Способ идентификации ингибитора якорной функции белка и способ определения присутствия в клетке кальцинейринсвязывающего и пка связывающего якорного белка

Способ идентификации ингибитора якорной функции белка и способ определения присутствия в клетке кальцинейринсвязывающего и пка связывающего якорного белка

Реферат

 

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии и может быть использовано для модуляции якорной функции белка. Ингибитор связывания между якорным белком и регуляторной субъединицей цАМФ-зависимой протеинкиназы (ПКА) типа I или кальцинейрином идентифицируют путем инкубации якорного белка, иммобилизованного на твердом носителе, с меченым партнером связывания в присутствии и в отсутствие предлагаемого ингибитора. Присутствие в клетке кальцинейринсвязывающего и ПКА-связывающего якорного белка проводят инкубированием лизата клеток с иммобилизованным на твердом носителе кальцинейрином. После промывания твердый носитель контактируют с меченой регуляторной субъединицей ПКА. Связавшуюся меченую субъединицу детектируют. Изобретение позволяет определять белки, связывающие и ПКА, и кальцинейрин, а также идентифицировать ингибиторы связывания. 2 с. и 4 з.п.ф-лы, 5 ил., 1 табл.

Данная заявка является частичным продолжением находящейся в процессе одновременного рассмотрения заявки на патент США с порядковым номером 08/503226, поданной 17 июля 1995 года, которая, в свою очередь, является частичным продолжением заявки с номером 08/404731, поданной 15 марта 1995 года, которая, в свою очередь, является частичным продолжением находящейся в процессе одновременного рассмотрения заявки на патент США с номером 08/344227, поданной 23 ноября 1994 года.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ Данное изобретение относится в общем к регуляции фосфатазной ферментативной активности кальцинейрина и модуляции экспрессии интерлейкина 2 Т-клетками. Более конкретно, данное изобретение относится к ингибированию фосфатазной активности кальцинейрина некоторыми пептидами и усилению экспрессии Т-клетками интерлейкина 2 посредством обработки этих клеток некоторыми другими пептидами.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ Кальцинейрин является Са²⁺/кальмодулин-зависимой протеинфосфатазой и участвует во многих внутриклеточных путях передачи сигналов. Guerini and Klee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9183-9187 (1989). Этот фермент был идентифицирован в эукариотических клетках в диапазоне от дрожжей до млекопитающих. Cyert and Thorner, J. Cell. Biol., 107:841a (1989) и Klee et al., Adv. Enzymol. , 61: 149-200 (1984). Поскольку кальцинейрин может участвовать во многих путях передачи сигналов в одной и той же клетке, должны существовать некоторые средства специфического нацеливания активности кальцинейрина. Одним из клеточных средств для специфического нацеливания активности фермента является нацеливание посредством компартментализации. Компартментализация разделяет пути передачи сигналов и способствует специфичности клеточных ответов на различные стимулы. Компартментализация определенных ферментов осуществляется посредством взаимодействия этих ферментов со специфическими якорными белками. Например, цАМФ-зависимая протеинкиназа (ПКА) закрепляется в специфических внутриклеточных сайтах посредством связывания с якорными белками А-киназы (АКАР). Поскольку было показано, что АКАР связывает и белки, иные, чем ПКА, это семейство белков называется здесь обычно якорными белками. Hirsch et al., J. Biol. Chem., 267:2131-2134 (1992). цАМФ активирует ПКА связыванием с регуляторными субъединицами (Р) покоящегося голофермента ПКА и вызывает высвобождение активной каталитической субъединицы (К). Существуют два класса субъединицы Р; PI и PII, которые образуют голоферменты ПКА типа I и типа II. Субклеточные распределения этих изоформ ПКА, по-видимому, являются различными. Имеется сообщение, что изоформы PI (PI или PI) являются преимущественно цитоплазматическими и не присутствуют в ядерном компартменте, тогда как изоформы PII (PII и PII) являются частицами и связаны либо с плазматической мембраной, компонентами цитоскелета, секреторными гранулами, аппаратом Гольджи, центросомами, либо, возможно, с ядрами.

Якорные белки были обнаружены в разнообразных организмах. Были идентифицированы по меньшей мере семь белков, которые связывают регуляторную субъединицу ПКА в Aplysia californica, морском беспозвоночном животном. Cheley et al., J. Biol. Chem., 269:2911-2920 (1994). Один из таких белков присутствует в большом количестве в неочищенных мембранных фракциях и стабилизированных таксолом микротрубочках и может, следовательно, прикреплять микротрубочки к клеточной мембране, а также связывать ПКА. Был идентифицирован якорный белок млекопитающих, который связан с микротрубочками; ассоциированный с микротрубочками белок 2 (МАР2) присоединяет ПКА к цитоскелету. Threurkauf and Valee, J. Biol. Chem., 257:3284-32-90 (1982) и DeCamilli et al. , J. Cell. Biol. 103:189-203 (1986). ПКА-связывающий сайт на МАР2 представляет собой пептид из 31 остатка в аминоконцевом районе этой молекулы. Rubino et al. , Neuron, 3: 631-638 (1989) и Obar et al., Neuron, 3:639-645 (1989).

Другой якорный белок, который связан с микротрубочками, АКАР 150, накапливается в дендритах в тесной связи с микротрубочками. Glantz et al., Mol. Biol. Cell, 3:1215-1228 (1992). АКАР 150 присутствует в нескольких типах нервных клеток и является членом семейства якорных белков, которые являются основными якорными белками в мозге млекопитающих. Другие члены этого семейства включают в себя АКАР 75, обнаруженный в бычьем мозге, и АКАР 79, обнаруженный в мозге человека. Glantz et al., J. Biol. Chem., 268:12796-12804 (1993). По-видимому, АКАР 75 связывает элементы цитоскелета через два несмежных района вблизи N-конца АКАР 75. АКАР 79 присутствует преимущественно в постсинаптических плотностях (PSD) в переднем мозге человека. Carr et al., J. Biol. Chem., 267:16816-16823 (1992).

Были также охарактеризованы другие якорные белки. Было показано, что выдерживание зернистых клеток яичника с фолликулостимулирующим гормоном и эстрадиолом положительно регулирует экспрессиию АКАР 80 кДа. Carr et al., J. Biol. Chem. , 268:20729-20732 (1993). Другой АКАР, Ht31, был клонирован из библиотеки кДНК щитовидной железы человека. Carr et al., J. Biol. Chem., 267: 13376-13382 (1992). Другой якорный белок, АКАР 95, меняет свою внутриклеточную локализацию во время клеточного цикла. АКАР 95 является интегральным ядерным белком во время интерфазы, но становится связанным с цитоплазматической ПКА при разрушении ядерной мембраны во время митоза. Это предполагает, что АКАР 95 мог бы играть роль в нацеливании активности определенных изоформ ПКА во время отвечающих на цАМФ событий, связанных с клеточным циклом. Coghlan et al., J. Biol. Chem., 269:7658-7665 (1994). Другие известные якорные белки включают в себя АКАР 85 кДа, который связывает ПКА с аппаратом Гольджи (Rios et al., EMBO J., 11:1723-1731 (1992)), и АКАР 350 кДа, который связывает ПКА с центромерами (Keryer et al., Exp. Cell Res., 204:230-240 (1993)).

Известные якорные белки связывают ПКА по обычному механизму. Хотя первичная структура якорных белков не является консервативной, каждый имеет мотив вторичной структуры, который включает в себя амфипатический спиральный район. Scott and McCartney, Mol. Endo., 8:5-11 (1994). Связывание якорных белков с регуляторной субъединицей ПКА блокируется пептидом, который имитирует эту спиральную структуру ПКА-связывающего района якорных белков. Разрушение спиральной структуры этого пептида аминокислотной заменой устраняет блокирование связывания ПКА с якорным белком (Carr et al., J. Biol. Chem., 266: 14188-14192 (1991)), показывая, что связывание ПКА происходит в амфипатической спирали якорных белков и управляется вторичной структурой молекул якорных белков. Это внутриклеточное связывание и локализация ПКА якорными белками обеспечивает средство для расхождения киназы, которая, подобно кальцинейрину, является общей для многих путей передачи сигналов, но все же может действовать специфическим в отношении конкретного пути образом.

ПКА функционирует во многих внутриклеточных путях. Например, было показано, что ингибирование связывания между АКАР 79 и ПКА в нейронах гиппокампа ингибирует рецепторы альфа-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изксазолпропионовой кислоты/каината-глутамата. Rosenmund et al., Nature, 368:853-856 (1994). Это свидетельствует о том, что ПКА регулирует эти рецепторы. ПКА регулирует также активность гликогенфосфорилазы обратимым фосфорилированием фермента в ответ на гормонально индуцируемые увеличения внутриклеточного цАМФ. Walsh et al., J. Biol. Chem., 243:3763-3765 (1969). Было также показано, что цАМФ ингибирует передачу сигнала через пути МАР-киназы. Wu et al., Science, 262: 1065-1072 (1993). Это ингибирование опосредовано активацией ПКА, которая ингибирует активацию Raf-1 посредством Ras, блокируя тем самым путь МАР-киназы. Vojtek et al., Cell, 74:205-214 (1993) и Hafner et al., Mol. Cell Biol., 14: 6696-6703 (1994). Эти пути являются важными во многих типах клеток, и предполагалось их участие во многих клеточных функциях, таких как транскрипционная активация гена интерлейкина 2, которая является важной в активации Т-клеток. Weiss and Littman, Cell, 76:263-274 (1994); Owaki et al., EMBO J., 12:4367-4373 (1993).

Подобно ПКА, кальцинейрин связан с активацией Т-клеток. Clipstone and Crabtree, Nature, 357: 695-697 (1992); O'Keefe et al., Nature, 357:692-694 (1992). В Т-клетках кальцинейрин участвует в регуляции экспрессии IL-2 после стимуляции Т-клеток. Weiss and Littman, supra. Было показано, что ядерный фактор активированных Т-клеток (NFATp) является субстратом фосфатазной активности кальцинейрина. Было сделано предположение, что, после стимуляции Т-клеток, опосредованное кальцинейрином дефосфорилирование NFATp делает возможной транслокацию NFATp из цитоплазмы в ядро, где NFATp взаимодействует с Fos и Jun с индукцией экспрессии гена IL-2. Jain et al., Nature, 365:352-355 (1993).

Роль кальцинейрина в активации Т-клеток обеспечивает мишень для терапевтического вмешательства в Т-клеточно-опосредованные нарушения, и были разработаны многочисленные лекарственные средства для ингибирования кальцинейрина. Два кальцинейрин-ингибирующих лекарственных средства, циклоспорин А (циклоспорин) и FK506, использовали в клинических условиях. Thomson and Starzl, Immunol. Rev., 136:71-98 (1992). Как циклоспорин, так и FK506 ингибируют кальцинейрин только после связывания с другими внутриклеточными белками, известными как иммунофилины (циклофилин и FKBP 12 соответственно). Schreiber and Crabtree, Immunology Today, 13:136-142 (1992). Таким образом, циклоспорин и FK506 действуют как пролекарства. После связывания с их соответствующими иммунофилинами комплексы лекарственное средство/иммунофилин связывают кальцинейрин, ингибируя посредством этого фосфатазную активность.

Ингибирование кальцинейрина наиболее эффективно использовали в лечении отторжения трансплантата после трансплантации органов. Циклоспорин и FK506 использовали после пересадки почек, печени, сердца, легкого и костного мозга. Canadian Multicentre Transplant Study Group, N. Engl. J. Med., 314: 1219-1225 (1986); Oyer et al. , Transplant Proc., 15:Suppl 1:2546-2552 (1983); Starzl et al. , N. Engl. J. Med., 305:266-269 (1981); The Toronto Lung Transplant Group, JAMA, 259:2258-2262 (1988); и Deeg et al., Blood, 65: 1325-1334 (1985). Применение этих лекарственных средств значимо удлиняло выживание трансплантата и уменьшало смертность после трансплантации. Najarian et al. , Ann. Surg., 201:142-157 (1985) и Showstack et al., N. Engl. J. Med., 321:1081-1092 (1989).

Циклоспорин использовали также в различных связанных с аутоиммунитетом заболеваниях. Увеит обычно дает улучшение в пределах нескольких недель терапии, но быстро дает рецидив после прекращения введения циклоспорина. Nussenblatt et al., Am. J. Ophthalmol., 96:275-282 (1983). Подобным образом, псориаз обычно обнаруживает улучшение при терапии циклоспорином, но быстро дает рецидив после лечения. Ellis et al., JAMA, 256:3110-3116 (1986). Периоды "медового месяца" инсулиннезависимости могут быть индуцированы и пролонгированы при возникновении сахарного диабета как типа I, так и типа II при введении циклоспорина в пределах двух месяцев инсулиновой терапии. Feutren et al., Lancet, 2:119-124 (1986) и Bougneres et al., N. Engl. J. Med., 318: 663-670 (1988). Различные нефропатии, в том числе очаговые и сегментальные с минимальными изменениями, мембранные и IgM-опосредованные нефропатии, также могут быть чувствительными к циклоспорину, хотя наблюдаемые уменьшения в протеинурии могут быть обусловлены уменьшением скорости гломерулярной фильтрации, а не заживалением базальной мембраны. Tejani et al., Kidney Intl. , 29: 206 (1986). Введение циклоспорина оказывает также зависимое от дозы действие на ревматоидный артрит, хотя такое лечение связано с высокой частотой нефротоксичности. Forre et al., Arthritis Rheum., 30:88-92 (1987).

Как упоминалось выше, циклоспорин был связан с нефротоксичностью. Mason, Pharmacol. Rev., 42:423-434 (1989). Пониженная почечная функция встречается фактически у всех пациентов, которых лечат циклоспорином. Обычно это может быть устранено прекращением циклоспориновой терапии. К сожалению, у реципиентов органов-трансплантатов замена циклоспорина другими обычно используемыми иммуносупрессорами несет большой риск отторжения трансплантата. У пациентов с трансплантированной почкой это может потребовать повторного установления диализа. В случае пациентов, подвергшихся пересадке сердца, легкого или печени, отторжение трансплантата может быть фатальным. Хотя и менее обычно, чем нефротоксичность, нейротоксичность и гепатотоксичность также связаны с циклоспориновой терапией. De Groen et al., N. Engl. J. Med., 317:861-866 (1987) и Kahan et al., Transplantation, 43:197-204 (1987).

Значительная токсичность стала также очевидной в использовании FK506. Подобно циклоспорину, FK506 связан с нефротоксичностью. Peters et al., Drugs, 4: 746-794 (1993). Клиническая картина, морфология повреждений и частота встречаемости приблизительно эквиваленты этим параметрам циклоспорина. McCauley, Curr. Op. Nephrol. Hyperten., 2:662-669 (1993). Нейротоксичность была также связана с FK506. Eidelman et al., Transplant. Proc., 23: 3175-3178 (1991) и Fung et al., Transplant. Proc., 23:3105-3108 (1991). В противоположность циклоспорину, FK506 обладает скорее гепатотрофическим, чем гепатотоксическим действием. Peters et al., supra.

Ввиду значительной потенциальной токсичности иммуносупрессивных агентов, таких как циклоспорин и FK506, ясно, что существует потребность в данной области в отношении дополнительных агентов, ингибирующих кальцинейрин. Эти агенты предпочтительно должны быть ассоциированы с меньшими токсичными побочными действиями, чем доступные в настоящее время агенты, и, следовательно, могли бы обеспечить прогресс в иммуносупрессивной терапии. Кроме того, существует потребность в агентах, которые ингибируют ПКА в Т-клетках, делая возможной повышенную экспрессию интерлейкина 2 этими клетками.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ Данное изобретение основывается, отчасти, на открытии того, что кальцинейрин связывает АКАР 79. Связыванием как ПКА, так и кальцинейрина АКАР 79 ко-локализует киназу и фосфатазу, что может регулировать поток сигналов через специфический путь передачи сигналов. Таким образом, данное изобретение обеспечивает композиции и способы для выделения кальцинейрина, а также для ингибирования активности кальцинейрина в клетке. Способы выделения предусматривают контактирование клеточной фракции с АКАР 79 или его кальцинейринсвязывающим фрагментом, который был иммобилизован на твердом субстрате, и затем элюцию из него кальцинейрина. Способы ингибирования кальцинейрина предусматривают контактирование клетки с АКАР 79 или его кальцинейринсвязывающим фрагментом. Предпочтительно, кальцинейринсвязывающий пептид не связывает также и ПКА. Предпочтительные пептиды содержат следующую аминокислотную последовательность: Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Ser-Ser-Lys-Glu-Glu-Lys-Pro (SEQ ID NO:1) Альтернативные пептиды, используемые в применении на практике способов ингибирования кальцинейрина данного изобретения, включают в себя: Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Ser-Ser-Lys-Glu-Glu-Lys-Pro-Leu-Gln (SEQ ID NO:2) и Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Ser-Ser-Lys-Glu-Glu-Lys-Pro-Phe-Lys (SEQ ID NO:3).

Эти пептиды являются гомологичными аминокислотным последовательностям АКАР 79, связывающим кальцинейрин. Хотя эти пептиды подобны кальцинейринсвязывающему району FKBP12, в отличие от ингибирования кальцинейрина комплексом FK506/FKBP12, эти пептиды ингибируют активность кальцинейрина без необходимости взаимодействия с другой молекулой.

Эти пептиды могут быть модифицированы для облегчения поступления в клетку, например, сопряжением с растворимой в липидах частью молекулы. Например, пептиды могут быть конъюгированы с миристиновой кислотой. Альтернативно эти пептиды могут быть упакованы в липосомы, которые могут сливаться с клеточными мембранами и высвобождать эти пептиды в клетки.

Другим аспектом данного изобретения являются способы определения, содержит ли клетка кальцинейринсвязывающий и ПКА-связывающий якорный белок. Эти способы обычно предусматривают лизис клетки с образованием лизата; инкубирование лизата с твердым носителем, имеющим иммобилизованные на нем молекулы кальцинейрина; вымывание лизата из твердого носителя; контактирование твердого носителя с меченой регуляторной субъединицей ПКА, вымывание несвязавшейся регуляторной субъединицы из твердого носителя; детектирование метки, остающейся на твердом носителе; и определение на основе этого детектирования присутствия кальцинейринсвязывающего и ПКА-связывающего якорного белка в клетке. Альтернативно регуляторная субъединица ПКА может быть иммобилизована на твердом носителе, а кальцинейрин может быть меченой молекулой. Обычно регуляторная субъединица ПКА будет субъединицей РII.

Эти способы применимы для идентификации дополнительных белков, связывающих как ПКА, так и кальцинейрин. Идентификация других подобных белков может обеспечить тканеспецифические мишени для терапевтического вмешательства.

Данным изобретением рассматриваются также способы для идентификации соединений, которые модулируют связывание между кальцинейрином и якорным белком кальцинейрина. Либо кальцинейрин, либо якорный белок может быть связан с твердым носителем. Несвязанный патнер связывания является детектируемо меченным. Партнеры связывания инкубируют в присутствии тест-соединения. Действие тест-соединения на связывание между кальцинейрином и якорным белком кальцинейрина определяют мониторингом количества метки, связанной с иммобилизованным партнером связывания. Уменьшение количества метки, связанной в присутствии тест-соединения, в сравнении с количеством метки, связанной в отсутствие тест-соединения, указывает на то, что тест-соединение является ингибитором связывания между кальцинейрином и якорным белком кальцинейрина. Могут быть также использованы другие анализы, такие как анализы сцинтилляционной близости.

Дополнительный аспект данного изобретения включает в себя способы усиления экспрессии интерлейкина 2 Т-клетками. Ингибирование киназной активности ПКА или локализации ПКА в Т-клетках усиливает экспрессию белков под контролем промоторных элементов, регулирующих транскрипцию гена интерлейкина 2. Эти способы обычно включают в себя контактирование Т-лимфоцита с одной из следующих аминокислотных последовательностей: Gly-Arg-Arg-Asn-Ala-Ile-His-Asp-Ile (SEQ ID NO:5) или Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile- Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala-Tyr (SEQ ID NO:9).

Пептид SEQ ID NO:5 является пептидом, ингибирующим киназную активность ПКА. Пептид SEQ ID NO:9 является пептидом, который гомологичен ПКА-связывающему району якорного белка НТ31. Эти пептиды могут быть модифицированы для облегчения прохождения в клетки или упакованы в липосомы, как описано выше. Данное изобретение рассматривает различные применения способов с использованием этих пептидов. Например, эти способы могут быть использованы для стимуляции иммунного ответа, для стимуляции активированных Т-клеток для выбранного клонального размножения или для усиления Т-клеточных ответов на экспериментальные стимулы для оценки ранних событий в биологии Т-клеток и активации иммунного ответа.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР Фиг. 1А-1В иллюстрируют ингибирование фосфатазной активности кальцинейрина полноразмерным АКАР 79 и кальцинейринсвязывающим фрагментом АКАР 79.

Фиг.2А-2С иллюстрируют субклеточную локализацию ПКА типа II и кальцинейрина, а также ко-локализацию (совместную локализацию) ПКА типа II и кальцинейрина.

Фиг. 3 иллюстрирует гомологию между клоном 11.1 и изоформой 11.1 кальцинейрина человека.

Фиг. 4 иллюстрирует увеличение внутриклеточной концентрации цАМФ, индуцируемое обработкой клеток Jurkat форсколином и IBMX.

Фиг. 5А-5Н иллюстрируют FACS-графики, демонстрирующие действие ингибирования и делокализации ПКА на транскрипцию белков под контролем промотора интерлейкина 2.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Пептиды, применяемые в способах данного изобретения, могут быть синтезированы в растворе или на твердом носителе в соответствии с общепринятыми способами, как описано в Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2^nd ed. Pierce Chemical Company (1984) или Tam et al., J. Am. Chem. Soc., 105: 6442 (1983). Обе статьи включены здесь в качестве ссылок. Пептиды могут быть миристоилированы стандартными способами, как описано в работе Eichholtz et al. , J. Biol. Chem., 268:1982-1986 (1993), включенной здесь в качестве ссылки. Инкапсулирование пептидов в липосомы может быть также выполнено стандартными способами, как описано в общем виде в патентах США с номерами 4766046, 5169637; 5180713; 5185154; 5204112 и 5252263 и Патентной заявке РСТ с номером 92/02244, все включены здесь в качестве ссылок.

Нижеследующие примеры приведены в качестве иллюстрации, а не для ограничения. Пример 1 описывает связь кальцинейрина с АКАР 79 и ПКА. Пример 2 относится к ингибированию активности кальцинейрина с использованием пептидов, полученных из аминокислотных последовательностей АКАР 79. Пример 3 относится к субклеточному распределению ПКА типа II и кальцинейрина. Пример 4 описывает дигибридный анализ, демонстрирующий физиологическое связывание между АКАР 79 и кальцинейрином. Пример 5 относится к анализу связывания АКАР 79 и кальцинейрина. Пример 6 описывает применение мутантов кальцинейрина для определения сайта связывания АКАР 79. Пример 7 относится к взаимодействию между АКАР 79 и субъединицей PI ПКА. Пример 8 описывает способ скрининга на ингибиторы компартментализации ПКА. Пример 9 описывает участие якорного белка в модулировании экспрессии IL-2. Пример 10 относится к идентификации других АКАР 79-связывающих белков. Пример 11 описывает взаимодействие между АКАР 79 и ПКС. Пример 12 относится к потенциальному терапевтическому применению якорных белков.

Пример 1 В этом примере продемонстрирована природно встречающаяся связь кальцинейрина с АКАР 79 и ПКА. Таким образом, АКАР 79 функционирует для ко-локализации (совместной локализации) как встречающейся повсюду киназы, так и встречающейся повсюду фосфатазы. Эта совместная локализация может обеспечивать специфическую регуляцию ферментов в путях передачи сигналов через фосфорилирование или дефосфорилирование, осуществляемое этими ферментами.

Иммунопреципитацию кальцинейрина (CaN) из очищенного кальмодулин-агарозой экстракта бычьего мозга получали с использованием аффинно-очищенных антител, специфических либо для CaN А, либо для CaN В, как описано в общих чертах в Harlowe and Lane, Antibodies: A Laboratoty Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1988), за исключением того, что была включена конечная очистка с использованием буфера А (10 мМ HEPES рН 7,9, 1,5 мМ MgCl₂, 10 мМ KCl, 1 мМ ПМСФ и 10 мкМ IBMX)+0,4 М NaCl. ПКА-активность измеряли, как описано в Scott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4379-4383 (1985), включенной здесь в качестве ссылки, после элюции иммунопреципитата 0,1 мМ цАМФ. Фосфорилирование иммунопреципитированных белков инициировали добавлением 0,1 мМ ³²Р-АТФ (1,510⁵ имп/мин/нмоль) и, после 30 мин при 30^oС, реакции останавливали добавлением буфера для нанесения с ДСН и подвергали электрофорезу на ДСН-ПААГ. Р-субъединицу ПКА очищали из 30-60% (NH₄)₂SO₄-фракции экстракта мозга с использованием цАМФ-агарозы способами, описанными в работе Coghlan et al., J. Biol. Chem., 269:7658-7665 (1994) (включенной здесь в качестве ссылки), за исключением того, что белок элюировали 0,5 мМ пептидом Ht31 (SEQ ID NO:4). Вестерн-блоты и наложения PII ПКА выполняли, как описано в Coghlan et al., supra.

Киназную активность детектировали в очищенном кальмодулином экстракте, и она была увеличенной в 1233,6 раза ( стандартное отклонение; n=3) в СаN-иммунопреципитате и специфически ингибировалась пептидом, ингибирующим киназную активность ПКА, пептидом ПКИ (SEQ ID NO:5), что указывало на то, что каталитическая (К) субъединица ПКА была компонентом выделенного комплекса. Бычий гомолог АКАР 79 (АКАР 75) и PII, оба субстрата для К-субъединицы, также присутствовали в этом иммунопреципитате и фосфорилировались при добавлении цАМФ и ³²Р-АТФ. В дополняющих экспериментах Р-субъединицы ПКА выделяли из неочищенных экстрактов бычьего мозга аффинной хроматографией на цАМФ-агарозе. Обработка аффинной колонки пептидом Ht31 специфически элюировала АКАР 75, отделяя его от цАМФ-связанной PII, и также высвобождала субъединицы как CaN А, так и CaN В. Было обнаружено, что приблизительно 5% тотального CaN, присутствующего в лизате, были связаны с АКАР 75 и PII, как было детектировано на Вестерн-блотах. В целом, эти результаты предполагают одновременную связь ПКА и CaN с якорным белком.

Пример 2 Данный пример демонстрирует ингибирование фосфатазной активности кальцинейрина пептидами из АКАР 79.

Для определения, является ли связывание пептида АКАР 79 ингибирующим, активность кальцинейрина (CaN) анализировали в присутствии рекомбинантного АКАР 79. Вкратце, рекомбинантный АКАР 79 экспрессировали в Е. coli, как описано в Carr et al., J. Biol. Chem., 267:16816-16823 (1992), включенной здесь в качестве ссылки. CaN и конститутивно активный укороченный мутант CaN₄₂₀ (укороченную Са²⁺/кальмодулин-независимую конститутивно активную форму CaN (Perrino et al., J. Biol. Chem., in press) экспрессировали в клетках Sf9 и очищали на кальмодулин-Сефарозе, как описано в работе Perrino et al., J. Biol. Chem. , 267: 15965-15969 (1992), включенной здесь в качестве ссылки. Фосфатазную активность в отношении ³²Р-PII-пептидного субстрата измеряли, как описано в Perrino et al., supra. CaN (30 нМ), кальмодулин (100 нМ) и ³²Р-РII-пептид (22 мкМ) инкубировали с белком АКАР 79 и пептидом АКАР 79 (SEQ ID NO:1 - аминокислоты 81-102) в диапазоне концентраций, указанном на фиг.1В. Кальмодулин опускали в анализах CaN₄₂₀. ³²Р, высвобожденный из субстрата, измеряли в трех повторностях проб в трех отдельных экспериментах с использованием сцинтилляционного счета. Константу ингибирования (К_i) рекомбинантного АКАР 79 в отношении CaN определяли посредством линейного регрессионного анализа данных. Величины К, для пептида АКАР 79 оценивали путем определения IC₅₀ с использованием фиксированной концентрации субстрата при Km (42 мкМ).

Фиг. 1А иллюстрирует график Lineweaver-Burk АКАР 79-ингибирования как полноразмерного CaN (Са²⁺/кальмодулин-зависимого) (кружки), так и CaN₄₂₀ (квадраты) неконкурентным образом в отношении фосфорилированного РII-пептидного субстрата. Белые символы представляют фосфатазную активность в отсутствие АКАР 79, а черные символы представляют фосфатазную активность в присутствии АКАР 79. Синтетический пептид, соответствующий пептиду АКАР 79, ингибировал как полноразмерный CaN (черные кружки), так и CaN₄₂₀, тогда как пептид Ht31 не был ингибитором CaN (фиг.1В). Наблюдаемое ингибирование было специфическим для кальцинейрина; пептид АКАР 79 не оказывал значимого влияния на активность протеинфосфатаз 1 (белые ромбы) или 2А (кресты) при таких высоких концентрациях пептида, как 0,4 мМ. Хотя сайты связывания CaN на АКАР 79 и FKBP-12 являются сходными, их различия могут иметь функциональное значение: FK506 (2 мкМ) не влиял на силу ингибирования и рекомбинантный АКАР 79 не проявлял пептидилпролилизомеразную активность в отношении флуоресцентного пептидного субстрата. Кроме того, субъединица CaN В, которая необходима для взаимодействия FK506/FKBP с субъединицей CaN А, не требуется для взаимодействия АКАР 79 с субъединицей CaN А. Кроме того, хотя взаимодействие FK506/FKBP с CaN А является кальций/кальмодулинзависимым, АКАР 79-ингибирование активности кальцинейрина является кальций/кальмодулиннезависимым. В целом, эти открытия предполагают, что CaN в его неактивном состоянии локализуется (якорным) белком АКАР 79 способом, аналогичным прикреплению связанной с белком ПКА.

Пример 3 Данный пример демонстрирует субклеточное распределение ПКА типа II и кальцинейрина в различных тканях.

Субклеточная локализация многих протеинкиназ и протеинфосфатаз определяется связью с нацеливающими субъединицами. АКАР 79 является новым членом этого класса регуляторных белков, так как он выполняет бифункциональную роль в локализации как ПКА, так и СаN.

Клетки культивировали, фиксировали формалином и иммуноокрашивали, как описано в Rosenmund et al., Nature, 368:853-856 (1994). ФИТЦ-конъюгированные антикозьи вторичные антисыворотки использовали для окрашивания РII. Биотинилированные антикроличьи вторичные антитела и стрептавидин-Техасский красный (Jackson) использовали в окрашивании на СаN. Изображения получали с использованием конфокальной лазерной сканирующей системы Biorad MRC-600 (фильтры А1 и А2) с микроскопом Nikon optiphot 2, снабженным масляно-иммерсионной линзой 60х planappo chromat (1,6 NA). Конфокальные срезы имели абсолютную толщину между 1,5 и 2 мкм.

Гомологи АКАР 79 наблюдались в бычьем, свином, кроличьем и мышином мозге. Это указывает на то, что ко-локализация ПКА и CaN может быть универсальным феноменом, который адаптирует нейроны в отношении специфических событий трансдукции (передачи) сигналов. С использованием иммуноцитохимических способов субклеточное распределение ПКА типа II и CaN исследовали в культивируемых нейронах гиппокампа. Распределения окрашивания для PII (зеленая метка на фиг. 2А) и CaN (красная метка на фиг.2В) были регионально разбросаны и перекрывались в невритах (PII является красным и CaN является зеленым на фиг.2С). Эти открытия согласуются с ко-локализацией ПКА типа PII и CaN якорным белком и предполагают роль этого трехкомпонентного комплекса в регуляции синаптической передачи возбуждения. Это согласуется с экспериментами, демонстрирующими ко-локализацию РII и АКАР 79 в этих клетках, и с исследованиями, показывающими, что АКАР 79, ПКА типа II и CaN являются компонентами постсинаптических плотностей. Потенциальные субстраты для локализованного трехкомпонентного комплекса трансдукции сигналов могут включать в себя АМРА/каинатные рецепторы, которые модулируются нацеленной якорным белком ПКА.

Пример 4 Данный пример демонстрирует взаимодействие между АКАР 79 и кальцинейрином в дрожжевом дигибридном анализе. С использованием АКАР 79 в качестве "приманки" было обнаружено, что кальцинейрин, кодируемый кДНК из библиотеки мышиных Т-клеток, связывается с АКАР 79.

Этот анализ выполняли по существу, как описано в статье Durfee, et al., Genes and Development 7:555-567 (1993), включенной здесь в качестве ссылки. "Мишенью" и "приманкой" были две плазмиды, каждая из которых содержит часть фактора транскрипции Gal-4. Плазмида-"приманка" (pAS1) была плазмидой на основе плазмиды 2 микрон с промотором АДГ, связанным с ДНК-связывающей субъединицей Gal-4 [аминокислоты 1-147, как описано в статье Keegan et al., Science, 231:699-704 (1986), включенной здесь в качестве ссылки], за которым следовали гемагглютининовая (ГА) метка, поликлональный сайт и терминатор АДГ. Отбор поддерживали с использованием среды SC-Trp. Конструкцией-"мишенью" была leu2, плазмида на основе плазмиды 2 микрон, содержащая промотор и терминатор АДГ с доменом II активации транскрипции Gal-4 [аминокислоты 768-881, как описано в статье Ма and Ptashne, Cell, 48:847-853 (1987), включенной здесь в качестве ссылки], за которыми следовал сайт множественного клонирования. Этот вектор, рАСТ, использовали в конструировании библиотеки слитых кДНК мышиных Т-клеток. Saccharomyces cerevisiae y190, используемый в скрининге, конструировали с двумя репортерными генами, интегрированными в его геном. Эти репортерные гены находятся под контролем промотора Gal-4, содержащего сайты связывания Gal-4. Если белки, кодируемые плазмидой-приманкой и плазмидой-мишенью, связываются, субъединицы фактора транскрипции Gal-4 соединяются и функционируют, инициируя транскрипцию репортерных генов.

NcoI/BamHI-фрагмент 1,3 кДа, содержащий кодирующий район АКАР 79, выделяли из каркаса pET11d и лигировали с pAS1 для действия в качестве "приманки" для скрининга. Один мкг этой конструкции трансформировали в y190 МАТа и y190 MAT с использованием стандартного протокола трансформации с ацетатом лития-ПЭГ. Четыре изолята каждого типа спаривания (у190А pAS1 АКАР 79 1-4 и y190 pAS1 АКАР 79 1-4) тестировали на их способность взаимодействовать со слитой (гибридной) конструкцией рАСТ-РII, которая содержит регуляторную субъединицу (аминокислоты 1-89 PII) ПКА. Это достигалось спариванием этих штаммов на YEPD (1% бакто-дрожжевой экстракт, 2% бактопептон, 2% декстроза и 2% бактоагар) в течение ночи при 30^oС с последующим отбором на диплоиды на SC-Leu-Trp-чашках. Затем ген lac Z E. coli, действующий в качестве репортера, можно было тестировать на -галактозидазную активность. Спаренные штаммы переносили методом реплик на SC-Leu-Trp-чашки, на которые накладывали фильтры Hybond-N (Amersham), и выращивали в течение ночи. Фильтры помещали в жидкий азот на одну минуту для раскрытия клеток дрожжей. Диск из бумаги ЗММ насыщали приблизительно 3 мл 0,1% X-gal (5-бром-4-хлориндолил--D-галактозидом) в 60 мМ Na₂HPO₄, 40 мМ NaH₂PO₄, 10 мМ KCl и 10 мМ MgSO₄. Фильтр с лизированными дрожжами помещали на верхнюю сторону диска и давали проявляться при 30^oС в течение приблизительно 1-2 ч. Диплоидные штаммы, содержащие слияния как pAS1 AKAP 79, так и рАСТ PII, которые были положительными в отношении -gal-активности, обнаруживали по приданию дрожжевому "пластырю" синего цвета. В качестве контроля плазмида-приманка AKAP 79 оставалась белой при спаривании с пустой контрольной плазмидой рАСТ.

Обнаружение слитого белка Gal-4 AKAP 79 достигалось выращиванием у190А AKAP 79 (изолятов 1 и 2) и у190а AKAP 79 (изолятов 1 и 2) до плотности клеток 210⁷ клеток/мл в 50 мл среды SC-Trp. Клетки осаждали при 3000g в течение 10 мин и лизировали с 200 мкл стеклянных шариков (бус) (размер 425-600 микрон) в 25 мМ Трисе рН 8, 5 мМ ЭДТА, 5 мМ ЭГТА, 2 мМ о-фенантролине, 1 мМ ДТТ, 25 мкМ 4-(2-аминоэтил)бензолсульфонилфториде-HCl, с молекулярным весом 239,5 (AEBSF), 1 мМ бензанидине, 1 мкг/мл PLACC (пепстатин, лейпептин, апротинин, калпаин I и II) и 20 мкг/мл бестантинового лизисного буфера. Альтернативно клетки встряхивали на вортексе в течение одной минуты и охлаждали на льду в течение одной минуты, всего в течение 24 минут (12 циклов). Определяли концентрацию белка и 30 мкг общего белка наносили на 10% гель для электрофореза в ДСН-ПААГ. Гель переносили во влажном виде на Immobilon-P (Millipore) и детектирование проводили стандартными процедурами с использованием моноклонального антитела 12CF5 против НА (Bab Co., Berkeley, CA) и козьей вторичной антисывороткой против мышиного IgG, конъюгированной со щелочной фосфатазой (Biorad, Hercules, CA). Слитый белок Gal-4 AKAP 79 приблизительно 100 кДа легко детектировался, что указывало на присутствие продукта правильного размера в этих штаммах.

Изолят 1 у190 pAS1 AKAP 79 был выбран для скрининга библиотеки кДНК мышиных Т-клеток в рАСТ. Собирали 500 мл SC-Trp-культуры (OD₆₀₀ =0,6-0,8), промывали 100 мл дистиллированной воды и повторно осаждали. Осадок помещали в 50 мл LiSORB (100 мМ ацетат лития, 10 мМ Трис рН 8, 1 мМ ЭДТА рН 8 и 1 М сорбит), переносили в колбу на 1 л и встряхивали при 220 об/мин в течение инкубирования 30 мин при 30^oС. Затем клетки осаждали и ресуспендировали с 625 мкл LiSORB и держали на льду при получении ДНК.

ДНК получали для трансформации кипячением 400 мкл 10 мг/мл ДНК спермы лосося в течение 10 мин, после чего добавляли 500 мкл LiSORB и давали медленно охлаждаться до комнатной температуры. Добавляли ДНК из Ми-библиотеки Т-клеток (40-50 мкг) из исходного раствора 1 мг/мл. Охлажденную на льду культуру дрожжей разливали в 10 эппендорфовских пробирок с 120 мкл полученной ДНК. Пробирки инкубировали при 30^oС при 220 об/мин. Спустя 30 мин 900 мкл 40% ПЭГ₃₃₅₀ в 100 мМ Li-ацетате, 10 мМ Трисе рН 8 и 1 мМ ЭДТА рН 8 смешивали с каждой культурой и возвращали для инкубирования в течение дополнительных 30 мин. Затем эти пробы объединяли и небольшую аликвоту (5 мкл) извлекали для испытания на эффективность трансформации и высевали на чашки с SC-Leu-Trp. Остальные клетки добавляли к 100 мл среды SC-Leu-Trp-His и выращивали в течение 1 ч при 30^oС при встряхивании при 220 об/мин. Собранные клетки ресуспендировали в 5,5 мл среды SC-Leu-Trp-His + 50 мМ ЗАТ (3-аминотриазол) и аликвоты по 300 мкл высевали на чашки 150 мм со средой SC-Leu-Trp-His + 50 мМ ЗАТ и оставляли расти в течение 1 недели при 30^oС.

Спустя четыре дня титрационные чашки считали и 1,110⁵ колоний подвергали скринингу. Крупномасштабные -gal-анализы проводили на чашках с библиотекой и для отдельных колоний выделяли десять положительных клонов.