Способ получения высокоочищенного монокомпонентного инсулина

Способ получения высокоочищенного монокомпонентного инсулина

Реферат

 

Изобретение относится к медицинской промышленности, а именно к получению высокоочищенных монокомпонентных инсулинов различного происхождения. Сущность изобретения: инсулин-сырец подвергают двум колоночным обращенно-фазовым хроматографическим очисткам - при рН 1,5 - 4,5 и рН 6,5 - 9,5. Очистка проводится на неполярных сорбентах со средним размером пор и размером частиц 10 - 100 мкм. В качестве элюента применяют водно-органические растворители, содержащие ионные модификаторы. Процесс хроматографической очистки ведут при температуре 5 - 30^oС. Технический результат: способ обеспечивает получение инсулина высокого качества, содержащего не менее 98,5% основного вещества, не более 0,5% дезамидо-А21-инсулина, не более 1,0% неидентифицированных примесей, не более 1,0 млн^-1 проинсулина. 14 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к медицинской промышленности, а именно к способу получения высокоочищенных монокомпонентных инсулинов: свиного, человеческого полусинтетического, человеческого генно-инженерного, применяемых для лечения сахарного диабета.

Современные требования к качеству высокоочищенного монокомпонентного инсулина очень высокие: содержание проинсулина, определенное методом радиоиммунологического анализа (далее по тексту РИА), не должно превышать 1,0 p.p.m. (0,0001%), содержание неидентифицированных примесей, определенное методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее по тексту ВЭЖХ) не должно превышать 1,0%, содержание дезамидо-А21-инсулина не более 1,0% (ВЭЖХ).

Известны способы [1, 2, 3, 4, 5] получения высокоочищенного инсулина, которые базируются на использовании ионообменной и гельпроникающей хроматографической очистки инсулина. Однако описанные способы не позволяют получить инсулин с содержанием основного вещества более 97% (ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина менее 1 p.p.m. (РИА). При этом выход не превышает 60%.

Известен способ [6] очистки инсулина на слабокислых ионитах с гидрофобной оболочкой в водно-органических растворителях при значениях рН от 1,5 до 5,5. Благодаря использованию двух механизмов адсорбции по данному способу достигается более глубокая очистка инсулина от примесей с изоэлектрической точкой pI более 6,5: аргинининсулинов, проинсулина и др. Однако при этом снижается эффективность очистки от примесей с рI менее 4,5: дезамидо-А21-инсулина, дезамидо-В3-инсулинов. В результате чистота полученного инсулина не превышает 96% (ВЭЖХ).

Наиболее близким к предлагаемому является способ [7] получения высокоочищенного инсулина, который сочетает использование жидкостной ионообменной хроматографии, обращенно-фазовой (далее по тексту ОФ) хроматографии при значении рН около 3,0 и гельпроникающей хроматографии. Данный способ позволяет получать инсулин с содержанием основного вещества более 98% (ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина менее 4 p.p.m. (РИА) при выходе от 60 до 65%. Однако из-за низкой селективности по таким примесям, как моноаргинининсулин, диаргинининсулин, сложноэфирные производные инсулина, дезамидо-В3-инсулины, дез-В30-инсулин уровень примесей в целом остается достаточно высоким. По этой же причине по данному способу используются очень невысокие нагрузки инсулина на хроматографические колонки при обращенно-фазовой хроматографии: от 13 до 15 г/л сорбента.

Целью изобретения является повышение выхода и улучшение качества инсулина при хроматографической очистке.

Для выполнения поставленной задачи исходный инсулин-сырец, с содержанием основного вещества не менее 85% (ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина не более 50 тыс. p. p. m. (РИА) последовательно подвергают двум хроматографическим очисткам: ОФ колоночной хроматографической очистке при значении рН от 1,5 до 4,5 и ОФ колоночной хроматографической очистке при значении рН от 6,5 до 9,5. Порядок проведения первой и второй ОФ хроматографической очистки может быть произвольным. Улучшение качества достигается за счет того, что при ОФ хроматографической очистке при значении рН от 6,5 до 9,5 по сравнению с ОФ хроматографической очисткой при значении рН от 1,5 до 4,5 происходит инверсия порядка выхода и улучшение селективности по целому ряду примесей (аргинининсулинам, дезамидо-В3-инсулину, дез-В30-инсулину и ряду других примесей) и улучшение селективности по дезамидо-А21-инсулину. Таким образом отпадает необходимость в проведении малопроизводительной ионообменной хроматографической очистки. Очистка проводится на неполярных макропористых сорбентах: модифицированных силикагелях (С-8, С-18) или полимерных сорбентах со средним диаметром пор и с размером частиц от 10 до 100 мкм. Максимальная эффективность очистки достигается при использовании сферических монодисперсных сорбентов со средним размером пор с размером частиц от 10 до 15 мкм, упакованных в хроматографические колонки с динамическим аксиальным сжатием сорбента. Высота слоя сорбента в хроматографической колонке от 10 до 60 см, предпочтительно от 25 до 40 см. В качестве элюента применяют водно-органические растворители со значением рН от 1,5 до 4,5 (предпочтительно от 2,3 до 2,8) и от 6,5 до 9,5 (предпочтительно от 7,3 до 8,0) и содержащие ионные модификаторы: органические и неорганические кислоты, основания и их соли с молярной концентрацией от 0,001 до 0,3 моль/л. Предпочтительно использовать кислоты: уксусную, трифторуксусную, ортофосфорную, соляную; основания: трис(оксиметил)аминометан (далее по тексту ТРИС), аммиак, гидроокись натрия и их соли. Значение рН элюентов устанавливают добавлением необходимого количества кислот и оснований. В качестве органического растворителя применяют ацетонитрил, спирты; предпочтительно использовать ацетонитрил, метанол, этанол, пропанол-2 при первой и этанол при второй хроматографических очистках. Процесс хроматографической очистки и кристаллизации инсулина проводят при температуре от 5 до 30^oС, предпочтительно от 10 до 20^oС.

По предлагаемому способу получают высокоочищенный монокомпонентный инсулин с содержанием основного вещества более 98,5%, с содержанием дезамидо-А21-инсулина менее 0,5%, с содержанием неидентифицированных примесей менее 1,0% (ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина менее 1 p.p.m. (РИА), при этом выход составляет не менее 70% при использовании нерегулярных сорбентов с размером частиц от 50 до 100 мкм и не менее 75% при использовании сферических сорбентов с размером частиц от 10 до 15 мкм в колонках с динамическим аксиальным сжатием сорбента.

Для проведения первой ОФ хроматографической очистки при значении рН от 1,5 до 4,5 исходный инсулин-сырец растворяют в стартовом элюенте А, содержащем от 10 до 30 объемных % органического растворителя, значение рН при необходимости устанавливают добавлением необходимого количества раствора соляной кислоты с массовой долей от 5 до 10%. Концентрация инсулина в растворе от 10 до 50 г/л. Нагрузка на хроматографическую колонку от 15 до 50 г на один литр сорбента. Перед вводом раствора инсулина в хроматографическую колонку его фильтруют через гидрофильный мембранный фильтр с абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм. Хроматографическая колонка перед вводом инсулина должна быть предварительно уравновешена стартовым элюентом А в объеме, равном от трех до пяти объемов сорбента в колонке. Ввод раствора инсулина в хроматографическую колонку осуществляют с линейной скоростью потока от 0,25 см/мин (для сорбентов с размером частиц 50-100 мкм) до 1,5 см/мин (для сорбентов с размером частиц 10-15 мкм). После ввода раствора инсулина хроматографическую колонку промывают стартовым элюентом А в объеме, равном объему сорбента в хроматографической колонке. Элюируют инсулин, используя непрерывный или ступенчатый градиент по концентрации органического растворителя, крутизна непрерывного градиента от 0,5 до 3 (предпочтительно от 0,8 до 1,5) объемных % органического растворителя на объем элюента, равный объему сорбента в хроматографической колонке. Линейная скорость потока при элюции от 0,5 см/мин (для сорбентов с размером частиц 50-100 мкм) до 3 см/мин (для сорбентов с размером частиц 10-15 мкм). Контроль за элюцией инсулина осуществляют по адсорбции света при длине волны 276 нм. Элюат разбивают на фракции объемом, равном примерно 0,25 объема сорбента в колонке. В каждой фракции методом ВЭЖХ определяют содержание примесей. По результатам анализа формируют три пула: пул 1 - фракции с содержанием примесей более 40%, пул 2 - фракции с содержанием примесей от 3 до 40%, пул 3 - фракции с содержанием примесей менее 3%. Пул 3 содержит высокоочищенный инсулин с содержанием примесей от 2 до 3%, который является полупродуктом для второй хроматографической очистки. Пул 2 содержит инсулин с содержанием примесей от 7 до 12%, который подвергают рехроматографии при тех же режимах, что и исходный инсулин-сырец; полученный после рехроматографии высокоочищенный инсулин с содержанием примесей менее 3% присоединяют к пулу 3. Пул 1, содержащий от 40 до 65% примесей, направляют в отходы.

После окончания процесса очистки инсулина хроматографическую колонку регенерируют элюентом, содержащем от 60 до 80% органического растворителя в объеме, равном от трех до пяти объемов сорбента в хроматографической колонке, и уравновешивают тем же объемом стартового элюента А. Выход при первой хроматографической очистке от 83 до 86%. Высокоочищенный инсулин, содержащийся в пуле 3, кристаллизуют в цитратном буферном растворе. Для этого элюат разбавляют дистиллированной водой для снижения концентрации органического растворителя до 10-20 объемных % (10% при использовании ацетонитрила, пропанола-2 и 20% при использовании этанола, метанола), добавляют раствор хлорида цинка с массовой долей 10% из расчета 0,75-0,80 мл на 1 г инсулина и раствор лимонной кислоты с молярной концентрацией 1,5 моль/л из расчета 34-35 мл на 1 л разбавленного элюата. Затем в кристаллизационном растворе раствором аммиака с массовой долей 10-12,5% при постоянном перемешивании устанавливают значение рН от 6,8 до 7,0, продолжают перемешивание в течение 1-2 ч. Далее раствором кислоты соляной с массовой долей 5-10% в кристаллизационном растворе при постоянном перемешивании постепенно в течение 1-2 ч устанавливают значение рН от 5,9 до 6,1 и продолжают перемешивание еще в течение 4-6 ч. Полученные кристаллы высокоочищенного инсулина отделяют от маточного раствора, промывают дистиллированной водой и передают на вторую хроматографическую очистку. Потери инсулина при кристаллизации от 1 до 3%.

Для проведения второй ОФ хроматографической очистки при значении рН от 6,5 до 9,5 высокоочищенный инсулин-полупродукт, выделенный из пула 3, растворяют в стартовом элюенте В, содержащем от 10 до 30 объемных % органического растворителя. Для связывания ионов цинка в раствор инсулина добавляют раствор трилона Б с молярной концентрацией 0,1 моль/л из расчета 0,5 мл на 1 г инсулина. Значение рН при необходимости корректируют раствором аммиака с массовой долей 10-12,5%. Концентрация инсулина в растворе от 10 до 30 г/л. Нагрузка на хроматографическую колонку от 15 до 50 г на один литр сорбента. Перед вводом раствора инсулина в хроматографическую колонку его фильтруют через гидрофильный мембранный фильтр с абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм. Хроматографическая колонка перед вводом раствора инсулина должна быть предварительно уравновешена стартовым элюентом В в объеме, равном от трех до пяти объемов сорбента в колонке. Ввод раствора инсулина в хроматографическую колонку осуществляют с линейной скоростью потока от 0,25 см/мин (для сорбентов с размером частиц 50-100 мкм) до 1,5 см/мин (для сорбентов с размером частиц 10-15 мкм). После ввода раствора инсулина хроматографическую колонку промывают стартовым элюентом В в объеме, равном объему сорбента в хроматографической колонке. Элюируют инсулин, используя непрерывный или ступенчатый градиент по концентрации органического растворителя, крутизна непрерывного градиента от 0,5 до 3 (предпочтительно от 0,8 до 1,5) объемных % органического растворителя на объем элюента, равный объему сорбента в хроматографической колонке. Линейная скорость потока при элюции от 0,5 см/мин (для сорбентов с размером частиц 50-100 мкм) до 3 см/мин (для сорбентов с размером частиц (10-15 мкм). Контроль за элюцией инсулина осуществляют по адсорбции света при длине волны 276 нм. Элюат разбивают на фракции объемом, равным примерно 0,25 объема сорбента в хроматографической колонке. В каждой фракции методом ВЭЖХ определяют содержание примесей. По результатам анализа формируют три пула: пул 4 - фракции с содержанием примесей более 20%, пул 5 - фракции с содержанием примесей от 1 до 20% и пул 6 - фракции с содержанием примесей менее 1%. Пул 4, содержащий от 30 до 45% примесей отправляют в отходы. Пул 6 содержит высокоочищенный монокомпонентный инсулин с содержанием примесей менее 1%. Пул 5 содержит инсулин с содержанием примесей от 2 до 5%, который подвергают рехроматографии при тех же режимах, что и инсулин, выделенный из пула 3, за исключением нагрузки, которая должна быть от 15 до 30 г на один литр сорбента в колонке. Полученный после рехроматографии пула 5 высокоочищенный монокомпонентный инсулин с содержанием примесей менее 1% присоединяют к пулу 6. После окончания процесса очистки инсулина хроматографическую колонку регенерируют элюентом, содержащим от 60 до 80% органического растворителя в объеме, равном от трех до пяти объемов сорбента в хроматографической колонке и уравновешивают тем же объемом стартового элюента В. Выход при второй хроматографической очистке от 91 до 94%. Высокоочищенный монокомпонентный инсулин, содержащийся в пуле 6, кристаллизуют в цитратном буферном растворе. Для этого элюат разбавляют дистиллированной водой до снижения концентрации органического растворителя до 10-20 объемных% (10% при использовании ацетонитрила, пропанола-2 и 20% при использовании этанола, метанола), добавляют раствор цитрата аммония с молярной концентрацией 1,5 моль/л и со значением рН от 7,5 до 8,5 из расчета 34-35 мл на один литр разбавленного элюата и раствор хлорида цинка с массовой долей 10% из расчета 0,75-0,80 мл на 1 г инсулина. Полученный кристаллизационный раствор фильтруют через стерилизующий гидрофильный мембранный фильтр с абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм. Затем в кристаллизационном растворе инсулина раствором кислоты соляной с массовой долей 5-10% при постоянном перемешивании сначала устанавливают значение рН от 6,8 до 7,0, а после 1-2 ч выдержки рН постепенно в течение 1-2 ч доводят до значения от 5,9 до 6,1 и продолжают перемешивание еще в течение 4-6 ч. Полученные кристаллы высокоочищенного монокомпонентного инсулина отделяют от маточного раствора, промывают дистиллированной водой, этанолом и сушат в вакуум-сушильном шкафу до постоянной массы. Потери инсулина при кристаллизации от 1 до 2%. Получают высокоочищенный монокомпонентный инсулин, содержащий не более 1% неидентифицированных примесей, не более 0,5% дезамидо-А21-инсулина (ВЭЖХ) и не более 1 p.p.m. проинсулина (РИА). Выход при очистке по предлагаемому способу от 70 до 80%.

Пример 1. Процесс хроматографической очистки инсулина проводят при температуре 11^oС. 110 г по технической массе (100 г в пересчете на сухое вещество) свиного инсулина-сырца, содержащего 3,5% дезамидо-А21-инсулина и 9% примесей растворяют в 1,8 л стартового элюента А, содержащего ацетат аммония с молярной концентрацией 0,020 моль/л, пропанол-2 с концентрацией 10 объемных % и со значением рН 2,5, значение рН раствора инсулина и элюента корректируют раствором кислоты соляной с массовой долей 10%. Полученный раствор инсулина фильтруют под избыточным давлением 0,7 bar через мембранный фильтр Bio-Inert NRLG (фирма Pall) с диаметром 293 мм и с абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм, фильтр промывают 0,2 л стартового элюента А. Получают около 2 л раствора инсулина.

В хроматографическую колонку Superformance 500-100 (фирма Merck) с внутренним диаметром 10 см и высотой 50 см загружают 1 кг нерегулярного силикагеля С18 фирмы Amicon Matrex С18-100-50 (размер частиц 50 мкм, размер пор ). Колонку собирают и верхним подвижным адаптером сжимают слой сорбента. Затем через колонку в течение 15 мин пропускают пропанол-2 с линейной скоростью потока 5,1 см/мин (при этом давление на колонке не должно превышать 8 bar) и при необходимости опять верхним адаптером сжимают слой сорбента. Получают слой сорбента высотой 25,5 см и объемом 2 л. Для уравновешивания через колонку пропускают 8 л стартового элюента А.

Процесс очистки инсулина ведут на жидкостном хроматографе Gilson (фирма Gilson), укомплектованного насосами модели 305, 306 с головками 200 Wti, демпфером давления модели 807, фотометрическим УФ-детектором модели 112 и коллектором фракций FC-30 (фирма Fharmacia Biotech).

Раствор инсулина подают с линейной скоростью потока 0,25 см/мин в хроматографическую колонку. Затем колонку промывают 2 л стартового элюента А. Элюцию инсулина ведут с линейной скоростью потока 0,5 см/мин в линейном градиенте концентрации пропанола-2 от 15 до 30 объемных % в течение 8 ч. Формирование градиента осуществляется автоматически путем смешения двух элюентов: стартового элюента А и элюента, содержащего ацетат аммония с молярной концентрацией 0,020 моль/л, пропанол-2 с концентрацией 30 объемных % и со значением рН 2,5. После окончания градиента сорбент в колонке регенерируют элюентом, содержащим ацетат аммония с молярной концентрацией 0,020 моль/л, пропанол-2 с концентрацией 60 объемных % и со значением рН 2,5, который подают с линейной скоростью потока 1,27 см/мин в течение 80 мин. Элюат, содержащий белок, дробят на фракции объемом 0,5 л каждая. Фракции анализируют методом ВЭЖХ на содержание примесей и по результатам анализа формируют три пула. Пул 1 содержит 12 г белка (7,5 л элюата с концентрацией белка 1,6 г/л) следующего состава: инсулина - 48,3%, дезамидо-А21-инсулина - 6,7%, примесей - 45%. Пул 2 содержит 13 г белка (4,33 л элюата с концентрацией белка 3 г/л) следующего состава: инсулина - 85,1%, дезамидо-А21-инсулина - 4,0%, примесей - 10,9%. Пул 3 содержит 75 г белка (8,33 л элюата с концентрацией белка 9,0 г/л) следующего состава: инсулина - 94,2%, дезамидо-А21-инсулина - 2,9%, примесей - 2,9%. Пул 1 передают в отходы. Пул 2 подвергают рехроматографии при тех же режимах, но на хроматографической колонке меньшего объема: Superformance 500-50 с внутренним диаметром 5 см, упакованную 0,45 л нерегулярного силикагеля С18 Matrex С18 - 100-20 с размером частиц 20 мкм. После рехроматографии пула 2 получают дополнительно 9,4 г инсулина (1,15 л элюата с концентрацией белка 8,17 г/л) следующего состава: инсулина - 94,3%, дезамидо-А21-инсулина - 2,7%, примесей - 3,0%. Элюат после рехроматографии пула 2 присоединяют к пулу 3. Получают 84,4 г инсулина в 9,48 л элюата с концентрацией 8,9 г/л. Концентрация пропанола-2 в элюате 17,5 объемных %. В элюат при перемешивании добавляют 7,11 л дистиллированной воды, 65 мл раствора хлорида цинка с массовой долей 10%, 0,57 л раствора лимонной кислоты с молярной концентрацией 1,5 моль/л и раствор аммиака с массовой долей 10% до значения рН 6,8. Раствор перемешивают в течение 90 мин, затем доводят значение рН до 5,9 раствором кислоты соляной с массовой долей 5% постепенно в течение 120 мин. Продолжают перемешивание еще 4 ч, после чего отделяют кристаллы инсулина от маточного раствора фильтрацией на нутч-фильтре через мембрану Ultipor N₆₆ NH (фирма Pall) с диаметром 293 мм и размером пор 0,8 мкм и промывают дистиллированной водой в количестве 200 мл. Получают 82,7 г инсулина в пересчете на сухое вещество следующего состава: инсулина свиного - 94,2%, дезамидо-А21-инсулина - 2,9%, неидентифицированных примесей - 2,9% (ВЭЖХ), содержание проинсулина - 8,2 p.p.m. (РИА).

Для второй хроматографической очистки используют те же упакованные хроматографические колонки, что и при первой хроматографической очистке: Superfоrmance 500-100 и Superformance 500-50 и тот же жидкостной хроматограф Gilson.

Полученные кристаллы инсулина после первой хроматографической очистки (82,7 г в пересчете на сухое вещество) растворяют в 2,5 л стартового элюента В, содержащего ТРИС с молярной концентрацией 0,02 моль/л, этанол с концентрацией 20 объемных % и со значением рН 7,6, значение рН корректируют раствором кислоты соляной с массовой долей 10%. При растворении инсулина в элюент В до корректировки значения рН добавляют 41,4 мл раствора трилона Б с молярной концентрацией 0,10 моль/л. Полученный раствор инсулина фильтруют под давлением 0,7 bar через мембранный фильтр Bio-Inert NRLG с диаметром 293 мм и абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм, фильтр промывают 0,3 л стартового элюента В. Получают около 2,9 л раствора инсулина.

Перед вводом раствора инсулина хроматографическую колонку Superformance 500-100 предварительно уравновешивают. Для этого через колонку пропускают 8 л стартового элюента В с линейной скоростью потока 1,27 см/мин.

Раствор инсулина подают с линейной скоростью потока 0,25 см/мин в хроматографическую колонку. Затем колонку промывают 2 л стартового элюента В. Элюцию инсулина ведут с линейной скоростью потока 0,5 см/мин в линейном градиенте концентрации этанола от 25 до 37,5 объемных % в течение 8 ч. Формирование градиента осуществляется автоматически путем смешения двух элюентов: стартового элюента В и элюента, содержащего ТРИС с молярной концентрацией 0,02 моль/л, этанол с концентрацией 50 объемных % и со значением рН 7,6. После окончания градиента сорбент в колонке регенерируют элюентом, содержащим раствор ТРИС с молярной концентрацией 0,020 моль/л и этанол с концентрацией 70 объемных %, который подают с линейной скоростью потока 1,27 см/мин в течение 80 мин. Фракции анализируют методом ВЭЖХ на содержание примесей и по результатам анализа формируют три пула. Пул 4 содержит 4,1 г белка (5 л элюата с концентрацией белка 0,82 г/л) следующего состава: инсулина - 46,7%, дезамидо-А21-инсулина - 19,3%, примесей - 34%. Пул 5 содержит 13,2 г белка (3,8 л элюата с концентрацией белка 3,47 г/л) следующего состава: инсулина - 85,4%, дезамидо-А21-инсулина - 11,1%, примесей - 3,5%. Пул 6 содержит 65,3 г белка (7,9 л элюата с концентрацией белка 8,27 г/л) следующего состава: инсулина - 98,8%, дезамидо-А21-инсулина - 0,3%, примесей - 0,9%. Пул 4 передают в отходы производства. Пул 5 подвергают рехроматографии при тех же режимах, но на хроматографической колонке меньшего объема: Superfоrmance 500-50, упакованную 0,45 л нерегулярного силикагеля С18 Matrex С18 - 100-20 с размером частиц 20 мкм. После рехроматографии пула 5 получают дополнительно 9,9 г инсулина (1,4 л элюата с концентрацией белка 7,07 г/л) следующего состава: инсулина - 98,1%, дезамидо-А21-инсулина - 1,0%, примесей - 0,9%. Элюат после рехроматографии пула 5 присоединяют к пулу 6. Получают 75,2 г инсулина в 9,3 л элюата с концентрацией белка 8,09 г/л. Концентрация этанола в элюате 33,5 объемных %. В элюат при перемешивании добавляют 5,28 л дистиллированной воды, 0,54 л раствора цитрата аммония с молярной концентрацией 1,5 моль/л и 58 мл раствора хлорида цинка с массовой долей 10%. Полученный кристаллизационный раствор фильтруют под давлением 1 bar через стерилизующий мембранный фильтр Bio-Inert NRL (фирма Pall) с диаметром 293 мм и абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм, фильтр промывают 1,0 л дистиллированной воды, промывную воду присоединяют к кристаллизационному раствору. В кристаллизационном растворе при перемешивании раствором кислоты соляной с массовой долей 5% устанавливают значение рН 6,9. Раствор перемешивают в течение 90 мин. Затем доводят значение рН до 6,0 раствором кислоты соляной с массовой долей 5% постепенно в течение 2 ч. Продолжают перемешивание еще 4 ч, после чего кристаллы инсулина отделяют от маточного раствора фильтрацией на нутч-фильтре через мембрану Ultipor ₆₆ NH (фирма Pall) с диаметром 293 мм и с размером пор 0,8 мкм. Кристаллы инсулина промывают 100 мл дистиллированной воды, затем трижды этанолом порциями по 100 мл. Сушку кристаллов инсулина осуществляют в вакуум-сушильном шкафу до постоянной массы. Потеря массы при высушивании 9,0%. Получают 81,9 г по технической массе (74,5 г в пересчете на сухое вещество) высокоочищенного монокомпонентного свиного инсулина следующего состава: инсулина свиного - 98,7%, дезамидо-А21-инсулина - 0,4%, неидентифицированных примесей - 0,9% (ВЭЖХ). Содержание проинсулина - 0,7 p.p.m. (РИА). Выход 74,5%.

Пример 2. Процесс хроматографической очистки инсулина проводят при температуре 20^oС. 5,2 г по технической массе (4,8 г в пересчете на сухое вещество) свиного инсулина-сырца, содержащего 4,3% дезамидо-А21-инсулина и 8,7% примесей растворяют в 0,150 л стартового элюента А, содержащего раствор уксусной кислоты с молярной концентрацией 0,25 моль/л, ацетонитрил с концентрацией 17,5 объемных %, значение рН в растворе инсулина доводят до 2,7 раствором кислоты соляной с массовой концентрацией 10%. Полученный раствор инсулина фильтруют под избыточным давлением 0,7 bar через мембранный фильтр Bio-Inert NRLG (фирма Pall) с диаметром 47 мм и с абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм, фильтр промывают 0,010 л стартового элюента А. Получают около 0,17 л раствора инсулина.

65 г сферического силикагеля С8 DuraSil S-100-C8 (фирма АРО) с размером пор и размером частиц 10 мкм суспендируют в 0,16 л пропанола-2. В хроматографическую колонку Superformance 300-26 (фирма Merck) с внутренним диаметром 2,6 см и высотой 30 см загружают полученную суспензию сорбента. Перед загрузкой суспензии к верней части рабочей хроматографической колонки Superformance 300-26 присоединяют аналогичную упаковочную колонку. Колонки собирают и подают пропанол-2 с линейной скоростью потока 3,8 см/мин (при этом давление не должно превышать 50 bar). После формирования слоя сорбента упаковочную колонку снимают. Сорбент в рабочей колонке сжимают с усилием нижним и верхним подвижными адаптерами. Получают слой сорбента высотой 30 см и объемом 0,16 л. Для уравновешивания через колонку пропускают 0,64 л стартового элюента А.

Процесс очистки инсулина ведут на жидкостном хроматографе Gilson (фирма Gilson), укомплектованного насосами модели 305, 306 с головками 25Wti, демпфером давления модели 805, динамическим миксером модели 811, фотометрическим УФ-детектором модели 112 и коллектором фракций FC-30 (фирма Fharmacia Biotech).

Раствор инсулина подают с линейной скоростью потока 1,5 см/мин в хроматографическую колонку. Затем колонку промывают 0,160 л стартового элюента А. Элюцию инсулина ведут с линейной скоростью потока 3,0 см/мин в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 17,5 до 30 объемных % в течение 125 мин. Формирование градиента осуществляется автоматически путем смешения двух элюентов: стартового элюента А и элюента, содержащего раствор уксусной кислоты с молярной концентрацией 0,125 моль/л и ацетонитрил с концентрацией 50 объемных %. После окончания градиента сорбент в колонке регенерируют элюентом, содержащим раствор уксусной кислоты с молярной концентрацией 0,125 моль/л и ацетонитрил с концентрацией 50 объемных % с линейной скоростью потока 3,0 см/мин в течение 40 мин. Элюат, содержащий белок, дробят на фракции объемом 0,040 л каждая. Фракции анализируют методом ВЭЖХ на содержание примесей и по результатам анализа формируют три пула. Пул 1 содержит 0,528 г белка (0,6 л элюата с концентрацией белка 0,88 г/л) следующего состава: инсулина - 15,1%, дезамидо-А21-инсулина - 28,6%, примесей - 56,3%. Пул 2 содержит 0,576 г белка (0,24 л элюата с концентрацией белка 2,4 г/л) следующего состава: инсулина - 88,1%, дезамидо-А21-инсулина - 5,1%, примесей - 6,8%. Пул 3 содержит 3,696 г белка (0,456 л элюата с концентрацией белка 8,11 г/л) следующего состава: инсулина - 97,1%, дезамидо-А21-инсулина - 0,7%, примесей - 2,2%. Пул 1 передают в отходы производства. Пул 2 подвергают рехроматографии при тех же режимах, но на хроматографической колонке меньшего объема: Superformance 300-10 с внутренним диаметром 1 см, упакованную 0,023 л сферического силикагеля С8 DuraSil S-100-C8 (размер частиц 10 мкм, размер пор ). После рехроматографии пула 2 получают дополнительно 0,432 г инсулина (0,055 л элюата с концентрацией белка 7,85 г/л) следующего состава: инсулина - 97,4%, дезамидо-А21-инсулина - 0,8%, примесей - 1,8%. Элюат, после рехроматографии пула 2 присоединяют к пулу 3. Получают 4,128 г инсулина в 0,511 мл элюата с концентрацией 8,08 г/л. Концентрация ацетонитрила в элюате 23 объемных %. В элюат при перемешивании добавляют 0,664 л дистиллированной воды, 3,2 мл раствора хлорида цинка с массовой долей 10%, 40,5 мл раствора лимонной кислоты с молярной концентрацией 1,5 моль/л и раствор аммиака с массовой долей 10% до значения рН 6,8. Раствор перемешивают в течение 90 мин, затем доводят значение рН до 5,9 раствором кислоты соляной с массовой долей 5% постепенно в течение 120 мин. Продолжают перемешивание еще 4 ч, после чего отделяют кристаллы инсулина от маточного раствора фильтрацией на нутч-фильтре через мембрану Ultipor N₆₆ NH (фирма Pall) с диаметром 47 мм и размером пор 0,8 мкм и промывают 15 мл дистиллированной воды. Получают 4,045 г инсулина в пересчете на сухое вещество следующего состава: инсулина свиного - 97,0%, дезамидо-А21-инсулина - 0,8%, неидентифицированных примесей - 2,2% (ВЭЖХ), содержание проинсулина 5,6 p.p.m. (РИА).

Для второй хроматографической очистки используют те же упакованные хроматографические колонки, что и при первой хроматографической очистке: Superformance 300-26 и Superformance 300-10 и тот же жидкостной хроматограф Gilson.

Полученные кристаллы инсулина после первой хроматографической очистки (4,045 г в пересчете на сухое вещество) растворяют в 130 мл стартового элюента В, содержащего ТРИС с молярной концентрацией 0,02 моль/л, этанол с концентрацией 20 объемных % и со значением рН 7,8, значение рН корректируют раствором кислоты соляной с массовой долей 10%. При растворении инсулина в элюент В до корректировки значения рН добавляют 2,0 мл раствора трилона Б с молярной концентрацией 0,10 моль/л. Полученный раствор инсулина фильтруют под давлением 0,7 bar через мембранный фильтр Bio-Inert NRLG с диаметром 47 мм и абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм, фильтр промывают 5 мл стартового элюента В. Получают около 142 мл раствора инсулина.

Перед вводом раствора инсулина хроматографическую колонку Superformance 300-26 предварительно уравновешивают. Для этого через колонку пропускают 0,64 л стартового элюента В с линейной скоростью потока 3,0 см/мин.

Раствор инсулина подают с линейной скоростью потока 1,5 см/мин в хроматографическую колонку. Затем колонку промывают 160 мл стартового элюента В. Элюцию инсулина ведут с линейной скоростью потока 3,0 см/мин в линейном градиенте концентрации этанола от 25 до 37,5 объемных % в течение 125 мин. Формирование градиента осуществляется автоматически путем смешения двух элюентов: стартового элюента В и элюента, содержащего ТРИС с молярной концентрацией 0,012 моль/л, этанол с концентрацией 50 объемных % и со значением рН 7,8. После окончания градиента сорбент в колонке регенерируют элюентом, содержащим раствор ТРИС с молярной концентрацией 0,04 моль/л, этанол с концентрацией 70 объемных % и значением рН 8,5, который подают с линейной скоростью потока 3,0 см/мин в течение 40 мин. Фракции анализируют методом ВЭЖХ на содержание примесей и по результатам анализа формируют три пула. Пул 4 содержит 0,121 г белка (0,101 л элюата с концентрацией белка 1,2 г/л) следующего состава: инсулина - 50,5%, дезамидо-А21-инсулина - 7,8%, примесей - 41,7%. Пул 5 содержит 0,607 г белка (0,148 л элюата с концентрацией белка 4,1 г/л) следующего состава: инсулина - 94,8%, дезамидо-А21-инсулина - 2,7%, примесей - 2,5%. Пул 6 содержит 3,317 г белка (0,364 л элюата с концентрацией белка 9,11 г/л) следующего состава: инсулина - 99,1%, дезамидо-А21-инсулина - 0,2%, примесей - 0,7%. Пул 4 передают в отходы производства. Пул 5 подвергают рехроматографии при тех же режимах, но на хроматографической колонке меньшего объема: Superformance 300-10, упакованную 23 мл сферического силикагеля С8 DuraSil S-100-C8. После рехроматографии пула 5 получают дополнительно 0,485 г инсулина (0,057 л элюата с концентрацией белка 8,51 г/л) следующего состава: инсулина - 98,9%, дзамидо-А21-инсулина - 0,3%, примесей - 0,8%. Элюат после рехроматографии пула 5 присоединяют к пулу 6. Получают 3,802 г инсулина в 0,421 л элюата с концентрацией белка 9,03 г/л. Концентрация этанола в элюате 32,5 объемных %. В элюат при перемешивании добавляют 0,24 л дистиллированной воды, 0,024 л раствора цитрата аммония с молярной концентрацией 1,5 моль/л и 2,9 мл раствора хлорида цинка с массовой долей 10%. Полученный кристаллизационный раствор фильтруют под давлением 0,7 bar через стерилизующий мембранный фильтр Bio-Inert NRL (фирма Pall) с диаметром 47 мм и абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм, фильтр промывают 0,023 л дистиллированной воды, промывную воду присоединяют к кристаллизационному раствору. В кристаллизационном растворе при перемешивании раствором кислоты соляной с массовой долей 5% устанавливают значение рН 6,9. Раствор перемешивают в течение 90 мин. Затем доводят значение рН до 6,0 раствором кислоты соляной с массовой долей 5% постепенно в течение 2 ч. Продолжают перемешивание еще 4 ч, после чего кристаллы инсулина отделяют от маточного раствора фильтрацией на нутч-фильтре через мембрану Ultipor N₆₆ NH (фирма Pall) с диаметром 47 мм и с размером пор 0,8 мкм. Кристаллы инсулина промывают 0,015 л дистиллированной воды, затем трижды этанолом порциями по 0,010 л. Сушку кристаллов инсулина осуществляют в вакуум-сушильном шкафу до постоянной массы. Потеря массы при высушивании 8,0%. Получают 4,091 г по технической массе (3,764 г в пересчете на сухое вещество) высокоочищенного монокомпонентного свиного инсулина следующего состава: инсулина свиного - 99,0%, дезамидо-А21-инсулина - 0,3%, неидентифицированных примесей - 0,7% (ВЭЖХ). Содержание проинсулина 0,6 p.p.m. (РИА). Выход - 78,4%.

Пример 3. Процесс хроматографической очистки инсулина проводят при температуре 16^oС. 9,0 г по технической массе (8,19 г в пересчете на сухое вещество) свиного инсулина-сырца, содержащего 5,1% дезамидо-А21-инсулина и 9,5% примесей растворяют в 0,300 л стартового элюента А, содержащего раствор трифторуксусной кислоты с массовой долей 0,15% и ацетонитрил с концентрацией 18,0 объемных %, значение рН в растворе инсулина корректируют до 2,4 раствором кислоты соляной с массовой концентрацией 10%. Полученный раствор инсулина фильтруют под избыточным давлением 0,7 bar через мембранный фильтр Bio-Inert NRLG (фирма Pall) с диаметром 47 мм и с абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм, фильтр промывают 0,030 л стартового элюента А. Получают около 0,340 л раствора инсулина.

Для очистки инсулина используют готовую хроматографическую колонку с системой динамического аксиального сжатия Dynamax-300А С8 (фирмы Rainin), с внутренним диаметром 4,14 см и длиной 25 см. Колонка упакована сферическим силикагелем С8 с размером частиц 15 мкм и средним размером пор Для уравновешивания через колонку пропускают 1,30 л стартового элюента А.

Процесс очистки инсулина ведут на жидкостном хроматографе Gilson (фирма Gilson), укомплектованного насосами модели 305, 306 с головками 50SC, демпфером давления модели 806, динамическим миксером модели 811, фотометрическим УФ-детектором модели 112 и коллектором фракций FC-30 (фирма Fharmacia Biotech).

Раствор инсулина подают с линейной скоростью потока 1,5 см/мин в хроматографическую колонку. Затем колонку промывают 0,330 л стартового элюента А. Элюцию инсулина ведут с линейной скоростью потока 3,0 см/мин в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 18,0 до 30,0 объемных % в течение 100 мин. Формирование градиента осуществляется автоматически путем смешения двух элюентов: стартового элюента А и элюента, содержащего раствор трифторуксусной кислоты с массовой долей 0,075% и ацетонитрил с концентрацией 50 объемных %. После окончания градиента сорбент в колонке регенерируют элюентом, содержащим раствор трифторуксусной кислоты с массовой долей 0,075% и ацетонитрил с концентрацией 50 объемных %, с линейной скоростью потока 3,0 см/мин в течение 30 мин. Элюат, содержащий белок, дробят на фракции объемом 0,080 л каждая. Фракции анализируют методом ВЭЖХ на содержание примесей и по результатам анализа формируют три пула. Пул 1 содержит 0,983 г белка (1,31 л элюата с концентрацией белка 0,75 г/л) следующего состава: инсулина - 6,9%, дезамидо-А21-инсулина - 29,1%, примесей - 64,0%. Пул 2 содержит 0,655 г белка (0,35 л элюата с концентрацией белка 1,87 г/л) следующего состава: инсулина - 75,8%, дезамидо-А21-инсулина - 14,1%, примесей - 10,1%. Пул 3 содержит 6,552 г белка (0,753 л элюата с концентрацией белка 8,70 г/л) следующего состава: инсулина - 97,6%, дезамидо-А21-инсулина - 0,6%, примесей - 1,8%. Пул 1 передают в отходы производства. Пул 2 подвергают рехроматографии при тех же режимах, но на хроматографической колонке меньшего объема: Superformance 300-10 с внутренним диаметром 1 см, упакованную 0,023 л сферического силикагеля С8 DuraSil S-100-C8 (размер частиц 10 мкм). После рехроматографии пула 2 получают дополнительно 0,426 г инсулина (0,060 л элюата с концентрацией белка 7,1 г/л) следующего состава: инсулина - 97,2%, дезамидо-А21-инсулина - 0,8%, примесей - 2,0%. Элюат, после рехр