Ингибитор пролиферации стволовой клетки и способ его применения

Ингибитор пролиферации стволовой клетки и способ его применения

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины. Сущность изобретения состоит в раскрытии способов выделения и использования ингибирующих факторов стволовой клетки для регулирования цикла ненормальной стволовой клетки и акселерации выздоровления клетки периферической крови в период и после периода химиотерапии. Раскрыты также способы лечения и вакцинации. В изобретение также входят ингибиторы пролиферации стволовой клетки. Технический результат - расширение арсенала средств, ингибирующих пролиферацию стволовых клеток. 32 с. и 22 з.п.ф-лы, 19 табл., 21 ил.

Изобретение касается использования ингибиторов пролиферации стволовой клетки для регулирования цикла стволовой клетки при лечении человека и животных, подверженных аутоиммунным заболеваниям, старению, раку, миелоэзу, прелейкозу, лейкозу, псориазу или другим болезням, включающим в себя условия гиперпролиферации. Настоящее изобретение также касается способа лечения человека и животных, имеющим симптомы или подвергающихся воздействию химиотерапевтических факторов, прочих факторов, пагубно воздействующих на цикличность стволовой клетки, или облученных радиацией. И, наконец, настоящее изобретение касается улучшения поддержания жизнедеятельности стволовой клетки или культур роста для процесса авто- и алло- трансплантации или переноса генов.

Большинство клеток на терминальной стадии дифференцировки в обновляющихся системах имеют короткий срок жизни и непрерывно заменяться на протяжении жизни человека. Например, клетки крови создаются в самообновляющейся популяции мультипотентных кроветворных стволовых клеток (КСК). Кроветворные стволовые клетки являются подпопуляцией кроветворных клеток. Кроветворные клетки могут быть получены, например, из костного мозга, умбиликальной пуповинной крови или периферической крови (не активированной или активированной таким фактором, как фактор роста - ликвор КСФ-Г; кроветворные клетки включают популяцию стволовой клетки, клетки-предшественника, дифференцированные клетки, придаточные клетки, клетки стромы и прочие клетки, которые вносят вклад в окружающую среду, необходимый для производства зрелых клеток в крови. Вследствие того, что кроветворные стволовые клетки необходимы для развития всех зрелых клеток кроветворной и иммунной систем, их выживаемость чрезвычайно важна для восстановления иммунной системы организма в полном объеме в людях, лечение которых производится с помощью химиотерапии или других агентов.

Воспроизводство кроветворных клеток регулируется серией факторов, которые стимулируют рост и дифференциацию кроветворных клеток, некоторые из которых, например, эритропоэтин и фактор роста - ликвер, сейчас используются в клинической практике. Одной из частей сети управления, которая однако не была широко рассмотрена, является механизм обратной связи, который образует отрицательный рычаг процесса регулирования (Ив и др. Кровь 78: 110-117, 1991).

Ранние исследования, проведенные Лордом и его коллегами, отразили существование фактора растворимого белка в обычных экстрактах костного мозга мышей и свиней, способного обратимо ингибировать цикл КСК (Лорд и др., Бр. Дж. Хаем. 34: 441-446, 1976). Эта ингибирующая деятельность (молекулярный вес 50-100 кД) была вызвана ингибитором стволовой клетки (ИСК).

Очистка этого фактора от первоначальных источников не была выполнена по причине трудностей, связанных с анализом in vivo, требующем большого количества облученных мышей. Пытаясь преодолеть эти проблемы, Прогнелл со своими коллегами разработал анализ с in vitro для примитивных кроветворных клеток (КОЕ-А, колониеобразующая единица) и протестировали клеточные, принятые в качестве источника ингибирующей деятельности ( см. Грэхэм и др. Природа 314: 442-444, 1990).

Как и в ранних исследованиях в качестве возможных источников для ИСК были выявлены макрофаги (Лорд и др. Клетки крови 6:581-593,1980), для исследования отобрали клеточную линию макрофагов мыши, J774.2 (Грэхэм и др. Природа 344: 442-444,1990). Для очистки Грэхэм и др. использовали обусловленную среду из этой клеточной линии, ингибирующий пептид был изолирован, что оказалось идентичным описанному выше возбуждающему белку макрофага цитокина 1 - альфа (ВБМ -1 альфа). Таким образом, ВБМ- 1 альфа был изолирован из клеточной линии, а не из первичного вещества. В то время, как Грэхэм и др. наблюдали за тем, как действие антитела к ВБМ - 1 альфа отменило действие необработанного экстракта костного мозга, другие сотрудники обратили внимание на важность другой ингибирующей деятельности. Например, Грэхэм и др. (Дж. Експ. Мед. 178: 925-32, 1993) выразили мысль, что главным ингибитором кроветворных стволовых клеток является TGF бетта, а не ВБМ-1 альфа. Далее, Ив и др. (PNAS 90:12015-19,1993) предложили, что как ВБМ-1 альфа, так и TGF бетта присутствуют на субоптимальных уровнях в обычном костном мозге, и ингибирование требует синергии (совместного действия) двух факторов.

Другие сотрудники описали дополнительные ингибирующие факторы стволовой клетки. Фриндель со своими коллегами изолировали тетраптид из эмбрионального экстракта костного мозга теленка и экстракта печени, в которой присутствует ингибирующая деятельность стволовой клетки (Lenfant и др. PNAS 86: 779-782, 1989). Paukovits и др. (Cancer res. 50: 328-332, 1990) дали описание пентапептида, который в своей изометрической форме является ингибитором, а в своей тетрагональной форме является стимулятором циклической деятельности стволовой клетки. В различных системах in vitro были признаны и другие факторы (см. Wright and Pragnell в Bailliere's Clinical Haematology, том 5, стр. 723-39, 1992(Bailliere's Tinadall)).

Цырлова и др. СССР 1561261 А1 рассмотрела процесс очистки для ингибитора пролифирации стволовой клетки.

Сегодня ни один из этих факторов не утвержден для использования в клинических целях. Однако необходимость в эффективных ингибиторах стволовой клетки существует. Главным источником токсичности, возникающей при химиотерапии и лучевой терапии, является разрушение обычных пролиферативных клеток, что может привести к супрессии костного мозга или к желудочно-кишечной токсичности. Эффективный ингибитор стволовой клетки предохранит эти клетки и позволит оптимизировать эти терапевтические режимы. Таким образом, при наличии обоснованной необходимости в разнообразных стимулирующих цитогенах ( таких как IL-1, IL-2, IL-3. IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, IL-14, IL-15, КОЕ-Г, КОЕ-ГМ, эритропоэтин, тромбопоэтин, фактор стволовой клетки, лигандов flk 2/flt 2 и т. д., которые стимулируют циркуляцию кроветворных клеток) в зависимости от клинической ситуации, таким образом, возможна ситуация, при которой видна необходимость в разнообразных ингибирующих факторах.

Гемоглобин представляет собой высоко консервированный тетрамерный белок с молекулярным весом 64000 Дальтон. Он состоит из двух альфа- и двух бета-цепей. Каждая цепь связывает одну молекулу гема (железопорфирина IX), железосодержащая протезная группа. Вертебральные альфа- и бета-цепи возможно были получены из одного наследственного гена, который удвоился и затем распространился; две цепи сохранили большую степень последовательной схожести, как между собой, так и между различными позвонками (см. рис.16 А). В человеческом организме скопление альфа-цепи на хромосоме 16 содержит два альфа-гена (альфа 1 и альфа 2), которые имеют следующий код для идентичных полипептидов, а также генов, кодирующих другие цепи, подобные альфа: зета, тета и несколько не транскрибированных псевдогенов (см. рис.16 В для кДНК и аминокислотной последовательности альфа-цепи человеческого организма). Скопление бета-цепи на хромосоме 11 состоит из одиночного гена бета-цепи и нескольких генов, похожих на бета: дельта, ипсилон, G-гамма и А-гамма, а также, по крайней мере, два невыраженных псевдогена (см. рис.16С для ДНК и аминокислотной последовательности бета-цепи человеческого организма). Экспрессия этих генов варьируется в период роста. В гемопоэзе человеческого организма, который был широко исследован, эмбриональные эритробласты успешно синтезировали тетрамеры двух зета- и двух ипсилон-цепей (Gower 1), двух альфа- и двух ипсилон-цепей (Gower II) или двух зета- и двух гамма-цепей (Hb Portland). В процессе развития эмбриогенеза преобладающая форма состоит из эмбрионального гемоглобина (Hb F), который состоит из двух альфа- и двух гамма-цепей. Гемоглобин зрелого организма (две альфа- и две бета-цепи) подвергается синтезированию во внутриутробный период; при рождении он составляет приблизительно 50% гемоглобина, а завершается переход в течение 6 месяцев. Значительная часть гемоглобина (приблизительно 97%) в зрелом организме наблюдается в виде следующих разновидностей: две альфа- и две бета-цепи (Hb А) с небольшим количеством Hb F или дельта-цепи (Hb А₂).

Гем был широко изучен с точки зрения влияния на кроветворность (см. S. Sassa, Seminars Hemat. 25: 312-20, 1988 и N. Abraham и др., Int. J. Cell Cloning 9: 185-210, 1991 для анализа). Гем необходим для созревания эритробластов: in vitro, гемин Хлорожелезопорфирин IX , т.е. гем с дополнительным ионом хлора увеличивает пролиферацию КОЕ-ГЕММ, БОЕ-Е и КОЕ-Е. Таким же образом гемин увеличивает объем клеточного содержимого в долговременных культурах костного мозга.

1. Химиотерапия и лучевая терапия рака.

Произведенное исследование факторов, стимулирующих рост, явилось причиной клинического использования этих факторов (эритропоэтин, КОЕ-Г, КОЕ-ГМ и т.д.). Эти факторы снизили смертность и заболеваемость, связанные с химиотерапией и лучевой терапией. Дальнейшие клинические выгоды для пациентов, которые проходят курс химио- и лучевой терапии, могут быть обнаружены путем использования альтернативной стратегии блокировки доступа стволовой клетки в цикл клетки, таким образом предохраняя их от постороннего токсического воздействия.

II. Трансплантация костного мозга.

Трансплантация костного мозга (ТКМ) является хорошим средством для лечения разнообразных гематологических, аутоиммунных и злокачественных болезней; современные виды лечения включают кроветворные клетки, полученные в умбиликальной пуповинной крови или из периферической крови (немобилизованной или мобилизованной такими агентами как КОЕ-Г), а также из костного мозга.

Для расширения примитивной стволовой клетки до популяции, пригодной для трансплантации, в настоящее время используется обработка кроветворных клеток методом ex vivo. Оптимизация этой процедуры требует: (1) достаточного количества стволовых клеток, способных поддерживать долговременное воспроизведение гемопоэза; (2) снижение трансплантата по отношению к Т-лимфоциту и (3) отсутствие остаточных злокачественных клеток. Эта процедура может быть оптимизирована, если для расширения методом ех vivo включаются ингибиторы стволовой клетки.

Эффективность очищения кроветворных клеток цитотоксичными лекарственными средствами с целью уничтожения остаточных злокачественных клеток ограничено вследствие токсичности этих составов для нормальных кроветворных клеток, и особенно стволовых клеток. Необходимо наличие эффективной защиты нормальных клеток во время процесса очищения; защита может быть обеспечена путем извлечения стволовых клеток из цикла посредством эффективного ингибитора.

III. Сбор периферической стволовой клетки.

Периферические стволовые клетки крови (ПСКК) обеспечивают несколько потенциальных преимуществ по сравнению с костным мозгом при аутогенной трансплантации. Пациенты, которые не имеют удобных участков для сбора костного мозга вследствие вмешательства опухоли или предшествующей лучевой терапии, могут однако быть объектами сбора ПСКК. При использовании стволовых клеток крови отпадает необходимость общей анестезии и хирургического вмешательства для пациентов, которые плохо их переносят. Технология афереза, необходимая для сбора клеток крови, является эффективной и имеется в наличии большинства медицинских центров. Крупнейшими ограничениями метода являются как низкая частота стационарного состояния стволовых клеток в периферической крови и их высокий статус цикла после мобилизационного процесса с использованием лекарственных средств или факторов роста (т.е. циклофосфамид, КОЕ-Г, фактор стволовой клетки). Эффективный игибитор стволовой клетки был бы полезен для возвращения таких клеток в неподвижное состояние, таким образом предотвращая их потерю посредством дифференцировки.

IV. Лечение гиперпролиферационных нарушений.

Некоторые болезни характеризуются гиперпролиферационным состоянием, при котором потерявшие управление стволовые клетки стимулируют перепроизводство клеток на терминальной стадии дифференцировки. Такие состояния болезни включают без ограничений псориаз, при котором происходит перепроизводство эпидермальных клеток, предраковые состояния в желудочно-кишечном тракте, характеризующееся появлением кишечных полипов. Ингибитор стволовой клетки был бы полезен в лечении таких состояний.

V. Перенос генов.

Способность переноса генетической информации в кроветворные клетки применяется в данный момент в клинических целях. Кроветворные клетки являются полезным объектом генной терапии вследствие легкости доступа, обширного опыта обработки и лечения этой ткани ex vivo, и по причине способности клеток крови проникать через ткани. Более того, исправление некоторых человеческих дефектов могло бы быть возможным путем внедрения функционального гена в примитивные стволовые клетки кроветворной системы человека.

Для внедрения генов в кроветворные клетки человека с использованием либо инфекции ретро вируса, либо физических методов переноса генов: (1) низкая частота стволовых клеток в кроветворных тканях потребовала разработки высокоэффективных способов переноса генов; (2) стволовые клетки, имеющие более быструю цикличность оказались более восприимчивы к инфекции переносчика, однако повышение частоты инфекции путем стимулирования пролиферации стволовой клетки факторами роста оказывает отрицательное воздействие на длительную экспрессию гена, так как клетки, содержащие гены-трансплантаты, принудительно необратимо дифференцированы и потеряли способность к самообновлению. Эти проблемы могут быть решены с помощью ингибитора стволовой клетки для того, чтобы предотвратить дифференцировку и потерю способности к самообновлению.

Настоящее изобретение касается полипептидов, которые являются ингибиторами пролиферации стволовой клетки (INPROL), и их использования.

Настоящее изобретение включает ингибитор пролиферации стволовой клетки, характеризующийся следующими свойствами: (а) специфическая активность (IC₅₀) менее или аналогична 20 нг/мл в анализе селезенки мышей (КОЕ-С) на колониеобразование (см. пример 4), (б) молекулярный вес более 10000 и менее 100000 Дальтон (путем ультрафильтрации), (в) активность чувствительна к деградации при использовании ципсина, (г) более гидрофобен чем MIP- альфа или бета и может быть отделен от последних путем обращенной хроматографии (см. пример 12), (д) биологическая активность сохраняется после нагревания в течение часа при температуре 37, 55 или 75^oС в водном растворе и (е) биологическая активность сохраняется при осаждении с добавлением 1% соляной кислоты в ацетон.

Далее настоящее изобретение характеризуется и отличается от прочих возможных ингибиторов стволовой клетки (например, MIP-1 альфа, TGF бета и различных олигопептидов) своей способностью достигать ингибирования при анализе in vitro после короткого преинкубационного периода ( см. пример 5).

Настоящее изобретение охватывает также фармацевтические составы, содержащие INPROL для лечения различных нарушений.

Настоящее изобретение охватывает способ лечения пациента, подвергающегося воздействию агента, способного уничтожить или повредить стволовые клетки путем введения этому пациенту действенной дозы ингибирующего состава стволовой клетки. Стволовые клетки, сохраненные таким способом, могут представлять собой кроветворные стволовые клетки, обычно содержащиеся и делящиеся в костном мозге. С другой стороны, стволовые клетки могут быть эпителиальными, расположенными, например, в кишках или на скальпе или в других частях тела, или терминальными, расположенными в органах размножения. Способом настоящего изобретения желательно пользоваться при лечении человека, однако, он также охватывает лечение животных. Термины "субъект" или "пациент" относятся к животным, таким как млекопитающие, включая человека.

С другой стороны, изобретение охватывает способ защиты и восстановления кроветворных, иммунных и прочих систем стволовых клеток пациента, подвергнутого химиотерапии, и предусматривает введение пациенту эффективной дозы INPROL.

Кроме того, настоящее изобретение включает способ вспомогательного лечения любых раковых заболеваний, включая те из них, которые характеризуются сплошной опухолью, путем введения пациенту, больному раком, эффективной дозы INPROL для защиты стволовых клеток костного мозга, желудочно-кишечного тракта или других органов от токсического воздействия химиотерапии и лучевой терапии.

Еще одной областью применения настоящего изобретения является лечение лейкоза, которое включает лечение кроветворных клеток, в состав которых входят пролиферативные лейкозные клетки, путем введения эффективной дозы INPROL для ингибирования пролиферации нормальных стволовых клеток, а также лечению костного мозга с помощью цитотоксического агента для уничтожения лейкозных клеток.

Можно усилить действие этого способа последующим лечением костного мозга другими агентами, стимулирующими его пролиферацию: то есть факторами, которые стимулируют колониеобразование. В сочетании эти виды лечения могут осуществляться in vivo. С другой стороны, этот способ также полезен для очищения ex vivo и экспансии кроветворных клеток для трансплантации.

Кроме того, этот способ включает лечение субъекта, имеющего любое нарушение, причиненное пролиферирующими стволовыми клетками. Такие нарушения как псориаз, миелодисплазия, некоторые аутоиммунные заболевания, иммунодепрессия при старении лечатся введением эффективной дозы INPROL для частичного ингибирования пролиферации сомнительной стволовой клетки.

Настоящее изобретение включает способ для обратной защиты стволовых клеток от повреждений, нанесенных цитотоксическим агентом, способным уничтожить или повредить стволовые клетки. Способ включает введение субъекту, которому надлежит быть объектом воздействия таким агентом, эффективной дозы INPROL.

Настоящее изобретение также включает: Ингибитор пролиферации стволовой клетки, выделенной от костного мозга свиньи или другого животного путем следующей процедуры (см. пример 12): (а) извлечение костного мозга и удаление частиц веществ посредством фильтрации; (б) обработка нагреванием при 50^oС в течение 40 минут с последующим охлаждением в ледяной бане; (в) удаление осадка путем обработки в центрифуге при 10000 g в течение 30 минут при 4^oС; (г) кислотное осаждение посредством добавления супернатанта к 10 объемам перемешанного ацетона пониженной температуры, содержащего 1% по объему концентрированной соляной кислоты при инкубации при 4^oС в течение 16 часов; (д) выделение осадка путем обработки в центрифуге при 20000 g в течение 30 минут при 4^oС и промывке холодным ацетоном после высушивания; (е) выделение путем обращенной хромотографии и отслеживания активности путем ингибирования процесса колониеобразования клетками костного мозга, в котором были предварительно введены 5-флуороурацил и выдержанного в присутствии IL-3 мыши, а также путем абсорбции при 280 нг и SDS-PAGE.

Настоящее изобретение также включает: Способы для очистки ингибитора пролиферации стволовой клетки, которые в значительной степени освобождены от прочих веществ, напоминающих белки, составляющие пункты, изложенные выше. Более подробно об этом изложено ниже.

Настоящее изобретение также включает: Способ лечения людей и животных, при котором ингибитор пролиферации стволовой клетки содействует ослаблению иммунодепрессии, возникающей вследствие гиперпролиферации стволовой клетки.

Настоящее изобретение также включает: Способ лечения людей и животных, при этом упомянутый ингибитор пролиферации стволовой клетки вводят после того, как стволовые клетки индуцированы для пролиферации путем воздействия цитотоксического лекарственного средства или облучения. Стволовые клетки обычно неактивны, однако их стимулируют внедряться в цикл клетки после химиотерапии. Это делает их более чувствительными ко второму приему химиотерапии; данный метод предохраняет их от такого лечения.

Настоящее изобретение также включает: Способ лечения человека и животных, при этом упомянутый ингибитор пролиферации стволовой клетки вводится в качестве адъюванта перед или совместно с вакцинацией с целью улучшения иммунной реакции.

Настоящее изобретение также включает: Способ лечения человека и животных, принимающих цитотоксическое лекарственное средство или подвергающихся лучевой терапии. Этот способ представляет собой введение эффективной дозы ингибитора пролиферации стволовой клетки для защиты стволовой клетки от повреждений.

Настоящее изобретение также включает фармацевтический состав, в который входят (а) полипептид, отобранный из группы, состоящей из альфа-цепи гемоглобина, бета-цепи гемоглобина, гамма-цепи гемоглобина, дельта-цепи гемоглобина, ипсилон-цепи гемоглобина и зета-цепи гемоглобина, и (б) фармацевтически приемлемый носитель. Такие фармацевтические составы могут состоять из одиночного полипептида, отобранного из упомянутой группы, смеси полипептидов, отобранных из упомянутой группы в форме димеров и мультимеров, с гемом или без него.

Настоящее изобретение также включает пептиды, имеющие следующую последовательность: Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val, Cys-Phe-Pro-His-Phe-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys там, где две группы Cys образуют дисульфидную связь, Cys-Phe-Pro-His-Phe-Phe-Asp-Leu-Ser- His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys там, где две группы Cys объединены углеродным мостиком, и Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala.

Настоящее изобретение также включает последовательности ДНК, кодирующие идентифицированные выше пептиды, инфекции, содержащие упомянутые последовательности ДНК и клетки-хозяева, содержащие упомянутые инфекции. Эти пептиды могут быть синтезированы с помощью стандартных химических приемов (например, синтез фазы твердого тела) или с помощью приема рекомбинации (например, системы синтеза, в которых применяется глютатион-S-трансфераз (D.B. Smith and K.S. Johnson, Gene 67:31-40, 1988), тиоредоксин (La Vallie и др., Biotechnology 11: 187-193, 1993) или убихитин (Butt и др., PNAS 86:2540-4, 1989; US Patent 5391490).

Настоящее изобретение довольно включает способ ингибирования пролиферации стволовой клетки, который предусматривает контактирование кроветворных клеток с составом, способным связывать рецепторы опиата, предпочтительно субкатегории мю рецепторов опиата. Пептиды, называемые геморфины, были выделены из гемоглобина, который демонстрировал активность, характерную для опиата (например, Branti и др., Eur. J. Pharm. 125: 309-10, 1986; Zhao и др. , Ann. N.Y. Acad. Sci 750:452-8,1995). На каждую из этих статей в изобретении имеется ссылка.

Изобретение также включает способ ингибирования пролиферации стволовой клетки, который предусматривает контактирование кроветворных клеток с пептидом, отобранным из группы пептидов геморфина, имеющих следующую последовательность: Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg- Phe, Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg, Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln, Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr, Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp, Leu-Val-Val-Tyr-Pro, Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-GIn, Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe, Туr-Рrо-Тrp-Thr-Gln-Arg, Tyr-Pro-Trp-Thr-GIn, Туr-Рrо-Тrp-Thr.

Вышеупомянутые пептиды имеют последовательность, схожую с другими пептидами, подобными семейству Tyr-MIF-1 (см. Reed и др., Neurosci. Biobehav. Rev. 18:519-25, 1994 для обзора), казоморфины, полученные из казеина (Brantl и др. Норре-Seyler's Z. Physiol. Chem. 360:1211-16, 1979; Loukas и др. Biochem. 22: 4567-4573, 1983; Fiat and Jolles, Mol. Cell. Biochem.. 87:5-30, 1989), пептиды, полученные из цитохрома b, называемые цитохрофины (Brantl и др. Eur. J. Pharm. 111:293-4, 1985), а также пептиды, полученные из комбинаторных библиотек, отсортированные для связи с рецепторами опиата (см. Dooley и др., Ptptide Research 8:124-137, 1995 для обзора). На каждую из этих статей в изобретении имеется ссылка.

Изобретение также включает способ ингибирования пролиферации стволовой клетки, который предусматривает контактирование кроветворных клеток с пептидом, отобранным из группы, состоящей из пептидов, родственных Tyr-MIF-1, казоморфинов и цитохрофинов. Особо следует отметить пептиды Tyr-MIF-1, имеющие следующую последовательность: Tyr-Pro-Try-Gly-NH₂ Tyr-Pro-Lys-Gly-NH₂ Tyr-Pro-Leu-Gly-NH₂ и Pro-Leu-Gly-NH₂ Изобретение также включает способ проведения генотерапии млекопитающего, который состоит из: а) удаления упомянутых кроветворных клеток из упомянутого млекопитающего, б) дополнительного лечения упомянутых кроветворных клеток ex vivo используя, по крайней мере, один стимулирующий цитокин для индуцирования пролиферации стволовой клетки.

в) трансфекции упомянутых кроветворных клеток ех vivo заданным геном, г) контактирования упомянутой зараженной кроветворной клетки ех vivo с INPROL, д) трансплантации в млекопитающее кроветворной клетки, упомянутой в этапе (г), е) дополнительного лечения упомянутого млекопитающего in vivo посредством INPROL.

Изобретение также включает способ проведения экспансии ех vivo стволовой клетки, предусматривающий лечение упомянутых стволовых клеток с помощью INPROL и, по крайней мере, одним стимулирующим цитокином. INPROL контактирует с кроветворными клетками до, в течение и после контакта со стимулирующим цитокином.

Изобретение также включает фармацевтическую структуру, в состав которой входят (a) INPROL и (б) по крайней мере, один ингибирующий состав, отобранный из группы, состоящей из MIP-1 альфа, TGF бета, TNF альфа, INF альфа, INF бета, INF гамма, пентапептид пиро Glu-Glu-Asp-Cys-Lys, тетрапептид N-Acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro и трипептид глютатион (Glu-Cys-гамма Glu).

Изобретение также включает фармацевтическую структуру, в состав которой входят (a) INPROL и (б) по крайней мере, один стимулирующий состав, отобранный из группы, состоящей из IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, IL-14, IL-15, КОЕ-Г, КОЕ-ГМ. КОЕ-М, эритропоэтин, тромбопоэтин, фактор стволовой клетки и лиганд flk2/flk3.

В настоящем изобретении дается описание ингибитора стволовой клетки (INPROL), который отличается от тех, которые известны у специалистов, таких как MIP-1 альфа, TGF бета, тетрапептид Фринделя и его коллег или пентапептид Пауковица и его сотрудников (cf., Wright & Pragnell, 1992 (ор cit)). В естественных условиях INPROL имеет молекулярный вес, превышающий 10000 дальтон посредством ультрафильтрации, что выделяет его из тетрапептидов и пентапептидов. Он более гидрофобен, чем MIP-1 альфа и TGF бета в системах обращенной хромотографии, что выделяет его из этих цитокинов. Далее, режим его действия отличается от тех ингибиторов, описание которых приводится выше, и он остается активным при анализе in vitro при использовании только в течение преинкубационного периода. Например, MIP-1 альфа не является эффективным при использовании в течение преинкубационного периода (пример 5). Далее, в естественных условиях INPROL активен при анализе, проводимом для измерения "клеток с высоким пролиферативным потенциалом" (HPP-PFC), в то время как MIP-1 альфа не является таковым (пример 6).

Краткое описание чертежей На рисунках 1-4 приведено расположение продукта геля полиакриламида SDS после каждого этапа очистки.

На рисунке 1: позиция 1 - химотрипсиноген, позиция 2 - овальбумин, позиция 3 -BSA, позиция 4 - фракции <30 kD, позиция 5 - фракции 30-50 kD и позиция 6 - фракции 50-100 kD.

На рисунке 2: позиция 1 - после осаждения сульфата аммония (40-80%) и позиции 2-5 - фракции DEAE (позиция 2 представляет собой активную фракцию).

На рисунке 3: позиция 1 - супернатант после осаждения сульфата аммония, позиция 2 - активная фракция DEAE, позиции 3-5 представляют собой фракции фильтрации геля (позиция 5 представляет собой активную фракцию).

Рисунок 4: позиция 2 представляет собой окончательный продукт.

На рисунке 5 приведена обращенная хроматография окончательной очистки.

На рисунке 6 приведено введение тритированного тимидина (cpm) в клетки линии смеси FDCP (контроль=0% ингибирования) и совместно с различными концентрациями очищенного INPROL, полученного от костного мозга свиньи (pINPROL). Данные нормализованы в соответствии с контрольной величиной.

На рисунке 7 приведен процент клеток в фазе S цикла клетки после лечения мышей с помощью пропионата тестостерона (TSP), TSP плюс pINPROL или раствор связующего (контроль). Каждая группа включала 25 животных (3-4 на временную точку).

На рисунке 8 приведена картина выживания мышей, которых лечили двумя дозами 5-ФУ, совместно с лечением посредством pINPROL или без него. В каждую группу входило 30 животных.

На рисунке 9 приведена картина выживания облученных мышей, прошедших или не прошедших лечения посредством pINPROL. В каждую группу входило 50 животных.

На рисунках 10А и 10В приведена картина восстановления обычных донорских клеток культуры декстеровского типа в течение 1 недели (10А) и 3 недель (10В) после лечения с помощью Аrа-с или Аrа-с плюс pINPROL.

На рисунке 11 приведена картина выживания мышей (75 на группу) после летального облучения и трансплантации 310⁴ клеток костного мозга после преинкубации в питательной среде (контроль) или в pINPROL (25 нг/мл) в течение 4 часов. Выживание отслеживалось в течение 30 дней.

На рисунке указан показатель КОЕ-ГМ, полученный спустя 14 дней в культуре мышей из клеток костного мозга мышей после летальной радиации и восстановления посредством донорских клеток костного мозга, прошедших преинкубацию вместе с pINPROL или в питательной среде в течение 4 часов.

На рисунке 13 приведены клетки суспензии из лимфоидной культуры декстеровского типа, которые брали и каждую неделю промывали и высеивали на чашку Петри вместе с IL-7 (10 нг/мл) после преинкубации в питательной среде или с pINPROL в течение 4 часов.

На рисунке 14 зафиксировано улучшение репопуляционной способности лейкозных переферических клеток крови, прошедших лечение посредством pINPROL. Стимулирующие клетки культуры декстеровского типа (LTC-IC) измерялись высеиванием на чашку Петри сросшихся или несросшихся клеток LTC совместно с pINPROL или без него, при этом показатель - КОЕ-ГМ замеряется на седьмой день. Данные нормализуют согласно контрольным величинам.

На рисунке 15А приведена обращенная хроматограмма С4 очищенного pINPROL, эльюирующего при 53% ацетонитрила.

Позиция 1 - сырой материал, позиция 2 - маркеры молекулярного веса и позиция 3 - очищенный продукт. На рисунке 15В приведена обращенная хроматограмма С4 MIP-1 альфа, эльюирующего при 43,9% ацетонитрила. На рисунке 15 С приведена хроматограмма сырого препарата pINPROL и очищенного препарата после фазы обращения.

На рисунке 16 приведены последовательности гемоглобина: на рисунке 16А приведены последовательности кДНК и аминокислот альфа гемоглобина человека. На рисунке 16В приведены последовательности кДНК и аминокислоты бета гемоглобина человека. Исчисление ведется в соответствием с исчислением аминокислот. На рисунке 16С приведено сравнение последовательностей аминокислот альфа- и бета-цепей гемоглобина человека, мыши и свиньи.

На рисунке 17 приведено сравнение следов ЖХВР фазы обращения С ₄ pINPROL (рисунок 17А) и кристаллизованный гемоглобин свиньи (рисунок 17В).

На рисунке 18 изображен гель SDS-PAGE фракций от разделения ЖХВР фазы обращения С4 кристаллизованного гемоглобина свиньи. Позиция 1 демонстрирует маркеры молекулярного веса, позиция 2 демонстрирует фракции 48-49, полученные при первом пике (при 47.11 мин), позиция 3 демонстрирует фракции 50-51, полученные при втором пике (при 49.153 мин), позиция 4 демонстрирует фракции 54-55, полученные при третьем пике (при 52.25 мин) и позиция 5 демонстрирует фракции 56-57, полученные при четвертом пике (при 56.613 мин).

На рисунке 19 приведены сравнения электрофореза геля в двух измерениях pINPROL (рисунок 19А) и очищенного бета гемоглобина свиньи (рисунок 19В).

На рисунке 20 приведено сравнение воздействия очищенного альфа гемоглобина свиньи, бета гемоглобина и pINPROL в анализе FDCP-MIX.

На рисунке 21 продемонстрирована обращенная сепарация гемоглобина свиньи с помощью пологого градиента элюции.

С целью более полного понимания настоящего изобретения ниже приведено его более подробное описание. Это описание, хотя и является иллюстративным, не должно быть истолковано в качестве ограничительной директивы для настоящего изобретения и такие вариации, которые входят в компетенцию опытного специалиста, считаются находящимися в диапазоне настоящего изобретения.

Подробное описание предпочтительного поля применения INPROL обратимо ингибирует деление стволовых клеток. Особо следует отметить, что INPROL является действенным при временном ингибировании деления клетки кроветворных стволовых клеток. Таким образом, методика изобретения может использоваться для смягчения нежелательного побочного воздействия химиотерапии кроветворной и иммунной систем, системы костного мозга пациента путем защиты стволовых клеток от урона, причиненного химиотерапевтическими средствами и средствами лучевой терапии, используемыми для уничтожения клеток, зараженных раком или вирусом. В одном поле применения изобретения INPROL вводят пациенту в такой дозе, которая достаточна для ингибирования деления клеток, в то время как химиотерапевтические средства действуют на заболевшую клетку. После того, как химиотерапевтическое средство выполнило свою функцию, стволовая клетка, ингибированная INPROL, без дальнейшего лечения возвращается к делящимся клеткам. Если требуется усилить процесс регенерации гемопоэза, в дополнение к упомянутым выше процедурам могут быть использованы факторы, стимулирующие рост, и цитокин.

Используемый здесь термин INPROL включает белки млекопитающего, очищенные, как это показано в примерах, гемоглобин, альфа-цепь гемоглобина (вместе с группой гема или без нее), бета-цепь гемоглобина (вместе с группой гема или без нее), и фрагменты или аналоги этих белков, включая эмбрионные, зародышевые или зрелые формы (например, альфа-, бета-, гамма-, дельта-, ипсилон-цепей, либо одиночных, либо смешанных, димеров или мультимеров (вместе с группой гема или без нее), способные ингибировать пролиферацию стволовой клетки. Термин "INPROL" включает встречающееся в естественных условиях или в неестественных условиях (например, изготовленные методом рекомбинации) формы этих белков.

В типичной клинической ситуации INPROL вводят пациенту ежедневно путем внутривенной инъекции вливанием в форме единиц дозировки, например, от 0,01 до 100 мг/кг, желательно от 0,1 до 1,0 мг/кг, вводят INPROL, например, за от 4 до 60 часов до стандартной химиотерапии или лучевой терапии.

Другое поле применения данного изобретения предусматривает предварительное лечение с помощью INPROL, которое позволяет увеличить дозы химиотерапевтических средств и средств лучевой терапии и превысить дозы, обычно переносимые пациентами.

Большая часть кроветворных стволовых клеток обычно статичны (не циркулируют). Однако в виде компенсационного ответа на ущерб кроветворной системе, нанесенный химиотерапией, большая часть стволовых клеток после химиотерапии начинает циркулировать, что делает их особенно уязвимыми к последующим дозам цитотоксической химиотерапии или терапевтического облучения. Путем ингибирования цикла таких стволовых клеток лечение посредством INPROL позволяет осуществлять более раннее и более частое введение последующих доз цитотоксической химиотерапии обычных или увеличенных доз.

В одном поле применения данного изобретения INPROL (от 0,1 до 6 мг, предпочтительно от 1,0 до 60 мг) вводят от 24 часов до 10 дней после принятия первоначальной дозы химиотерапии. После периода от 4 до 60 часов, предпочтительно от 24 до 48 часов, вводят следующую дозу химиотерапии. Такой цикл сочетания химиотерапии и INPROL продолжается согласно лечебной необходимости. Средства химиотерапии и схемы их введения выбирается на основе пригодности для особых типов опухоли в стандартной клинической практике. Кроме того, для дальнейшего улучшения хода кроветворной реконструкции после химиотерапии и лучевой терапии используют стимулирующие факторы роста, такие как КОЕ-Г и фактор стволовой клетки.

Для применения ex vivo используют от 0,1 нг до 100 нг/10⁶ клеток/мл, желательно 20-50 нг/10⁶ клеток/мл INPROL.

В другом поле применения изобретения INPROL используется в мет