pRS38-pUC19. Escherichia coli, которая содержит эту плазмиду pRS38-pUC19, была интернационально депонирована 5 октября 1993 года National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba city, Ibalaki prefecture, Japan) как Escherichia coli DH5 (pRS38-pUC19) под регистрационным номером FERM BP-4434 в соответствии с Будапештским соглашением (см. японскую патентную публикацию без экспертизы (Kokai) 7-196694).

В качестве одного из осуществлений таких химерных антител или реконструированных антител, упоминается химерное анти-НМ 1.24 антитело или реконструированное человеческое анти-НМ 1.24 антитело. Подробное описание химерного анти-НМ 1.24 антитела или реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела будет приведено далее.

Так, в настоящем изобретении предложены также химерные L-цепи, включающие константный участок (С-участок) человеческой легкой (L-) цепи и вариабельный (V-) участок L-цепи анти-НМ 1.24 антитела, и химерную Н-цепь, включающую константный участок человеческой тяжелой (Н-) цепи и V-участок тяжелой (Н-) цепи анти-НМ 1.24 антитела.

Далее в настоящем изобретении предложены химерные антитела, включающие: (1) L-цепь, включающую С-участок человеческой L-цепи и V-участок L-цепи анти-НМ 1.24 антитела; и (2) Н-цепь, включающую С-участок человеческой Н-цепи и V-участок Н-цепи анти-НМ 1.24 антитела.

Далее в настоящем изобретении предложен V-участок реконструированной человеческой L-цепи анти-НМ 1.24 антитела, включающий: (1) каркасный участок (FR) V-участка человеческой L-цепи, и (2) CDR V-участка L-цепи анти-НМ 1.24 антитела; и V-участок реконструированной человеческой Н-цепи анти-НМ 1.24 антитела, включающий: (1) FR V-участка человеческой Н-цепи, и (2) CDR V-участка Н-цепи анти-НМ 1.24 антитела.

Далее в настоящем изобретении предложена реконструированная человеческая L-цепь анти-НМ 1.24 антитела, включающая: (1) С-участок человеческой L-цепи, и (2) V-участок L-цепи, включающий FR человеческой L-цепи, и CDR L-цепи анти-НМ 1.24 антитела; и реконструированная человеческая Н-цепь анти-НМ 1.24 антитела, включающая: (1) С-участок человеческой Н-цепи, и (2) V-участок Н-цепи, включающий FR человеческой Н-цепи, и CDR Н-цепи анти-НМ 1.24 антитела.

Далее в настоящем изобретении предложено реконструированное человеческое антитело анти-НМ 1.24 антитела, включающее: (A) L-цепь, включающую: (1) С-участок человеческой L-цепи; и (2) V-участок L-цепи, включающий FR человеческой L-цепи и CDR L-цепи анти-НМ 1.24 антитела; и (B) Н-цепь, включающую: (1) С-участок человеческой Н-цепи, и (2) V-участок Н-цепи, включающий FR человеческой Н-цепи и CDR Н-цепи анти-НМ 1.24 антитела.

Настоящее изобретение предлагает далее ДНК, кодирующую V-участок L-цепи анти-НМ 1.24 антитела, и ДНК, кодирующую V-участок H-цепи анти-HM 1.24 антитела.

Далее настоящее изобретение предлагает ДНК, кодирующую химерную L-цепь, включающую: (1) С-участок человеческой L-цепи; и (2) V-участок L-цепи анти-НМ 1.24 антитела, и ДНК, кодирующую химерную Н-цепь, включающую: (1) С-участок человеческой Н-цепи; и (2) V-участок Н-цепи анти-НМ 1.24 антитела.

Настоящее изобретение предлагает далее ДНК, кодирующую V-участок реконструированной человеческой L-цепи анти-НМ 1.24 антитела, включающий: (1) FR V-участка человеческой L-цепи; и (2) CDR V-участка L-цепи анти-НМ 1.24 антитела; и ДНК, кодирующую V-участок реконструированной человеческой Н-цепи анти-НМ 1.24 антитела, включающий: (1) FR V-участка человеческой Н-цепи; и (2) CDR V-участка Н-цепи анти-НМ 1.24 антитела.

В настоящем изобретении предложена ДНК, кодирующая реконструированную человеческую L-цепь анти-НМ 1.24 антитела, включающую: (1) С-участок человеческой L-цепи; и (2) V-участок L-цепи, включающий FR человеческой L-цепи и CDR L-цепи анти-НМ 1.24 антитела; и ДНК, кодирующая реконструированную человеческую Н-цепь анти-НМ 1.24 антитела, включающую: (1) С-участок человеческой Н-цепи; и (2) V-участок Н-цепи, включающий FR человеческой Н-цепи и CDR Н-цепи анти-НМ 1.24 антитела.

Далее в настоящем изобретении предложен вектор, включающий любую из указанных выше ДНК.

В настоящем изобретении предложена клетка-хозяин, трансформированная вышеуказанным вектором.

В настоящем изобретении предложены способы получения химерного антитела анти-НМ 1.24 антитела, включающие стадии культивирования клетки-хозяина, которая была котрансформирована экспрессирующим вектором, включающим ДНК, кодирующую указанную химерную L-цепь, и с вектором экспрессии, включающим ДНК, кодирующую указанную Н-цепь, и выделения желаемого антитела.

Далее в настоящем изобретении предложены способы получения реконструированного человеческого антитела анти-НМ 1.24 антитела, включающие стадии культивирования клетки-хозяина, которая была котрансформирована экспрессирующим вектором, включающим ДНК, кодирующую указанную реконструированную человеческую L-цепь, и с вектором экспрессии, включающим ДНК, кодирующую указанную реконструированную человеческую Н-цепь, и выделения желаемого антитела.

Далее в настоящем изобретении предложены фармацевтические композиции, особенно терапевтические агенты для лечения миеломы, включающие указанное химерное антитело или реконструированное человеческое антитело.

Далее в настоящем изобретении предложены фармацевтические композиции, которые содержат в качестве активного ингредиента химерное антитело, специфически распознающее полипептид с аминокислотной последовательностью, представленной в Последовательности ИД 103, и фармацевтические композиции, которые содержат в качестве активного ингредиента реконструированное человеческое антитело, специфически распознающее полипептид с аминокислотной последовательностью, представленной в Последовательности ИД 103. В качестве фармацевтической композиции конкретно предложен терапевтический агент для лечения миеломы.

Краткое объяснение рисунков Фиг. 1 представляет график, демонстрирующий, что в FCM анализе с использованием клеточной линии миеломы человека КРММ2, интенсивность флуоресценции химерного анти-НМ 1.24 антитела сдвигается аналогично сдвигу для мышиного анти-НМ 1.24 антитела, при сравнении с контрольным антителом.

Фиг. 2 представляет график, демонстрирующий, что в клеточном ELISA с использованием WISH-клеток, химерное анти-НМ 1.24 антитело по аналогии с мышиным анти-НМ 1.24 антителом дозозависимо ингибирует связывание биотинилированного мышиного анти-НМ 1.24 антитела с WISH-клетками.

Фиг.3 представляет график, демонстрирующий, что контрольный человеческий IgG1 или мышиное анти-НМ 1.24 антитело не обладают цитотоксичностью, тогда как химерное анти-НМ 1.24 антитело демонстрирует повышенную цитотоксичность в отношении RPMI 8226 клеток при возрастании отношения Е/Т.

Фиг. 4 представляет схему способа конструирования L-цепи реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела в результате трансплантации CDR методом ПЦР.

Фиг. 5 представляет схему способа сборки олигонуклеотидов RVH1, RVH2, RVH3 и RVH4 методом ПЦР при создании Н-цепи реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела.

Фиг. 6 представляет схему способа конструирования V-участка Н-цепи человеческого/мышиного гибридного анти-НМ 1.24 антитела методом ПЦР.

Фиг. 7 представляет схему способа конструирования V-участка Н-цепи мышиного/человеческого гибридного анти-НМ 1.24 антитела методом ПЦР.

Фиг.8 представляет график, демонстрирующий, что вариант а L-цепи реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела обладает антигенсвязывающей активностью, равной активности химерного анти-НМ 1.24 антитела. -1 и -2 указывают на то, что это различные группы.

Фиг.9 представляет график, демонстрирующий антигенсвязывающую активность реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела, в котором вариант а L-цепи и вариант а, b, f или h Н-цепи были объединены, и химерного анти-НМ 1.24 антитела.

Фиг. 10 представляет график, демонстрирующий активность связывания реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела, в котором вариант b L-цепи и вариант а, b, f или h Н-цепи были объединены, и химерного анти-НМ 1.24 антитела.

Фиг. 11 представляет график, демонстрирующий активность ингибирования связывания реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела, в котором вариант а L-цепи и вариант a, b, f или h Н-цепи были объединены, и химерного анти-НМ 1.24 антитела.

Фиг. 12 представляет график, демонстрирующий активность ингибирования связывания реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела, в котором вариант b L-цепи и вариант а, b, f или h Н-цепи были объединены, и химерного анти-НМ 1.24 антитела.

Фиг. 13 представляет график, демонстрирующий активность связывания антигена вариантов а, b, с и d Н-цепи реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела, и химерного анти-НМ 1.24 антитела.

Фиг. 14 представляет график, демонстрирующий активность связывания антигена вариантов а и е Н-цепи реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела, и химерого анти-НМ 1.24 антитела. -1 и -2 указывают на то, что они относятся к разным группам.

Фиг. 15 представляет график, демонстрирующий активность ингибирования связывания вариантов а, с, р и r Н-цепи реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела, и химерного анти-НМ 1.24 антитела.

Фиг. 16 представляет график, демонстрирующий активность связывания антигена человеческого/мышиного гибридного анти-НМ 1.24 антитела, мышиного/человеческого гибридного анти-НМ 1.24 антитела и химерного анти-НМ 1.24 антитела.

Фиг. 17 представляет график, демонстрирующий активность связывания антигена вариантов а, b, с и f Н-цепи реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела и химерного анти-НМ 1.24 антитела.

Фиг. 18 представляет график, демонстрирующий активность связывания антигена вариантов a и g Н-цепи реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела и химерного анти-НМ 1.24 антитела.

Фиг. 19 представляет график, демонстрирующий активность ингибирования связывания вариантов а и g Н-цепи реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела и химерного анти-НМ 1.24 антитела.

Фиг. 20 представляет график, демонстрирующий активность связывания антигена вариантов h и i Н-цепи реконструированного Н человеческого анти-НМ 1.24 антитела и химерного анти-НМ 1.24 антитела.

Фиг. 21 представляет график, демонстрирующий активность связывания антигена вариантов f, h и j Н-цепи реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела и химерного анти-НМ 1.24 антитела.

Фиг. 22 представляет график, демонстрирующий активность ингибирования связывания вариантов h и i Н-цепи реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела и химерного анти-НМ 1.24 антитела.

Фиг. 23 представляет график, демонстрирующий активность ингибирования связывания вариантов f, h и j Н-цепи реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела и химерного анти-НМ 1.24 антитела.

Фиг. 24 представляет график, демонстрирующий активность связывания антигена вариантов h, k, l, m, n и o Н-цепи реконструированного человеческого lнти-НМ 1.24 антитела и химерного анти-НМ 1.24 антитела.

Фиг. 25 представляет график, демонстрирующий активность связывания антигена вариантов а, h, р и q Н-цепи реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела и химерного анти-НМ 1.24 антитела.

Фиг. 26 представляет график, демонстрирующий активность ингибирования связывания с WISH-клетками вариантов h, k, 1, m, n и о Н-цепи реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела и химерного анти-НМ 1.24 антитела.

Фиг. 27 представляет график, демонстрирующий активность ингибирования связывания вариантов а, h, р и q Н-цепи реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела и химерного анти-НМ 1.24 антитела.

Фиг. 28 представляет график, демонстрирующий активность связывания антигена вариантов а, с, p и r Н-цепи реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела и химерного анти-НМ 1.24 антитела.

Фиг. 29 представляет график, демонстрирующий, что вариант s реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела обладает антигенсвязывающей активностью, равной активности варианта r реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела.

Фиг. 30 представляет график, демонстрирующий, что вариант s реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела обладает активностью ингибирования связывания, равной активности варианта r реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела.

Фиг. 31 представляет график, демонстрирующий, что очищенное реконструированное человеческое анти-НМ 1.24 антитело обладает активностью связывания антигена, равной активности химерного анти-НМ 1.24 антитела.

Фиг. 32 представляет график, демонстрирующий, что очищенное реконструированное анти-НМ 1.24 антитело обладает активностью ингибирования связывания, равной активности химерного анти-НМ 1.24 антитела.

Фиг.33 представляет график, демонстрирующий, что введение химерного анти-НМ 1.24 антитела вызывает продление срока жизни по сравнению с введением контрольного человеческого IgG1 у мышей с трансплантированными клетками миеломы человека.

Фиг.34 представляет график, демонстрирующий, что если клетки, полученные из периферической крови здорового человека, используют в качестве эффекторных клеток, контрольный человеческий IgG1 не демонстрирует цитотоксичности по отношению к клеткам КРММ2, и что мышиное анти-НМ 1.24 антитело также обладает слабой цитотоксичностью, тогда как реконструированное человеческое анти-НМ 1.24 антитело демонстрирует высокую цитотоксичность в отношении клеток КРММ2.

Фиг.35 представляет график, демонстрирующий, что если используют клетки, полученные из периферической крови здорового человека в качестве эффекторных клеток, контрольный человеческий IgG1 не демонстрирует цитотоксичности по отношению к клеткам ARH-77, и что мышиное анти-НМ 1.24 антитело также обладает слабой цитотоксичностью, тогда как реконструированное человеческое анти-НМ 1.24 антитело демонстрирует высокую цитотоксичность в отношении клеток ARH-77.

Фиг. 36 представляет график, демонстрирующий, что если в качестве эффекторных клеток используют клетки, полученные из костного мозга мышей SCID, контрольный человеческий IgG1 не демонстрирует цитотоксичности по отношению к клеткам КРММ2, тогда как реконструированное человеческое анти-НМ 1.24 антитело демонстрирует повышающуюся цитотоксичность в отношении клеток КРММ2 с возрастанием концентрации антител.

Фиг. 37 представляет график, демонстрирующий, что у мышей с трансплантированными клетками миеломы человека уровень человеческого IgG в сыворотке повышается после введения контрольного человеческого IgG1 по сравнению с уровнем до его введения, тогда как введение реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела ингибирует повышение уровня человеческого IgG в сыворотке.

Фиг. 38 представляет график, демонстрирующий, что у мышей с трансплантированными миеломными клетками человека введение реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела вызывает пролонгирование срока жизни по сравнению со сроком после введения контрольного IgG1 человека.

Фиг. 39 представляет график, демонстрирующий, что у мышей с трансплантированными миеломными клетками человека уровень человеческого IgG в сыворотке повышается после введения мелфалана и контрольного человеческого IgG1 по сравнению с уровнем до введения, тогда как введение реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела ингибирует повышение уровня человеческого IgG в сыворотке.

Фиг. 40 представляет график, демонстрирующий, что у мышей с трансплантированными миеломными клетками человека введение реконструированного человеческого анти-НМ 1.24 антитела вызывает пролонгирование периода выживания по сравнению с периодом после введения мелфалана или контрольного человеческого IgG1.

Способ осуществления изобретения 1. Конструирование химерного антитела (1) Клонирование ДНК, кодирующей V-участок мышиного анти-НМ 1.24 моноклонального антитела Получение мРНК Для клонирования ДНК, кодирующей V-участок мышиного анти-НМ 1.24 моноклонального антитела, получают полную РНК из выделенной гибридомы, используя известный способ, такой как способ с использованием гуанидин-ультрацентрифугирования (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979), 18, 5294-5299), способ AGPC (Chomczynski, P. et al, (1987), 162, 156-159), и т.д., и мРНК получают, используя спай-колонку с олиго(дТ)-целлюлозой, дополненной с набором для очистки мРНК (mRNA Purification Kit, Pharmacia) и т.д. Кроме того, используя QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia), мРНК можно получить без стадии выделения полной РНК.

Получение и амплификация кДНК Из мРНК, полученной на приведенной выше стадии получения мРНК, каждую кДНК для V-участков L-цепи и Н-цепи синтезируют, используя обратную транскриптазу кДНК V-участка L-цепи синтезируют, используя набор для синтеза первой цепочки кДНК AMV обратной транскриптазы (AMV Reverse Transcriptase First-Strand cDNA Synthesis Kit). Для амплификации синтезированной кДНК используют соответствующий праймер, который гибридизуется с лидерной последовательностью и С-участком гена антитела (например, праймер MKV, нуклеотидная последовательность которого представлена Последовательностями ИД 29-39, и праймер МКС нуклеотидная последовательность которого представлена Последовательностью ИД 40).

Синтез и амплификацию кДНК V-участка Н-цепи можно осуществить с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции) методом 5'-RACE (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989), используя набор 5'-Ampli FINDER RACE (CLONTECH). С 5'-концом синтезированной ранее кДНК лигируютAmpli FINDER Anchor, а в качестве праймера для амплификации V-участка Н-цепи, можно использовать праймер, который специфически гибридизуется с праймером Anchor (Последовательность ИД 77) и константным участком (C-участок) мышиной Н-цепи (например, праймер МНС2а, нуклеотидная последовательность которого представлена последовательностью ИД 42).

Выделение ДНК и определение ее нуклеотидной последовательности Продукт ПЦР подвергают электрофорезу в агарозном геле, используя известные методики, для вырезания нужного ДНК фрагмента, и ДНК выделяют из него и очищают, а затем лигируют с векторной ДНК.

ДНК можно очистить, используя коммерческий набор (например, GENECLEAN II; BI0101). Известную векторную ДНК (например, pUC19, Bluescript и т.д.) можно использовать для сохранения фрагментов ДНК.

Вышеуказанную ДНК и вышеуказанный вектор лигируют, используя известный набор для лигирования (производитель Таkara Shuzo) для получения рекомбинантного вектора. Затем полученный рекомбинантный вектор вводят в Escherichia coli JM109, после чего устойчивые к ампициллину колонии отбирают, и векторную ДНК получают на основании известного метода (J. Sambrook, et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

После расщепления вышеуказанной векторной ДНК ферментами рестрикции, известным способом определяют нуклеотидную последовательность желаемой ДНК (например, "дидезокси" методом) (J. Sambrook, et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). В соответствии с настоящим изобретением можно использовать автоматическую систему секвенирования (DNA Sequencer 373А; изготовитель ABI Co. Ltd.).

Участок, определяющий комплементарность V-участок Н-цепи и V-участок L-цепи образуют антигенсвязывающий сайт, причем их полные структуры обладают аналогичными свойствами. Так, каждый из четырех каркасных участков (FR) был лигирован с тремя гипервариабельными участками, т. е. участками, определяющими комплементарность (CDR). Аминокислотные последовательности FRs были относительно устойчиво консервативны, тогда как среди аминокислотных последовательностей CDR участков вариации встречаются чрезвычайно часто (Kabat, E.A. et al., "Sequence of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983).

Многие части вышеуказанных четырех FRs принимают структуру -листа, что приводит к образованию трех CDR-петель. Иногда CDR могут составлять часть структуры -листа. Три CDR стерически сохраняются в тесной близости друг к другу, и образуют антигенсвязывающий сайт с тремя CDR участками спаривания.

На основании этих фактов аминокислотная последовательность вариабельного участка мышиного анти-НМ 1.24 антитела подогнана к данным для аминокислотных последовательностей антител, полученных Kabat et al. "Sequence of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983), для исследования гомологии и, тем самым, для определения CDR участков.

(2) Конструирование векторов экспрессии для химерного антитела После того, как клонированы фрагмент ДНК, кодирующий V-участки мышиной L-цепи и Н-цепи мышиного моноклонального антитела, можно получить химерное анти-НМ 1.24 антитело за счет связывания этих мышиных V-участков с ДНК, кодирующей константный участок человеческого антитела, и последующей их экспрессии.

Основной способ конструирования химерного антитела включает связывание мышиной лидерной последовательности и последовательности V-участка, присутствующей в клонированной кДНК, с последовательностью, кодирующей С-участок человеческого антитела, уже присутствующего в экспрессирующем векторе для клеток млекопитающих. В другом варианте он включает связывание мышиной лидерной последовательности с последовательностью V-участка, уже присутствующей в клонированной кДНК, с последовательностью, кодирующей С-участок человеческого антитела, что потом связывают с вектором экспрессии для клеток млекопитающих.

С-участок человеческого