Рекомбинантная нейраминидаза гриппа типа na 2 (варианты)

Рекомбинантная нейраминидаза гриппа типа na 2 (варианты)

Реферат

 

Изобретение относится к генной инженерии. Рекомбинантную нейраминидазу гриппа типа NA2 получают культивированием в подходящей среде инфицированных клеток насекомого или дрожжевых клеток. Клетки насекомого инфицируют вирусом, трансформированным посредством гомологичной рекомбинации его генома с помощью вектора экспрессии рAc21VNAS. Дрожжевые клетки трансформируют вектором экспрессии рРР1IVNAf1S. Рекомбинантную нейраминидазу используют в вакцине против гриппа. Изобретение позволяет получать вакцину, эффективную против вируса гриппа типа NA2. 2 с. и 3 з.п. ф-лы, 17 ил., 2 табл.

Изобретение относится к рекомбинантной нейраминидазе гриппа, вектору экспрессии, с помощью которого рекомбинантная нейраминидаза может экспрессироваться в клетках-хозяевах методом продуцирования и очистки рекомбинантной нейраминидазы, вакцинам против гриппа и использованию рекомбинантной нейраминидазы в соответствии с настоящим изобретением.

Эпидемии гриппа, вызываемые вирусами А и Б, приводят к значительному дискомфорту пораженных ими людей и оказывают очень большое воздействие на социальную и экономическую жизнь. Грипп является причиной высокого уровня смертности у пожилых людей и пациентов, страдающих хроническими заболеваниями. С момента применения в 40-х годах нашего столетия инактивированные вакцины на основе вирусного материала, выращенного в куриных эмбрионах, показали свою очевидную эффективность против гриппа и привели к значительному сокращению смертности людей, входящих в группу риска.

Вирусы гриппа уникальны среди других вирусов, развивающихся в бронхиолах, поскольку они претерпевают значительные антигенные изменения (так называемый "дрейф") в двух их поверхностных антигенах, а именно гемагглютинине (HА) и нейраминидазе (NА).

Кроме того, грипп А благодаря феномену "сдвига" (shift) способен обходить распространенный иммунитет. Возникающий у людей вирус представляет собой ген нейраминидазы, который появляется из животных источников генов гриппа. В 1957 году наиболее распространенный в то время вирус типа NA1 сменился новым вирусом типа NА2. С 1977 года вирусы типа NА1 вновь вернулись в популяцию человека. Применяемые в настоящее время вакцины должны поэтому предпочтительно быть направлены против обоих типов вирусов NA1 и NА2.

Нейраминидаза катализирует удаление концевых остатков сиаловой кислоты гликозильных групп, при этом разрушаются потенциальные рецепторы для гемагглютинина (Gottschalk 1957; Burnet and Stone, 1947). Считается, что нейраминидаза играет важную роль, препятствуя агрегации вируса и подавляя его способность распространяться из клетки в клетку (Colman and Ward, 1985).

Каждая молекула нейраминидазы (М_r = 240000) имеет структуру, которая напоминает поганку и состоит из четырех идентичных полипептидных цепочек, образованных двумя димерами, которые связаны дисульфидными мостиками и далее скрепляются друг с другом нековалентными связями (Bucher and Kilbourne, 1972; Laver and Valentine, 1969; Vargese et al., 1983; Ward et al., 1983). В отличие от гемагглютинина нейраминидаза закрепляется в липидной мембране с помощью неподвергнутой сплайсингу NА-концевой липофильной последовательности (Fields et al. , 1983; Вlоск et al., 1982), так называемого мембранного якоря. Наибольшая часть всей структуры выступает за мембрану и образует там периферическую "головную" часть, имеющей форму коробочки, которая размещается поверх удлиненной области "стебля" (Wrigley et al., 1973). Внутри головки содержится мономер, который имеет свой собственный каталитический сайт и содержит по крайней мере четыре NА-связанные гликозильные группы (Colman et al. , 1983; Ward et al., 1982). Наличие O-гликозилирования было установлено совсем недавно.

Вследствие их внешнего расположения антигены гемагглютинин и нейраминидаза являются наиболее важными мишенями в структуре вируса для иммунной системы хозяина. Что касается антигенов, которые специфично связываются с гемагглютинином, то считается, что они нейтрализуют инвазивную способность вируса, вероятно путем блокирования ранних стадий инфекции (Hirst, 1942; Kida et al., 1983). Нейраминидаза-специфичные антитела обычно не препятствуют первичной инфекции клетки-мишени (Jahiel and Kilbourne, 1966; Kilbourne et al. , 1968; Johanssen et al., 1988), а блокируют именно распространение вируса. Далее, вследствие протекания конкурентных процессов иммунный ответ на нейраминидазу, видимо, частично подавляется в пользу более часто встречающегося антигена гемагглютинина (Johanssen et al., 1987; Kilbourne, 1976). В итоге воздействие иммунитета нейраминидазы обычно затмевается антителами, нейтрализующими гемагглютинин. По этой причине внимание разработчиков вакцины в течение длительного времени было почти исключительно сфокусировано на гемагглютинине.

Однако ряд экспериментальных наблюдений указывает на то, что нейраминидаза на самом деле способна играть важную роль в создании защитного иммунитета против гриппа (Schulman et al., 1968; Johansen and Kilbourne, 1990; Johansen et al. , 1993). Фундаментальные исследования иммуногенного потенциала нейраминидазы требуют очень чистых антигенов в достаточном количестве и с правильной трехмерной структурой. До настоящего времени нейраминидазу получают обработкой оболочек вируса детергентами (Gallgher et al., 1984; Kilbourne еt al., 1968) или протеолитическим расщеплением головки белка, часто с помощью проназы (Seto et al., 1966; Rott et al., 1974), с последующей очисткой нейраминидазы. Хотя эти методы в какой-то степени применимы, они имеют значительные ограничения с точки зрения выхода и чистоты продукта.

В связи с этим целью настоящего изобретения является рекомбинантная нейраминидаза гриппа, которая обладает антигенными свойствами, соответствующими свойствам природной нейраминидазы, и корректно свернута.

В соответствии с настоящим изобретением указанная рекомбинантная нейраминидаза в практически очищенной форме может быть получена: а) культивированием в культуральной среде клеток-хозяев, трансформированных с помощью вектора экспрессии нейраминидазы или инфицированных вирусом, который трансформирован с помощью вектора экспрессии нейраминидазы, при этом вектор экспрессии включает по крайней мере часть кодирующей области гена нейраминидазы вируса гриппа минус область, кодирующая мембранный якорь, или ее модифицированный вариант, которой предшествует присоединенная в фазе сигнальная последовательность; и б) выделением продуктов экспрессии нейраминидазы из культуральной среды.

Рекомбинантная нейраминидаза по настоящему изобретению, секретируемая в культуральную среду, может, например, использоваться в фундаментальных исследованиях, в которых проводится отдельная вакцинация нейраминидазой, с целью определения роли нейраминидазы в вакцине. На практике рекомбинантная нейраминидаза вероятно все еще будет использоваться в сочетании с гемагглютинином, чтобы увеличить степень защиты (процента получившего прививки населения, которое эффективно защищено от инфекции) и устойчивость защиты (защиты от более поздних эпидермических штаммов).

В настоящем изобретении, в частности, заявляется рекомбинантная нейраминидаза гриппа NА2, которую можно получить выращиванием клеток-хозяев в подходящей для выращивания питательной среде и выделением продукта экспрессии нейраминидазы из питательной среды. На практике эта процедура заключается в переносе рекомбинантного модуля экспрессии из рАс21VNАS в бакуловирус дикого типа или его производное. Клетки-хозяева затем инфицируют с помощью этого рекомбинантного бакуловируса.

Клетки-хозяева, которые используются для получения рекомбинантной нейраминидазы гриппа, преимущественно получают из низших эукариотных организмов, таких как насекомые, преимущественно из клеточной линии sf9 насекомых, однако могут также использоваться дрожжевые клетки, такие как Saccharomyces или Pichia.

Настоящее изобретение относится также к двух векторам для экспрессии способной секретироваться нейраминидазы гриппа, содержащим сайт инициации репликации, по крайней мере часть кодирующей области гена нейраминидазы гриппа минус область, которая кодирует мембранный якорь, или ее модифицированный вариант, сигнальную последовательность, расположенную в 5'-положении от кодирующего района и связанную с ним в фазе, промотор, расположенный в 5'-положении от сигнальной последовательности, и терминатор транскрипции, расположенный в 3'-положении от кодирующей области. В изобретении, в частности, заявляется вектор для экспрессии способной секретироваться нейраминидазы гриппа NA2, который содержит сайт инициации репликации, кодирующую область гена штамма гриппа A/Victoria/3/75 минус область, кодирующая мембранный якорь, или ее модифицированный вариант.

Для экспрессии в клетках насекомых указанный вектор помещают в клетку вместе с бакуловирусом дикого типа или его производным. Вследствие двойной гомологичной рекомбинации получают рекомбинантный бакуловирус, при этом модуль экспрессии из вектора вводится в геном вируса. После очистки бляшек получают запас рекомбинантных бакуловирусов, который затем можно использовать, например, для инфицирования клеток sf9.

Предпочтительно используют сигнальную последовательность гена гемагглютинина вируса A/Victoria/3/75 (Н3N2) гриппа NA2. Изобретение преимущественно включает вектор рАс21VNАS, зарегистрированный 3 января 1994 года в Коллекции плазмид Лаборатории молекулярной биологии (Laboratorium voor Moleculaire Biologie - Plasmidencollectie (LMBP)) по адресу: K.L. Ladeganckstraat 35, B-9000 Ghent, Belgium, и получивший при депонировании регистрационный номер LMBP 2976, который используют для трансформации вируса, такого как, например, бакуловирус, с помощью двойной гомологичной рекомбинации. В соответствии с настоящим изобретением модуль экспрессии вектора, включающий сигналы регуляции транскрипции, сигнальную последовательность и кодирующую область, помещают в геном вируса.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения используют второй вектор по настоящему изобретению. Указанный вектор рассчитан на использование в дрожжах и включает, например, сайт инициации репликации, кодирующая область гена нейраминидазы штамма A/Victoria/3/75 гриппа NА2 минус области, которые кодируют соответственно мембранный якорь и стеблевую часть нейраминидазы, или ее модифицированные варианты, сигнальную последовательность, расположенную в 5'-положении от кодирующей области и связанную с ней в фазе, промотор, расположенный в 5'-положении от сигнальной последовательности, и терминатор транскрипции, расположенный в 3'-положении от кодирующей области.

Последовательности промотора и терминатора предпочтительно являются гомологичными и выделяются из метилотрофных дрожжей Pichia pastoris таких как последовательности гена алкогольоксидазы 1. В сигнальной последовательности, например, располагается сигнал секреции препро-фактора, спаривания Saccharomyces cerevisiae.

Указанный вектор pPP1IVNAf1s зарегистрирован 3 января 1995 года в Laboratorium voor Moleculaire Biologie - Plasmidencollectie (LMBP), K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Ghent, Belgium, и получил при депонировании регистрационный номер LMBP 3223.

Рекомбинантная нейраминидаза по настоящему изобретению оказалось способна генерировать защитный иммунитет против вирусов гриппа, в частности вирусов гриппа типа NA2. Изобретение относится также к вакцине против гриппа, которая содержит рекомбинантную нейраминидазу.

Кроме того, изобретение относится к способу получения рекомбинантной нейраминидазы и к способу ее очистки.

В описании настоящего изобретения и в формуле термин "NAS" обозначает секретируемую (рекомбинантную) нейраминидазу; "рNА" относится к природной нейраминидазе, обработанной проназой; "NA" обозначает нейраминидазу.

Настоящее изобретение далее поясняется приведенными ниже примерами, которые приводятся лишь для иллюстрации, а не для ограничения объема притязаний по настоящему изобретению.

Пример 1. Экспрессия, очистка и изучение свойств рекомбинантной нейраминидазы гриппа NА2 Материалы и методики 1. Конструирование гена, кодирующего секретируемую нейраминидазу, и его интегрирование в систему экспрессии бакуловируса а. Плазмиды Плазмида рV6/21 является производной pBR322, содержащей копию гена нейраминидазы вируса A/Victoria/3/75 гриппа (Van Rompuy et al., 1982). pSV 51 и как pSV 23m, так и рS 24m представляют собой соответственно поздний и ранний SV40-замещенные секторы и описываются в других местах (Huylenbroeck et al., 1988). pSRS-8 представляют собой плазмиду на основе pPLa2311, которая содержит стартовую последовательность гена гемагглютинина (NА) из A/Victoria/3/75 (Н3N2) (Huylenbroeck et al., 1988). Бакуловирусный трансферный вектор pVL941 разработали Luckow and Summers (1989).

b. Субклонирование сигнальной пептидной последовательности гемагглютинина (pIV-рrеНА) Bst NI фрагмент pSR S-8 размером 1830 пар оснований вставляют с помощью фермента Кленова. Далее располагают Pvu II-линкеры (GCAGCTGC). Полученный фрагмент и pBR322 расщепляют Pvu I и Pvu II и выделяют фрагменты размером соответственно 731 пара оснований и 1699 пар оснований. Их лигированием получают pIv рrеНА, которая содержит 5'-нетранслируемую область гена гемагглютинина, начиная с G₁₆ (АТG = +1, +2, +3), за которой следует интактная сигнальная последовательность гемагглютинина и первые несколько кодонов зрелого гемагглютинина.

с. Конструирование химерной последовательности, которая кодирует способную секретироваться нейраминидазу: pATIVNAS pV 6/21 раскрывают с помощью Pvu I и обрабатывают экзонуклеазой Ва131. К этой смеси лигируют Hind III-линкеры, а затем расщепляют Hind III. Фрагмент нейраминидазы размером приблизительно 1500 пар оснований отделяют и клонируют в уникальный Hind III - сайт pSV 23m (рSV 23mIVNA). Плазмиды со вставкой в противоположной ориентации затем расщепляют Fnud и Sal I и выделяют фрагмент размером 1291 пара оснований, содержащий ген нейраминидазы минус последовательность мембранного якоря. Затем pIVpreNA инкубируют с Рst I и Pvu II и получают В61br - фрагмент с сигнальной последовательностью гемагглютинина. Оба фрагмента в конце концов сливают методом лигирования по тупым концам Pvu II - Fnud II и встраивают во фрагмент Sal I/Pst I размером 2253 пары оснований из рАТ153, получая pATIVNAs. Эта плазмида содержит последовательность, которая кодирует сигнальную последовательность гемагглютинина, включая первые несколько аминокислот зрелого гемагглютинина, за которыми непосредственно следует последовательность нейраминидазы, в которой отсутствует сигнальный пептид/мембранный якорь и часть области, кодирующей "стебель". Лигирование фрагментов гемагглютинина и нейраминидазы приводит к замене лишь одной аминокислоты (Gly на Аlа), которая соответствует позиции 5 в зрелом гемагглютинине. На основании информации, опубликованной Minjou et al. (1988) и Van Rompuy et al. (1982), предсказанные последовательности ДНК и аминокислотных остатков, фланкирующие места лигирования в нейраминидазе, показаны на фиг. 2.

d. Интеграция нейраминидазы в бакуловирусный вектор переноса XbaI/SalI фрагмент из pATIV NAS размером 1368 пар оснований лигируют с фрагментом SаlI/ЕсоRI из рSV 51 размером 5562 пары оснований и фрагментом EcoRI/XbaI из рSV24m размером 624 пары оснований. Копию фрагмента BamHI размером 1647 пар оснований, содержащего ген нейраминидазы и поли(А)-сайт SV40, затем встраивают в единственный сайт рестрикции pVL941, учитывая правильную ориентацию по отношению к промотору полиэдрина, и получают pAc21VNAS. Эта конструкция обеспечивает гомологичную рекомбинантную с ДНК AcNPV дикого типа после котрансфекции клеток sf9. Потомство рекомбинантного вируса выделяют последующей очисткой бляшек, как описано Summers and Smith (1987).

2. Культура клеток насекомого - продукция нейраминидазы Обычную культуру sf9 клеток насекомого поддерживают в виде конфлюентных клеточных монослоев в среде ТС100, содержащей 10% сыворотки эмбриона теленка и 50 мкг/мл гентамицина. Для проведения инфекции рекомбинантным бакуловирусом культуры переносят в суспензии объемом 200 мл, которые выращивают в роллер-флаконах емкостью 850 мл (25 об/мин). Затем суспензии клеток по окончании их лог-фазы (210⁶ клеток на миллилитр) инфицируют рекомбинантным бакуловирусом при moi ("множественности заражения", т.е. количестве инфекционных вирусных частиц на клетку), равной 1,0. Через два часа инфицированные клетки переносят в свежую порцию среды ТС100, не содержащую сыворотку, и инкубируют в суспензию в течение 48 часов. Нейраминидазу очищают из культуральной жидкости, как описано ниже.

3. Выращивание вируса Х-47 гриппа Штамм Х-47 гриппа используют в качестве источника для получения природной нейраминидазы A/Victoria/3/75 после обработки проназой. Вирус Х-47 выращивают в полости желточного мешка 11-дневного куриного эмбриона. После двух дней выдерживания в термостате при температуре 25,5^oС яйца оставляют на ночь охлаждаться до 4^oС и собирают жидкость желточного мешка для дальнейшей переработки.

4. Буферные системы Обычно применяют следующие буферные растворы: буфер А: 20 мМ диэтаноламин/HCl с pH 8,5; буфер В: 50 мМ NaAc с рН 5,5; буфер С: 10 мМ NaP с рН 7,4, 150 мМ NaCl; буферы А и С дополнительно содержат 4% бутанола (если специально не оговаривается) и 2 мМ хлорида кальция.

5. Очистка рекомбинантной нейраминидазы а. Фракционирование с помощью сульфата аммония Суспензии культуры sf9 (обычно около 1 литра) собирают после заражения (см. выше) и остатки клеток осаждают центрифугированием при 4000g в течение 15 минут. Все остальные операции проводят при температуре 4^oС. На первой стадии очистки к растворам добавляют 5 мМ раствор азида натрия. Осветленную сырую среду подвергают фракционированию с помощью сульфата аммония при рН 7,5. Вещество, которое осаждается в интервале концентраций от 20% до 60% сульфата аммония, отделят центрифугированием (10000g, 60 минут) и растворяют в буфере А (без бутанола) + 20 мМ хлорида натрия в количестве, равном одной десятой от первоначального объема. Вновь растворенный осадок подвергают в течение 24 часов диализу (с молекулярным весом отсечки, равным 25 килодальтон) против 50 объемов того же самого буфера в течение 24 ч, при этом буфер трижды меняют. Нерастворимые компоненты удаляют центрифугированием при ускорении 20000g в течение 15 минут.

b. Анионообменная хроматография на сефарозе Q К раствору после диализа вначале добавляют бутанол до 4% и помещают в колонку с сефарозой Q (2,5 см10 см), которую уравновешивают буфером А + 20 мМ хлорида натрия со скоростью потока 25 мл/ч. После промывки колонки тем же самым буфером проводят элюирование в линейном градиенте концентраций хлорида натрия в промывочном буфере до достижения концентраций 250 мМ (250 мл; 25 мл/ч). Фракции объемом 2,5 мл, содержащие рекомбинантную нейраминидазу, идентифицируют, измеряя активность фермента и его содержание по методу твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Активность нейраминидазы элюируется из колонки в виде одного пика.

с. Афинная хроматогарфия на агарозе с N-(п-аминофенил)оксамовой кислотой Использование указанной афинной матрицы описано для очистки нейраминидазы (нерекомбинантной) вируса гриппа и бактериальных NА-ферментов (Cuatracassas and Illiano, 1971; Bucher, 1977). Корректное функционирование афинной матрицы достигается лишь после изменения первоначально рекомендованных буферных условий. Активные фракции после разделения на сефарозе Q собирают и добавляют к ним равный объем 200 мМ раствора ацетата натрия с рН 5,5. Затем активные фракции помещают в колонку на основе агарозы с N-(п-аминофенил)оксамовой кислотой (1,5 5 см), уравновешенную буфером В, 100 мМ NaCl. Затем колонку промывают уравновешивающим буфером и обессоливают буфером В. Вторую стадию промывки проводят, используя буфер А. Рекомбинантную нейраминидазу в конце концов элюируют буфером А, содержащим 1 М хлорид натрия со скоростью потока 10 мл/ч (собирают фракции объемом 2 мл).

d. Гель-хроматография на Superdex 200 Элюат, полученный после афинной колонки, концентрируют до объема 2,0 мл, используя концентраторы Centriprep ТМ (от компании "Amicon", молекулярная масса отсечки 30 килодальтон). Концентрат хроматографируют во фракциях объемом 1,0 мл на колонке для гель-хроматографии с Superdex 200 (1,560 см), которую уравновешивают буфером С, содержащим 4% бутанола. Колонку элюируют уравновешивающим буфером при скорости потока 10 мл/ч и отбирают фракции объемом 1,0 мл. Для хранения в течение длительного времени при температуре минус 20^oС отбирают соответствующие фракции, концентрируют как описано ранее и добавляют к ним глицерин до конечной концентрации 50%.

Для оценки молекулярного веса очищенных белков гель-хроматографическую колонку калибруют апоферритином из селезенки лошади (443 килодальтон), бета-амилазой из сладкого картофеля (200 килодальтон), алкогольдегидрогеназой из дрожжей (150 килодальтон), бычьим сывороточным альбумином (67 килодальтон) и карбонангидразой (29 килодальтон) (все от компании "Sigma Chemical Со.").

6. Получение и очистка природной нейраминидазы, обработанной проназой (pNA) а. Обработка проназой Желточный мешок куриных эмбрионов, инфицированных с помощью Х-47, вначале осветляют центрифугированием на малой скорости (1000g, 10 минут), а затем подвергают центрифугированию при 13000g в течение 16 часов, чтобы осадить вирус. Осадок вируса вновь суспендируют в объеме 10 мл буфера С на эквивалент 100 инфицированных яиц и, не проводя дальнейшую очистку вируса, добавляют проназу в количестве от 2 мг/мл. Смесь инкубируют в течение 16 часов при температуре 20^oС, слегка перемешивая. Оставшиеся части вируса и нерастворенные проназой компоненты затем удаляют на ультрацентрифуге (100000g, 1 час) при температуре 4^oС. Супернатант, содержащий освобожденные головки нейраминидазы, очищают колоночной хроматографией.

b. Катионообменная хроматография на сефарозе S Хроматографию проводят при температуре 4^oС. Сырой образец рNА разбавляют в пять раз и добавляют к 50 мМ раствора ацетата натрия с рН 5,5, содержащего 2 мМ хлорида кальция и 1% бутанола. Затем раствор помещают на колонку с сефарозой S (1,5 см 10 см), которую уравновешивают буфером В + 1% бутанола и 50 мМ хлорида натрия. Связанное вещество элюируют в линейном градиенте до концентрации 500 мМ хлорида натрия в том же самом буфере. Собирают фракции, показывающие наибольшую активность фермента, и концентрируют до объема 2,0 мл с помощью концентраторных трубок Centriprep ТМ ("Amicon"; молекулярная масса отсечки: 30 килодальтон).

d. Гель-фильтрация на Superdex 200 Гель-фильтрацию на Superdex 200 проводят аналогично тому, как проводят очистку нейраминидазы (за исключением того, что концентрация бутанола составляет 1%). Очищенную pNA хранят при температуре минус 20^oС в 50%-ном глицерине.

7. Ферментативный анализ нейраминидазы Анализ каталитической активности нейраминидазы основан на методе Potier et al. (1979). Если коротко, то испытания фермента проводят в реакционном объеме 100 мкл в растворе 20 мМ ацетата натрия с рН 6,5, 2 мМ хлорида кальция и 1% бутанола в присутствии 1 мМ 2'-(4-метилумбеллиферил)-альфа-D-N-ацетилнейраминовой кислоты в качестве субстрата. После инкубации при температуре 37^oС в течение от 30 до 60 минут реакцию прекращают, добавляя 0,5 мл 133 мМ глицина, 83 мМ бикарбоната натрия, 60 мМ хлорида натрия, рН 10,7. Определяют содержание 4-метилумбеллиферона, измеряя поглощение на длине волны 365 нм. Одну единицу определяют как количество фермента, которое освобождает один нмоль 4-метилумбеллиферона в минуту.

8. Иммунологические методы а. Получение поликлонального анти-рNА IgG Поликлональную антисыворотку против очищенной pNA, обработанной проназой, получают в трехмесячных кроликах линии New Zealand. Первичную иммунизацию проводят, вводя в каждую лапу внутримышечно четыре дозы объемом 500 мкл, содержащей 50 мкг рNА/доза и 75%-ный полный адъювант Фрейнда. Через шесть недель животные получают две соответствующие бустерные инъекции в обе задние лапы. Для получения фракций IgG собранную сыворотку очищают адсорбцией на протеин А-сефарозе ("Pharmacia LKB").

b. ELISA Ячейки планшета для микротитрования покрывают анти-рNА IgG кролика. Испытуемые образцы разбавляют забуференным фосфатом солевым физиологическим раствором, содержащим 0,1% бычьего сывороточного альбумина. Связанный антиген определяют с помощью обработанного биотином анти-рNА IgG кролика с последующим добавлением конъюгата стрептавидин-щелочная фосфатаза ("Boehrinqer"). Ферментативная реакция развивается при инкубировании планшетов с п-нитрофенилфосфатом ("Sigma Chemical Co."). Значения абсорбции определяют на длине волны 405 нм с помощью ридера микропланшетов.

9. Аналитические методы Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия проводят по методу Laemmli (1970) на 10%-ном разделяющем геле (если специально не указано). Все образцы, если специально не оговаривается, денатурируют в присутствии бета-меркаптоэтанола. В качестве белков-маркеров в 10%-ном геле используют фосфорилазу b (94 килодальтон), бычий сывороточный альбумин (67 килодальтон), овальбумин (43 килодальтон), карбонангидразу (29 килодальтон) и ингибитор трипсина (20,1 килодальтон, не всегда виден) ("Pharmacia LKB"). Градиентные гели калибруют следующими стандартами массы: миозин (22 килодальтон), бета-галактозидаза (116 килодальтон), фосфорилаза b, бычий сывороточный альбумин и овальбумин ("Biorad"). Окрашивание серебром в гелях проводят по модифицированному методу, приведенному Morrisey (1981). Концентрацию белка определяют по методу Bradford (1976), используя в качестве стандарта овальбумин.

10. Анализ методом перекрестного связывания Молекулу ВS³ для перекрестного связывания используют в виде свежеприготовленного 1,0 М раствора в 10 мМ буфере Hepes с рН 7,4. Белки перекрестно связывают добавлением BS³ до концентрации 0,5 мМ в реакционном объеме 30 мкл. Инкубацию проводят в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем реакцию прерывают, добавляя 5 мкл 1,0 М буфера Тris с рН 8,0. Полипептидные образцы анализируют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

11. Углеводный анализ Образцы белков (от 0,1 мкг до 1 мкг) денатурируют кипячением в 500 мМ Тris/НСl с рН 8,0, 0,5% додецилсульфата натрия, 50 мМ бета-меркаптоэтанола. После добавления нейраминидаза-октилглюкозида до концентрации 2,5%, что приводит к по крайней мере семикратному превышению над конечной концентрацией додецилсульфата натрия, добавляют нейраминидаза-глюканазу (около 0,5 единиц; количество единиц указано в соответствии с данными производителя) и реакционную смесь инкубируют при температуре 37^oС в течение 16 часов. Картины расщепления анализируют электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

Результаты 1. Очистка pNА При проведении описываемого здесь типичного эксперимента перерабатывают 186 инфицированных яиц. Различные стадии очистки суммированы в табл. 1. После сбора жидкости из желточных мешочков и осаждения вируса добавляют проназу до концентрации 2 мг/мл и смесь инкубируют при температуре 20^oС в течение 16 часов. После ультрацентрифугирования в жидкости над осадком определяют приблизительно 60% активности нейраминидазы. Было показано, что в указанных условиях потеря активности в основном связана с неполным извлечением головок нейраминидазы вирусных частиц. Более высокие концентрации проназы, более длительные периоды инкубации или более высокая температура не приводят к увеличению выхода, поскольку нейраминидаза постепенно деградирует (данные не показаны). Сырой материал рNА затем растворяют, доводят рН до 5,5 и помещают на катионообменную колонку с сефарозой S. Для максимального выхода рNА, все последующие растворы содержат 1% бутанола. Большая часть белка не удерживается в колонке с сефарозой S и после градиентного элюирования при значении концентрации хлорида натрия приблизительно 400 мМ собирают единственный пик (не показано). Это вещество содержит в значительной степени очищенную рNА: поскольку никаких загрязняющих полос после электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия не обнаружено (фиг. 3А, дорожка 3). Далее, окрашивание серебром не показывает никаких отличий между пулом после сефарозы S и после дополнительной гель-фильтрации на Superdex 200 (фиг. 3А, дорожки 3 и 4). После последней колонки собирают единственный колоколообразный пик во фракции 60 (не показано), который соответствует молекулярному весу приблизительно 210 килодальтон. Последовательные стадии очистки поясняются на фиг. 3А.

Во время электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия мономер рNА на самом деле виден как дублет двух полос, соответствующих соответственно приблизительно 54 килодальтон и 52 килодальтон, причем последняя встречается наиболее часто, о чем свидетельствует относительно интенсивности при окрашивании серебром. Наиболее вероятно, что эта амбивалентность появляется вследствие предпочтительного расщепления проназой в двух различных местах стеблевой области. Перекрестное связывание химическим агентом BS³ подтверждает, что pNA выделяется в виде аутентичного тетрамерного белка (фиг. 3В).

2. Конструирование и экспрессия рекомбинантной нейраминидазы Ген нейраминидазы штамма A/Victoria/3/75 гриппа NA2 отделяют от его концевого мембранного якоря нейраминидазы и присоединяют вместо этого к 5'-последовательности гена гемаглютинина A/Victoria/3/75, который содержит сайт сплайсинга сигнального пептида. Становится возможным синтез секретируемого растворимого продукта. Полученный химерный ген содержит сигнальную последовательность гемагглютинина, включающую кодоны для первых четырех концевых аминокислот зрелого гемагглютинина, непосредственно за которыми следуют последовательность нейраминидазы, в которой отсутствует трансмембранная часть (якорь) и часть стеблевой области (аминокислоты с 1 по 45). Обе ДНК-последовательности располагаются в одной рамке считывания информации, при этом не вводится дополнительных аминокислот. Лигирование приводит лишь к одной замене аминокислоты, соответствующей позиции 5 зрелого белка гемагглютинина (фиг. 2). Копию этой химерной последовательности которая теперь в основном кодирует способный секретироваться белок, интегрируют позади промотора полиэдрина бакуловируса AcNPV, используя pVL941 в качестве вектора переноса. После заражения клеток sf9 насекомого быстро определяют активность нейраминидазы в этой среде и показывают, что действительно получает растворимый белок.

Из фиг. 4 видно, что активность нейраминидазы в среде достигает уровня плато приблизительно через 48 часов после инфицирования. Дальнейшая инкубация не приносит результатов, поскольку общая концентрация белка начинает резко уменьшаться, вероятно вследствие избыточного лизиса клеток. Было показано, что экспрессия наиболее интенсивно проходит в том случае, когда промежуточный перенос между исходным монослоем sf9 и суспензионной культурой ограничен к минимуму (данные не приведены). На основании разнообразных экспериментов по очистке было установлено, что уровень экспрессии нейраминидазы варьирует от 6 до 8 мг/л, что соответствует довольно низкой производительности, однако она сравнима с выходами, которые сообщаются для других секретируемых комплексных гликопротеинов, продуцируемых в данной системе (Jarvis et al., 1990).

3. Очистка рекомбинантной нейраминидазы Среду ТС100 собирают через 48 часов после инфицирования в тот момент, когда удельная ферментативная активность растворимого белка достигает пикового значения (фиг. 4). Различные стадии очистки рекомбинантной нейраминидазы суммированы в табл. 1. Осаждение сырой среды сульфатом аммония в интервале насыщения от 20 до 60% дает среднее двоекратное обогащение и позволяет осуществить концентрирование продукта. После интенсивного диализа и удаления нерастворимых продуктов добавляют бутанол до концентрации 4%. Было показано, что добавление бутанола оказывает значительное благоприятное воздействие на общий выход рекомбинантной нейраминидазы, особенно при низких концентрациях белка. Возможно, для предотвращения образования нерастворимых агрегатов необходима определенная гидрофобность среды. Затем раствор фракционируют анионообменной хроматографией на сефарозе Q (фиг. 5). Активность нейраминидазы элюируется в начале градиента соли в виде практически симметричного пика. В соответствии с твердофазным иммуносорбентным анализом оставшиеся фракции не содержат относящегося к нейраминидазе вещества. На этой стадии выделяют приблизительно 97,5% исходного количества белка, что приводит к увеличению удельной активности приблизительно в 20 раз. Затем рН раствора перед загрузкой в колонку с N-(п-аминофенил)оксамовой кислотой - агарозой понижают до величины 5.5. Из ранних исследований известно, что нейраминидаза-замещенные оксамовые кислоты являются сильными обратимыми ингибиторами нейраминидазы гриппа (Edmond et al., 1966). Использование N-(п-аминофенил)оксамовой кислоты - агарозы в качестве селективного абсорбента нейраминидазы гриппа или бактерий впервые описали Cuatrecasas and Illiano (1971) и позднее Bucher (1977). В соответствии с оригинальной методикой нейраминидазу элюируют буфером с высоким рН (100 мМ бикарбоната натрия, рН 9,1). Однако в наших экспериментах эти условия позволяют осуществить лишь частичное и медленное извлечение рекомбинантной нейраминидазы. Однако эффективной десорбции можно достичь, сочетая увеличение значения рН с высокой концентрацией соли. Перед элюированием значительное количество неспецифично связанного белка удаляют из колонки, проведя дополнительную стадию промывки при рН 8,5 при низкой концентрации соли. Если отдать предпочтение диэтаноламину как буферному агенту перед бикарбонатом натрия, то можно добиться абсорбции 2 мМ хлорида кальция без осаждения. Неоднократно указывалось, что сохранение активности нейраминидазы несколько зависит от концентрации ионов кальция (Chond et al., 1966; Dimmock, 1971). Так ли это, в настоящем исследовании детально не анализируется.

Чтобы удалить следы остаточных загрязняющих веществ элюат концентрируют методом ультрафильтрации и подвергают гель-фильтрации на Superdex 200 (фиг. 6). Проверка с использованием А₂₈₀ показывает три пика с неравными поглощениями, которые элюируются, соответственно, приблизительно как 220 килодальтон, приблизительно 130 килодальтон и приблизительно 54 килодальтон. Было показано, что картины иммунореактивности элюата, измеренные методом иммуноферментного твердофазного анализа, являются надежным представлением профилей A₂₈₀ для каждого из зарегистрированных трех пиков, что свидетельствует о том, что все соединения являются NАs-специфичными. Анализ фракций пиков с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия показывает интенсивную полосу в ожидаемой области размером приблизительно 55 килодальтон, хотя с увеличением номера фракции наблюдается небольшое понижение молекулярного веса (фиг. 7А). Пик размером 220 килодальтон анализом по методу перекрестного связывания с использованием ВS³ идентифицируют как тетрамерную рекомбинантную нейраминидазу, а два других пика с меньшей молекулярной массой являются, как было обнаружено, димерной и мономерной нейраминидазой, соответственно, при этом последняя форма имеет незначительную количественную значимость (фиг. 7В). Полагают, что благодаря своей палочкообразной структуре димерная рекомбинантная нейраминидаза элюируется несколько выше значения своего молекулярного веса по сравнению с тетрамерной и мономерной рекомбинантной нейраминидазой, которые, как полагают, имеют круглую форму. Особо следует отметить, что каталитическая активность требует полностью собранной тетрамерной структуры рекомбинантной нейраминидазы. Возможно, формирование тетрамера вызывает несколько локальных конформационных изменений, которые имеют важное значение для ферментной активности.

Последовательность проведения операций очистки приведена в табл. 2.

4. Свойства рекомбинантной нейраминидазы Денатурация кипящим раствором додецилсульфата натрия в присутствии бета-меркаптоэтанола вызывает полную диссоциацию рекомбинантной нейраминидазы на мономерные цепочки с молекулярным весом близким к 55 килодальтон (фиг. 7А). Тетрамерная и димерная рекомбинантная нейраминидаза гомогенно очищены, если судить