Изолированная молекула днк, кодирующая рецептор глюкагона, днк-конструкция, линия клеток, способ получения рецептора глюкагона, изолированный пептид рецептора глюкагона, изолированное антитело, зонд, способ обнаружения присутствия антагонистов глюкагона

Изолированная молекула днк, кодирующая рецептор глюкагона, днк-конструкция, линия клеток, способ получения рецептора глюкагона, изолированный пептид рецептора глюкагона, изолированное антитело, зонд, способ обнаружения присутствия антагонистов глюкагона

Реферат

 

Изобретение касается рецептора глюкагона. Предложена изолированная молекула ДНК, кодирующая рецептор глюкагона или пептид рецептора глюкагона. ДНК-конструкция обеспечивает экспрессию изолированной молекулы ДНК и встраивается в линию клеток COS или ВНК. Также предложен способ получения рецептора глюкагона, предусматривающий культивирование линий клеток COS или ВНК и выделение целевого продукта. В изобретении представлено также изолированное моноклональное антитело, специфически связывающееся с рецептором глюкагона и блокирующее связывание глюкагона с рецептором глюкагона. Другим аспектом изобретения является способ обнаружения антагониста глюкагона, предусматривающий связывание агониста с изолированным рецептором глюкагона. Изобретение может быть использовано в стимулировании выделения глюкагона, что связано со стимулированием гликолиза и гликогенолиза и изучением роли глюкагона в таком заболевании, как сахарный диабет. 9 с. и 4 з.п. ф-лы, 5 ил., 8 табл.

Область техники Изобретение относится в общем плане к рецепторам клеточной поверхности и, более конкретно, касается рецепторов глюкагона.

Предпосылки данного изобретения Глюкагон представляет собой гормон из 29 аминокислот, продуцируемый -клетками панкреатических островков. Глюкагон ответственен за поддержание нормальных уровней глюкозы во многих животных, в том числе в человеке, действуя как противодействующий инсулину гормон. В частности известно, что в то время как инсулин быстро снижает уровни глюкозы в крови, глюкагон уравновешивает эти эффекты, способствуя повышению уровней глюкозы в крови.

Взаимодействия глюкагона и инсулина очень важны для поддержания уровней глюкозы внутри тела. Считают, что дисбаланс глюкагона или инсулина играет роль в различных заболеваниях, таких как сахарный диабет и диабетический кетоацидоз. Согласно одной теории, гипергликемическое состояние сахарного диабета может быть вызвано не только снижением использования глюкозы (вследствие пониженного уровня инсулина), но также избыточным образованием глюкозы вследствие повышенных концентраций глюкагона (см. Under, "Diabetes and the alpha cell", Diabetes 25:136-151, 1976; Unger and Orci, "Тhе essential role of glucagon in the pathogenesis of diabetes mellitus". Lancet 1:14-16, 1975).

Важным фактором в изучении глюкагона и его роли в таких заболеваниях, как сахарный диабет, является рецептор глюкагона, который при связывании с глюкагоном переносит сигнал к клетке, запуская тем самым гликогенолиз (гидролиз гликогена) и глюконеогенез (синтез глюкозы).

В настоящее время считают, что эффекты глюкагона опосредованы отчасти повышением внутриклеточных уровней циклического аденозинмонофосфата (сАМР). В частности связывание глюкагона с его клеточным рецептором активирует аденилатциклазу для продуцирования сАMР, повышая таким образом уровни внутриклеточного сАМР. Считают, что это повышение внутриклеточных уровней сАМР приводит к гликогенолизу и глюконеогенезу и в конечном счете к повышению образования глюкозы печенью (см. Unson et al., "Biological Activities of des-His^I[Glu]⁹Glucagon Amide, a Glucagon Antagonist", Peptides 10:1171-1177, 1989).

Однако были предположения также о дополнительных путях стимулирования гликогенолиза и глюконеогенеза. В частности сообщалось, что глюкагон связывается с рецепторами в мембране гепатоцита (печеночной клетки), которые соединены через G-белок с фосфолипазой С. При стимулировании этот белок вызывает распад фосфатидилинозитол-4,5-бифосфата с образованием вторичных мессенджеров (посредников) инозиттрифосфата и 1,2-диацилглицерина (см. Wakelam et al. , "Activation of two signal-transduction systems in hepatocytes by glucagon", Nature 323: 68-71, 1986; Unson et al., Peptides 10:1171-1177, 1989; и Pittner and Fain, Btochem. J. 277:371-378, 1991). Стимулирование глюкагона метаболизмом инозитфофолипида может быть дополнительным путем, при помощи которого глюкагон может стимулировать гликогенолиз и глюконеогенез.

Данное изобретение описывает рецептор (рецепторы) глюкагона и, кроме того, обеспечивает другие связанные с этим объектом преимущества.

Краткое изложение сущности изобретения Согласно одному аспекту данного изобретения предложены выделенные молекулы ДНК, кодирующие рецептор глюкагона. Применяемый здесь термин "изолированная молекула ДНК относится к молекулам ДНК или последовательностям ДНК, которые отделены, помещены отдельно от других клеточных компонентов. Например, молекула ДНК изолирована, если она отделена от других молекул ДНК, в том числе от других хромосомных последовательностей, с которыми она природно ассоциирована в геноме и, в частности, свободна от других структурных генов. Изолированная молекула ДНК может содержать 5'- и 3'- нетранслируемые последовательности, с которыми она природно ассоциирована. В одном из вариантов изобретения рецептор глюкагона выбран из группы, состоящей из крысиных и человеческих рецепторов глюкагона. В другом варианте молекула ДHК содержит последовательность нуклеотидов SEQ ID 14, от нуклеотида 145 до нуклеотида 1599. В другом варианте молекула ДНК кодирует рецептор глюкагона, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID 15, от метионина, номер аминокислоты 1, до треонина, номер аминокислоты 485. В следующем варианте молекула ДНК содержит последовательность, нуклеотидов SEQ ID 24, от нуклеотида 53 до нуклеотида 1486. Еще в одном варианте молекула ДНК кодирует рецептор глюкагона, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID 25, от метионина, номер аминокислоты 1, до фенилаланина, номер аминокислоты 477. Также обеспечены конструкции ДНК, содержащие первый сегмент ДНК, кодирующий рецептор глюкагона, оперативно связанный с дополнительными сегментами ДНК, необходимыми для экспрессии первого сегмента ДНК, клетки-хозяева, содержащие такие конструкции ДНК, а также способы получения рецептора глюкагона, предусматривающие стадию культивирования клетки-хозяина при условиях, способствующих экспрессии сегмента ДНК, кодирующего рецептор глюкагона.

Согласно другому аспекту изобретения предложены изолированные пептиды рецептора глюкагона. Согласно одному варианту предложен изолированный пептид рецептора глюкагона, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID 15, от глутамина, аминокислоты 28, до тирозина, номер аминокислоты 142.

Согласно другому аспекту изобретения предложены изолированные антитела, специфически связывающиеся с рецепторами глюкагона. В одном варианте эти антитела представляют собой моноклональные антитела. В дополнительном варианте обеспечены моноклональные антитела, способные блокировать связывание глюкагона с рецептором глюкагона. Также обеспечены гибридомы, продуцирующие описанные выше моноклональные антитела.

Еще в одном аспекте данного изобретения обеспечен способ обнаружения присутствия антагонистов глюкагона, предусматривающий стадии (а) экспонирования соединения в присутствии агониста глюкагона с рекомбинантным рецептором глюкагона, связанным с путем ответной реакции, при условиях и в течение времени, достаточных для того, чтобы произошло связывание соединения с рецептором и произошла ассоциированная ответная реакция через путь метаболизма и (b) детектирования уменьшения в стимулировании ответного пути, вызываемого связыванием испытуемого соединения с рецептором глюкагона, по сравнению со стимулированием ответного пути одним агонистом глюкагона, и определение из этих данных присутствия антагониста глюкагона.

В различных вариантах изобретения ответным путем является ответная реакция мембраносвязанной аденилатциклазы и стадия детектирования предусматривает измерение уменьшения продуцирования циклического АМР в ответном пути, медиируемом мембраносвязанной аденилатциклазой. В другом варианте изобретения ответная реакция включает в себя люциферазную репортерную систему.

Еще в одном аспекте данного изобретения обеспечены зонды по меньшей мере из 12 нуклеотидов, способные гибридизоваться с нуклеиновыми кислотами, кодирующими рецептор глюкагона.

Эти и другие аспекты данного изобретения станут понятными в ходе дальнейшего детального описания со ссылками на прилагаемые чертежи. Кроме того, различные ссылки изложены ниже, описывающие в больших деталях определенные процедуры или композиции (например, плазмиды и т.д.) и поэтому даваемые здесь в виде полных ссылок.

Краткое описание чертежей Фиг.1 иллюстрирует структуру типичного рецептора глюкагона. Использованы следующие символы: ЕАТD (внеклеточный аминоконцевой домен); ЕD (эффекторный домен), окруженный пунктирной линией; 1ID, первый внутриклеточный петлевой домен; 2lD, второй внутриклеточный петлевой домен; 3ЕlD, третий внутриклеточный петлевой домен; С-ID, карбоксиконцевой внутриклеточный домен; IELD, первый домен внеклеточный петлевой домен; 2ELD, второй внеклеточный петлевой домен; 3ELD, третий внеклеточный петлевой домен; TMDI, первый трансмембранный домен; ТМD2, второй трансмембранный домен; ТМD3, третий трансмембранный домен; ТМD4, четвертый трансмембранный домен; TMD5, пятый трансмембранный домен; ТМD6, шестой трансмембранный домен и ТМD7, седьмой трансмембранный домен.

Фиг.2 графически изображает гидрофобность крысиного рецептора глюкагона.

Фиг. 3 графически изображает связывание ¹²⁵I-глюкагона с рецепторами глюкагона.

Фиг. 4 представляет собой анализ Скетчарда кажущейся Кd для рецепторов глюкагона.

Фиг. 5 дает аминокислотную последовательность крысиного рецептора глюкагона с линиями над трансмембранными доменами.

Детальное описание изобретения Как отмечено выше, данное изобретение обеспечивает изолированные молекулы ДНК, кодирующие рецепторы глюкагона. Считают, что в их природной конфигурации рецепторы глюкагона существуют в виде мембраносвязанных белков, состоящих из внеклеточного аминоконцевого домена, а также нескольких наружных и внутренних доменов меньшей величины (см. фиг.1). В контексте данного изобретения "рецептором глюкагона" называют такие белки и подобные им производные. Производные могут быть аллельными разновидностями и генетически сконструированными вариантами, содержащими консервативные аминокислотные замены и (или) минорные добавления, замены или делеции аминокислот. Рецепторы глюкагона данного изобретения способны связывать глюкагон и осуществлять трансдукцию этого сигнала в клетку. Предпочтительно, рецепторы глюкагона данного изобретения способны связывать глюкагон с Кd 100 нМ или менее, более предпочтительно 50 нМ или менее и наиболее предпочтительно 33 нМ или менее. Типичные тесты, которые могут быть использованы для определения связывания глюкагона рецептором глюкагона, описаны более детально в примерах 3 и 6.

Обычно трансдукция сигнала происходит при активации ответного пути метаболизма наружным стимулом, который обычно, но не всегда, связывается с мембраносвязанным рецептором. Отвечающие на стимул пути обычно индуцируют клеточные ответные реакции, такие как внеклеточная матриксная секреция восприимчивых клеточных линий, секреция гормона, хемотаксис, дифференциация, или инициация, или ингибирование клеточного деления восприимчивых клеток. Сопряжением рецепторов с восприимчивыми к исследуемому сигналу путями называют здесь прямую активацию отвечающего на сигнал пути или трансдукцию сигнала через вторичный мессенджер, такой как G-белок, для активации пути клеточного ответа.

Многие пути клеточного ответа могут быть использованы рецепторами глюкагона для трансдукции сигнала связывания глюкагона к клетке, в том числе, например, путь аденилатциклазного ответа и путь ответа внутриклеточного кальция.

Тесты определения аденилатциклазной активности хорошо известны в этой области исследований, например, описанные Lin et al. (Biochemistry 14: 1559-1563, 1975). Данное изобретение также обеспечивает измерение биологической активности рецептора глюкагона на основе концентраций внутриклеточного кальция (см. Grynkiewicz et аl., J.Biol.Сhеm. 260:3440-3450, 1985), а также путем применения люцифразной репортерной системы, описанной в больших деталях ниже. Кроме того, биологические ответные реакции, осуществляющиеся через инозит-трифосфатный путь, могут оцениваться путем измерения метаболизма инозиттрифосфата, как описано в Subers and Nataanson (J.Mol.Cell.Cardiol. 20: 131-140, 1988) или Pittner and Fain. (Biochem.J. 277:371-378, 1991). Следует отметить, что в контексте данного изобретения не все отвечающие на сигнал пути обязательно должны присутствовать для того, чтобы рецептор глюкагона переносил сигнал в клетку. Например, некоторые клеточные ответные реакции, такие как увеличение уровней внутриклеточного кальция, могут инициироваться связыванием глюкагона с его рецептором в отсутствие сАМР- или инозитфосфатных сигналов.

Изолирование (выделение) клонов кДНК рецептора глюкагона Как отмечено выше, данное изобретение обеспечивает изолированные молекулы ДHK, кодирующие рецепторы глюкагона. Вкратце, геномные или кДНК-молекулы, кодирующие рецепторы глюкагона, могут быть получены из библиотек, приготовленных из клеток и тканей согласно процедурам, описанным ниже и в примерах. Клетки и ткани, которые можно использовать в рамках данного изобретения, можно получать из множества млекопитающих, в том числе, например, из человека, макак, крупного рогатого скота, свиней, лошадей, собак, крыс и мышей. Предпочтительными клетками и тканями являются жировая ткань, почки, поджелудочная железа, сердце и печень.

В одном аспекте изобретения крысиный рецептор глюкагона может быть изолирован и клонирован при помощи описанных здесь процедур. Вкратце, поли(А)⁺-РНК выделяли из Sрrаguе Dаwlеу крыс и использовали в качестве матрицы для синтеза кДНК в основном, как описано Ноuаmеd еt аl. (Sсiеnсе 252:1318-1321, 1991), для получения кДНК полной длины. Затем библиотеку, содержащую приблизительно 110⁶ клонов, конструировали в экспрессирующей плазмиде клеток млекопитающих путем направленного клонирования кДНК, больших, чем 800 н. п. Затем плазмидные ДНK, полученные из пулов, содержащих 5000 клонов, трансфицировали в COS-7 клетки, отбирали и выращивали на предметных стеклах для микроскопа. Трансфицированные клетки анализировали после 72 часов путем связывания с ¹²⁵1-глюкагоном с последующей эмульсионной радиографией (McMahan et аl., ЕМВО J. 10:2821-2832, 1931). Положительные пулы последовательно разбивались, пока не был изолирован отдельный клон. Плазмида, полученная из этого клона, обозначенная как рLJ4, содержит приблизительно 2,0 т. п. н. инсерцию, которая кодирует белок из 485 аминокислот с предсказанной мол. массой 54962 дальтон (см. SEQ ID 15).

В других аспектах данного изобретения обеспечены способы выделения и клонирования человеческого рецептора глюкагона. Многие технологии можно использовать для обеспеченного здесь способа, в том числе, например, применение полимеразной цепной реакции (РСR) для амплификации последовательностей, кодирующих рецептор глюкагона (пример 4), которые затем могут быть использованы в идентификации библиотек, которые содержат последовательности, кодирующие человеческий рецептор глюкагона с последующим клонированном этого рецептора (пример 5). Особенно предпочтительными стратегиями для клонирования человеческого рецептора глюкагона являются стратегии, изложенные в примерах 4 и 5. Альтернативно экспрессирующая библиотека, содержащая человеческие кДНК, может быть получена из подходящих источников РНК, описанных в примере 1 и скринированных, как описано в примере 3 для клонов, экспрессирующих функциональные рецепторы глюкагона.

Получение рекомбинантных рецепторов глюкагона Данное изобретение обеспечивает получение рекомбинантных рецепторов глюкагона путем культивирования клеток-хозяев, содержащих конструкцию ДНК, содержащую первый сегмент ДНК, кодирующий рецептор глюкагона, оперативно соединенный с дополнительными сегментами ДНК, необходимыми для экспрессии первого сегмента ДНК. Как отмечено ранее, в контексте данного изобретения под рецепторами глюкагона подразумевают и их производные, в основном сходные с рецепторами. Кроме того, рецепторы глюкагона могут кодироваться последовательностями ДНК, в основном сходными с описанными здесь последовательностями ДНК. Последовательность ДНК считают "в основном сходной", если: (а) эта последовательность ДНК произведена из кодирующего района нативного гена рецептора глюкагона (в том числе, например, аллельные вариации описанных ниже последовательностей); (b) эта последовательность ДНК способна гибридизоваться с последовательностями ДНК данного изобретения при высокой или низкой строгости (см. Sambrook еt аl., Моlесulаr Cloning: A Lаbоrаtоrу Маnuаl, 2d Ed., Соld Sрring Наrbоr Laboratory Рrеss, V, 1989); или (c) последовательности ДНК являются вырожденными в результате вырожденности генетического кода до последовательностей ДНК, описанных в (а) или (b).

Мутации в нуклеотидных последовательностях, сконструированных для экспрессии вариантных рецепторов глюкагона, должны сохранять рамку считывания кодирующих последовательностей. Кроме того, мутации предпочтительно не должны создавать комплементарные районы, которые могли бы гибридизоваться с образованием вторичных структур мРНК, таких как петли или шпильки, которые могут неблагоприятно влиять на трансляцию мРНК рецептора. Хотя сайт мутации может быть заданным, не обязательно, что природа мутации per Se должна быть заранее определена. Например, для отбора оптимальных характеристик мутантов при данном сайте мутагенез можно проводить на кодоне-мишени с последующим скринингом мутантных рецепторов глюкагона на биологическую активность.

Мутации могут быть введены при определенных локусах путем синтеза олигонуклеотидов, содержащих мутантную последовательность, фланкированную сайтами рестрикции, позволяющими лигирование с фрагментами нативной последовательности. После лигирования полученная последовательность кодирует производное, имеющее желаемые аминокислотные инсерцию, замену или делению.

Альтернативно, процедуры олигонуклеотиднаправленного сайтспецифического мутагенеза могут быть использованы для обеспечения измененного гена, имеющего измененные определенные кодоны в соответствии с желаемыми заменой, делецией или инсерцией. Примеры получения изложенных выше изменений описаны Walder еt аl. (Gеnе 42:133-1986); Bauer еt аl. (Gеnе 37:73, 1985); Craik (Вiо Techniques, Jаnuаry 1985, 12-19); Smith еt аl. (Gеnеtiс Еngineering: Рrinсiрlеs and Methods, Plenum Press, 191); and Sаmbrook et аl. (Supra).

Первичная аминокислотная структура рецептора глюкагона также может быть модифицирована путем образования ковалентных или агрегированных конъюгатов с другими химическими частями молекулы, такими как гликозильные группы, липидные, фосфатные, ацетильные группы или с другими белками, или полипептидами. В следующем варианте рецепторы глюкагона могут быть слиты с другими пептидами, облегчающими очистку или идентификацию рецепторов глюкагона. Например, рецептор глюкагона можно получить в виде слитого белка с FLAG-полипептидной последовательностью (см. U. S. Раtеnt 4851341; см. также Норр еt аl., Bio/Technology 6:1204, 1988). FLAG-полипептидная последовательность обладает высокой антигенностью и обеспечивает эпитоп для связывания специфическими моноклональными антителами, делая возможной быструю очистку экспрессируемого рекомбинантного белка. Эта последовательность также специфически расщепляется энтерокиназой бычьей слизистой оболочки при остатке, следующем непосредственно после пары Аsр-Lys. Для удобства могут быть приготовлены многочисленные конструкции ДНК, включающие в себя полные последовательности или части последовательностей нативного или вариантного рецепторов глюкагона, обсужденных выше. В контексте данного изобретения конструкцией ДНК называют молекулу ДНК или клон такой молекулы (одноцепочечной или двухцепочечной), которая была модифицирована таким образом, что она содержит сегменты ДНК, объединенные и помещенные рядом таким образом, что образуется молекула, которая не существовала в природе. Конструкции ДHК данного изобретения содержат первый сегмент ДНК, кодирующий рецептор глюкагона, оперативно соединенный с дополнительными сегментами ДНК, необходимыми для экспрессии первого сегмента ДНК. В контексте данного изобретения дополнительные сегменты ДНК в основном будут включать в себя промоторы и терминаторы транскрипции и могут, кроме того, содержать энхансеры и другие элементы.

Конструкции ДНК, известные также как экспрессирующие векторы, могут также содержать сегменты ДНК, необходимые для управления секрецией целевого полипептида. Такие сегменты ДНК могут содержать по меньшей мере одну секреторную сигнальную последовательность. Предпочтительными секреторными сигналами являются секреторная сигнальная последовательность глюкагона (пре-пропоследовательность), сигнальная последовательность альфа-фактора (пре-пропоследовательность; Kurian аnd Herskowitz, Cell 30:933-943, 1982; Kurian еt аl. , U.S. Раtеnt 4546082; Brake, EP 116 201), сигнальная последовательность РН05 (Весk еt аl., WO 86/00637), секреторная сигнальная последовательность BAR I (MасКаy еt аl., U.S. Раtеnt 4613572; MacKay WO 87/002670), сигнальная последовательность SUC2 (Carlson et al., Mol. Cell. Biol. 3:439-447, 1983), сигнальная последовательность -1-антитрипсина (Кurасhi еt аl., Рrос. Nаtl. Acad. Sci. USA 78:6826-6830, 1981), сигнальная последовательность ингибитора плазмина -2 (Тоnе еt аl., J. Biochem. (Tokyo) 102:1033-1042, 1987), сигнальная последовательность тканевого активатора плазминогена (Реnniса еt аl. , Nаture 301:214-221, 1983) сигнальная последовательность PhoA Е. соli (Yuаn еt al. , J.Biol. Сhem. 265:13528-13552, 1990) или любая из бактериальных сигнальных последовательностей, обзор которых дан, например, Оlivеr (Аnn. Rеv. Miсrоbiоl. 39:615-649, 1985). Альтернативно, секреторная сигнальная последовательность может быть синтезирована согласно установленным правилам, например, Heinje (Eur. J.Biochem. 133:17-21, 1983; J. Mol. Biol. 184: 99-105, 1985; Nuc. Acids Res. 14:4683-4690, 1986).

Секреторные сигнальные последовательности могут быть использованы по отдельности или могут быть скомбинированы. Например, первая секреторная сигнальная последовательность может применяться с последовательностью, кодирующей третий домен Ваrriеr (описанный в U.S. Раtеnt 5037243, на который дается полная ссылка). Последовательность, кодирующая третий домен Ваrriеr может быть помещена в подходящей рамке считывания 3' от целевой последовательности ДНК или 5' по отношению к сегменту ДНК и в подходящей рамке считывания как с секреторной сигнальной последовательностью, так и с целевым сегментом ДНК.

Для экспрессии молекулу ДНК, кодирующую рецептор глюкагона, встраивают в подходящую конструкцию ДНК, которую в свою очередь используют для трансформации или трансфекции подходящих клеток-хозяев для экспрессии. Клетки-хозяева для применения в практике данного изобретения представляют собой клетки млекопитающих, птиц, растений, насекомых, бактериальные и грибные клетки. Предпочтительными эукариотическими клетками являются культивируемые линии клеток млеокпитающих (например, клеточные линии грызунов или человека) и грибные клетки, в том числе виды дрожжей (например, Saccharomyces sрр., в частности S. cerevisiae, Schizosaccharomyces spp. или Kluyveromyces spp.) или нитчатые грибы (например, Aspergillus spp., Neurospora spp.). Особенно предпочтительны штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Способы получения рекомбинантных белков во множестве прокариотических и эукариотических клеток-хозяев известны специалистам в этой области (см. "Gеnе Expression Technology", Methods in Еnzymоlоgу, Vol. 185, Goeddel (ed.), Асаdеmic Press, San Diego, Calif., 1990; см. также, "Guide to Yеаst Genetics and Molecular Вiоlоgy", Methodk in Enzyrmology, Guthrie and Fink (ed.) Academic Press, Sаn Diego, Calif., 1991). Как правило, клетку-хозяина выбирают на основе ее способности продуцировать целевой белок на высоком уровне или на основе ее способности проводить по меньшей мере некоторые из стадий процессинга, необходимых для биологической активности этого белка. Таким путем число клонированных последовательностей ДНК, которое должно быть трансфицировано в клетку-хозяин, может быть сведено к минимуму, и общий выход биологически активного белка может быть оптимизирован.

Подходящими дрожжевыми векторами для применения в данном изобретении являются векторы YRр7 (Struhl еt аl., Рrос. Nаtl. Acad. Sci. USA 76:1035-1039, 1978), YЕр13 (Вrоасh еt al., Gene 8:121-133, 1979), POT (Kawasaki et аl. , U. S. Patent 4931373, который включен здесь в виде ссылки) pJDB249 и pJDВ219 (Beggs, Nature 275:104-108, 1978) и их производные. Такие векторы обычно содержат селектируемый маркер, который может быть одним из любого числа генов, проявляющих доминантный фенотип, для которого существует фенотипический тест, позволяющий проводить отбор трансформантов. Предпочтительными являются такие селектируемые маркеры, которые дополняют ауксотрофию клетки-хозяина, обеспечивают устойчивость к антибиотикам или делают клетку способной использовать специфические источники углерода и включают в себя LЕU2 (Broach et al., ibid.), URА 3 (Botstein et al., Gene 8:17, 1979), HIS 3 (Struhl et аl., ibid.) или РОТI (Каwаsакi et al., ibid.). Другим пригодным селектируемым маркером является CAT ген, который сообщает дрожжевым клеткам устойчивость к хлорамфениколу.

Предпочтительными промоторами для применения в дрожжах являются промоторы из дрожжевых гликолитических генов (Нit Zeman et al., J.Biol. Сhеm. 255: 12073-12080, 1980; Аlbеl and Каwаsакi, J.Моl. Аррl. Gеnеt. 1:419-434, 1982; Каwаsакi., U.S. Patent 4599311) или гены алкогольдегидрогеназы (Young еt аl. , in Genetic Engineering of Microorganisms оf Сhеmiсаl, Hollaender et al., (ads. ), p.355, Plenum, Nеw Yоrk, 1982; Ammеrеr, Meth. Еnzymol. 101:192-201, 1983). В этой связи особенно предпочтительными промоторами являются TPLI промотор (Kawasaki, U.S. Раtеnt 4599311, 1986) и ADH2-4^C промотор (Pussel et аl. , Nature 304:652-654, 1983; Irani and Kilgore, U.S. Раtеnt Аррliсаtion Serial 07/764653, который включен здесь ссылкой). Единицы экспрессии могут также содержать терминатор транскрипции. Предпочтительным является TPLI терминатор транскрипции (Alber and Kawasaki, ibid.).

Кроме дрожжей белки данного изобретения могут экспрессироваться в нитевидных грибах, например в штаммах гриба Asper-gillus (McKnight et al., U.S. Раtеnt 4935-349, включен в ссылки). Примерами применимых промоторов являются промоторы, произведенные из гликолитических генов Aspergillus nidulans, такие как АDН3 промотор (МсКnight еt аl., ЕМВО J. 4:2093-2099, 1989) и tpiA промотор. Примером пригодного терминатора является АDН3 терминатор (МсKight еt аl., 1985). Единицы экспрессии, использующие такие компоненты, клонированы в векторы, способные к встраиванию в хромосомную ДНК Aspergillus.

Способы трансформации грибов хорошо известны в литературе и были описаны, например, Beggs (ibid.), Нinеnеt et аl., (Рrос.Nаtl. Acad. Sсi. USA 75: 1929-1933, 1978) Yеltоn еt аl., (Рrос. Nаtl. Асаd. Sci USA 81:1740-1747, 1984) и Russel (Nаturе 301:167-169, 1983). Генотип клетки-хозяина обычно содержит генетический дефект, который дополняется селектируемым маркером, присутствующим на экспрессирующем векторе. Выбор определенного хозяина и селектируемого маркера доступны для людей с обычным уровнем квалификации в данной области. Для оптимизации получения гетерологичных белков в дрожжах, например, предпочтительно, чтобы штамм хозяина нес мутацию, такую как рер4 мутация дрожжей (Jones, Genetics 85:23-33, 1977), приводящую к пониженной протеолитической активности.

Кроме грибных клеток в данном изобретении в качестве клеток-хозяев можно использовать культивированные клетки млекопитающих. Предпочтительными культивированными клетками млекопитающих для применения в изобретении являются линии клеток COS-I (АТСС CRL 1650), COS-7 (АТСС CRL 1651), ВНК (АТСС СRL 1632) и 293 (АТСС СRL 1573; Graham et al., J. Gеn. Virol. 36:59-72, 1977). Предпочтительной клеточной линией ВНК является клеточная линия ВНК 570 (депонированная в АТСС под Accession CRL 10314). Кроме того, ряд других клеточных линий млекопитающих может применяться в данном изобретении, в том числе клеточные линии Rat Нер I (АТСС CRL 1600), Rat Hep II (АТСС СRL 1548), ТСMК (АТСС CCL 139), Human lung (клетки легких человека) (АТСС CCL 75.1), Human hepatoma (клетки гепатомы человека) (АТСС НТВ-52), Нер G2 (АТСС НВ 8065). Mouse liver (клетки печени мышей) (АТСС CСL 29.1), N СТС 1469 (АТСС ССL 9.1), SP2/O-Ag-14 (АТСС 1581), HIT-Т15 (АТСС CRL 1777) и RINm 5AHT₂B (Orskov and Nielson, FEBS 229 (1): 175-178, 1988).

Экспрессирующие векторы млекопитающих для применения в данном изобретении содержат промотор, способный направлять транскрипцию клонированного гена или кДНК. Предпочтительными промоторами являются вирусные промоторы и клеточные промоторы. Вирусные промоторы представляют собой самый ранний промотор цитомегаловируса (Boshart еt аl., Сеll 41:521-530, 1985) и промотор SV40 (Subramani et аl., Mol. Сеll. Вiol. I: 854-864, 1981). Клеточные промоторы включают мышиный промотор металлотионеина-1 (Palmiter еt аl., U.S. Patent 4579821), мышиный V_k промотор (Веrgmаn еt аl., Рrос. Nаtl. Acad. Sci. USA 81: 7041-7045, 1983; Grаnt еt аl., Nuс. Acids Res. 15:5496, 1987) и мышиный V_H промотор (Lоh еt аl., Cell 33:85-93, 1983). Особенно предпочтительным промотором является основной поздний промотор из аденовируса 2 (Каufmаn and Shаrр, Моl. Сеll. Вiоl. 2:1304-1319, 1982). Такие экспрессирующие векторы могут также содержать ряд сайтов сплайсинга РНК, локализованных в направлении 5' --> 3' от промотора и 3' --> 5' от последовательности ДНК, кодирующей целевой пептид или белок. Предпочтительные сайты сплайсинга РНК могут быть получены из генов аденовируса и (или) генов иммуноглобулинов. В экспрессирующих векторах находится также сигнал полиаденили-рования, расположенный в направлении 5' --> 3' от кодирующей целевой последовательности. Пригодными сигналами полиаденилирования являются ранние или поздние сигналы полиаденилирования из SV40 (Каufmаn аnd Sharp, ibid.), сигнал полиаденилирования из ЕIВ района аденовируса и терминатор гена гормона роста человека (DeNoto еt аl., Niс. Acids Res. 9:3719-3730, 1981). Экспрессирующие векторы могут содержать некодирующую вирусную лидерную последовательность, такую как состоящий из трех частей лидер аденовируса 2, расположенный между промотором и сайтами сплайсинга РНК. Предпочтительные векторы могут также содержать энхансерные последовательности, такие как энхансер SV40 и энхансер мышей (Gillies, Cеll 33:717-728, 1983). Экспрессирующие векторы могут также содержать последовательности, кодирующие РЕК VA аденовируса. Пригодные векторы могут быть получены из коммерческих источников (например, Stratagene, La Jоllа, СА).

Клонированные последовательности ДНК могут быть введены в культивированные клетки млекопитающих, например, путем медиируемой фосфатом кальция трансфекции (Wigler еt аl., Сеll 14:725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham and Vаn der Eb, Virology 52:456, 1973), путем электропорации (Nеumаnn еt аl., ЕМВО J. 1:841-845, 1982) или путем медиированной ДЭАЭ-декстраном трансфекции (Ausubel et al., (eds.), Currеnt Protocols in Моlесulаr Вiоlоgy, Jоhn Wilеy and Sons, Inс., NY, 1987), которые включены в виде ссылки. Для идентификации клеток, стабильно интегрировавших клонированную ДНК, обычно вводят в клетки селектируемый маркер вместе с целевыми геном или кДНК. Предпочтительными селектируемыми маркерами для применения в культивируемых клетках млекопитающих являются гены, придающие клеткам устойчивость к лекарственным средствам, таким как неомицин, гигромицин и метотрексат. Селектируемый маркер может быть амплифицируемым селектируемым маркером. Предпочтительными амплифицируемыми селектируемыми маркерами являются ген DHRR и ген устойчивости к неомицину. Селектируемые маркеры рассмотрены Thily (Mammalian Cell Technology, Butterworth Рuоblishers, Stoneham, МА, который включен в ссылки). Выбор селектируемых маркеров вполне доступен при уровне обычной квалификации в этой области.

Селектируемые маркеры могут быть введены в клетку на отдельном векторе одновременно с последовательностью рецептора глюкагона или они могут быть введены на том же векторе. Если их вводят на одном векторе, то селектируемый маркер и последовательность рецептора глюкагона могут находиться под контролем различных промоторов или одного и того же промотора, причем последний вариант даст дицистронную мРНК. Конструкции этого типа известны специалистам (например, Lеvinsоn аnd Simonsen, U.S. Раtеnt 4713-339). Предпочтительно бывает добавление дополнительной ДНК, известной как "ДНК-носитель", к смеси, которая вводится в клетки.

Трансфицированным клеткам млекопитающих позволяют расти в течение периода времени обычно 1-2 дней, после чего они начинают экспрессировать целевую последовательность (целевые последовательности) ДНК. Затем применяют отбор при помощи лекарственного средства для селекции по росту клеток, которые экспрессируют стабильно селектируемый маркер. Для клеток, трансфицированных амплифицируемым селектируемым маркером, концентрацию лекарственного средства можно увеличивать ступенчато для селекции на повышенное число копий клонированных последовательностей, т. е. на повышение уровня экспрессии. Клетки, экспрессирующие введенные последовательности, отбирают и подвергают скринингу на продуцирование целевого белка в желаемой форме и на желаемом уровне. Клетки, удовлетворяющие этим критериям, можно затем клонировать и оценивать на производительность.

Предпочтительными прокариотическими клетками-хозяевами для применения в проведении данного изобретения являются штаммы бактерии Escheriсhiа соli, хотя также можно использовать Baccillus и другие роды. Техника трансформации этих хозяев и экспрессии чужеродных последовательностей ДНК хорошо известны в этой области исследований (см.например Maniatis et аl., Molecular Сlоning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, который включен в ссылки; или Sаmbrооk еt аl., suрrа). Векторы, применяемые для экспрессии клонированных последовательностей ДНК в бактериальных хозяевах, обычно содержат селектируемый маркер, такой как ген устойчивости к антибиотику, и промотор, функционирующий в клетке-хозяине. Предпочтительными промоторами являются промоторные системы trp (Nichols and Yanofsky, Meth. Enzymol. 101: 155-164, 1983), lac (Casadaban et al., J.Bacteriol. 143:971-980, 1980) и фага (Quееn, J.Mоl. Аррl. Genet 2:1-10, 1983). Плазмидами, применимыми для трансформации бактерий, являются рВР 322 (Bolivar еt аl., Gene 2:95-113, 1977), рUС (Messing, Meth. Еnzymоl. 101:20-78, 1983; Viеirа аnd Messing, Gеnе 19:259-268, 1982), pCQV2 (Оuееn, ibid.) и их производные. Плазмиды могут содержать как вирусные, так и бактериальные элементы. После данных здесь объяснений промоторы, терминаторы и способы введения экспрессирующих векторов, кодирующих рецепторы глюкагона данного изобретения в клетки растений, птиц, насекомых, будут ясны для специалистов в данной области. Применение бакуловирусов, например, в качестве векторов для экспрессии гетерологичных последовательностей ДНК в клетках насекомых было рассмотрено Atkinson еt аl. (Реstiс. Sci. 28: 215-224, 1990). Кроме того, применение Аgrоbасtеriumrhizogenes в качестве векторов для экспрессии генов в клетках растений было рассмотрено в обзоре Sinkar еt аl. (J.Вiоsсi. (Ваngаlоrе) 11:47-58, 1987).

Клетки-хозяева, содержащие конструкции ДНК данного изобретения, культивируют для экспрессии сегмента ДНК, кодирующего рецептор глюкагона. Клетки культивируют в соответствии со стандартными способами в культуральной среде, содержащей питательные элементы, необходимые для роста выбранных клеток-хозяев. Известно много подходящих сред, которые обычно содержат источник углерода, источник азота, незаменимые аминокислоты, витамины и минеральные соли, а также другие компоненты, например факторы роста или сыворотку, которые могут быть необходимы для определенных клеток-хозяев. Ростовая среда будет селектировать клетки, содержащие конструкцию (конструкции) ДНК, например, при помощи селекции с применением лекарственного средства или селекции при недостаточности основного питательного элемента, что дополняется селектируемым маркером на конструкции ДНК или на другом векторе, котрансфицируемым вместе с конструкцией ДНК.

Подходящие условия роста для дрожжевых клеток предусматривают, например, культивирование в химически определенной среде, содержащей источник азота, который может быть иным, чем аминокислоты, или дрожжевой экстракт, неорганические соли, витамины и добавки незаменимых аминокислот при температуре между 4^oС и 37^oС, предпочтительно при 30^oС. рН среды поддерживают предпочтительно более 2 и менее 8, более предпочтительно 5-6. Способы для поддержания стабильного рН предусматривают применение буферов и постоянного контроля рН. Предпочтительным агентом для контроля рН является гидроксид натрия. Предпочтительными буферными агентами являются янтарная кислота и Bis-Tris (Sigma Chemical Co., St.Louis, МО). Вследствие тенденции дрожжевых клеток-хозяев гипергликозилировать гетерологичные белки, может быть предпочтительно экспрессировать рецепторы глюкагона данного изобретения в дрожжевых клетках, имеющих дефект в гене, необходимом для связанного с аспарагином гликозилирования. Такие клетки предпочтительно растут в среде, содержащей осмотический стабилизатор. Предпочтительным осмотическим стабилизатором является сорбит, добавляемый в среду при концентрации между 0,1 М и 1,5 М,