Способ выявления или определения пациентов, имеющих фактор риска в отношении заболеваний, связанных с коронарным спазмом

Способ выявления или определения пациентов, имеющих фактор риска в отношении заболеваний, связанных с коронарным спазмом

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины и касается способа выявления или определения пациентов, имеющих фактор риска в отношении заболеваний, связанных с коронарным спазмом. Сущность изобретения: способ включает выявление присутствия соответствующих нуклеотидных замен в гене эндотелиальной синтазы оксида азота, и по этим заменам выявляют пациентов, имеющих фактор риска в отношении заболеваний, связанных с коронарным спазмом. Преимущество изобретения заключается в выявлении механизма коронарного спазма и, следовательно, в ранней диагностике заболеваний, связанных с коронарным спазмом. 7 з.п.ф-лы, 5 табл., 5 ил.

Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к способу диагностики конкретного заболевания, в частности к способу скрининга гена, обусловливающего связанное со спазмом коронарной артерии заболевание.

Предпосылки создания изобретения Внутренний оксид азота (внутренний NO) представляет собой недавно обнаруженное in vivo соединение, которое, как было установлено, действует в качестве сосудорасширяющего фактора (18-25), нейромедиатора (11, 12) или иммунореактанта (13-17). Внутренний NO синтезируется из L-аргинина с помощью семейства ферментов, состоящего по крайней мере из трех синтаз оксида азота (NOSs), т.е. невральной NOS, эндотелиальной NOS и NOS макрофагов. Невральная NOS и эндотелиальная NOS характерна для соответствующих структур, а их активность усиливается в зависимости от концентраций внутриклеточного кальция. С другой стороны, NOS макрофагов не зависит от кальция и активируется при воспалении. Ранее рядом исследователей было изучено строение гена синтазы оксида азота эндотелиальных клеток (eNOS) и опубликованы данные о том, что ген eNOS локализован на хромосоме 7q35-36, состоит из 26 экзонов и имеет протяженность 21 т.п.н. (18-25).

Краткое описание изобретения Известно, что спазм коронарной артерии является фактором, вызывающим различные ишемические заболевания сердца, такие, как коронарная спастическая стенокардия и вариантная стенокардия (1-6). Однако механизм коронарного спазма пока недостаточно понятен.

В связи с этим заявители по данной заявке провели исследование с целью выяснить механизм коронарного спазма, предполагая, что такие исследования могут способствовать разработке способов ранней диагностики и лечению ишемических заболеваний, связанных с коронарным спазмом. Следует отметить, что в большинстве предыдущих исследований было установлено, что наиболее важным патогенным механизмом коронарного спазма является гиперсократимость гладкой мышцы, а не повреждение эндотелия кровеносных сосудов (35).

Ацетилхолин обычно оказывает воздействие на гладкую мышцу, вызывая ее сокращение, однако через определенный промежуток времени ацетилхолин может вызвать расширение кровеносных сосудов в результате секреции оксида азота (NO), оказывающего воздействие на гладкую мышцу, в том случае, когда эндотелий не поврежден. Однако введение в коронарные сосуды пациентов, страдающих коронарной спастической стенокардией, определенной дозы ацетилхолина чаще вызывает коронарный спазм, а не расширение кровеносных сосудов (7,8). В соответствии с указанным фактом заявителями по данной заявке изобретения ранее уже было подтверждено, что основной уровень секреции NO, вызванный ацетилхолином, понижен у пациентов, страдающих коронарной спастической стенокардией (10).

Поскольку нитроглицерин и препараты на основе азотистой кислоты могут вызывать расширение кровеносных сосудов в процессе образования NO in vivo, основной уровень секреции NO может быть понижен в коронарной артерии пациентов, страдающих коронарной спастической стенокардией, что подтверждается тем фактом, что реакция сосуда, в котором происходит синтез NO, является подавленной, сверхчувствительной к препаратам на основе азотистой кислоты (9), а пациенты, страдающие коронарной спастической стенокардией, обладают повышенной чувствительностью к нитроглицерину. Эти результаты позволяют пересмотреть возможность наличия выраженной взаимосвязи между коронарным спазмом и NO, прежде всего в эндотелии, где происходит секреция NO. До настоящего времени не уделялось достаточного внимания изучению взаимосвязи между коронарным спазмом и эндотелием, где происходит секреция NO, за исключением известного факта о снижении основного уровня секреции NO.

Исходя из различных точек зрения, заявители по данной заявке предположили, что коронарный спазм может иметь генетическую основу в свете того факта, что коронарный спазм более часто встречается в Японии, чем в Соединенных Штатах Америки и в Европе (26, 27).

На основе вышеуказанных данных основное внимание было сконцентрировано на гене одного из ферментов семейства NOS, который продуцирует внутренний NO, а именно, синтазу оксида азота эндотелиальной клетки (eNOS), с целью выяснить, имеет ли развитие коронарного спазма генетическую основу, что и является предметом настоящего изобретения.

Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение относится к способу скрининга гена, обусловливающего связанное со спазмом коронарной артерии заболевание, при этом способ включает выявление присутствия одной или нескольких нуклеотидных замен в гене эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS), причем эти замены выбирают из группы, включающей замены гуанина (G) на тимин (Т) в положении 894 и цитозина (С) на тимин (Т) в положении 774 последовательности кДНК гена eNOS и замены тимина (Т) на цитозин (С) в положении -786, аденина (А) на гуанин (G) в положении - 922 и тимина (Т) на аденин (А) в положении - 1468 5'-фланкирующей области гена eNOS, а также замены в соответствующих положениях в комплементарной ей цепи. В предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к вышеуказанному способу, который включает выявление присутствия двух или более нуклеотидных замен, выбранных из любых нуклеотидных замен в гене eNOS и любых нуклеотидных замен в его 5'-фланкирующей области, и более предпочтительно оно относится к вышеуказанному способу, когда заболевание, связанное со спазмом коронарной артерии, представляет собой стенокардию, и наиболее предпочтительно оно относится к вышеуказанному способу, когда заболевание, связанное со спазмом коронарной артерии, представляет собой коронарную спастическую стенокардию.

Одним из объектов настоящего изобретения является способ скрининга гена с целью выявить вышеуказанные замены, который включает применение анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), с помощью которого выявляют присутствие или отсутствие расщепления, вызванного рестриктазой. В частности, настоящее изобретение относится к способу, при осуществлении которого присутствие замен выявляют путем амплификации соответствующей области в экзоне 7 кДНК, кодирующей eNOS, с помощью ПЦР, расщепления амплифицированных фрагментов рестриктазой (ами) Ban II и/или Mbo I и электрофореза фрагментов, полученных в результате расщепления ферментом, а также к способу, при осуществлении которого присутствие замен в экзоне 6 выявляют путем обработки рестриктазой Fok I, к способу, при осуществлении которого присутствие замен в положении -786 5'-фланкирующей области гена eNOS выявляют путем обработки рестриктазой Msp I, и к способу, при осуществлении которого присутствие замен в положении -1468 5'-фланкирующей области гена eNOS выявляют путем обработки рестриктазой Mbo I.

Согласно настоящему изобретению предлагается также набор для осуществления способа по настоящему изобретению, в частности набор для диагностики заболевания, связанного со спазмом коронарной артерии, который включает олигонуклеотид, предназначенный для амплификации с помощью ПЦР соответствующей области экзона 7 кДНК, кодирующей eNOS, и рестриктазу(ы) Ban II и/или Mbo I; набор для диагностики заболевания, связанного со спазмом коронарной артерии, который включает олигонуклеотид, предназначенный для амплификации с помощью ПЦР соответствующей области экзона 6 кДНК, кодирующей eNOS, и рестриктазу Fok I; набор для диагностики заболевания, связанного со спазмом коронарной артерии, который включает олигонуклеотид, предназначенный для амплификации с помощью ПЦР области, включающей нуклеотид в положении - 786 5'-фланкирующей области гена eNOS, и рестриктазу Msp I; и набор для диагностики заболевания, связанного со спазмом коронарной артерии, который включает олигонуклеотид, предназначенный для амплификации с помощью ПЦР области, включающей нуклеотид в положении - 1468 5'-фланкирующей области гена eNOS, и рестриктазу Mbo I. Следует отметить, что олигонуклеотид, входящий в набор по настоящему изобретению, может представлять собой олигонуклеотид, отличный от таковых, перечисленных ниже в таблице 1, и может быть выбран из любых олигонуклеотидов, соответствующих геномной последовательности eNOS.

Далее в изобретении предлагается способ диагностики заболевания, связанного со спазмом коронарной артерии, который включает выявление присутствия любой одной или нескольких нуклеотидных замен в гене eNOS, как определено выше, которые обусловливают возникновение заболевания, связанного со спазмом коронарной артерии.

Краткое описание чертежей На фиг.1 представлена фотография, полученная в результате электрофореза на основе ПЦР-ОЦКП-анализа фрагментов ДНК, содержащих экзон 7 гена eNOS. Стрелкой показано смещение полос.

На фиг. 2 представлено графическое изображение прямого секвенирования фрагментов ДНК, содержащих экзон 7 гена eNOS, полученных как для случая мутации (мутантный тип), так и для случая без мутации (дикий тип). Мутантный тип представляет собой гетерозиготу.

На фиг. 3 представлен результат скрининга содержащих экзон 7 гена eNOS фрагментов ДНК, полученный с помощью ПЦР-ПДРФ. Рестриктаза представляет собой Ban II и/или Mbo I. На фиг.3А представлена их рестрикционная карта. На фиг. 3Б представлена фотография, на которой показан реальный результат электрофореза.

На фиг. 4 представлена фотография, которая получена в результате электрофореза путем скрининга с помощью ПЦР-ПДРФ фрагментов ДНК, содержащих экзон 6 гена eNOS. Рестриктаза представляет собой Fok I.

На фиг. 5 представлена фотография, которая получена в результате электрофореза путем скрининга с помощью ПЦР-ПДРФ фрагментов ДНК, содержащих нуклеотиды в положении -786 и -1468 5'-фланкирующей области гена eNOS. Фермент рестриктаза представляет собой Msp I в случае мутации в положении -786 и Mbo I в случае мутации в положении -1468.

Подробное описание изобретения Как указано выше, согласно настоящему изобретению основное внимание заявителей было сконцентрировано на гене eNOS с целью выяснить, обусловливает ли этот ген развитие коронарного спазма, при этом были получены следующие результаты.

А) Мутации в экзонах гена eNOS 1) Мутации в экзоне 7: мутация, представляющая собой замену гуанина (G) в положении 894 кДНК, кодирующей eNOS на тимин (Т) С помощью метода ПЦР-ОЦКП (полимеразная цепная реакция-анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК) и метода прямого секвенирования была выявлена точковая мутация в экзоне 7 гена eNOS, выделенного у пациента, страдающего коронарной спастической стенокардией. Мутация представляет собой замену GAG на GAT, и она соответствует замене аминокислотного остатка глутаминовой кислоты на остаток аспарагиновой кислоты (Glu298Asp). При скрининге этой мутации, проведенном с использованием 96 пациентов, страдающих коронарной спастической стенокардией, и 86 контрольных пациентов, было обнаружено, что 22 больных человека и 7 контрольных соответственно имели эту мутацию.

2) Мутации в экзоне 6: мутация, представляющая собой замену цитозин (С) в положении 774 кДНК, кодирующей eNOS на тимин (Т) С помощью метода ПЦР-ОЦКП установлено, что такая замена основания обнаружена у 4 из 10 пациентов, страдающих коронарной спастической стенокардией. С другой стороны, такой замены основания не обнаружено у 9 обследованных контрольных пациентов (Р=0,03). Такая замена основания не сопровождается аминокислотной заменой.

Б) Мутации в 5'-фланкирующей области гена eNOS В 5'-фланкирующей области гена eNOS обнаружено несколько мутаций и была изучена взаимосвязь между этими мутациями и коронарными спастическими заболеваниями, при этом получены следующие результаты.

1) Мутация, представляющая собой замену тимина (Т) в 5'-фланкирующей области (-786) на цитозин (С) С помощью метода ПЦР-ОЦКП установлено, что такая замена основания обнаружена у 34 из 123 (27,6%) пациентов, страдающих коронарной спастической стенокардией, тогда как это замена основания обнаружена только у 4 из 86 контрольных пациентов (4,7%) (Р<0,0001).

С помощью метода ПЦР-ОЦКП установлено, что такая замена основания обнаружена у 31 из 104 (29,1%) пациентов, страдающих коронарной спастической стенокардией, тогда как такая замена основания обнаружена только у 3 из 83 контрольных пациентов (3,6%) (Р<0,0001).

С помощью метода ПЦР-ОЦКП установлено, что такая замена основания обнаружена у 26 из 98 (26,5%) пациентов, страдающих коронарной спастической стенокардией, тогда как такой замены основания не обнаружено у 26 контрольных пациентов (0%) (Р<0,0006).

Понятие "заболевание (я), связанное(ые) с коронарным спазмом" в контексте настоящего описания включает стенокардию, в частности коронарную спастическую стенокардию, вариантную стенокардию, нестабильную стенокардию, стенокардию напряжения, стенокардию покоя, острый инфаркт миокарда, микрососудистое заболевание и т.п.

Взаимосвязь между коронарным спазмом и мутациями, связанными с геном eNOS, подтверждена согласно настоящему изобретению и, следовательно, если у пациента, у которого предполагается наличие заболеваний, связанных с коронарным спазмом, выявлены эти мутации в гене eNOS или в его 5'-фланкирующей области, то можно предположить, что рассматриваемый пациент имеет фактор риска в отношении заболеваний, связанных с коронарным спазмом. В качестве индикатора заболеваний достаточно присутствия только одной из этих мутаций, а наличие двух или большего числа мутаций может служить еще лучшим индикатором. Кроме того, было обнаружено, что выявление мутаций как в области гена eNOS, так и в его 5'-фланкирующей области позволяет сделать вывод о серьезности заболеваний, связанных с коронарным спазмом.

Как описано выше, настоящее изобретение относится к способу скрининга гена, обусловливающего связанное со спазмом коронарной артерии заболевание. Этот способ предусматривает выявление присутствия одной или нескольких нуклеотидных замен в гене эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS), причем эти замены выбирают из группы, включающей замены гуанина (G) на тимин (Т) в положении 894, цитозина (С) на тимин (Т) в положении 774 последовательности кДНК гена eNOS и замены тимина (Т) на цитозин (С) в положении - 786, аденина (А) на гуанин (G) в положении - 922 и тимина (Т) на аденин (А) в положении - 1468 5'-фланкирующей области гена eNOS, а также замены в соответствующих положениях в комплементарной ей цепи.

Понятие "замены в соответствующих положениях в комплементарной ей цепи" означает, например, что в случае нуклеотидной замены гуанина (G) на тимин (Т) в положении 894 в кДНК гена eNOS происходит мутация, представляющая собой замену цитозина (С) на аденин (А) в положении комплементарной цепи, соответствующем положению 894.

Ниже описан способ выделения у пациента гена eNOS и 5'-фланкирующей последовательности.

В качестве образца для получения гена может применяться любая биопсия, при этом обычно используется образец лейкоцитов, а также дополнительно может использоваться биопсия печени. Образец обрабатывают протеиназой К-SDS с целью протеолизиса и денатурации, а затем экстрагируют фенолом/хлороформом, получая геномные ДНК(+РНК). При необходимости РНК могут быть удалены с помощью РНКазы.

Затем проводят ПЦР, используя для амплификации геномной ДНК любой из приведенных ниже праймеров. Далее присутствие мутаций подтверждают с помощью методов выявления мутации нуклеиновой кислоты, к которым относятся следующие: 1) Метод ПДРФ (анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов).

2) Метод ПЦР-ОЦКП (анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК).

3) Метод АСО-гибридизации (аллельспецифическая олигонуклеотидная гибридизация).

ПЦР-продукты блоттируют на подложке, такой, как найлоновый фильтр, и гибридизуют с синтетическим олигонуклеотидным зондом размером приблизительно 18-мер (звеньев), последовательность оснований которого включает мутацию, которая должна быть выявлена, и который с целью получения сигнала может помечен радиоизотопом или биотином. Затем, когда фильтр промывают в соответствием со значением t_пл зонда, можно обнаружить ошибочное спаривание одной пары оснований, поскольку ошибочное спаривание может сделать гибрид плавким. Этот метод обычно используется в качестве метода выявления специфической мутации основания с помощью ПЦР.

4) Метод секвенирования.

5) Метод саузерн-блоттинга.

Этот метод представляет собой обычный метод выявления мутаций, который включает расщепление ДНК с помощью рестриктазы, проведение электрофореза и гибридизацию с зондом. Этот метод включает как саузерн-блоттинг геномной ДНК, так и методы ПЦР - саузерн-блоттинга.

Преимуществом последнего метода, который основан на тех же принципах, что и метод (3), является точность, с которой может быть получена информация о миграции.

6) ARMS (амплификационная система для идентификации мутаций).

При проведении ПЦР праймеры отжигают с ДНК-матрицы и затем с помощью ДНК-полимеразы получают комплементарную ДНК в направлении от 5'- к 3'-концу. ARMS основана на том принципе, что эффективность ПЦР-амплификации уменьшается, а ПЦР-продукты не могут быть обнаружены с помощью гель-электрофореза, когда 3'-конец праймера образует ошибочное спаривание с ДНК-матрицей. Когда для амплификации с помощью ПЦР применяют праймер, имеющий мутацию на его 3'-конце, которая должна быть выявлена, можно обнаружить мутацию, оценивая присутствие или отсутствие продуктов амплификации.

7) ЭГДГ (электрофорез в градиенте денатурирующего геля).

Этот метод основан на том принципе, что в ПЦР-продуктах гетеродуплекс, содержащий ошибочное спаривание, может более легко диссоциироваться, чем гомодуплекс. При использовании этого метода двухцепочечную ДНК, которая включает ошибочное спаривание, т.е. мутацию, выявляют по миграции в электрофоретическом геле благодаря тому, что миграция такой ДНК на геле является плохой из-за диссоциации и в дальнейшем ускоряется при повышении плотности градиента мочевины и формамида при проведении электрофореза в полиакриламидном геле.

8) Метод гидролиза РНКазой А.

РНКаза А (рибонуклеаза) представляет собой фермент, который не гидролизует двухцепочечную РНК или гибрид РНК/ДНК, а избирательно гидролизует одноцепочечную РНК. Поэтому, после того, как РНК-зонд, меченный с помощью ³²Р, был гибридизован с образцом ДНК, который предварительно был денатурирован до одноцепочечной ДНК, гибрид обработан РНКазой А, а продукты подвергнуты электрофорезу, могут быть выявлены две полосы, поскольку одноцепочечная РНК, полученная из РНК-зонда после гибридизации с мутантной ДНК, гидролизуется РНКазой А.

9) Метод химического расщепления.

"С"-нуклеотид и "Т"-нуклеотид в сайте ошибочного спаривания гибридной ДНК модифицируют гидроксиламином и тетраоксидом осмия соответственно, а затем модифицированную ДНК обрабатывают пиперидином с целью отщепления остатка сахара. Для этого процесса используют гибрид, состоящий из меченого зонда и образца ДНК, и электрофоретическое разделение. Если в образце ДНК присутствует мутация, выбирают зонд меньшего размера. В случае, когда выявляют Glu298Asp, сайтом ошибочного спаривания является С-Т, и, следовательно, для выявления ошибочного спаривания также может применяться обратная последовательность дикого типа.

10) Лигазный метод.

Этот метод основан на том принципе, что два типа олигонуклеотидов не могут быть лигированы друг с другом с помощью ДНК-лигазы, когда ДНК-матрица имеет ошибочное(ые) спаривание(я) в сайте связывания.

I) LMGD (опосредованное лигазой выявление гена) Например, один олигонуклеотид ДНК метят с помощью ³²Р, а другой олигонуклеотид ДНК метят биотином. Их лигируют друг с другом и лигированный продукт собирают путем абсорбции на стрептавидине. Когда они соответствующим образом лигированы друг с другом, т.е., иными словами, не образовано никакого ошибочного спаривания, их затем можно выявить, поскольку радиоактивность ³²Р становится более высокой.

II) ЛЦР (лигазная цепная реакция) Повторяя вышеописанное лигирование, за исключением того, что используют термостабильную лигазу, олигонуклеотид ДНК отжигают с цепью ДНК аналогично тому, как это осуществляют при ПЦР, что способствует более высокой чувствительности при выявлении мутации.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 1. Мутация в экзоне 7 Мутация в экзоне 7, в частности мутация, представляющая собой замену гуанина (G) на тимин (Т) в положении 894 последовательности кДНК, кодирующей ген eNOS, представляет собой замену GAG на GAT с формированием для каждого различных сайтов рестрикции. Таким образом, присутствие мутации может быть выявлено с помощью рестриктазы. В частности, расщепление амплифицированных продуктов с помощью фермента рестриктазы либо Ban II, либо Mbo I позволяет выявить присутствие мутации. Иными словами, считается, что мутация присутствует, если рестриктаза Ban II может расщеплять представляющий интерес сайт, и наоборот, считается, что мутация отсутствует, если рестриктаза Mbo I может расщеплять представляющий интерес сайт.

В альтернативном варианте в связи с тем, что мутация, представляющая собой замену гуанина (G) на тимин (Т) в положении 894 последовательности кДНК, кодирующей ген eNOS, соответствует аминокислотной замене глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту (Glu298Asp), изменение в аминокислотной последовательности гена eNOS, т.е. замена глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту в положении 298, может служить соответствующим индикатором.

2. Мутация в экзоне 6 Мутация в экзоне 6, в частности мутация, представляющая собой замену цитозина (С) на тимин (Т) в положении 774 последовательности кДНК, кодирующей ген eNOS, приводит к появлению отличных друг от друга сайтов рестрикции, поэтому присутствие мутации может быть выявлено с помощью рестриктазы. В частности, расщепление амплифицированных продуктов рестриктазой Fok I позволяет выявить присутствие мутации. Иными словами, считается, что мутация присутствует, если продукты могут расщепляться рестриктазой Fok I, и наоборот, считается, что мутация отсутствует, если продукты не могут расщепляться рестриктазой Fok I.

3. Мутация в положении -786 в 5'-фланкирующей области Мутация в 5'-фланкирующей области гена eNOS, в частности мутация, представляющая собой замену тимина (Т) на цитозин (С) в положении -786, также приводит к формированию отличных друг от друга сайтов рестрикции, поэтому присутствие мутации может быть выявлено с помощью рестриктазы. В частности, расщепление амплифицированных продуктов с помощью рестиктазы Msp I позволяет выявить присутствие мутации. Иными словами, считается, что мутация отсутствует, если фермент Msp I расщепляет амплифицированные продукты в одном сайте, и наоборот, считается, что мутация присутствует, если фермент Msp I может расщеплять амплифицированные продукты в двух сайтах.

4. Мутация в положении -1468 в 5'-фланкирующей области Мутация в 5'-фланкирующей области гена eNOS, в частности мутация, представляющая собой замену тимина (Т) на аденин (А) в положении -1486, также приводит к формированию отличных друг от друга сайтов рестрикции, поэтому присутствие мутации может быть выявлено с помощью рестриктазы. В частности, расщепление амплифицированных продуктов с помощью рестриктазы Mbo I позволяет выявить присутствие мутации. Иными словами, считается, что мутация отсутствует, если фермент Моb I расщепляет амплифицированные продукты в одном сайте, и наоборот, считается, что мутация присутствует, если рестриктаза Mbo I может расщеплять амплифицированные продукты в двух сайтах.

Примеры Пример 1 Выявление мутации в экзоне 7 гена eNOS Исследования проводили на 96 пациентах, страдающих коронарной спастической стенокардией, и на 86 контрольных пациентах. Для всех пациентов, страдающих коронарной спастической стенокардией, был характерен внезапный приступ в состоянии покоя (53 мужчины, 43 женщины, средний возраст 61 год, возраст от 33 до 86 лет). У всех пациентов проводили обследование сердца с помощью катетера методом коронарной артериографии с целью подтверждения коронарного спазма, вызванного ацетилхолином или эргоновином, а также для подтверждения с помощью электрокардиограммы существенного изменения ST-T (7, 8). У всех пациентов в коронарной артерии не обнаружено значительного сужения (>75%).

Из 86 контрольных пациентов 61 составляли группу с острой грудной болью, 12 составляли группу с аномальной электрокардиограммой и 13 составляли группу пациентов, страдающих заболеванием клапана средней тяжести (35 мужчин, 51 женщина, средний возраст 61 год, возраст от 13 до 83 лет).

Коронарная артериография показала, что ни один из пациентов контрольной группы не имел значительных сужений. Когда с участием 61 пациента из группы с острой грудной болью и 12 пациентов с аномальной электрокардиограммой проводили спазм-индуцирующий тест с помощью коронарного введения ацетилхолина или эргоновина, все пациенты дали отрицательную реакцию. В контрольную группу не были включены пациенты, страдающие инфарктом миокарда, синдромом X, миокардиопатией и сердечной недостаточностью.

(1) Оценка мутации гена eNOS с помощью ПЦР-ОЦКП I) Выделение ДНК Брали периферическую венозную кровь у 10 пациентов, страдающих типичным коронарным спазмом, и у 9 контрольных и ДНК экстрагировали из клеток лейкоцитов (28), используя набор для экстракции ДНК DNAQUICH [DAINIPPON SEIYAKU].

II) Стадия ПЦР В соответствии с ранее описанным строением гена eNOS (18-25) метод ПЦР-ОЦКП применяли для всех экзонов гена eNOS (29).

Все праймеры получали на основе последовательности интронов, фланкирующих каждый экзон. Все используемые на этой стадии праймеры приведены в таблице 1.

В каждую пробирку с раствором общим объемом 5 мкл, содержащим 50 ммолей/л КСl, 20 ммолей/л трис-НСl (рН 8,4), 0,75 ммоля/л MgCl₂, 0,1 ммоля/л дНТФ, 0,2 мл -[³²Р]дЦТФ (0,2 мл), по 5 пмолей каждого праймера и 0,01 ед. полимеразы Taq (фирма GIBCO BRL, Life Technologies Inc., MD, США), добавляли по 30 нг ДНК пациента.

ПЦР осуществляли следующим образом: один цикл продолжительностью 2 минуты при 94^oС; 30 циклов продолжительностью по 30 секунд при 94^oС; 30 секунд при 55-58^oС и одна минута при 72^oС; и образовавшийся амплифицированный продукт хранили при 4^oС. Амплификацию экзона 7 проводили при 57^oС.

III) Стадия ОЦКП Электрофорез проводили при трех различных условиях, первым из которых было использование 5%-ного глицеринового геля при комнатной температуре, а два остальных состояли в использовании 5% и 10% глицеринового геля при 4^o С.

Глицериновые гели получали следующим образом: 1) готовили 5%-ный раствор, содержащий акриламид и N,N'-метиленбисакриламид в соотношении 49:1; 2) готовили 0,5-кратный ТБЭ (10-кратный ТБЭ разбавляют в 20 раз: 108 г трис(гидроксиметил)аминометана + 55 г борной кислоты + 40 мл 0,5М ЭДТК + вода, при смешении объемов всех ингредиентов получают общий объем 500 мл); 3) готовили гель, добавляя 160 мкл 10%-ного АРС (пероксодисульфид аммония) и 60 мкл TEMED (N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин) к раствору 5%-ного или 10%-ного глицерина.

IV) Результаты Результаты, полученные при амплификации экзона 7, приведены на фиг.1. На этом чертеже видно смещение полосы фрагмента, включающего экзон 7, у 3 из 10 пациентов, страдающих коронарной спастической стенокардией. С другой стороны, у контрольной группы не обнаружено никакого смещения.

(2) Анализ мутантного гена методом прямого секвенирования ДНК пациентов, в которых на стадии (1) методом ПЦР-ОЦКП обнаружена мутация, и ДНК контрольных пациентов, у которых не обнаружена мутация, вновь амплифицировали в таких же условиях, которые использовались на стадии (1), и аплифицированные продукты очищали с помощью системы для очистки ДНК типа Wizard PCR Preps (Wizard PCR Preps DNA Purification System, фирма Promega, США). Затем последовательность оснований определяли с помощью автоматического секвенатора, поставляемого фирмой ABI (США).

При анализе мутантной ДНК и ДНК дикого типа методом прямого секвенирования была обнаружена точковая мутация, представляющая собой замену гуанина (G) на тимин (Т) в положении 894 в экзоне 7 кДНК гена eNOS. Наличие указанной мутации было подтверждено у трех пациентов, имеющих мутацию. Точковая мутация представляет собой миссенс-мутацию, что соответствует замене глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту (Glu298Asp). Результаты, полученные методом прямого секвенирования, приведены на фиг.2. На чертеже представлены результаты, полученные для не имеющего мутации дикого типа и для гетерозиготного типа.

(3) Скрининг мутации, представляющей собой замену "G" на "Т" с помощью ПЦР-ПДРФ После того, как в экзоне 7 гена eNOS была обнаружена миссенс-мутация, соответствующая Glu298Asp, как описано для стадии (2), все 96 пациентов, страдающих коронарной спастической стенокардией, и 86 контрольных пациентов были подвергнуты скринингу в отношении этой мутации. Этот скрининг проводили с помощью ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция-анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов). С целью предотвратить любые ошибочные спаривания при неполном расщеплении рестрикционными ферментами использовали два типа ферментов рестриктаз Ban II и Mbo I (поставляемые фирмой TAKARA).

Экзон 7 гена eNOS из всех образцов амплифицировали в соответствии со способами (II), описанными для стадии (1). Протяженность амплифицированных фрагментов, содержащих экзон 7, составляла 248 пар оснований. Далее Ban II, либо Mbo I в соответствии с инструкциями производителя. Расщепленные продукты подвергали электрофорезу на 4%-ном агарозном геле типа Nusieve GTG, получая соответствующие полосы.

Результаты могут быть классифицированы в соответствии с тремя схемами, как показано на фиг. 3. На фиг.3А представлена рестрикционная карта, а на фиг.3Б представлено фотографическое изображение подлинных результатов электрофореза. Как видно на фиг.3Б, обработка Ban II приводит к образованию двух фрагментов, имеющих длину 163 пары оснований и 85 пар оснований, а обработка Mbo I приводит к образованию одной нерасщепленной полосы длиной 248 пар оснований в образце дикого типа, не имеющего мутации. Это свидетельствует о том, что дикий тип, несущий мутацию, имеет один сайт рестрикции Ban II, но не имеет сайта рестрикции Mbo I.

В случае гомозиготы, имеющей Т/Т в положении 894 кДНК гена eNOS, Ban II не приводит к расщеплению (248 пар оснований), в то время как Mbo I приводит к образованию двух фрагментов длиной 158 пар оснований и 90 пар оснований. Это свидетельствует о том, что гомозигота не имеет сайта рестрикции Ban II и имеет один сайт рестрикции Mbo I.

Обнаружено несколько случаев, в которых было получено три полосы длиной 248 пар оснований, 163 пары оснований и 85 пар оснований при использовании Ban II и 248 пар оснований, 158 пар оснований и 90 пар оснований при использовании Mbo I. Этот случай считается гетерозиготой (G/T), поскольку как Ban II, так и Mbo I приводят к появлению одного сайта расщепления в любой полосе.

На основе данных, полученных для трех пациентов, как описано выше, частоту мутации Glu298Asp в гене eNOS оценивали как для всех случаев коронарной спастической стенокардии, так и для контрольных групп. Во всех случаях проводили расщепление обоими ферментами. Результаты, полученные с использованием этих двух ферментов, оказались достоверными для всех случаев.

Мутация Glu298Asp обнаружена у 22 из 96 (23%) пациентов, страдающих коронарной спастической стенокардией, из которых один оказался гомозиготой по этому признаку, а 21 гетерозиготами. С другой стороны, мутация обнаружена у 7 из 86 (8%) контрольных пациентов, все из которых оказались гетерозиготами.

(4) Статистический анализ: взаимосвязь между коронарным спазмом и мутацией Glu298Asp или другими Факторами риска Частоту мутации, выявленную на стадии (3), сравнивали с частотой факторов риска коронарного спазма, включающих возраст, пол, высокое кровяное давление, сахарный диабет, гиперхолестеринемию, индекс массы тела и курение, у контрольной группы и группы, страдающей коронарной спастической стенокардией, с помощью критерия -квадрат и непарного критерия Стьюдента с применением "идеальной" вероятности по Фишеру. Кроме того, с целью выяснить, какой из факторов в наибольшей степени коррелирует с коронарным спазмом, осуществляли многовариантный анализ (метод множественной логарифмической регрессии) с помощью программного обеспечения SPSS Advanced Statistics версия 6.1 для компьтера типа Macintosh (фирма SPSS Japan Inc., Япония). Условные бинарные переменные применяли в качестве всех независимых переменных следующим образом. Каждое численное значение представляло собой средние значение СО (стандартное отклонение).

Пол: 0 - мужчина, 1 - женщина Возраст: 0 - до 60 лет, 1-60 или более лет Индекс массы тела: 0 - до 26, 1 - 26 или более Холестеринемия: 0 - норма, 1 - гиперхолестеринемия (порог, 260 м г/децилитр) Курение: 0 - некурящий, 1 - курящий Гипертензия: 0 - норма, 1 - высокая (порог, 160/95 мм ртутного столба) Сахарный диабет: 0 - отсутствует, 1 - присутствует (порог, 140 мг/децилитр глюкозы в крови в голодном состоянии или 200 мг/децилитр OGTT (тест на толерантность к оральной глюкозе)) Результаты анализа с использованием критерия -квадрат и результаты анализа с использованием метода прямого шагового включения (Wald) представлены в таблицах 2 и 3 соответственно, где р=0,05 признается достоверным значением с точки зрения статистики.

Результаты статистического анализа Оценка корреляции между коронарным спазмом и мутацией Glu298Asp или другими факторами риска, такими, как возраст, пол, высокое кровяное давление, сахарный диабет, гиперхолестеринемия, индекс массы тела и курение, показала достоверность данных для пола (р=0,035), курения (р=0,00001) и мутации Glu298Asp (р=0,005), что видно из таблицы 2.

Результаты многовариантного анализа (метод множественной логарифмической регрессии) приведены в таблице 3. Из таблицы 3 видно, что курение является первым фактором, который оказался ответственным за коронарный спазм (р= 0,0005), а мутация Glu298Asp является вторым фактором (р=0,0272). Методом множественной логарифмической регрессии не выявлено никакой достоверной корреляции между полом и коронарным спазмом.

Пример 2 Выявление мутации в экзоне 6 гена eNOS Аналогично методам, описанным в примере 1, геномную ДНК выделяли у 10 пациентов, страдающих коронарной спастической стенокардией, и у 9 контрольных. ПЦР проводили, используя праймеры, описанные в таблице 1, а затем для выявления мутации в экзоне 6 проводили ОЦКП-анализ. Затем экзон 6 подвергали прямому секвенированию для выявления замены основания, представляющего собой цитозин (С) на тимидин (Т) в положении 774 кДНК гена eNOS.

Эта замена основания была выявлена у 4 из 10 пациентов, страдающих коронарной спастической стенокардией, но такой замены не обнаружено ни у одного из 9 контрольных пациентов (р=0,03). Эта замена не связана с изменением аминокислоты.

Пример 3 Выявление мутации в 5'-фланкирующей области гена eNOS (1) В основном использовали методы, описанные в примере 1, за исключением того, что для выявления замены основания, представляющего собой тимин (Т) на цитозин (С) в 5'-фланкирующей области (-786), применяли следующие праймеры.

ПЦР-ОЦКП (-585 ~ -820 пар оснований; 236 пар оснований) праймер 5'-конца: 5'-ATGCTCCCACCAGGGCATCA-3' праймер 3'-конца: 5'-GTCCTTGAGTCTGACATTAGGG-3' Эта замена основания обнаружена у 34 из 123 (27,6%) пациентов, страдающих коронарной спастической стенокардией, в то время как такая замена обнаружена только у 4 из 86 (4,7%) контрольных пациентов (Р<0,0001).

Выявление мутации в 5'-фланкирующей области гена eNOS (2) В основном использовали методы, описанные в примере 1, за исключением того, что для выявления замены основания, представляющего собой аденин (А) на гуанин (G) в 5'-фланкирующей области (-922), применяли следующие праймеры.

ПЦР-ОЦКП (-801 ~ -1008 пар оснований; 208 пар оснований) праймер 5'-конца: 5'-TCAGTCTCTGAGGTCTCGAA-3' праймер 3'-конца: 5'-TGATGCCCTGGTGGGAGCAT-3' Эта замена основания обнаружена у 31 из 104 (29,1%)