Способ стерилизации нативного коллагена в жидкой среде, полученный стерильный нативный коллаген, содержащие его композиции и их применение

Способ стерилизации нативного коллагена в жидкой среде, полученный стерильный нативный коллаген, содержащие его композиции и их применение

Реферат

 

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения коллагена из солюбилизированного и очищенного, возможно, пепсинизированного экстракта нестерильного нативного или ателопептидного коллагена, включающему: i) стадию перемешивания и сдвига указанного экстракта в смесителе с двойными поперечными резцами при поэтапном повышении первоначальной скорости перемешивания на 500-1000 об/мин без превышения скорости 10000 об/мин и при поэтапном повышении температуры на 2-10^oС, предпочтительно на 3-5^oС, таким образом, чтобы увеличить исходную окружающую температуру экстракта до максимально контролируемой температуры, составляющей не выше 50^oС, а затем ii) стадию стерилизации в жидкой среде указанного экстракта с получением стерильного коллагена в нативной или ателопептидной форме, к нативному или ателопептидному коллагену типа I, полученному в условиях вышеуказанного способа, имеющему следующие характеристики или свойства: соотношение ₂(I)₁/₁(I)₂ от 0,48 до 0,52; стерильность в соответствии со стандартом Европейской Фармакопеи; общее содержание азота от 17,0 до 18,7%; гидроксипролин от 12 до 13,9%; не содержит триптофан, аминогликаны и полипептиды с мол.м. <95000 Да; липиды <1%; серосодержащая зола <2%, к фармацевтической и/или парафармацевтической, и/или медико-хирургической, и/или офтальмологической, и/или косметической композиции. 4 с. и 9 з.п.ф-лы, 4 ил.

Изобретение относится к способу получения коллагена, включающему стадию стерилизации указанного коллагена, к полученному таким образом стерильному коллагену, к композициям и применению, в частности к фармацевтическим и/или парафармацевтическим, и/или медико-хирургическим, и/или офтальмологическим, и/или косметическим композициям и к применению последних.

Коллаген и его применения в целом были описаны в работах, приводимых в качестве ссылок, таких как, например, Collagen, Vol. 1,2,3 Marcel E. Nimni., CRC Press Inc., 1988, и Methods in Enzymology, Vol. 144, 1987, and Vol. 82, 1982, Ed. Leon W. Gunningham.

Хорошо известно, что коллаген представляет собой молекулу с трехмерной структурой, которая присутствует в большинстве тканей человека и животных и обнаруживается, в частности, в коже, сухожилиях и плаценте.

Среди его различных известных свойств имеются, между прочих, свойства увлажнения, свертывания крови и заживления ран.

Для сохранения кровоостанавливающего действия коллагена в целом желательно сохранить его нативную форму перед введением в организм человека, как указывается, например, в документе US-A-4515637.

Кроме того, ввиду сфер применения коллагена, в частности в медицине и/или в косметике, он должен быть лишен каких-либо загрязнений (вирусов, бактерий, прионов и т.д.). Стерилизация коллагена разнообразно исследовалась в предшествующем уровне техники, которая, вследствие естественного происхождения коллагена, в течение нескольких лет столкнулась с новыми проблемами (риск передачи СПИДа, болезни Крейцфельда - Якоба и т.д.).

Методики стерилизации коллагена в твердой форме включают применение этиленоксида в соответствии, в частности, с документом FR-A-2393581, или облучения (использование бета- или гамма- ионизирующей радиации), как описано, например, в документе ЕР-А-0224453. В последнем из указанных документов, в котором описаны косметическая и фармацевтическая сферы применения типа губки на основе коллагена, рекомендуется стерилизация в сухой форме ввиду невозможности, в соответствии с этим документом, стерилизации растворимого естественного коллагена, включенного в эмульсии или растворы.

В документе ЕР-А-0664132 описывается клеевая композиция для применения в хирургии, основанная на коллагене без поперечной сшивки, модифицированном окислительным расщеплением. Один предпочтительный вариант реализации композиции, описанной в этом документе, состоит в получении с помощью окислительного расщепления стерильного порошка коллагена I типа без поперечной сшивки (лакуна) и в растворении этого порошка в стерильной, подвергнутой ультрафильтрации воде путем нагревания приблизительно до 60^oС при перемешивании. Указано, что ввиду проводимого контролируемого нагревания, коллаген теряет свою спиральную структуру и трансформируется в желатин. Кроме того, объясняется, что с клеевыми композициями, представляющими предшествующий уровень техники в этом документе, которые основаны на поперечно сшитом коллагене, нелегко обращаться, и это связано с проблемами их нанесения на склеиваемые поверхности и механической прочности.

В документе ЕР-А-0667352 описана щелочная обработка, используемая по отношению к коллагену в растворе, с целью устранения возможных прионов. Для того, чтобы избежать весь риск остаточного загрязнения указанными прионами, в этом документе, в частности, приводится способ, состоящий в солюбилизации экстрагированного из ткани коллагена или с помощью ферментативной обработки, или с помощью щелочного расщепления ковалентных связей, которые обеспечивают взаимосвязь между цепями коллагена, а затем в удалении фрагментов ткани с помощью фильтрации и воздействия на солюбилизированный таким образом коллаген щелочной обработки.

В документе FR-A-2586703 приводится способ получения прозрачных и физиологичных гелей или растворов коллагена, основанных на коллагене IV типа. Однако указывается, что поскольку коллагены I, II или III типа практически нерастворимы при нейтральном рН, они позволяют получать лишь непрозрачные суспензии, и что невозможно их применять для получения прозрачных и физиологичных гелей без того, чтобы не прибегнуть к химической модификации молекул коллагена, что может вероятно сделать их антигенными и/или токсичными.

Знание предшествующего уровня техники и исследование в ходе научно-исследовательской работы позволило автору настоящего изобретения продемонстрировать следующие трудности и проблемы, которые еще остаются до настоящего времени в получении стерильного нативного коллагена, в частности, I типа: * Обращение - Высокая вязкость нативного коллагена, которая вносит технические ограничения в проведение процедур фильтрации, в частности в процедуры прямой фильтрации обычного нативного коллагена в жидкой среде.

* Денатурация - Частичная или полная тепловая денатурация нативного коллагена во время различных обычно применяемых способов стерилизующей обработки, которая вызывает потерю всей или части его структуры и/или его благоприятных свойств, таких как, например, резорбция, механическая прочность или увлажнение.

- Стерилизация облучением (ионизирующим излучением) или этиленоксидом, которая вызывает разрушение благоприятных активных составных частей, которые предстоит комбинировать в растворе с коллагеном, таких как, например, антибиотики, и/или которая приводит к разделению обычного геля, основанного на нативном коллагене, на две фазы, делая его непригодным для коммерческого применения.

- Денатурация под воздействием длительной щелочной обработки.

* Токсичность и/или загрязнение (вирусы, прионы) - Присутствие следовых количество остаточного этиленоксида в продуктах, стерилизованных с помощью этих средств, присутствие примесей в необработанном исходном коллагене.

* Несовместимость - Несовместимость между рН благоприятных активных составных частей, которые растворимы при нейтральном рН, таких как, например, противоинфекционные средства, и рН коллагена, который растворим в кислой среде.

* Галеновая композиция - Неудовлетворительная форма, в которой представлены препараты, основанные на нативном коллагене, которые имеют волокнистый и неоднородный внешний вид.

- Форма, в которой представлены обычные препараты биологического клея, неприемлемая для предполагаемых видов их применения (например, такие как препараты, которые не готовы для применения и которые требуют слишком длительного времени подготовки).

Таким образом, целью настоящего изобретения является преодоление указанных выше трудностей и разрешение упомянутых выше проблем, в частности стерилизации коллагена в жидкой среде, сохраняя в то же самое время его нативную форму, и другие проблемы, которые будут изложены ниже.

Таким образом, предметом настоящего изобретения является способ получения коллагена в нативной форме, включающий этап предварительной обработки коллагена в смесителе с двойными поперечными резцами, который оборудован устройством регулирования скорости перемешивания и скорости сдвига, и термостатом, и последующий этап стерилизации коллагена в жидкой среде.

Предметом настоящего изобретения является также стерильный коллаген, в частности коллаген преимущественно I типа, в нативной форме и композиции для применения у людей и/или в ветеринарии, которые содержат его в качестве единственной активной составной части или в которых он комбинируется с другими веществами, которые предпочтительно приемлемы с фармацевтической, парафармацевтической, медико-хирургической и/или офтальмологической, и/или косметической точки зрения.

Предметом изобретения является также применение коллагена в соответствии с изобретением в производстве композиции, предназначенной для фармацевтического и/или парафармацевтического, и/или медико-хирургического, и/или офтальмологического, и/или косметического лечения организма человека или животного.

Эти и другие предметы станут очевидными для специалистов по прочтении нижеследующего подробного описания.

Имеющиеся способы получения стерильного коллагена создают уже упомянутые выше проблемы осуществления, и до настоящего времени не позволили на практике осуществить прямую стерилизацию в жидкой среде одного коллагена или коллагена в присутствии других активных веществ. Проведение этой стерилизации отличается простотой, и она особенно эффективно гарантирует стерильность и нативную природу полученного коллагена, сохраняя таким образом его благоприятные свойства.

Таким образом, настоящее изобретение достигло эту цель и относится к способу получения коллагена, включающему перед стерилизацией стадию механической предварительной обработки в смесителе, таком как "режущий смеситель", имеющийся в продаже под товарным названием DITO-SAMA 175 (LA BOVIDA), и, например, модифицированный компанией "J.F.I., Graulhet France", который оборудован системой регулировки температуры экстракта нестерильного нативного коллагена, который солюбилизируется и очищается и, необязательно, подвергается действию пепсина. Самое удивительное и неожиданное, что этот этап предварительной обработки обеспечивает возможность стерилизации коллагена в жидкой форме и сохранения его нативной формы, когда он не был подвергнут воздействию пепсина.

Предпочтительно полученный таким образом коллаген представляет собой в основном коллаген I типа.

В основном коллаген I типа, полученный таким образом, является стерильным и имеет ненативную форму, т.е. с неизмененными вторичными и третичными структурами, и даже после стерилизации сохраняет все свои благоприятные свойства.

Коллаген в соответствии с настоящим изобретением может использоваться в очень многих сферах применения, которые подробно описаны ниже, в частности: различные виды применения в медицине и ветеринарии; различные виды фармацевтического применения; различные виды парафармацевтического применения; различные виды применения в офтальмологии; различные виды медико-хирургического применения; различные виды косметического применения.

Он может применяться сам по себе, т.е. без каких-либо других активных составляющих веществ, например, в форме стерильного прозрачного раствора, для инъекционных препаратов или альтернативно в качестве биологического клея и в других формах, которые подробно описаны ниже.

Он может применяться в композициях в комбинации при низком рН в качестве носителя для других активных составных частей с целью немедленного высвобождения последних. Эти другие активные составные части преимущественно выбраны из группы, состоящей из факторов свертывания, например тромбина, противоинфекционных средств, например метронидазола, антибиотиков, в частности макролидов, таких как гентамицин, фторхинолонов, таких как пефлоксацин, противовоспалительных средств, например ацилкарбоксильных или оксикамовых производных стероидных или нестероидных противовоспалительных средств, антимикотических средств и факторов роста, в частности факторов роста кости, таких как соматотропин, и эпидермальные факторы роста, такие как EGF.

Однако при определенных специфических сферах применения, например в офтальмологии или в случае применения лекарственных комбинаций, включающих активные составные части, которые несовместимы с кислым рН, таких как гликопептидный антибиотик ванкомицин, именно в приведенных этих двух примерах очевидно, что предпочтительно иметь коллаген при нейтральном рН.

Может также быть предпочтительным иметь коллаген при нейтральном рН в качестве носителя для активных составных частей пролонгированного высвобождения, таких как, например, факторы свертывания, или, альтернативно, когда предусматривается комбинация активности последних и механического действия. Таким образом, особенно предпочтительно также применять коллаген в соответствии с настоящим изобретением или путем комбинирования двух предшествующих комбинаций в стратифицированных твердых формах при кислом рН и при нейтральном рН при специфических способах применения, которые будут описаны ниже.

В качестве примеров очень многих форм представления коллагена в соответствии с изобретением можно упомянуть: - жидкие формы: гель, в частности, гель для инъекций, капли, пену, аэрозоль; - псевдотвердые формы: пленки, листки, мембраны, ленты или накладки и т. д.; - твердые формы: порошки, ламинированные/стратифицированные губки, пленки, мембраны, нити, шовный материал и т.д.

Можно также использовать свойства кислотности и растворимости стерильного коллагена в соответствии с изобретением в фармацевтических или косметических композициях, в частности в увлажняющих композициях.

Можно, например, использовать коллаген при низком рН и в псевдотвердой форме, полученной в соответствии со способом изобретения, отдельно или в комбинации с другими активными составными частями, такими как витамин Е или витамин С, в частности, в качестве увлажнителя ткани на эпидермисе и в качестве носителя для активной составной части (частей) в маске для лица.

Эти и некоторые другие формы представления будут проиллюстрированы в остальной части настоящего описания.

В контексте настоящего изобретения термин "нативный коллаген" предназначен для обозначения коллагена, который не был подвергнут модификации его первоначальной структуры, причем сохраняется целостность его полипептидных цепей (включая телопептиды) и спиральная структура молекулы остается нетронутой.

Термин "ателопептидный коллаген" предназначен для обозначения коллагена, который был подвергнут ограниченному протеолизу с помощью ферментативной обработки с использованием протеолитического фермента, отличного от коллагеназы, такого, например, как трипсин, папаин и т.д., или еще лучше пепсин, приводящий к удалению его телопептидов. Конечно, если коллаген был в нативной форме, то он сохраняет свою трехспиральную структуру.

Термин "стерильный коллаген" предназначен для обозначения коллагена, который стерилен в соответствии со стандартами Всемирной Организации Здравоохранения, Европейской Фармакопеи и Фармакопеи США (USP 22), т.е. который сертифицирован как стерильный после микробиологического анализа в соответствии с критериями, признанными соответствующими администрациями.

Термин "жидкий коллаген" предназначен для обозначения коллагена в растворе или в форме суспензии, дисперсии или геля.

Термин "псевдотвердый коллаген" предназначен для обозначения коллагена в форме геля, который не текуч и который образует компактную и однородную массу, содержащую более чем 75% воды.

Термин "твердый коллаген" предназначен для обозначения коллагена, который содержит не более чем 10 - 25% воды и который может быть в твердой форме, например в виде порошка, пленки, губки, мембраны и т.д.

Фраза "нативный коллаген со способностью к полимеризации" предназначена для обозначения нативного коллагена, полученного в соответствии с вариантом способа в соответствии с настоящим изобретением, который в жидкой форме или будучи однажды солюбилизированным из твердой формы, имеет жидкую природу при температуре выше чем 37^oС. Он трансформируется в однородную массу и находится в "псевдотвердой" форме при температуре, меньшей 37^oС или приблизительно равной ей. Ателопептидный коллаген также может иметь указанную способность полимеризоваться.

Фраза "солюбилизированный и очищенный экстракт" предназначена для обозначения нестерильного экстракта коллагена при низком рН (от 1,5 до 6,5, обычно от 3 до 6, еще лучше от 4 до 5), в котором содержание серосодержащей золы в целом менее чем 2% и содержание липидов в целом менее чем 1% и который содержит от 12 до 13,9% гидроксипролина и от 17 до 18,7% общего азота, и который не содержит следовых количеств триптофана или полипептидных цепей менее чем 95000 Да.

Такой экстракт может быть получен из высушенных обработанных известью свежих шкур, таких как шкура ягненка или кролика, и/или из соединительных тканей, в частности, от крупного рогатого скота, коз, свиней, овец, лошадей, кроликов, молодых жеребцов, страусов, рыб и т.д., или из высушенных или свежих костей, роговиц или даже сухожилий животных (например, ахилловых сухожилий страусов), или альтернативно из очищенных коллагеновых волокон или порошков. Он может также экстрагироваться из плаценты человеческого происхождения.

Экстракт, который может использоваться в контексте настоящего изобретения, получают с помощью серии обработок, включающих в итоге этапы: обработки известью / удаления волос / промывания / удаления извести / удаления эпидермиса и подкожных тканей / разрезания / центрифужной сушки / погружения в 1 н. NaOH на 12 ч при 25^oС / промывания для полного устранения NaOH / размалывания / разрезания на пленки / обезжиривания в бане Triton X100 при 0,01% / необязательного удаления аминогликанов в бане K₂HPO₄ / промывания / центрифужной сушки / промывания очищенной водой / центрифужной сушки / подкисления в 10^-2 М уксусной кислоте, монохлоруксусной кислоте или лимонной кислоте / необязательного разведения экстракта коллагена.

Способ настоящего изобретения может применяться к различным коллагенам типа I, II, III, IV и т.д. Однако далее и исключительно в качестве не ограничивающей иллюстрации термины "экстракт коллагена" и "коллаген" при отсутствии других указаний относятся к экстракту коллагена преимущественно типа I.

Таким образом, в контексте настоящего изобретения экстракт коллагена состоит преимущественно из коллагена I типа, т.е. содержащего более чем 90% коллагена I типа. Экстракт может также состоять полностью из коллагена I типа, например, с помощью продолжения удаления коллагена III типа в соответствии с известными методиками диализа, центрифугирования и дифференциального осаждения с хлоридом натрия.

Коллаген I типа представляет собой полимер с высокой молекулярной массой, составляющей 285000 Да, и состоящий из ассоциации трех спиральных из двух идентичных полипептидных цепей, называемых ₁(I)₂ и из полипептидных цепей, называемых ₂(I)₁. Он относится к семейству фибриллярных коллагенов (типа I, II, III и V).

Коллаген имеет пик денатурации, который зависит от его происхождения, от способа экстракции, приводящего к нему, и от его поперечно сшитой или не поперечно сшитой формы. У не поперечно сшитой формы пик денатурации находится при 35-45^oС.

Коллаген преимущественно I типа имеет соотношение ₂(I)₁/₁(I)₂ от 0,48 до 0,52, по данным измерения с помощью денситометрии, проводимой на полиакриламидном геле после миграции цепей с помощью электрофореза.

Вирусная инактивация этого экстракта и необязательно присутствующего пепсина может проводиться с помощью химической обработки путем попеременного пропускания через буферные растворы при рН, превышающем или равном 13, и при рН ниже 2,5 или равном ему. В целом проводятся такие известные сами по себе способы обработки, как вымачивание в бане гидроксида кальция при концентрации 4% в комбинации с сульфидом натрия при концентрации 3% с последующей второй баней метабисульфита натрия при концентрации 0,5% в комбинации с аммония хлоридом при концентрации 2%.

Необязательная нейтрализация пепсина проводится с помощью обработки натрием, которая возвращает рН к уровню от 6,8 до 7,4, как изложено, например, в документе FR 2586703.

Аналогичным известным образом, как описано, например, в распоряжениях ВОЗ (WHO/COS/VHP/92.104) и Европейского Сообщества от 11 декабря 1991 г., может также проводиться устранение возможных агентов, которые ответственны за бычьи губчатообразные энцефалопатии и которые называются "прионами". Это устранение может таким образом состоять из обработки раствором 1 н. гидроксида натрия в течение 1-48 ч при 25^oС или, альтернативно, из обработки гипохлоритом натрия в течение, по меньшей мере, 1 ч при 25^oС.

В соответствии с первым аспектом, предметом настоящего изобретения является таким образом более точно способ получения коллагена из солюбилизированного и очищенного, необязательно пепсинизированного экстракта нестерильного нативного коллагена. Обычно этапы состоят из смешивания и сдвигания указанного экстракта в смесителе с двойными поперечными резцами в течение периода от 1 до 60 мин, преимущественно от 15 до 40 мин, а предпочтительно от 10 до 20 мин, при скорости перемешивания от 100 до 10000 об/мин, в целом от 500 до 7000 об/мин, а предпочтительно от 1000 до 5000 об/мин, с контролем в то же самое время температуры, а затем в стерилизации указанного экстракта.

Преимущественно в соответствии с первым вариантом реализации и когда экстракт обычно не пепсинизируется (для простоты именуемый далее "вариант 1" - вариант реализации способа изобретения, при котором при отсутствии других указаний экстракт не пепсинизируется), температура, которая всегда контролируется, в целом не превышает 40-50^oС или даже 60 - 80^oС в присутствии поперечно сшивающего агента (в соответствии с другим вариантом реализации, который представляет собой альтернативу этому варианту и подробно описан ниже).

Предпочтительно в соответствии с первым вариантом способа настоящего изобретения, поскольку экстракт не пепсинизируется, его температура постепенно увеличивается от комнатной температуры до тех пор, пока в указанном смесителе не будет достигнута температура от 40 до 50^oС, в то же самое время поэтапно повышая первоначальную скорость перемешивания с 500 об/мин с тем, чтобы достичь скорости от 5000 до 7000 об/мин, и на каждой фазе увеличения вязкости проводится разведение экстракта. Таким образом, поддерживается выбранная высокая вязкость коллагена, и в то же самое время уменьшается его концентрация. Преимущественно указанная высокая вязкость составляет от 15000 до 20000 сП (от 15 до 20 Пас). Например, если указанная максимальная температура составляет от 42 до 44^oС, указанный экстракт оставляют стоять перед указанным этапом стерилизации.

После стерилизации наблюдают, что полученный таким образом коллаген из непепсинизированного экстракта сохранил свою нативную форму и приобрел улучшенные свойства, в частности эластичность и механическую прочность. Он обладает сцепляющей и полимеризующей способностью.

Предпочтительно, температура указанного экстракта в указанном смесителе ступенчато повышается от комнатной температуры до температуры максимум от 40 до 50^oС на 2-10^oС, предпочтительно на 3-5^oС, при одновременном также ступенчатом увеличении скорости перемешивания на 500-1000 об/мин с тем, чтобы достичь скорости от 1500 до 7000 об/мин, предпочтительно 5000 об/мин.

Действительно важно ступенчатое повышение температуры, поскольку резкое увеличение температуры вызывает временную денатурацию коллагена без достаточного увеличения его эластичных свойств. Эта температура доводится до, по меньшей мере, 40^oС, поскольку ниже этой температуры последующая фильтрация затрудняется или даже становится невозможной.

Важно также ступенчато увеличивать скорость перемешивания с тем, чтобы лучше контролировать выбранную высокую вязкость, в то же самое время уменьшая концентрацию коллагена, как уже упоминалось.

Концентрация коллагена в экстракте составляет от 0,001 до 15%, в целом от 0,1 до 10%, а предпочтительно от 3 до 6%.

Как описано выше, температура в указанном смесителе может, однако, достигать более высоких величин, которые могут достигать 80^oС, в присутствии поперечно сшивающих агентов, таких как глутаральдегид и азиловые кислоты, таких как гидразин, или любого другого поперечно сшивающего агента, который совместим с коллагеном. При их присутствии эти агенты имеют конечную концентрацию в экстракте от 0,00075 до 0,1%, предпочтительно от 0,0075 до 0,01% в случае глутаральдегида и от 0,1 до 2%, предпочтительно от 0,5 до 1,5% для гидразина. "Поперечно сшитый" таким образом коллаген имеет более высокую температуру отверждения, которая может составлять около 40-50^oС, и имеет время резорбции in vivo, которое длиннее, в сравнении с коллагеном без поперечной сшивки, и которое может достигать от 8 до 12 нед.

В соответствии с особым вариантом реализации этого варианта способа в соответствии с изобретением, который состоит в получении стерильного нативного коллагена в форме вязкой жидкости, проводятся следующие процедуры: - Нестерильный нативный коллаген, который экстрагируется из кроличьих шкур или из ахилловых сухожилий страусов, получают в достаточно высокой концентрации, составляющей около 10-15%.

- Затем экстракт нестерильного нативного коллагена подвергается перемешиванию и сдвигу в уже упоминавшемся смесителе с двойными поперечными резцами с умеренной скоростью от 500 до 1000 об/мин и при комнатной температуре около 20^oС.

- Скорость вращения и скорость сдвига ступенчато увеличиваются, что оказывает эффект в виде значительного увеличения вязкости экстракта. Вязкость может иметь величины от 7000 до 20000 сП. Начиная от 1500 сП, экстракт имеет по существу эластичный вид, что крайне затрудняет его перемешивание и его сдвиг в смесителе.

- На каждой фазе увеличения вязкости осуществляют разведение экстракта с помощью добавления воды для инъекций (ВДИ) или 10^-2 М лимонной кислоты и ступенчато увеличивают скорость перемешивания и температуру в смесителе до тех пор, пока не будет получена очень высокая вязкость, составляющая около 20000 сП (20 Пас).

- Эту операцию повторяют несколько раз, предпочтительно 4-5 раз до тех пор, пока не будут достигнуты температура 35^oС, скорость от 3000 до 5000 об/мин и концентрация коллагена около 3-6%.

- Продукт держат при этой температуре 35^o С и при этой скорости от 3000 до 5000 об/мин в течение нескольких минут, предпочтительно от 3 до 5 мин.

- Температуру в смесителе увеличивают до тех пор, пока не будет достигнут ее уровень от 40 до 50^oС, предпочтительно, в случае коллагена без поперечной сшивки, от 40 до 45^oС. При этой температуре наблюдается наиболее удивительное разжижение экстракта с падением вязкости до уровня приблизительно от 40 до 100 сП.

- Экстракт коллагена, полученный с помощью изложенного выше способа, немедленно тщательно фильтруют через мембраны с размером пор от 0,45 мкм до 0,22 мкм при контролируемой рабочей температуре от 40 до 50^oС.

- Затем его подвергают стерилизации предпочтительно с помощью абсолютной фильтрации через мембрану с размером пор 0,22 мкм, такую как мембрана Millidisck, продаваемая компанией Millipore, при контролируемой рабочей температуре от 40 до 50^oС. Время фильтрации при температуре от 40 до 50^oС выбирают так, чтобы оно не превышало 1 ч, еще лучше, чтобы оно составляло от 10 до 20 мин. Можно также проводить стерилизацию предпочтительно также с помощью добавления надуксусной кислоты, производимой, в частности, компанией "Air Liquide" под названием Soproper, в конечной концентрации в тщательно профильтрованном экстракте от 0,5 до 50%, а предпочтительно от 5 до 15 мас.% по отношению к сухой массе коллагена. Нейтрализацию этого стерилизующего агента проводят с помощью добавления тиосульфата натрия в пропорции от 2 до 20 г на 1 г надуксусной кислоты, предпочтительно от 4 до 12 г/г надуксусной кислоты. Время контакта, требуемое для стерилизации надуксусной кислотой, составляет от 1 ч до 24 ч при комнатной температуре предпочтительно от 2 до 4 ч.

В соответствии с другим определенным вариантом реализации этого первого варианта способа в соответствии с настоящим изобретением, который состоит в получении нативного коллагена в форме псевдотвердого геля, ввиду того, что концентрация коллагена составляет от 0,5 до 10%, предпочтительно также стерилизовать его прямо облучением в дозе 2,5 Мрад (2,510^-5 Грэй) (бета- или гамма-ионизирующее излучение). Неожиданно наблюдается, что псевдотвердый гель остается компактным и однородным и что, в отличие от обычных гелей, поэтому не происходит разделения на две фазы, и он сохраняет свои физико-химические свойства и его полимеризующую способность. Этот псевдотвердый гель, стерилизованный с помощью этого способа, может преимущественно разжижаться с тем, чтобы комбинироваться со стерильными активными составными частями, которые чувствительны к ионизирующему излучению, такими как факторы свертывания, антибиотики, антимикотические средства и т.д., для производства жидких или твердых препаратов, в частности препаратов, приведенных ниже в качестве примеров: губок, порошков, пленок, мембран, накладок и т.д.

При использовании этого способа стерилизации применительно к твердым препаратам коллагена, который получен в соответствии с этим первым вариантом способа, и который используется сам по себе или в комбинации с активными составными частями, которые устойчивы к ионизирующему излучению и которые выбраны из терапевтических классов, приведенных в настоящем документе, не происходят изменения физико-химических свойств или полимеризующей или сцепляющей способности этой формы коллагена.

В соответствии с этим 1 вариантом способ в соответствии с изобретением может также включать этап нейтрализации. Эту нейтрализацию можно проводить до и после этапа стерилизации. Нейтрализацию можно проводить, например, гидроксидом натрия для доведения рН в диапазоне от 6,8 до 8,2, а предпочтительно от 7,0 до 7,4. Наиболее неожиданно то, что, как было отмечено, эта нейтрализация коллагена в вязкой жидкости и форме при температуре от 40 до 50^o С не вызывает никакого осаждения коллагена. Экстракт остается в светлой и прозрачной вязкой жидкой форме и быстро отвердевает при тех же условиях, что и коллаген при низком рН. Это имеет большие преимущества, поскольку до настоящего времени препятствием производству определенных препаратов, таких как гель на основе коллагена или комбинация коллагена с ванкомицином, было осаждение коллагена при нейтральном рН.

Анализы молекулы коллагена изобретения с помощью уже упомянутых обычных методик подтверждают целостность первичных, вторичных и третичных структур нейтрализованного таким образом коллагена.

Характеристики коллагена, полученного в соответствии с вариантом 1.

Самым неожиданным было то, что, как отмечено, коллаген, стерилизованный в соответствии с первым вариантом способа настоящего изобретения, сохранял свою нативную форму.

При температуре от 40 до 50^oС он представляет собой вязкую прозрачную жидкость.

Вязкость в целом варьирует от 20 до 300 сП (от 2010^-3 до 300 10^-3 Пас), а предпочтительно от 30 до 200 сП (от 3010^-3 до 20010^-3 Пас), а еще даже лучше от 40 до 100 сП (от 4010^-3 до 10010^-3 Пас).

Его рН в целом составляет от 1,5 до 6,5, предпочтительно от 2 до 5 и даже еще лучше от 3 до 4.

Его концентрация в целом составляет от 0,001 до 15%, предпочтительно от 0,1 до 10% и даже еще лучше от 3 до 6%.

Он очень быстро отвердевает при температуре ниже или равной 38^oС. Он принимает псевдотвердую форму, которая обладает заметными сцепляющими свойствами кровоостанавливающего клея. Время его отвердения при температуре около 38^o С составляет менее 1 мин при концентрации, превышающей или равной 5%, от 1 до 2 мин при концентрации от 3 до 4% и около 3 мин при концентрации ниже 2%.

Полученный нативный стерильный коллаген имеет также следующие другие важные характеристики или свойства: - коллаген преимущественно представляет собой коллаген I типа, т.е. содержит его в количестве 90% или более, т.е. имеет соотношение ₂(I)₁/₁(I)₂ от 0,48 до 0,52; - содержание воды: более 80%; - внешний вид: жидкость при температуре выше чем приблизительно 38^oС и липкая на ощупь; псевдотвердая плотная и однородная желеобразная масса при температуре ниже чем приблизительно 38^oС; - общее содержание азота: от 17,0 до 18,7%; - гидроксипролин: от 12 до 13,9%; - не содержит триптофан, аминогликаны и полипептиды с молекулярной массой <95000 Да; - липиды <1%;oС, по данным измерения с помощью дифференциальной термографии (DSC); - обладает способностью склеивания; - обладает способностью полимеризоваться; - хранится при комнатной температуре; - готов к немедленному применению.

Таким образом, предметом настоящего изобретения является также такой коллаген, который имеет упомянутые выше характеристики.

Препараты на основе коллагена, полученного в соответствии с этим первым вариантом способа в соответствии с настоящим изобретением, и способы их применения.

Как уже упоминалось, коллаген в соответствии с изобретением обладает способностью полимеризоваться и склеиваться при кислом или нейтральном рН. Последнее из упомянутых свойств в комбинации с его кровоостанавливающими и резорбционными свойствами придают ему качество рассасываемого гемостатического клея.

Коллаген изобретения может предпочтительно распределяться в шприцы или флакончики емкостью от 2 до 5 мл, которые предпочтительно изготовлены из стекла и которые хранятся при температуре, позволяющей ему полимеризоваться или отвердеть при температуре от 0 до 38 ^oС, даже еще лучше при комнатной температуре.

Другой преимущественной формой этого рассасываемого гемостатического клея в соответствии с изобретением является сухая, порошкообразная или губчатая форма. Эта форма не требует предварительной подготовки перед ее применением.

Для получения такой формы коллаген изобретения, полученный в вязкой форме, подвергается, например, лиофилизации.

Коллаген изобретения в жидкой форме равномерно распределяется в контейнеры (лиофилизационные лотки) в асептических условиях, обеспечивая получение лиофилизатов с толщиной от 1 до 20 мм, предпочтительно от 2 до 10 мм и даже еще лучше от 3 до 5 мм. Полученный лиофилизат имеет кремовый цвет и имеет слегка эластичный образующий пленку вид. Он имеет содержание воды от 1 до 25%, а предпочтительно от 5 до 15%. Лиофилизаты могут подвергаться размалыванию с тем, чтобы получить порошок с выбранным маленьким размером частиц.

Для порошкообразных препаратов предпочтительно иметь перед лиофилизацией концентрацию коллагена приблизительно от 3 до 6% или более, с тем чтобы обеспечить лучшее распыление.

Порошок после размалывания может распределяться