Система восстановления конфермента, набор для ферментативного определения концентрации анализируемого вещества и ферментативный способ определения концентрации анализируемого вещества

Система восстановления конфермента, набор для ферментативного определения концентрации анализируемого вещества и ферментативный способ определения концентрации анализируемого вещества

Реферат

 

Изобретение относится к биохимии. Набор для ферментативного определения концентрации анализируемого вещества в пробе биологической жидкости субъекта путем измерения степени окисления кофермента стабилизирован против окисления при помощи системы восстановления кофермента и других необходимых реагентов. Система состоит из пары фермента и субстрата, которую выбирают так, чтобы обеспечивать постоянное восстановление указанного кофермента на протяжении всего срока хранения данного реагента. Ферментативный способ определения концентрации анализируемого вещества в пробе биологической жидкости по степени восстановления кофермента заключается в том, что использует набор, содержащий систему восстановления кофермента, состоящую из пары фермента и субстрата, которую выбирают так, чтобы обеспечить постоянное восстановление указанного кофермента на протяжении всего срока хранения данного реагента. Изобретение предназначено для определения аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, аммиака и мочевины. Изобретение обеспечивает увеличение стабильности восстановленного кофермента и сохранение ее в течение по крайней мере 6-7 месяцев при хранении в закрытом крышкой флаконе. 3 с. и 30 з.п. ф-лы, 2 ил., 28 табл.

Данное изобретение относится к реагентам для ферментативного определения концентрации анализируемых веществ в пробах биологических жидкостей. В частности, данное изобретение относится к реагентам для количественного определения окисленного кофермента, содержание которого в прореагировавшей пробе соответствует концентрации анализируемого вещества в исходной пробе. Это изобретение относится также к усовершенствованным методам определения концентрации анализируемого вещества.

С помощью реагентов согласно изобретению можно определять концентрации таких веществ, как трансаминазы, аммиак, мочевина, лактатдегидрогеназа, триглицериды и салицилат.

Аспартатаминотрансфераза является ферментом, который в больших количествах присутствует в сердце, печени, эритроцитах и скелетных мышцах. Этот фермент катализирует следующую реакцию Установлено, что содержание аспартатаминотрансферазы в сыворотке увеличивается в случае многих заболеваний печени, связанных с разрушением клеток печени, например, при гепатите. Концентрация этого фермента увеличивается также после инфаркта миокарда и при мышечных заболеваниях.

Такой фермент, как аланинаминотрансфераза, также обнаружен в больших концентрациях в печени и в меньшей степени в сердце, почках и скелетных мышцах. Он катализирует следующую реакцию Установлено, что концентрация этого фермента в сыворотке увеличивается в случае заболеваний печени, в частности при гепатите.

Непрямое количественное определение ферментов, в частности трансаминаз, аспартатаминотрансферазы и аланинамино-трансферазы, в пробах биологических жидкостей заключается в установлении различия между контрольной пробой и пробой анализируемого вещества, соответствующий фермент которого был подвергнут ферментативному превращению.

Для ферментативного превращения анализируемого вещества субстрат, используемый для количественного определения представляющего интерес фермента, подвергают воздействию субстратспецифического фермента (трансаминазы). Изменения, произошедшие в реакционной смеси по сравнению с контрольной пробой, можно определить при помощи разных методов, которые применяют для измерения оптической плотности веществ. Изменение оптической плотности непосредственно связано с количеством трансаминазы, присутствующей в пробе.

Хотя традиционные методы, такие как колориметрическое определение, можно считать вполне приемлемыми, установлено, что ферментативный анализ является гораздо точным, надежным и простым по сравнению с другими методами, когда его используют для определения содержания трансаминазы.

Обычно используемым методом количественного определения трансаминаз в пробе является кинетическое определение посредством сопряженной ферментативной реакции.

В случае определения аспартатаминотрансферазы (AST) оксалоацетат, образующийся под действием этого фермента, превращается в малат под действием малатдегидрогеназы (MDH), включаемой в реагент. Этот процесс сопровождается окислением кофермента, такого как никотинамидадениндинуклеотид (NADH в NAD⁺), которое можно определить спектрофотометрическим путем при длине волны 340 нм. Таким образом, имеет место следующая последовательность реакций Третья реакция необходима для устранения пирувата, который может присутствовать в больших количествах в пробах субъектов. Использование в большом количестве такого фермента, как лактатдегидрогеназа (LDH), можно теоретически обосновать следующим образом: если в пробе биологической жидкости субъекта присутствует большое количество пирувата, то благодаря высокой концентрации лактатдегидрогеназы в реагенте под действием NADH и LDH он быстро превращается в лактат и не мешает ходу реакции. Необходимость введения в реагент лактатдегидрогеназы с целью устранения указанной побочной реакции может повлиять на стабильность реагента из-за увеличения загрязняющих примесей.

В случае определения аланинаминотрансферазы (ALT) пируват, образующийся под действием этого фермента, превращается в лактат под действием лактатдегидрогеназы, включаемой в реакционную смесь. Этот процесс сопровождается окислением кофер-мента NADH в NAD⁺, которое можно также определить спектрофотометрическим путем при длине волны 340 нм. Таким образом, при использовании этого реагента имеет место следующая последовательность реакций Теоретическое обоснование и методика измерения аланинаминотрансферазы аналогичны определению аспартатаминотрансферазы за исключением того, что в случае определения аланинаминотрансферазы необходим лишь один эндогенный фермент, а именно лактатдегидрогеназа (в отличие от определения аспартатаминотрансферазы, когда необходимо использовать лактатдегидрогеназу и малатдегидрогеназу). В этом случае реагенты для определения аланинаминотрансферазы содержат гораздо меньше загрязняющих примесей, что, как правило, означает увеличение срока их хранения по сравнению с реагентами для определения аспартатаминотрансферазы.

Для обоих реагентов скорость образования NAD⁺ соответствует концентрации трансаминазы, присутствующей в исходной пробе.

Мочевина является основным азотсодержащим продуктом караболизма белка, который образуется в печени гепатитными ферментами и выводится, главным образом, через почки. Повышенное содержание мочевины в сыворотке может быть следствием плохого функционирования почек, заболевания печени, изменения режима питания, застойной сердечной недостаточности, диабета и инфекционных болезней.

Концентрацию мочевины в сыворотке и моче человека можно определить прямыми и косвенными методами. Прямыми методами обычно являются модификации реакции Фирона. В этой реакционной системе диацетил взаимодействует с мочевиной с образованием хромогенного диазина, концентрацию которого можно измерить спектрофотометрическим путем, исходя из его наибольшей оптической плотности при длине волны 540 нм. Наиболее распространенный метод измерения мочевины в сыворотке и моче человека предполагает применение сопряженной ферментативной реакционной системы непрямого типа. Уреазу, первый фермент в реакционной системе, используют для превращения мочевины в ионы аммония и бикарбоната. Глутаматдегидрогеназа (GLDH), второй фермент в этой реакционной системе, обеспечивает взаимодействие NADH и ионов аммония с образованием NAD⁺ и глутамата. В ходе этой реакции происходит превращение NADH в NAD⁺, которое контролируют спектрофотометрическим путем при длине волны 340 нм. Альтернативно, можно произвести количественное определение ионов аммония посредством потенциометрии или измерения электропроводимости.

Таким образом, для определения концентрации мочевины используют следующую последовательность реакций По мере превращения NADH в NAD⁺ измеряют уменьшение оптической плотности при длине волны 340 нм, которое пропорционально концентрации мочевины в исходной пробе.

Аммиак в основном циркулирует в желудочно-кишечном тракте. В процессе обмена веществ аммиак преобразуется в печени, где он превращается в мочевину в соответствии с циклом Кребса-Генселейта. Повышенная концентрация аммиака в сыворотке человека чаще всего связана с прогрессирующим заболеванием печени. Гипераммониемия оказывает токсическое действие на центральную нервную систему.

Концентрацию аммиака в сыворотке человека обычно измеряют при помощи прямого одностадийного ферментативного метода с использованием глутаматдегидрогеназы. В ходе этой реакции происходит превращение аммиака, -кетоглутарата и NADH (или NADPH) в глутамат и NAD⁺ (или NADP⁺), которое измеряют спектрофотометрическим путем при длине волны 340 нм.

Концентрацию аммиака в пробе обычно определяют с помощью следующей реакции По мере превращения NSDPH в NADP⁺ измеряют уменьшение оптической плотности при длине волны 340 нм, которое пропорционально концентрации аммиака в пробе биологической жидкости субъекта.

Как указывалось выше, реагенты для определения трансаминазы характеризуются плохой стабильностью. Эти реагенты, особенно если все их компоненты соединяют в одном флаконе, обычно сохраняют стабильность максимум в течение одного месяца при хранении в холодильнике. Причиной такой нестабильности может быть разрушение эндогенных ингредиентов в этих реагентах, а также нестабильность NADH в растворе. Основные причины нестабильности NADH в растворе непосредственно связаны с присутствием эндогенных ферментов, в частности лактатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы в реагенте для определения аспартатаминотрансферазы и лактатдегидрогеназы в реагенте для определения аланинаминотрансферазы. Выпускаемые промышленностью препараты эндогенных ферментов MDH и LDH независимо от того, имеют они животное или бактериальное происхождение, содержат загрязняющие примеси, которые, в конечном счете, влияют на стабильность никотинамидадениндинуклеотида (NADH), а следовательно, и на стабильность реагентов. Этими загрязняющими примесями обычно являются AST и ALT, содержащиеся в небольших количествах и представляющие собой ферменты, для определения концентрации которых и выполняют измерение, а также NADH-оксидаза, которые все вместе вызывают окисление NADH в реагенте.

Показатель рН реагента может также влиять на стабильность NADH, так как NADH быстро разлагается в растворе, особенно в кислой среде. Большинство реагентов для определения трансаминазы имеет рН в интервале от 7,3 до 8,0. Чем более щелочным является реагент, тем выше стабильность NADH в растворе.

Реагенты для определения аммиака и мочевины также характеризуются плохой стабильностью; они сохраняют стабильность при хранении в одном флаконе в холодильнике в течение максимум одного месяца в случае аммиака и двух месяцев в случае мочевины. Причиной такой нестабильности является разрушение эндогенных ингредиентов в реагентах, нестабильность NADH или NADPH в растворе и загрязнение аммиаком, присутствующим в воде, используемой для восстановления порошкообразного реагента.

Основные причины нестабильности NADH или NADPH в растворе непосредственно связаны с присутствием в реагенте эндогенных ферментов. Показатель рН реагента может также влиять на нестабильность NADH или NADPH, так как NADH и NADPH быстро разрушаются в растворе, особенно в кислой среде.

В реагентах для определения аммиака обычно используют никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADPH) (который предпочтителен по сравнению с NADH), чтобы устранить интерференцию эндогенной лактатдегидрогеназы в сыворотке субъекта. Эндогенная лактатдегидрогеназа и пируват, содержащиеся в пробе субъекта, взаимодействуют с NADH в соответствии со следующей реакцией На стабильность NADPH в растворе влияет также наличие загрязняющих примесей в выпускаемых промышленностью препаратах глутаматдегидрогеназы, которые вызывают окисление NADPH в реагенте для определения аммиака. Загрязняющие примеси, присутствующие в выпускаемых промышленностью препаратах уреазы и глутаматдегидрогеназы, точно также вызывают окисление NADH в реагенте для определения мочевины.

Одним из способов устранения трудностей, связанных с нестабильностью NADH и NADPH в растворе, является восстановление кофермента в реагенте непосредственно перед его применением.

Один такой метод описан в заявке на патент Австралии AU-A-61906/90, поданной на имя Ф.Хофмана Ла Роше АГ (F.Hoffmann La Roche AG), который предназначен для использования аналогичных ферментативных систем с целью измерения концентрации бикарбоната и аммиака в сыворотке. В описании этого изобретения указывается, что восстановленный кофермент получают in situ одновременно или перед повторным окислением кофермента анализируемым веществом, субстратом или специфическими ферментами. Это достигается путем включения в реакционную смесь фермента и ферментного субстрата, восстанавливающих окисленный кофермент. Ф. Хофман Ла Роше АГ описывает и подтверждает примерами следующую реакцию, осуществляемую для достижения указанного результата Эта реакция позволяет получить восстановленный никотинаминаденозиндинуклеотид.

В случае такого восстановления NADH возникает проблема, связанная с невозможностью получения стабильного реагента в одном флаконе.

Ф. Хофман Ла Роше АГ смог до некоторой степени устранить эту проблему, получив систему реагентов в двух флаконах. Для количественного определения аммиака первый реагент содержит NADP⁺ и G-6-P, и второй реагент содержит -кетоглутарат, G6PDH и GLDH. При этом процедуру определения анализируемого вещества выполняют следующим образом где (А) и (В) обозначают альтернативные эквивалентные способы выполнения этого метода.

Однако трудности остаются и при использовании этой системы реагентов. Даже если не принимать во внимание тот факт, что в этом случае нужны два флакона с реагентами, что увеличивает их стоимость, инвентары и отходы, необходимо также очень точно дозировать глюкозо-6-фосфат, и, кроме того, применение этой системы ограничено конкретными химическими анализаторами. Сразу после объединения реагентов начинается образование NADH из NAD⁺ за счет расходования глюкозо-6-фосфата. Поскольку содержание глюкозо-6-фосфата уменьшается, это сильно влияет на стабильность полученного реагента, если два реагента не были сразу же использованы после их объединения. Если концентрация глюкозо-6-фосфата будет неточной или избыточной, время выдерживания реагента приобретает критическое значение. В результате этого могут быть получены ложные результаты изменения оптической плотности, а следовательно, и совершенно неточные результаты анализа.

Ранее предложенный метод измерения концентрации анализируемого вещества, описанный в патенте США 4394449, на имя Модровича, предлагает использование пары субстрата и фермента, предназначенной для восстановления кофермента, как это происходит в растворе Роше; однако в этом случае глюкозо-6-фосфат получают из глюкозы в соответствии со следующей реакцией NAD⁺ затем взаимодействует с образовавшимся глюкозо-6-фосфатом в присутствии такого фермента, как глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, с образованием NADH. Кроме того, Модрович включает в композицию как NADH, так и NAD⁺ с тем, чтобы, когда NADH окисляется или разрушается, NAD⁺, присутствующий в реагенте, способствовал восстановлению NADH. Этот реагент также следует хранить в двух флаконах.

Другой альтернативный метод был предложен Клоузом и др. в патенте США 4019961. Это изобретение основано на применении нескольких отдельных стадий реакции и ферментативной системы восстановления NADH. Недостатком этой системы является недостаточная надежность при выполнении нескольких стадий реакции и отделения полученного продукта, что делает этот анализ достаточно трудоемким. Кроме того, эта система реагентов подходит только для субстратов, которые могут быть фосфорилированы.

Общей проблемой, связанной с механизмом восстановления NADH и NADPH, наличие которой отмечалось во всех указанных выше изобретениях, то есть является то, что невозможно выполнить одностадийную реакцию с использованием реагента в одном флаконе, так как сразу же после добавления сыворотки субъекта к реагенту одновременно происходят две реакции: a) уменьшение оптической плотности вследствие превращения NADH (или NADPH) в NAD⁺ (NADP⁺); b) образование NADH (NADPH) из NAD⁺ (NADP⁺), что ведет к увеличению оптической плотности.

Эти две реакции происходят с одинаковыми скоростями, следствием чего является ошибочно медленное изменение оптической плотности и получение совершенно неточных результатов.

Поэтому целью настоящего изобретения является создание системы реагентов для определения концентрации анализируемого вещества в сыворотке, которая позволяет устранить проблемы, присущие ранее известным системам реагентов, используемым для ферментативного анализа уровней анализируемого вещества в сыворотке на основе окисления кофермента, в частности такие проблемы, которые связаны с эндогенным или экзогенным загрязнением реагента. Другой целью данного изобретения является создание усовершенствованного способа определения концентрации анализируемого вещества в пробе биологической жидкости субъекта, который позволяет преодолеть недостатки, характерные для известных способов, в том числе преждевременное окисление коферментного определителя и необходимость хранения системы в нескольких флаконах, чтобы свести до минимума разрушение реагента.

Таким образом объектом настоящего изобретения является реагент для ферментативного определения концентрации анализируемого вещества в пробе биологической жидкости субъекта путем измерения степени окисления кофермента, отличающийся тем, что указанный реагент стабилизирован против окисления при помощи системы восстановления кофермента, состоящей из пары фермента и субстрата, которую выбирают так, чтобы обеспечивать постоянное восстановление указанного кофермента на протяжении всего срока хранения данного реагента.

Предложен также реагент для ферментативного определения концентрации трансаминазы в пробе биологической жидкости субъекта путем измерения степени окисления кофермента, отличающийся тем, что указанный реагент стабилизирован против окисления при помощи системы восстановления кофермента, состоящей из пары фермента и субстрата, которую выбирают так, чтобы обеспечить постоянное восстановление указанного кофермента на протяжении всего срока хранения данного реагента.

Предложен также реагент для ферментативного определения концентрации аспартатаминотрансаминазы в пробе биологической жидкости субъекта путем измерения степени окисления кофермента, отличающийся тем, что указанный реагент стабилизирован против окисления при помощи системы восстановления кофермента, состоящей из пары фермента и субстрата, которую выбирают так, чтобы обеспечить постоянное восстановление указанного кофермента на протяжении всего срока хранения данного реагента.

Изобретение также относится к реагенту для ферментативного определения концентрации аланинаминотрансферазы в пробе биологической жидкости субъекта путем измерения степени окисления кофермента, отличающийся тем, что указанный реагент стабилизирован против окисления при помощи системы восстановления кофермента, состоящей из пары фермента и субстрата, которую выбирают так, чтобы обеспечить постоянное восстановление указанного кофермента на протяжении всего срока хранения данного реагента.

Изобретение также относится к реагенту для ферментативного определения концентрации мочевины в пробе биологической жидкости субъекта путем измерения степени окисления кофермента, отличающийся тем, что указанный реагент стабилизирован против окисления при помощи системы восстановления кофермента, состоящей из пары фермента и субстрата, которую выбирают так, чтобы обеспечить постоянное восстановление указанного кофермента на протяжении всего срока хранения данного реагента.

Предложен также реагент для ферментативного определения концентрации аммиака в пробе биологической жидкости субъекта путем измерения степени окисления кофермента, отличающийся тем, что указанный реагент стабилизирован против окисления при помощи системы восстановления кофермента, состоящей из пары фермента и субстрата, которую выбирают так, чтобы обеспечить постоянное восстановление указанного кофермента на протяжении всего срока хранения данного реагента.

Система восстановления кофермента предпочтительно состоит из фермента и субстрата, причем указанный фермент обладает неполной специфичностью к указанному субстрату, что снижает перекрестную реактивность.

Этот реагент предпочтительно находится в одном флаконе.

В описании изобретения термин "неполная специфичность" используется в отношении пары фермента и субстрата, в которой выбранный субстрат не является природным субстратом выбранного фермента, поэтому перекрестная специфичность для фермента составляет менее 100%.

В основе этого изобретения лежит открытие того, что при объединении фермента и субстрата с неполной специфичностью в отношении друг друга значительно замедляется скорость восстановления кофермента. Вследствие замедления реакции восстановления основные компоненты реагента можно хранить в одном флаконе, при этом его содержимое стабилизировано против загрязнения благодаря постоянному медленному восстановлению кофермента. В связи с замедлением этого процесса восстановление NADH или NADPH не влияет на точность измерения анализируемых веществ. Восстановление может происходить и в неиспользуемом реагенте, при этом скорость восстановления можно точно регулировать, целенаправленно выбирая пару фермента и субстрата и их количества.

Альтернативным вариантом осуществления данного изобретения предусматривается реагент для ферментативного определения концентрации анализируемого вещества в пробе биологической жидкости субъекта путем измерения степени окисления кофермента, отличающийся тем, что указанный реагент стабилизирован против окисления при помощи системы восстановления кофермента, состоящей из пары фермента и субстрата, которую выбирают так, чтобы обеспечить восстановление указанного кофермента со скоростью 0,01-0,9 мЕОП/мин при длине волны 340 нм.

Скорость восстановления реагента по данному изобретению предпочтительно равна 0,05-0,4 мЕОП/мин, наиболее предпочтительно 0,05-0,25 мЕОП/мин при комнатной температуре (18-25^oС) и длине волны 340 нм.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения степень специфичности между субстратом и ферментом в системе восстановления кофермента предпочтительно меньше 100%, более предпочтительно меньше 50% и наиболее предпочтительно меньше 10% на эквимолярной основе. Оптимальной является пара фермента и субстрата с перекрестной реактивностью менее 5% на эквимолярной основе.

Коферментами, предпочтительно используемыми в реагенте по данному изобретению, являются восстановленный никотинамидадениндинуклеотид (NADH) и восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADPH), хотя приемлемы также такие аналоги, как никотинамидгипоксантиндинуклеотидфосфат или тио-NADH.

Установлено, что реагенты согласно изобретению обладают дополнительным преимуществом, в частности, при измерении концентрации аммиака и мочевины. Содержание NADH и/или NADPH снижается в реагентах для определения мочевины и аммиака в присутствии загрязняющего аммиака, который попадает вместе с водой, используемой для восстановления порошкообразных реагентов. Аммиак, содержащийся в воздухе, который растворяется в жидких реагентах для определения мочевины и аммиака, с течением времени снижает уровни NADH и/или NADPH. Присутствие загрязняющего аммиака в реагентах для определения аммиака и мочевины не только вызывает неточное определение концентраций мочевины и аммиака, но и инициирует реакцию с -кетоглутаратом и NADH в присутствии глутаматдегидрогеназы до добавления проб. Это снижает уровни NADH или NADPH и ведет к возникновению ошибок при определении концентраций аммиака и мочевины в пробах. Однако настоящее изобретение позволяет удалить загрязняющий аммиак и восстановить NADH или NADPH, что обеспечивает точное определение концентраций аммиака и мочевины в пробах субъектов.

Ферментами, предпочтительно используемыми в системе восстановления кофермента для определения содержания трансаминазы в пробе сыворотки, являются глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (G-6-P-DH) или глюкозодегидрогеназа.

Ферментами, предпочтительно используемыми в системе восстановления кофермента для определения содержания мочевины или аммиака в пробе сыворотки, являются глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (G-6-P-DH) или глюкозодегидрогеназа.

Кроме того, приемлемы такие ферменты, как формиатдегидрогеназа, глицеролдегидрогеназа, лейциндегидрогеназа, L-аланин-дегидрогеназа, 3-гидроксистероиддегидрогеназа, L-лактатдегидрогеназа (полученная из Lactobacillus sp.) или глицерол-3-фосфатдегидрогеназа. Предпочтительным ферментом, используемым в реагентах для определения трансаминазы, аммиака и мочевины, является глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа. Этот фермент можно получить из любых приемлемых видов бактерий, таких как Leuconostoc mesenteroides, Bacillus stearothermophilus, Zymomonas mobilus, или дрожжей.

Такие ферменты предпочтительно получают из бактерий. Установлено, что введение в реагент ферментов бактериального происхождения сводит до минимума эндогенные загрязняющие примеси, такие как NADH-оксидаза и протеазы, которые ранее сильно влияли на стабильность реагентов. Дополнительным преимуществом бактериальных ферментов являются их более высокая термостойкость, которая продлевает стабильность реагента в растворе.

Более предпочтительным источником глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы является Leuconostoc Mesenteroides. При использовании глюкозо-6-фосфата, полученного из Bacillus Stearothermophilus или Zymomonas Mobilus, замедляется скорость реакции. Аналогичным образом, при использовании глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, полученной из дрожжей, вместо NADH можно использовать кофермент NADPH, так как дрожжевая глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа специфична только к NADP⁺. Количество глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в реагентах согласно изобретению может быть различным в зависимости от требуемой скорости восстановления. Однако в реагенте для определения аспартатаминотрансферазы это количество предпочтительно должно составлять около 2000 ед/д, чтобы продлить время хранения в растворе. В реагенте для определения аланинаминотрансферазы концентрация этого фермента равна 2000 ед/д. Предпочтительная концентрация в реагенте для определения мочевины составляет 2000 ед/л и предпочтительная концентрация в реагенте для определения аммиака равна 35000 ед/л.

С учетом того, что субстрат и фермент необходимо выбирать так, чтобы в системе восстановления кофермента они обладали неполной специфичностью в отношении друг друга, приемлемыми субстратами для использования в реагенте согласно изобретению являются рибозо-5-фосфат, глюкозо-1-фосфат, 6-фосфоглюконовая кислота, 2-дезоксиглюкозо-6-фосфат, 2-дезокси-2-фторглюкозо-6-фосфат, 2-дезокси-2-хлорглюкозо-6-фосфат, 2-дезокси-2,2-дифторглюкозо-6-фосфат, 2-О-метилглюкозо-6-фосфат, маннозо-6-фосфат, глюкозамин-6-фосфат, 3-дезокси-глюкозо-6-фосфат, 3-дезокси-3-фторглюкозо-6-фосфат, 3-О-метилглюкозо-6-фосфат, аллозо-6-фосфат, арозо-6-фосфат, 4-дезокси-4-фторглюкозо-6-фосфат, галактозо-6-фосфат, 5-тиоглюкозо-6-фосфат, аналоги фосфоната, глюкозо-6-сталлат, -D-глюкоза, D-галактоза, 2-дезоксиглюкоза, арабиноза, ксилоза, 1-сорбоза, D-манноза, D-фруктоза, D-лактоза, D-сорбит, D-маннит, сахароза, инозит, мальтоза.

При использовании в реагенте NADH в качестве предпочтительного кофермента предпочтительной парой фермента и субстрата является глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (G-6-P-DH) и D-глюкоза. Предпочтительными альтернативными субстратами для D-глюкозы являются такие субстраты, для которых при специфичности между глюкозо-6-фосфатом (G-6-P) и G-6-P-DH скорость реакции между ферментом G-6-P-DH и выбранным субстратом меньше 50%, более предпочтительно меньше 10% и наиболее предпочтительно меньше 5%. Кроме того, с учетом требуемой скорости восстановления наиболее подходящее содержание D-глюкозы в реагентах по настоящему изобретению, а следовательно, и наиболее предпочтительное, составляет около 100 ммоль/л, хотя можно использовать до 1000 ммоль/л. Проблема растворимости D-глюкозы в реагенте возникает при более высокой концентрации.

При использовании предпочтительной комбинации из D-глюкозы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в нее можно ввести ионы фосфата калия в виде двухосновного фосфата калия. Содержание ионов фосфата зависит от требуемой скорости восстановления. Однако, когда концентрация D-глюкозы равна примерно 100 ммоль/л (но может быть от 10 до 200 ммоль/л) и количество глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы составляет около 2000 ед/л (но может быть от 500 до 3500 ед/л), приемлемое содержание ионов фосфата может быть от 2,0 ммоль/л до 20 ммоль/л. Повышение концентрации ионов фосфата увеличивает скорость восстановления. Ионы фосфата предпочтительно добавляют в количестве около 10 ммоль/л для определения аспартатаминотрансферазы и около 5 ммоль/л для определения аланинаминотрансферазы. В реагенте для определения мочевины предпочтительная концентрация ионов фосфата составляет около 5 ммоль, и в реагенте для определения аммиака концентрация указанных ионов также равна около 5 ммоль.

При использовании предпочтительной комбинации из D-глюкозы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы или в любой системе, в которой не образуется свободный фосфат, в реагент нужно ввести свободные ионы фосфата. В частности свободные ионы фосфата необходимы для образования нерассматриваемого комплекса с D-глюкозой для инициации восстановления в присутствии глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

Вместо комбинации из D-глюкозы и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы можно использовать глюкозодегидрогеназу (GLD), которая катализирует следующую реакцию, где D-глюкоза является 100% реагирующим субстратом Если в качестве фермента используется глюкозодегидрогеназа, предпочтительными субстратами для восстановления кофермента NAD и относительными значениями перекрестной реактивности по сравнению D-глюкозой являются: Субстрат - Относительная активность, % Ксилоза - 8,9 L-сорбоза - 0,3 D-манноза - 2,4 D-фруктоза - 0,8 D-галактоза - 0,1 D-лактоза - 1,2 D-сорбит - 0,1 Инозит - 0,2 Мальтоза - 3,9 где процентные значения обозначают скорость реакции по сравнению с глюкозодегидрогеназой в присутствии ее природного субстрата 1-D-глюкозы.

Альтернативно, при использовании в качестве фермента глицеролдегидрогеназы (GLY.DH) приемлемыми субстратами при осуществлении реакции и значениями их активности (%) по сравнению с глицеролом (100%) являются Субстрат - Относительная активность Глицерол--монохлоргидрин - 48,5 Этиленгликоль - 7,8 2,3-Бутандиол - 52,6 В тех случаях, когда в качестве фермента в нижеследующей реакции используют лейциндегидрогеназу (L.D) приемлемыми субстратами и значениями их относительной активности (%) по сравнению с L-лейцином (100%) являются Субстрат - Относительная активность L-валин - 74 L-изолейцин - 58 L-норвалин - 41 L-норлейцин - 10 L-метионин - 0,6 L-цистеин - 0,3 Если в реакционной системе, аналогичной той, в которой используют лейциндегидрогеназу, в качестве фермента служит L-аланиндегидрогеназа (A.D), приемлемым субстратом и значением его относительной активности (%) по сравнению с L-аланином (100%) является Субстрат - Относительная активность L-серин - 5 3-Гидроксистероиддегидрогеназу (H. DH) можно также использовать в качестве фермента в сочетании с перечисленными ниже субстратами. Здесь также указаны значения их относительной активности (%) по сравнению с холевой кислотой.

Субстрат - Относительная активность Литохолевая кислота - 96 Этиохолевая кислота - 60 Если в следующей реакции в качестве фермента используется L-лактатдегидрогеназа (LDH), полученная из Lactobacillus sp.

приемлемыми субстратами и значениями их относительной активности (%) по сравнению с L-лактатом являются: Субстрат - Относительная активность 2-Оксоглутарат - 0,09 Оксолоацетат - 96 Если NADP⁺ является коферментом, полученным, например, из дрожжей, предпочтительные комбинации субстрата и фермента включают, %: G-6-P-DH / галактозо-6-фосфат - 25 G-6-P-DH / 2-дезоксиглюкозо-6-фосфат - 18 G-6-P-DH / глюкозамин-6-фосфат - 2 Процентные значения, указанные справа, означают относительную реактивность по сравнению с реактивностью пары G-6-P-DH / G-6-P.

Кроме того, NADP⁺ можно использовать в качестве кофермента для такой пары фермента и субстрата, как глицерол-3-фос-фатдегидрогеназа и дигидроксиацетонфосфат.

Как указывалось в вводной части описания изобретения, реагент для определения концентрации аспартатаминотрансферазы в сыворотке должен содержать лактатдегидрогеназу, восстановленный никотинамидадениндинуклеотид (NADH), малатдегидрогеназу (MDH), аспартат и 2-оксоклутарат. При определении аланинаминотрансферазы малатдегидрогеназа не нужна, а вместо аспартата следует использовать L-аланин. Реагент для определения мочевины должен содержать уреазу и -кетоглутарат, а реагент для определения аммиака должен также включать -кетоглутарат.

Аспартат можно использовать в виде разных солей, таких как натриевые и калиевые соли. Предпочтительной солью согласно изобретению является калиевая соль, так как она лучше растворяется и менее гидратирована, чем натриевая соль. В реагентах по данному изобретению концентрация этого компонента составляет 180-240 ммоль/л. Наиболее предпочтительна конечная концентрация около 200 ммоль/л, причем следует отметить, что именно такая концентрация рекомендована Международной федерацией химиотерапии (МФХ).

Концентрация 2-оксоглутарата, которая предпочтительна для реагентов согласно изобретению, составляет около 1-15 ммоль/л, однако известно, что высокие концентрации этого субстрата могут ограничивать количество NADH, добавляемого в композицию, так как 2-оксоглутарат поглощают свет при длине волны 340 нм, перекрывая оптическую плотность NADH. Если ограничить количество 2-оксоглутарата, добавляемого в композицию, этот реагент можно без каких-либо затруднений использовать в большинстве спектральных анализаторов. Предпочтительная концентрация этого субстрата в реагентах для определения аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы составляет около 12 ммоль/л, что также соответствует уровню, рекомендованному МФХ. В реагентах для определения мочевины и аммиака предпочтительная концентрация составляет около 7,5 ммоль/л.

Количество аланина в реагенте для определения аланинаминотрансферазы определяется до некоторой степени растворимостью этого компонента. В частности, предпочтительная концентрация равна 200-500 ммоль/л, хотя при более высокой концентрации не наблюдается значительного увеличения каталитической активности. Наиболее предпочтительная концентрация этого субстрата равна около 400 ммоль/л, что связа