Эмульсионный препарат для профилактики респираторных вирусных инфекций

Эмульсионный препарат для профилактики респираторных вирусных инфекций

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, а именно к препаратам в аэрозольной форме на основе природных полиизопреноидов. Эмульсионный препарат для профилактики респираторных вирусных инфекций включает полиизопреноиды, неионогенное поверхностно-активное вещество и водную основу. В качестве полиизопреноидов используют природные полипренолы, в частности полипренолы древесной зелени пихты сибирской (Abies sibirica), а готовая эмульсионная форма препарата представляет собой водную микроэмульсию с турбидиметрическим параметром Р, преимущественно не менее 2,0, при следующем процентном содержании компонентов, вес.%: полиизопреноиды пихты сибирской 0,01-5,0; неионогенное поверхностно-активное вещество 0,05-25; водная основа остальное до 100%. Технический результат - усиление профилактической защиты от респираторных вирусных инфекций. 2 з.п. ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к препаратам в аэрозольной форме на основе природных полиизопреноидов для профилактики респираторных вирусных инфекций.

Полиизопреноиды представляют собой большую группу широко распространенных в природе регулярно построенных линейных 1,5 - полиенов с различной конфигурацией двойных связей. Важное место среди этих соединений принадлежит полипренолам, строение молекул которых выражается общей формулой (I), и их производным - долихолам (II), обладающим широким спектром биологической активности [1], включая иммуномодулирующую и протективную при бактериальных и вирусных инфекциях (колибактериоз и Сендай-инфекция) [1-3].

Полипренолы более распространены в растениях, причем для голосеменных растений характерны полипренолы с m = 2 (бетулапренолы), а для покрытосеменных более характерны соединения с m = 3 (фикапренолы). Дигидропроизводные полипренолов - долихолы распространены в основном в животных организмах, где выполняют важные регуляторные функции. В настоящее время эти группы веществ рассматриваются как новый класс низкомолекулярных биорегуляторов (особенно важных при биосинтезе полисахаридов и гликопротеинов).

Долихолы обладают более высокой биологической активностью и предпочтительны для разработок новых лечебно-профилактических препаратов. Однако концентрация долихолов в животных тканях очень низка (например, из 10 кг свиной печени можно выделить около 0,6 г долихолов). Более того, в настоящее время имеются большие трудности в препаративном получении долихолов полностью синтетическим путем. Эти обстоятельства сильно затрудняют как исследования биологической активности долихолов, так и разработки новых препаратов.

Вместе с тем, смеси природных полипренолов могут быть экстрагированы из зеленых частей многих растений (например, листья Ginkgo biloba /сырье для лечебного препарата БИЛОБИЛ/ поздней осенью содержат до 2% полипренолов). Другие хвойные растения (семейство Pinaceae) также содержат полипренолы в значительном количестве, причем состав композиции полипренолов (m = 2, n = 12 - 19, преимущественно n = 13, 14) соответствует композиции природных долихолов (m = 2, n = 12 - 19, преимущественно n = 13-15) [1,4].

В научной и патентной литературе неоднократно отмечалась способность различных полиизопреноидов (в том числе различных полипренолов, долихолов и их простых и сложных эфиров) нормализировать иммунную функцию организма и повышать его устойчивость к инфекциям [1 - 3, 6, 8 - 11].

Механизм защитного действия полиизопреноидов и их производных связывают, как правило, с их способностью стимулировать генерацию нейтрофилов и активировать макрофаги РЭС [1, 2, 8, 10].

Известны фармацевтические препараты на основе различных полиизопреноидов (таблетки, капсулы, порошки), наружные (кремы и ленименты) для инъекционного, интраназального или перорального применения. В указанных фармацевтических композициях для повышения резистентности организмов животных и человека, для профилактики и лечения болезней, обусловленных иммунодефицитом, а также в сочетании с антибиотиками - для лечения инфекционных заболеваний отмечено применение различных полиизопреноидов и их производных (включая дигидрополипрены и их простые и сложные эфиры) [1-3, 6, 8 - 11].

Однако в известных источниках информации нет сведений об использовании данных составов и форм препаратов для профилактики респираторных вирусных инфекций. При этом из публикаций неизвестно, что иммуностимулирующая и противовирусная активность (в том числе и полипренолов пихты сибирской) при ингаляционном применении в аэрозольной форме может быть существенно увеличена за счет применения эмульгаторов и солюбилизаторов и обеспечения требуемых характеристик эмульсий (преимущественно - получение микроэмульсий).

Наиболее близким аналогом (прототипом) к предлагаемому техническому решению является эмульсионный состав для инъекционного (внутримышечного) применения, содержащий синтетические полипренилалкоголи и лецитин в качестве эмульгатора. Препарат обладает активностью как профилактическое средство при инфекции Е. coli в белых мышах [11].

К недостаткам известного способа можно отнести необходимость применения высоких доз действующего вещества (около 100 мг/кг) при внутримышечном применении. Кроме того, имеются данные о низкой профилактической эффективности инъекционного применения полиизопреноидов при респираторных инфекциях [3].

Задачей предлагаемого изобретения является создание такого препарата, который обеспечивал бы усиление его профилактического действия за счет повышения эффективности доставки и утилизации полиизопреноидов in vivo путем конструирования эмульсионных композиций полиизопреноидов с требуемыми физико-химическими характеристиками, пригодных для их применения в аэрозольной форме.

Указанная задача решается тем, что в эмульсионном препарате для профилактики респираторных вирусных инфекций, включающем полиизопреноиды, неионогенное поверхностно-активное вещество и водную основу, согласно изобретению в качестве полиизопреноидов используют природные полипренолы, в частности полипренолы пихты сибирской (Abies sibirica), а готовая эмульсионная форма препарата представляет собой водную микроэмульсию с турбидиметрическим параметром Р, преимущественно не менее 2,0, при следующем процентном содержании компонентов, вес. %: Полипренолы пихты сибирской - 0,01-5,0 Неионогенное поверхностно-активное вещество - 0,05-25,0 Водная основа - Остальное до 100% В качестве неионогенного поверхностно-активного вещества используют эфиры жирных кислот с полиэтиленгликолем, или эфиры жирных кислот с многоатомными спиртами (сорбитом), или блок-сополимеры этилена и пропилена, или оксиэтилированное касторовое масло, или высшие жирные спирты (С₁₆-С₁₈).

В качестве водной основы используют водно-солевые или водно-спиртовые составы.

При разработке фармацевтических препаратов (в том числе - на основе различных полиизопреноидов) известно применение эмульгаторов для улучшения биологической активности препаратов. Однако они используются для приготовления инъекционных форм, кремов и линиментов [6, 8, 10, 11].

Особенностью данного изобретения являются ингаляционные формы применения полиизопреноидов (в аэрозольной форме). Преимуществом предлагаемого решения является возможность существенно уменьшить применяемую дозу препарата, а также обеспечить селективную активацию системы иммунитета дыхательного тракта с целью обеспечения лечебно-профилактического действия против респираторных инфекций (особенно противогриппозной активности).

Полипренолы пихты сибирской (Abies sibirica) были выбраны исходя из сырьевой доступности и по экономическим соображениям (ориентируясь на ранее разработанный недорогостоящий метод их выделения из хвои [5]).

Общие сведения о технологии, используемой для приготовления заявляемых препаратов в виде микроэмульсий.

Заявляемые препараты приготавливают на основе полипренолов, выделенных из Abies sibirica, по методу, описанному в [5]. Полипренол (ППР) представляет собой хроматографически очищенную природную смесь изопренологов, описываемых общей формулой (1), где m = 2; n = oт 6 до 16 (присутствуют все члены ряда, в основном с n = 12 и 13).

Для получения лекарственных композиций липофильных полипренолов пихты сибирской (получаемых экстракцией препаратов хвои) применяли методы: эмульгирования и солюбилизации.

Качество эмульсий для аэрозольных ингаляций определяется (при всех других равных условиях) их дисперсностью, т.е. размерами мицелл дисперсной фазы, и устойчивостью, т.е. способностью существовать длительное время, не расслаиваясь. На агрегационную устойчивость эмульсий сильнее всего влияют природа эмульгатора и содержание его в системе. В качестве эмульгаторов могут применяться самые различные по природе вещества: ионогенные и неионогенные поверхностно-активные вещества (ПАВ) и высокомолекулярные соединения.

Растворимость лекарственных веществ в воде представляет важное условие их профилактического эффекта. В фармацевтической технологии растворимость гидрофобных лекарственных средств достигается применением комплексообразователей, солюбилизаторов и разных сорастворителей. Солюбилизация способствует получению лекарственных средств с высокой дисперсностью, что приводит к быстрому и полному их всасыванию. Кроме того, некоторые солюбилизаторы обладают способностью усиливать фармакологическое действие лекарственных веществ, что позволяет снижать их дозы. В фармацевтической практике чаще как солюбилизаторы используют неионогенные ПАВ, поскольку они имеют ряд преимуществ: абсолютную стойкость в жесткой воде, избирательную солюбилизирующую способность, относительно низкую токсичность и др.

Для получения лекарственных композиций полипренолов в качестве эмульгаторов и солюбилизаторов использованы неионогенные ПАВ: Эфиры жирных кислот с полиэтиленгликолем, эфиры жирных кислот с многоатомными спиртами (сорбитом), или блок-сополимеры этилена и пропилена, или оксиэтилированные высшие спирты (С₁₆-С₁₈), или касторовое масло.

Дисперсные характеристики эмульсий (способных влиять на распределение частиц по фракциям аэрозоля) контролировали турбидиметрическим методом, регистрируя мутность эмульсий и/или турбидиметрический параметр Р [7], определяемый по спектрам мутности A() (в диапазоне длин волн от 400 до 650 нм) интерполяцией по формуле LogA() = C-PLog(), где С - константа.

Турбидиметрический параметр Р определяется как коэффициент линейной регрессии зависимости A() в координатах Log(A) от Log(). При размерах частиц менее 300 нм размер (турбидиметрический радиус) можно определить количественно по теоретической калибровочной кривой. В случае эмульсий частиц, имеющих частицы с размерами более 500 нм, или полидисперсных эмульсий показатель Р позволяет проводить сравнительный анализ эмульсий, контролировать воспроизводимость методик приготовления и изучать изменения свойств препаратов при хранении. Меньшие значения Р соответствуют более крупным мицеллам эмульсии.

Диспергируемость эмульсий (используемых для ингаляций) и свойства аэрозоля характеризовали следующими параметрами: эффективность перевода препарата в аэрозоль, фракционно-дисперсный состав аэрозоля и загрузка целевой фракции при условиях диспергирования, имитирующих ингаляционное применение.

Диспергирование эмульсий проводили на ультразвуковом аэрозольном ингаляторе "Вулкан-1" при среднем значении мощности излучателя, объеме образца 20 мл и температуре 37^oС. Для определения массовой концентрации аэрозоля и фракционно-дисперсного состава проводили изокинетический отбор потока аэрозоля непосредственно на выходе ингалятора на четырехступенчатый каскадный импактор и фильтр. Расход воздуха 25 л/мин контролировали ротаметром.

Для регистрации количества аэрозоля использовали водорастворимую флуоресцентную метку - флуоресцеин натрия (уранин). Для определения содержания полипренолов в аэрозоле (загрузка целевой фракции) применяли (с учетом спектральных характеристик) липидорастворимую флуоресцентную метку - перилен.

Отобранный аэрозоль смывали с отбойников импактора щелочным раствором (NaOH в воде, рН 11). Интенсивность флуоресценции измеряли на флуориметре "PERKIN-ELMER - 1000".

Ниже приведена конкретная технология получения микроэмульсий и примеры предлагаемых составов в эмульсионной форме.

Для обеспечения эффективной доставки действующего вещества в респираторный тракт и утилизации полиизопреноидов in vivo (для усиления иммуномодулирующих и протективных свойств) препараты готовили тем или иным способом, обеспечивая формирование микроэмульсий с турбидиметрическим параметром Р, преимущественно, не менее 2,0.

Пример 1. Эмульсионную форму полипренолов готовят с использованием ПАВ - Tween 80 (Serva). 1 г полипренолов хвои смешивают с 5,0 г Tween 80 и тщательно перемешивают компоненты до получения визуально однородной смеси (для ускорения процесса смесь прогревали на водяной бане при температуре 60^oС). Далее добавляют при перемешивании дистиллированную воду (подогретую до 60^oС) до суммарного объема 20 мл. Полученная эмульсия имеет Р = 2,2 (размер частиц около 0,5 мкм).

Процентное содержание компонентов: вес. %: Полипренолы пихты сибирской - 5,0 Поверхностно-активное вещество Tween 80 - 25,0 Водная основа (вода) - До 100% Пример 2. Эмульсионную форму полипренолов готовят на основе неионогенного ПАВ - Span 20 (Serva). 2 мл раствора ППР хвои в пентане (100 мг/мл) смешивают с 1 г Span 20 (разведенного с 2 мл этанола), смесь высушивают на ротационном испарителе, разводят с 2 мл этанола, а затем быстро вводят в 50 мл раствора Хенкса (подогретого до 50^oС) при интенсивном перемешивании. Полученная устойчивая эмульсия имеет Р = 2,1.

Процентное содержание компонентов: вес. %: Полипренолы пихты сибирской - 0,4 Неионогенное поверхностно-активное вещество Span 20 - 2,0 Водная основа (раствор Хенкса с 4% этанола) - До 100% Пример 3. Эмульсионную форму полипренолов готовят на основе неионогенного ПАВ - Span 20 (Sеrva). 2 мл раствора ППР хвои в пентане (100 мг/мл) смешивают с 1 г Span 20 (разведенного с 2 мл этанола). Далее полученную смесь быстро вводят в 100 мл раствора Хенкса (подогретого до 40 - 50^oС) при интенсивном перемешивании. Полученная устойчивая эмульсия имеет Р = 2,4.

Процентное содержание компонентов: вес. %: Полипренолы пихты сибирской - 0,2 Неионогенное поверхностно-активное вещество Span 20 - 1,0 Водная основа (раствор Хенкса с 2% этанола) - До 100% Пример 4. Эмульсионную форму полипренолов готовят на основе неионогенного ПЛВ - Tween 80 (Serva). 2 мл раствора полипренолов хвои в пентане (100 мг/мл) смешивают с 1 г Tween 80 (разведенного с 2 мл этанола), смесь высушивают на ротационном испарителе, разводят с 2 мл этанола, а затем быстро вводят в 18 мл дистиллированной воды при интенсивном перемешивании. Полученная устойчивая эмульсия имеет Р = 2,0 и А₄₀₀=0,45.

Процентное содержание компонентов: вес. %: Полипренолы пихты сибирской - 1,0 Неионогенное поверхностно-активное вещество Tween 80 - 5,0 Водная основа (10%-ный водный раствор этанола) - До 100% Пример 5. Эмульсионную форму полипренолов готовят на основе неионогенного ПАВ - Tween 80 (Serva). 2 мл раствора полипренолов хвои в пентане (100 мг/мл) смешивают с 1 г Tween 80 (разведенного с 2 мл этанола). Полученную смесь быстро вводят в 20 мл раствора Хенкса (подогретого до 40^oС) при интенсивном перемешивании. Полученная устойчивая эмульсия имеет Р = 2,44 и А₄₀₀ = 0,17 (турбидиметрический диаметр мицелл около 0,2 мкм).

Процентное содержание компонентов: вес. %: Полипренолы пихты сибирской - 1,0 Неионогенное поверхностно-активное вещество Tween 80 - 5,0 Водная основа (раствор Хенкса с 10% этанола) - До 100% Пример 6. Эмульсионную форму полипренолов готовят на основе неионогенного ПАВ - Tween 80 (Serva). 2 мл раствора полипренолов хвои в пентане (100 мг/мл) смешивают с 1 г Tween 80 (разведенного с 2 мл этанола). Полученную смесь медленно (по каплям) вводят в 18 мл раствора Хенкса (подогретого до 50^oС) при интенсивном перемешивании. Полученная устойчивая эмульсия имеет Р = 3,5 и А₄₀₀ = 0,1 (турбидиметрический диаметр мицелл менее 0,1 мкм).

Процентное содержание компонентов: вес. %: Полипренолы пихты сибирской - 1,0 Неионогенное поверхностно-активное вещество Tweеn 80 - 5,0 Водная основа (раствор Хенкса с 10% этанола) - До 100% Пример 7. Эмульсионную форму полипренолов готовят на основе неионогенного ПАВ - Twееn 80 (Serva) и Span 20. 2 мл раствора полипренолов хвои в пентане (100 мг/мл) смешивают с 1 г Tweеn 80 и 0,2 г Span 20 (разведенных в 2 мл этанола). Полученную смесь (раствор ППР и ПАВ в этаноле) быстро вводят в 18 мл раствора Хенкса, подогретого до 50^oС, при интенсивном перемешивании. Полученная устойчивая эмульсия имеет Р = 2,29.

Процентное содержание компонентов: вес. %: Полипренолы пихты сибирской - 1,0 Поверхностно-активные вещества:* Tweеn 80 - 5,0 Span 20 - 1,0 Водная основа (раствор Хенкса с 10% этанола) - До 100% Пример 8. Эмульсионную форму полипренолов готовят на основе неионогенного ПАВ - эмульгатор RO-35 (оксиэтилированное касторовое масло).

2 мл раствора полипренолов хвои в пентане (100 мг/мл) смешивают с 1 г эмульгатора RO-35 (оксиэтилированное касторовое масло), разведенного с 2 мл этанола). Раствор ППР и RO-35 в этаноле медленно (по каплям) вводят в 18 мл раствора Хенкса (подогретого до 50^oС) при интенсивном перемешивании. Полученная прозрачная микроэмульсия (с Р = 3,3) имеет процентное содержание компонентов: вес. %: Полипренолы пихты сибирской - 1,0 Неионогенное ПАВ - эмульгатор RO-35 - 5,0 Водная основа (раствор Хенкса с 10% этанола) - До 100% Пример 9. Эмульсионную форму полипренолов готовят на основе неионогенного ПАВ - эмульгатор "Эмульгин В2" (на основе оксиэтилированных высших спиртов С₁₆-С₁₈). 2 мл раствора полипренолов хвои в пентане (100 мг/мл) смешивают с 1 г эмульгатора "Эмульгин В2", разведенного с 2 мл этанола. Полученную смесь медленно (по каплям) вводят в 18 мл раствора Хенкса (подогретого до 50^oС) при интенсивном перемешивании. Полученная прозрачная ультраэмульсия (с Р = 3,5) имеет процентное содержание компонентов: вес. %: Полипренолы пихты сибирской - 1,0 Неионогенное ПАВ Эмульгин В2 - 5,0 Водная основа (раствор Хенкса с 10% этанола) - До 100% Пример 10. Эмульсионную форму полипренолов готовят на основе неионогенного ПАВ - эмульгатора "Lutrol F68" (полоксимер на основе блок-сополимеров этилена и пропилена). 2 мл раствора полипренолов хвои в пентане (100 мг/мл) смешивают с 1 г эмульгатора "Lutrol F68" (разведенного с 2 мл этанола). Смесь раствора ППР и эмульгатора в этаноле медленно (по каплям) вводят в 18 мл раствора Хенкса (подогретого до 50^oС) при интенсивном перемешивании. Полученная прозрачная микроэмульсия имеет процентное содержание компонентов: вес. %: Полипренолы пихты сибирской - 1,0 Неионогенное ПАВ "Lutrol F68" - 5,0 Водная основа (раствор Хенкса с 10% этанола) - До 100% Для сравнения приготавливают липосомальные и эмульсионные формы препарата, близкие к аналогам [8 или 11] и используемые для инъекций.

Пример 11. Липосомальную форму полипренолов готовят на основе яичного лецитина /фирма Росма (Россия)/. 2 мл раствора полипренолов хвои в пентане (100 мг/мл) смешивают с 20 мл лецитина в хлороформе (100 мг/мл), высушивают на ротационном испарителе в виде тонкой пленки, тщательно эмульгируют в 20 мл раствора Хенкса и диспергируют обработкой ультразвуком на УЗДН-1.

Процентное содержание компонентов: вес. %: Полипренолы пихты сибирской - 1,0 Неионогенное ПАВ лецитин - 10,0 Водная основа (раствор Хенкса) - До 100% Полученная эмульсия имеет А₄₀₀ = 16,4; Р = 0,59.

Выбранный метод приготовления лецитиновых препаратов обеспечивает получение стабильных эмульсий (не распадающихся при хранении). В течение нескольких суток в эмульсии образуется небольшой осадок (легко диспергируемый при перемешивании).

Пример 12 (контроль). Эмульсионную форму полипренолов готовят на основе неионного ПАВ - Span 20 (Serva). 2 мл раствора полипренолов хвои в пентане (100 мг/мл) смешивают с 1 г Span 20 (разведенного с 2 мл этанола), смесь высушивают на ротационном испарителе, разводят с 2 мл этанола, а затем перемешивают с 18 мл раствора Хенкса и диспергируют обработкой ультразвуком на УЗДН-1.

Особенностью эмульсий этого типа (препарат-прототип) является их невысокая устойчивость, что приводит к образованию при приготовлении фракции крупных частиц (более 10 мкм), видимых под световым микроскопом (при этом турбидиметрический параметр Р эмульсии изменялся при хранении в течение нескольких дней от 0,56 до 0,24, что свидетельствует об увеличении частиц эмульсии. При длительном хранении наблюдается формирование крупных капелек масляной фазы).

Процентное содержание компонентов: вес. %: Полипренолы пихты сибирской - 1,0 Неионогенное поверхностно-активное вещество Span 20 - 5,0 Водная основа (раствор Хенкса с 10% этанола) - До 100% Пример 13. Оценка аэрофизических характеристик препаратов полиизопреноидов Препараты, приготовленные в примере 5 и примерах 11 и 12 (контроли), были использованы как образцы для исследования.

Анализ методами световой и электронной микроскопии, а также турбидиметрии показал, что препарат, приготовленный в соответствии с примером 11, представляет собой стабильную полидисперсную эмульсию, состоящую преимущественно из субмикронных частиц. Препарат, приготовленный в соответствии с примером 12, состоит из довольно крупных частиц (достигающих 5 мкм) и нестабилен. Препарат, приготовленный в соответствии с примером 5, представляет собой микроэмульсию, то есть прозрачный (опалесцирующий) препарат с размером мицелл около 0,2 мкм (турбидиметрический диаметр).

Таким образом, для аэрозольных экспериментов были выбраны 3 различные варианта эмульсий: полидисперсная нестабильная эмульсия Р = 0,43 (пример 12); стабильная эмульсия с субмикронными мицеллами Р = 0,59 (пример 11); стабильная эмульсия с мицеллами около 0,2 мкм Р = 2,44 (пример 5).

В качестве наиболее адекватной характеристики диспергируемости препаратов измеряли: эффективность перевода препарата в аэрозоль, фракционно-дисперсный состав аэрозоля и загрузку целевой фракции при условиях диспергирования, соответствующих ингаляционному применению.

Эксперименты проводили на ультразвуковом аэрозольном ингаляторе "Вулкан-1" при среднем значении мощности излучателя, объеме образца 20 мл и температуре 37^oС. Для определения массовой концентрации аэрозоля и фракционно-дисперсного состава проводили изокинетический отбор потока аэрозоля непосредственно на выходе ингалятора на четырехступенчатый каскадный импактор и фильтр. Расход воздуха 25 л/мин контролировали ротаметром.

Для регистрации количества аэрозоля использовали водорастворимую флуоресцентную метку - флуоресцеин натрия (уранин). Для определения содержания полипренолов в аэрозоле - липидорастворимую флуоресцентную метку - перилен.

Отобранный аэрозоль смывали с отбойников импактора щелочным раствором (NaOH в воде, рН 11). Интенсивность флуоресценции измеряли на флуориметре "PERKIN-ELMER - 1000".

В таблице 1 приведены результаты экспериментов.

Таким образом, наиболее эффективно переводится в аэрозоль препарат, приготовленный в соответствии с примером 5. Судя по результатам, дальнейшее уменьшение размеров мицелл, как это получено для препарата в примерах 6, 8-10, может лишь незначительно увеличить эффективность перевода в аэрозоль. Применение эмульсий с Р менее 2,0 нежелательно из-за уменьшения эффективности перевода в аэрозоль Пример 14. Оценка профилактического действия препаратов полиизопреноидов при инъекционном их применении на животных, аэрогенно инфицированных вирусом гриппа.

Препараты, приготовленные в соответствии с примерами 5, 11 и 12, были использованы как образцы для сравнительного изучения их профилактической активности при экспериментальной гриппозной инфекции у мышей.

С целью сравнения биологической активности препаратов с прототипом (при инъекционном применении) в качестве контроля приготовлены трубодисперсные препараты по примерам 11 и 2 (по аналогии с прототипом).

Использовали вирус гриппа штамм A/Aichi/2/68 (H3N2), полученный из Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, прошедший 12 пассажей на мышах и два на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). В экспериментах использовали вирусаллантоисную жидкость, полученную путем культивирования вируса гриппа на 9-11-суточных РКЭ, с биологической концентрацией вируса 10⁸ - 10⁹ 50% эмбриональных инфицирующих доз (ЭИД₅₀) в 1 мл. Вирусные препараты до проведения исследований хранили при температуре минус 12^oС.

Эксперименты проведены на беспородных мышах обоего пола массой 15-17 г (не имеющих антител к вирусу гриппа А).

Заражение животных вируссодержащим аэрозолем проводили при температуре 20-24^oС и относительной влажности 50-70% на установке, в состав которой входили: Распылитель для вируссодержащих суспензий типа Collison [l2], работающий при избыточном давлении 0,8 - 1,0 атм при расходах воздуха 16 л/мин и суспензии 0,1 мл/мин и создающий аэрозоль с медианно-массовым аэродинамическим диаметром частиц 1,1 мкм ((_g = 2,1). Аэрозольный дозатор, позволяющий плавно уменьшать концентрацию аэрозоля от 1:1 до 1:100.

Малая динамическая камера для 20 мышей [13] со скоростями воздушных потоков до 2 м/с при неравномерности концентрации аэрозоля в объеме камеры не более 10%.

Пробоотборные устройства: импинджер со скоростью отбора воздуха 10 л/мин и объемом сорбирующей жидкости 10 мл [12] для определения концентрации вируса в аэрозоле (состав сорбирующей жидкости: раствор Хенкса с 2% по объему сыворотки крупного рогатого скота, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг стрептомицина); четырехкаскадный импактор конструкции, аналогичной прибору Андерсена для биологического пробоотбора [14] с объемным расходом 25 л/мин для анализа дисперсного состава аэрозолей препаратов и вируссодержащих аэрозолей.

При изучении аэрозольной активности вируса для животных определяли экспонирующую дозу (DE) по формуле DE=CбTW, где Сб - биологическая концентрация вируса в аэрозоле (в lоgЭИД₅₀/л).

Специфичность гибели подопытных животных определяли по гемагглютинирующей активности аллантоисной жидкости, взятой из РКЭ, инокулированных суспензией гомогената легких павших животных.

50%-ные аэрогенные летальные дозы (АЛД₅₀) рассчитывали по модифицированному методу Ван дер Вардена [15], используя значения экспонирующих доз.

Препараты вводили животным внутримышечно по 0,1 мл каждого препарата (по 1000 мкг на голову или примерно 60 мг/кг веса животного) или раствора Хенкса за 2 суток до заражения вирусом. Заражение мышей проводили аэрогенным способом, используя по 5 животных на дозу.

В таблице 2 приведены результаты оценки профилактической противогриппозной активности препаратов на основе полипренолов пихты сибирской при инъекционном применении с целью сравнения протективной активности препаратов с прототипом.

Таким образом, достоверным защитным противогриппозным действием при инъекционном применении обладал только препарат типа грубой эмульсии с крупными размерами мицелл (пример 12). Высокодисперсный препарат по примеру 5 (микроэмульсия) не проявлял сколько-нибудь заметной профилактической активности. В то же время препарат по примеру 11, занявший промежуточное положение по размерам мицелл, не обладал достоверным профилактическим действием при гриппозной инфекции.

Сравнение с прототипом.

В прототипе анализировали протективное действие препаратов на основе полипренилалкаголей при внутримышечном введении препаратов при инфекции, вызываемой Е. coli (при подкожном способе инфицирования животных). Показано, что лучшие препараты при дозах 50 мг/кг веса защищали до 50-60% животных от дозы примерно 6 LD₅₀ этой инфекции.

При гриппозной инфекции из испытанных препаратов контроли примеров 11 и 12 имитировали по своим физико-химическим характеристикам прототип (грубая эмульсия). Из них препарат по примеру 12 защищал 40% животных от примерно такой же аэрозольной дозы вируса гриппа при введении животным в количестве примерно 60 мг/кг их веса. В то же время препарат 11 (стабилизированный лецитином по аналогии с прототипом), занявший промежуточное положение по размерам мицелл, не обладал достоверным профилактическим действием при гриппозной инфекции.

Таким образом, как и в прототипе, достоверным защитным противогриппозным действием при инъекционном применении обладал препарат типа грубой эмульсии с крупными размерами мицелл (пример 12). Препараты ППР, приготовленные с применением неионогенных ПАВ в виде тонкой эмульсии (пример 5), не проявляют защитного действия при внутримышечном введении. Это также полностью согласуется с примерами и результатами, приведенными в прототипе, где отмечено, что использованный в качестве одного из вариантов неионный солюбилизатор НСО-60 (обеспечивающий получение микроэмульсий) не оказывает защитного действия при внутримышечном введении.

Препараты, приготовленные в соответствии с примерами 1-10, и прототип проявляют общие закономерности (в зависимости от характеристик эмульсии) и близкое по величине защитное действие при внутримышечном введении (несмотря на существенное различие заболеваний, вызываемых вирусом гриппа и Е.coli, и некоторые различия в составе эмульгаторов). Это свидетельствует о близких значениях биологической активности полипренолов пихты сибирской и синтетических полипренилалкаголей прототипа, а также о возможности количественного сравнения биологической активности разработанных препаративных форм и прототипа.

Пример 15. Оценка профилактического действия препаратов ППР при аэрозольном их применении на животных, аэрогенно инфицированных вирусом гриппа.

Препараты, приготовленные в соответствии с примерами 5, 6 и 11, 12, были использованы как образцы для сравнительного изучения их профилактической активности при аэрозольном применении против экспериментальной гриппозной инфекции у мышей.

Препарат по примеру 11 - стабильная эмульсия с субмикронными мицеллами и примесью крупных частиц.

Препарат по примеру 12 - полидисперсная нестабильная эмульсия с размерами частиц до 10 мкм.

Препарат по примеру 5 - стабильная ультраэмульсия с мицеллами диаметром около 0,2 мкм.

Препарат по примеру 6 - стабильная ультраэмульсия с мицеллами диаметром менее 0,1 мкм.

Использовали вирус гриппа штамм A/Aichi/2/68 (H3N2), подробно описанный выше.

Эксперименты проведены на беспородных мышах обоего пола массой 15-17 г (не имеющих антител к вирусу гриппа А).

Обработка мышей аэрозолями препаратов и вируса гриппа проводилась при температуре 20-24^oС и относительной влажности 50-70% на установке, в состав которой входил, кроме оборудования ранее описанного, еще и ингалятор ультразвуковой "Вулкан-1" для диспергирования препаратов, обеспечивающий расход аэрозоля до 30 л/мин и расход распыляемого препарата до 3 мл/мин. С помощью такого ингалятора создавали аэрозоль, 85% по массе которого составляли частицы с ММАД от 0,8 до 2 мкм.

Для определения весовой концентрации аэрозоля использовали водорастворимую флуоресцентную метку - флуоресцеин натрия (уранин). Интенсивность флуоресценции уранина измеряли при _фп = 520 нм (возбуждение при _возб = 472 нм).

Аэрозольная доза препаратов на основе полипренолов пихты сибирской, полученная мышами (DEp), оценивалась по формуле DEp = CпTW, где Сп - концентрация аэрозоля препаратов в камере (в мкг/л), Т - время экспонирования животных (в мин), W - минутный дыхательный объем мыши (л/мин) - 15 мл/мин, вычисленный по данным, приведенным в работе Guyton A.C. [16].

Оценку 50%-ных аэрогенных летальных доз (АЛД₅₀) и специфичности гибели животных проводили так же, как описано выше.

Эффективность профилактического действия препаратов на основе полипренолов пихты сибирской при гриппозной инфекции определяли по доле выживших животных.

Обработку мышей аэрозолями препаратов проводили различными дозами за 3 и/или 1 день до инфицирования аэрозолем вируса гриппа. Данные по дозам препарата, полученного животными, и по их выживаемости после инфицирования вирусом гриппа суммированы в таблице 3. Наибольшим защитным эффектом обладают аэрозоли препарата, приготовленного в виде микроэмульсии (препарат 5): в 4 из 8 изученных схем применения препарата выживаемость животных превысила 75% (при этом в одном случае она достигла 100%).

Аэрозольную обработку животных препаратом 6 проводили, варьируя величины доз и схемы применения препарата (первая обработка за 3-9 и/или вторая обработка за 1-6 дней до заражения). При больших дозах двукратного аэрозольного введения препарата 6 (первое - 4,56-9,6 мкг/мышь и второе 6 мкг/мышь) достоверное защитное действие при гриппозной инфекции достигается при увеличении интервала времени между второй обработкой препаратом и инфицированием (до 3 сут).

В то же время при применении малых доз препарата (1,4 и 1,4 мкг/мышь в первую и вторую обработку) профилактический эффект обнаруживается при заражении животных через 1 сутки после второй обработки.

Таблица 3 характеризует защитный эффект препаратов ППР в аэрозольной форме при аэрозольном заражении мышей вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) в дозах 1 - 5 LD₅₀.

Анализ таблицы 3 показывает, что принципиальное преимущество имеют образцы 5 и 6, представляющие собой мелкодисперсные препараты - микроэмульсию с размерами мицелл около 0,2 и менее 0,1 мкм соответственно (по сравнению с препаратами 11 и 12, имеющими более крупный размер мицелл). Наиболее выраженный защитный эффект при использовании препарата 5 наблюдался при двукратном его введении с интервалом 48 часов 5,4 и 3,6 мкг/мышь за 1 сутки до заражения, а препарат 6 - при тех же условиях применения 1,4 и 1,4 мкг/мышь.

Применение грубых эмульсий (препараты 11 и 12) нецелесообразно также из-за меньшей эффективности перевода в аэрозоль и увеличенного расхода препарата для получения требуемой терапевтической дозы в легких.

Таким образом, препараты на основе полипренолов пихты сибирской обеспечивают высокую протективную активность при аэрозольном способе доставки животным при введении в дозах примерно в 100 раз меньших, чем при внутримышечном введении, с обеспечением надежной профилактической зашиты от респираторных вирусных инфекций.

Источники информации 1. Григорьева Н. Я., Моисеенков А.М. Физиологическая активность полиизопреноидов (обзор патентных данных) //Хим.-фарм. журн., 1989, 2.-с. 144-155.

2. Araki S., Kagaya K., Kitoh К., Кimura М., Fukazawa Y. Enhancement of resistance to Escherichia coli infection in mice by dihydroheptaprenol, a synthetic polyprenol derivative //Infect. Immunol.- 1987.- Vol.55, N.9.- P. 2164-2170.

3. Iida J. , Ishihara C., Mizukoshi N. et al. Prophylactic activity of dihydroheptaprenol, a synthetic polyprenol derivative, against Sendai virus infection in mice // Vaccine. - 1990. - Vol.8, N4. - Р.376-380.

4. Ibata K., Mizuno M., Tanaka Y., Kageyu A. Long-chain polyprenoles in the family of Pinaceae. //Phytochemistry. 1984. Vol.23, No.4, pp.783-786.

5. Ралдугин В.А. Полипренолы древесной зелени пихты сибирской: использование сжиженного диоксида углерода в новом способе их выделения //Химия в интересах устойчивого развития. 1997. N 5. С. 75-77.

6. Патент ЕР 0 239 729 В1 Koyama N., Ikeuсhi Т., Araki S., Kioth K., Ida К. Polyprenol alcohol-containing injections and use thereof.

7. Слоним И.Я. Определение размера частиц по светорассеянию. Формулы и номограммы для расчета радиуса частиц по оптической плотности и по интенсивности рассеянного света //Оптика и спектроскопия. 1960. - том 8. ВЫП.1. - С.98-108.

8. US Potent (Патент США 5280048) в,г - Dihydropolyprenyl alkohol derivatives and pharmaceutical composition containing a polyprenyl compound.

9. Патент 2005475 C1, МКИ А 61 К 31/21 (RU). Противовирусное средство.

10. Патент ЕР 0166436 А2. Use of dolichol or its ester in medicines.

11. Патент 4839389 (США). Polyprenyl alcohol-containing injections.

12. Гапочко К.Г., Мисников О.П., Раевский К.К. Средства и методы изучения микробных аэрозолей. Л.: Медицина, 1985.

13. Сергеев А. Н. , Пьянкова О.Г., Булычев Л.Е. и др. Чувствительность белых мышей к вирусу гриппа (А/АИЧИ/2/68) при аэрогенном заражении //Вопр. вирусол. - 1999. - 2. С. 69-71.

14. Gliffiths W. D., Dc Cosemo G.A.L. The assessment of bioaerosols. A critical review //J. Aerosol Sci. - 1994. - Vol. 25, N 8. - P. 1425-1458.

15. Ашмарин И. П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Гос. изд. ме