Химические соединения

Химические соединения

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины, в частности онкологии. Сущность изобретения составляют улучшенные системы направленной терапии опухолей с использованием фермента и пролекарственного соединения, а в частности антитело-опосредованной терапии с использованием фермента и пролекарственного соединения (ADEPT). В системе используемый фермент представляет собой мутированную форму фермента клетки-хозяина, где натуральный фермент клетки-хозяина, такой как рибонуклеаза, располагает свой натуральный субстрат посредством взаимодействия пары ионов. При этом в данной системе мутированного фермента и комплементарного пролекарственного соединения это взаимодействие является обратным (т.е. обратной полярности). Техническим результатом изобретения является расширение арсенала противоопухолевых средств. 9 с. и 11 з.п. ф-лы, 33 ил.

Изобретение относится к антителоопосредованной терапии с использованием фермента и пролекарственного соединения (ADEPT), где указанным ферментом является мутантная форма натурального фермента хозяина, а в частности, мутантная форма рибонуклеазы.

Конъюгирование лекарственного средства для селективного цитолиза раковых клеток у пациента длительное время представляло серьезную проблему для медицинских исследований. Терапия ADEPT является одним из способов решения этой проблемы. В АDЕРТ используется опухолеспецифическое антитело, конъюгированное с ферментом. Этот конъюгат, введенный пациенту (обычно внутривенно), локализуется в опухолевом участке (или участках) и высвобождается из общего кровотока. Затем пациенту вводят пролекарство, которое под действием фермента (локализованного в опухолевом участке) превращается в цитотоксическое лекарственное средство, вызывающее цитолиз опухолевых клеток. Поскольку одна молекула фермента может катализировать продуцирование многих молекул цитотоксического лекарственного средства, то в этом процессе имеет место эффект амплификации. Кроме того, опухолевые клетки, не отображающие на своей поверхности антиген, распознаваемый антителом (обычно опухоли обнаруживают микрогетерогенность), также подвергаются цитолизу под действием ферментативно амплифицированной генерации цитотоксического лекарственного средства. В известной системе (см. WО 88/07378), в качестве ферментного компонента используется прокариотическая карбоксипептидаза G2 (CPG2). Недостаток систем, использующих прокариотические ферменты, заключается в том, что нормальная кишечная флора может содержать прокариотические организмы, способные стимулировать продуцирование неселективного цитотоксического лекарственного средства.

Другой недостаток известных систем заключается в том, что повторное введение конъюгата приводит к иммунному ответу хозяина, и тем самым, к снижению эффективности терапии. В качестве антитела в указанном конъюгате обычно используется мышиное моноклональное антитело, которое, в целях снижения иммуногенности, может быть "очеловечено" с применением известной техники. Однако снижение иммуногенности ферментного компонента является более проблематичным. Это можно объяснить тем, что этот ферментный компонент не должен присутствовать в кровотоке человека в естественных условиях, поскольку, в противном случае, происходило бы преждевременное превращение пролекарства в цитотоксическое лекарственное средство, и селективной токсичности по отношению к опухолевым клеткам не наблюдалось бы. В работе Акzо WО 90/02939 было предложено использовать для ADEPT ферменты человека, селективность которых обеспечивалась выбором такого фермента человека, который не присутствует в кровотоке, например, лизоцима. В указанной работе Akzo в качестве фермента был выбран лизоцим, и поскольку по своей природе он требует определенного субстрата [т. е., будучи по своей природе эндогликозидазой, он катализирует гидролиз полимера N-ацетилглюкозамина с _1-4-связями (NАG-хитин)], то авторы этой работы были вынуждены продуцировать пролекарственное соединение, содержащее указаные функциональные группы. Кроме того, чтобы предупредить прохождение в клетки, они разработали олигомер с тауриновыми остатками, содержащими сульфоновые кислоты, что предупреждает проникновение в клетки, а поэтому снижает цитотоксичность в 20 раз (Фиг.13, в WО 90/02939).

Использование фермента млекопитающего, такого как щелочная фосфатаза (Senter и др., патент США 4 975 278) или фермента человека, такого как бета-глюкуронидаза (Behringwerke, DE 42336237) или лизоцим (Akzo, WO 90/07929) для ADEPT имеет то преимущество, что такие ферменты, по сравнению с ферментами, не происходящими от млекопитающих, имеют низкую иммуногенность или вообще не являются иммуногенными. Недостаток в использовании фермента млекопитающего или человека заключается в том, что этот фермент эндогенно присутствует в организме пациента, а поэтому, потенциально, он может катализировать превращение предшественника в лекарственное соединение, не обусловленное введением конъюгата "антитело - фермент". Очевидно, что использование таких ферментов для АDEPT приводит к повышенной токсичности. Так, например, неактивная форма лекарственного средства для щелочной фосфатазы быстро превращалась в его активную форму у мышей (Doyle T.W., Vyas D.M., Cancer Treatment Reviews, 17, 127-131, 1990) и у человека (Hande et al., Clinical Pharmacology and Therapeutics 53, 233, 1993) без какого-либо введения конъюгата, лишь благодаря тому, что щелочная фосфатаза является широко распространенным эндогенным ферментом, что свидетельствует о серьезной проблеме, возникающей в связи с использованием этого фермента. В настоящее время какие-либо данные о предшественниках лекарственного средства для бета-глюкуронидазы человека или лизоцима отсутствуют. Глюкуронидаза и лизоцим присутствуют в плазме и других тканях. В работе Акzо сообщается, что лизоцим присутствует в молоке, слезах, слюне, селезенке, лейкоцитах и моноцитах. В работе DE 4236237 (Beringwerke) сообщается, что активированные макрофаги, гранулоциты и тромбоциты секретируют глюкуронидазу. Поскольку эти клетки широко распространены во всех тканях организма, то это может приводить к нежелательной активации предшественника лекарственного средства. Действительно, в работе Behringwerke показано, что у мышей, после введения пролекарства Дозоксорубицина, накапливаются относительно высокие уровни свободного лекарственного средства в селезенке, которая богата указанными клетками (см. Таблицу 3 в DЕ 4236237).

Использование ферментов человека в указанном методе ADEPT ограничено тем, что в нем могут быть использованы лишь ферменты с преобладающим внутриклеточным распределением, и тем, что предшественники лекарственного средства, которые используются вместе с этими ферментами, должны находиться вне клеток для минимизации токсичности. Эти условия значительно ограничивают возможные варианты получения АDЕРТ-системы. Лизоцим, хотя и является небольшим ферментом, не подходит для АDЕРТ. Лизоцим высвобождает не активное лекарственное средство, а его производное с неизвестной фармакологической активностью. В примере, приведенном в работе Аkzo, высвобождается не свободный дезоксорубицин, a Dox-(GlcNAc)₁ или Dox-(GlcNAc)₅. Сообщалось (Bosslet K. et al.. Cancer Ressearch 54, 2151-59, 1994), что глюкуронидаза способствует высвобождению активного лекарственного средства, например адриамицина, из глюкуронидного предшественника, и что это лекарственное средство обладает противоопухолевой активностью. Однако глюкуронидаза человека является высокомолекулярным ферментом (150-300 кДа), а поэтому полученный с ее помощью конъюгат имел бы слишком крупные размеры. Очевидно, что проникновение такого конъюгата в опухолевые ткани является весьма проблематичным, так как хорошо известно, что менее крупные белки быстрее проникают в твердые опухоли. Кроме того, глюкуронидаза подвергается гликозилированию, а гликозилирование приводит к быстрому выведению из кровотока конъюгата "антитело-глюкуронидаза", используемого в ADEPT. Быстрое выведение конъюгата из кровотока приводит к тому, что в опухолевом ксенотрансплантате локализуется небольшое количество конъюгата. Отсюда очевидно, что большая масса конъюгата в сочетании с его быстрым выведением из кровотока приводят к низкой локализации указанного конъюгата в опухоли пациента. Таким образом, глюкуронидаза не может рассматриваться как идеальный фермент для АDЕРТ.

Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что фермент хозяина (например, рибонуклеаза человека, которая представляет собой фермент, присутствующий в общем кровотоке человека в естественных условиях) может быть модифицирован таким образом, что он будет распознавать предшественника лекарственного средства, используемого для АDЕРТ-терапии, который в основном не распознается натуральным ферментом хозяина. Поскольку сконструированный фермент по своему аминокислотному составу обладает высокой степенью схожести с нативным ферментом хозяина, то он будет обладать значительно меньшей иммуногенностью, чем бактериальные ферменты, такие как CPG2. Кроме того, указанный сконструированный фермент не является натуральным ферментом, а поэтому неселективная активация предшественника лекарственного средства, которая происходит обычно под действием натуральной флоры или ферментами человека, будет значительно уменьшена. Рассматриваемый способ имеет то преимущество, что он может быть применен к широкому кругу хозяев-млекопитающих или человеку, поскольку используемые в этом способе ферменты не ограничены природным распределением ферментов хозяев, а поэтому может быть использовано пролекарственное соединение, которое проникает в клетки.

Об этих проблемах частично сообщалось в Международной патентной заявке WO 95/13095 (Wellcome Foundation), которая была опубликована после наиболее ранней даты приоритета настоящего изобретения. В этой заявке предложен метод ADЕРТ с использованием мутантных ферментов млекопитающих для активации предшественников лекарственных средств, которые не активируются соответствующим нативным ферментом, но метод, заявленный в настоящем изобретении, в этой заявке не раскрывается.

Совершенно неожиданно было обнаружено, что замена заряженного остатка, расположенного в сайте связывания или вблизи сайта связывания с субстратом или в каталитическом сайте фермента, остатком с противоположным зарядом, продуцирует мутантный фермент с интактным каталитическим центром; причем этот мутантный фермент отличается от нативного фермента лишь тем, что он обладает специфичностью к родственному, комплементарному, но противоположно заряженному субстрату.

Кроме того, в Wellcome раскрываются комбинации пролекарственного/лекарственного соединений (на основе метотрексата и мелфалана), выбор которых зависит от возможности блокады механизмов активного транспорта в целях предупреждения проникновения пролекарственного соединения в клетки. Зависимость от таких механизмов активного транспорта ограничивает диапазон выбора пролекарственных/лекарственных соединений. В противоположность этому метод, основанный на обратной полярности и раскрытый в настоящей заявке, позволяет выбрать параметры заряда пролекарственного соединения (которое может (или не может) также обладать способностью к активному транспорту) для блокирования проникновения пролекарственного соединения в клетку, и тем самым, позволяет применять настоящее изобретение к широкому диапазону вариантов пролекарственных/лекарственных соединений.

В соответствии с одним из своих аспектов настоящее изобретение относится к системе из двух соответствующих друг другу компонентов, разработанной в целях ее использования в определенном хозяине, и содержащей: (I) первый компонент, который представляет собой молекулу, обеспечивающую направленную доставку препарата к мишени и способную связываться с опухолеспецифическим антигеном; причем указанная молекула связана с мутированным ферментом, способным превращать пролекарственное соединение в противоопухолевое лекарственное средство; (II) второй компонент, который представляет собой предшественник лекарственного средства, способный под действием фермента превращаться в противоопухолевое средство; где: мутированный фермент представляет собой мутированную форму натурального фермента хозяина, распознающего свой натуральный субстрат посредством взаимодействия ионной пары; причем в системе мутированного фермента и комплементарного пролекарственного соединения это взаимодействие является обратным (с "обратной полярностью"); первый компонент является, в основном, неиммуногенным для хозяина; и второй пролекарственный компонент, в основном, не превращается в противоопухолевое средство в организме хозяина под действием натурального немутированного фермента хозяина.

Предпочтительной системой, описанной выше, является система, в которой первый компонент содержит мутированный фермент, полученный на основе фермента, происходящего от того же самого вида, что и хозяин, для которого предназначена эта система.

Предпочтительной системой, описанной выше, является система, в которой молекула, обеспечивающая направленную доставку, представляет собой антитело или его фрагмент. При этом предпочтительной является вышеописанная система, где в качестве фрагмента антитела служит F(аb')₂-фрагмент.

Предпочтительной системой, описанной выше, является система, в которой в качестве мутированного фермента используется мутированная рибонуклеаза. При этом, предпочтительно, если в вышеописанной системе мутированным ферментом является рибонуклеаза человека, содержащая отрицательно заряженную аминокислоту в положении 66. Причем, предпочтительно, чтобы такой отрицательно заряженной аминокислотой в положении 66 последовательности рибонуклеазы являлась Glu.

Другим предпочтительным вариантом системы, описанной выше, является система, в которой в качестве мутированного фермента используется мутированная глюкуронидаза.

В соответствии с другим своим аспектом настоящее изобретение относится к системе из двух соответствующих друг другу компонентов, предназначенной для введения хозяину, и содержащей: (I) первый компонент, который представляет собой молекулу, способную связываться с опухолеспецифическим антигеном и обеспечивать направленную доставку лекарственного соединения к нужной ткани; причем указанная молекула связана с мутированным ферментом, способным превращать пролекарственное соединение в противоопухолевое средство; (II) второй компонент, который представляет собой пролекарственное соединение, которое под действием фермента способно превращаться в противоопухолевое средство, где: указанный фермент представляет собой мутированную форму фермента хозяина; первый компонент является, в основном, неиммуногенным в организме хозяина; и указанное пролекарственное соединение, в основном, не может превращаться в противоопухолевое лекарственное средство в организме хозяина под действием натурального немутированного фермента хозяина.

Выражение "пролекарственное соединение, в основном, не может превращаться в противоопухолевое лекарственное средство в организме хозяина под действием натурального немутированного фермента хозяина" означает, что указанное пролекарственное соединение не оказывает нежелательного неспецифического действия после его введения хозяину.

Понятие "в основном, неиммуногенный" означает, что первый компонент может быть введен хозяину более, чем один раз без индуцирования какого-либо значительного иммунного ответа у хозяина, который наблюдается, например, у человека при введении ему мышиного антитела, связанного с бактериальным ферментом.

Предпочтительным мутированным ферментом является фермент, происходящий от того же вида, что и хозяин, для которого предназначена указанная система; однако, может быть также использован мутированный фермент, полученный на основании фермента, происходящего от другого вида, при условии что структура этого фермента является достаточно консервативной по отношению к структуре натурального фермента хозяина, а поэтому не вызывает нежелательного иммуногенного эффекта.

Предпочтительной молекулой, обеспечивающей доставку препарата в нужные ткани, является антитело, а в частности фрагмент антитела, например, такой, как F(аb')₂. Связывание этой молекулы с ферментом может быть осуществлено известными методами, например, путем использования гетеробифункциональных реагентов, таких как перекрестносшивающие агенты, либо путем слияния генов, либо каким-нибудь другим подходящим методом. Антитело может быть получено от того же самого хозяина (например, для мыши может быть использовано мышиное антитело), либо антитело может быть модифицировано таким образом, чтобы оно не распознавалось в выбранном хозяине, в основном, как чужеродное (например, для человека может быть использовано химерное, CDR-привитое или маскированное антитело).

Было показано, что трансплантация вариабельных доменов антител грызунов в константные домены антител человека (химерные антитела) и встраивание антиген-связыващих петель (СDR), происходящих от антител грызунов, в антитело человека (СDR-трансплантация) значительно снижали иммуногенность антител грызунов в предклинических исследованиях, проводимых на обезьянах, и с участием пациентов. При этом даже СDR-привитые антитела включают в каркас антитела человека большое число (> 50) аминокислот из последовательности антитела грызунов. Несмотря на это, у обезьян и у человека наблюдалось значительное снижение иммуногенности. Это свидетельствует о том, что мутация сильно ограничивает число аминокислот в каталитическом участке фермента человека и, очевидно, приводит к образованию фермента с минимальной иммуногенностью, которая, несомненно, ниже иммуногенности фермента, не являющегося ферментом хозяина (см. A. Mountain & J.R. Adair, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 10, 1-142, 1992; G. Winter & W.J. Harris, Trends in Pharmacological Sciences, 14, 139-143, 1993; I.I. Singer et al., J. Inmunol. 150, 2844-57, 1993; J. Hakimi et al., J. Inmunol., 147, 11352-59, 1991; J.D. Isacs et al., The Lancet, 340, 740-752, 1992.

Домены константной области могут быть, например, доменами иммуноглобулинов IqA, IqE, IgG или IgM человека. При этом предпочтительными являются IgG2 и IgG3 человека (особенно IgG2), но могут быть также использованы изотипы IgG1 и IgG4. Человеческие антитела per se могут быть также использованы, так как они были генерированы в мышах, полученных в целях продуцирования человеческих антител.

Мутация фермента хозяина (которая может быть осуществлена любым способом, например, путем химического или биотехнологического генного синтеза, либо путем сайт-направленной мутации) приводит к изменению типа взаимодействия между активным центром фермента и пролекарственным соединением по сравнению с нативным ферментом хозяина.

При этом, предпочтительно, чтобы после мутации фермента изменялась его полярность в активном центре, так, чтобы он катализировал превращение пролекарственного соединения с комплементарной полярностью и чтобы указанное пролекарственное соединение, в основном, не подвергалось превращению под действием немутированного фермента хозяина. Предпочтительно также, чтобы натуральный фермент хозяина распознавал свой натуральный субстрат посредством взаимодействия пары ионов и чтобы такое взаимодействие в системе мутированного фермента и комплементарного пролекарственного соединения было обратным. Предпочтительным ферментом является мутированная рибонуклеаза, в частности, рибонуклеаза человека с обратной полярностью (см. Фиг.12-15).

В рибонуклеазе человека лизин 66 является положительно заряженным остатком, который взаимодействует с отрицательно заряженными фосфатными группами, присутствующими на натуральном РНК-субстрате для данного фермента. Полярность этого остатка может быть изменена на обратную, например, методами генной инженерии (а также методами химического синтеза) с получением отрицательно заряженного остатка, такого как глутаминовая кислота. Полученный в результате фермент с "обратной полярностью" распознает пролекарственное соединение настоящего изобретения, которое обычно не распознается немутированным ферментом хозяина. Кроме того, для оптимизации связывания с субстратом и изменения свойств фермента можно провести дополнительные модификации остатков в области нативных участков фермента. Преимущество рибонуклеазы заключается в ее низкой молекулярной массе (приблизительно 13600 Да), что способствует хорошему ее проникновению в опухолевые ткани после введения, и достаточной устойчивости к тепловому стрессу и протеолизу. Предпочтительным пролекарственным соединением является ипритсодержащий рибонуклеотид Формулы 1 (см. Фиг.11), где: Q обозначает О или NН (предпочтительно NН); А представляет группу формулы -Х-Y-, где: Y является SO₂ или простой связью (предпочтительно СО) при условии, что если Q является кислородом, то Y не является SO₂; Х является -(СН₂)_n, где n= 1-4 (предпочтительно n=1, за исключением случая, когда Y является простой связью, и в этом случае n предпочтительно равно 2); при этом Х необязательно замещен _1-4 алкилом на любом атоме углерода (при этом предусматривается, что любой хиральный атом присутствует в R и/или S-конфигурациях); либо если Y является СО и n=1, то Х необязательно замещен на атоме углерода боковой цепью аланина, валина, лейцина, изолейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, серина, треонина, цистенина, аспарагина, глутамина, лизина, аргинина или гистидина (при этом предусматривается, что любой хиральный атом присутствует в R- и/или S-конфигурации); R1 обозначает урацил или цитозин, как показано на фиг.11; R2 и R3 независимо представляют Н или С_1-4 алкил (предпочтительно метил, а особенно R²-R³=H); R5 и R6 независимо представляют Сl, мезил или тозил (а предпочтительно R5=R6=Cl); R7, R8, R9 и R10 независимо представляют Н, С_1-4 алкил (предпочтительно метил), С_1-4алкокси (предпочтительно метокси), F или Сl (предпочтительно С1), при этом предпочтительными положениями для указанных радикалов, не обозначающих Н, являются R8 и R9, но особенно предпочтительно, когда R7=R8= R9=R10=H.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, "мустард"-рибонуклеотид является соединением, в котором: Q является NH; Х является -(СН₂)_n, где n=1-4; Y является -С(О)-; R1 является урацилом или цитозином; R2 и R3 являются Н; R5 и R6 являются С1; и R7, R8, R9 и R10 являются Н; или его соль.

Особенно предпочтительным является следующее соединение: Q - (2R, 3S, 4R, 5R)-2-(2-аминоацетамидометил)-5-(2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-пиримидин-1-ил)4-гидрокси-2,3,4,5-тетрагидрофуран-3-ил]-Q-4-(бис[2-хлорэтил]амино) фенокси]би-фосфат, который в качестве конечного продукта показан на Фиг.7.

Другим предпочтительным соединением является цитозиновый аналог конечного продукта, показанного на Фиг.7.

В настоящем описании общий термин "алкил" означает алкильную группу с прямой и разветвленной цепью. Oднако при ссылке на отдельные алкильные группы, такие как "пропил", подразумевается лишь алкильная группа с прямой цепью, а при ссылке на такие группы, как "изопропил", подразумевается лишь алкильная группа с разветвленной цепью. Аналогичные определения могут быть сделаны и в отношении других общих терминов.

При этом следует отметить, что поскольку соединения Формулы 1 могут, как известно, существовать в оптически активной или рацемической форме благодаря наличию у них одного или нескольких ассиметрических атомов углерода, то настоящее изобретение также включает в себя любые из таких оптически активных или рацемических форм, являющихся субстратами для мутантных ферментов настоящего изобретения.

Синтез оптически активных форм может быть осуществлен методами органической химии, хорошо известными специалистам, например, путем синтеза из оптически активных исходных соединений либо путем разделения рацемической формы. Аналогичным образом субстратные свойства соединения по отношению к мутантным ферментам могут быть оценены с помощью стандартной лабораторной техники.

Точечные мутации будут обозначаться в настоящем описании следующим образом: натуральная аминокислота (при этом используется 1-буквенная номенклатурная аббревиатура), положение, новая аминокислота. Так, например, "D253К" означает, что аспарагиновая кислота (D) была заменена лизином (К) в положении 253. Множественные мутации в одном ферменте будут указаны в квадратных скобках.

В настоящем описании термин СРВ означает: i) зрелую, про- и препро-формы фермента с метками или без меток (например, с-mус); ii) любую карбоксипептидазу, обладающую специфичностью к пептидным субстратам, имеющим Lys или Аrg на С-конце; iii) ферменты СРВ поджелудочной железы и плазмы (при этом предпочтительным является фермент поджелудочной железы), если это не указано особо и если это само не очевидно из контекста.

Мутантными СРВ настоящего изобретения являются мутанты любого из вышеуказанных СРВ, имеющие свойства, необходимые для осуществления настоящего изобретения. При этом предпочтительными являются следующие мутанты НСРВ поджелудочной железы: D253K, D253Р, а особенно G251N.D253Р; а также мутанты других СРВ с соответствующими мутациями. Мутантный СРВ настоящего изобретения может также содержать другие "консервативные" мутации (инсерции, замещения и/или делеции), которые, в основном, не влияют на свойства ключевой мутации. Консервативным аминокислотным замещением, используемым в целях настоящего изобретения, является такое замещение, о котором можно сказать, что вероятность его осуществления в природе более чем в 10 раз превышает вероятность случайного возникновения такого замещения (определяемого компьютерными методами, описанными Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 1971, pp. 95-96, и Фиг.9 - 10).

Упоминание о СРВ можно найти в следующей литературе: Folk J.E. в "The Enzymes Vol. 111, Academic Press (1971), pp. 57; Coll M. et al. (1991) EMBO Journal 10, l-9; Eaton D D.L. et al. (1991) J. Biol Chem. 266, 21833-21838; Yamamoto K. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 2575-2581; патент США 5364934 (Genentech) и Международная патентная заявка WO 95/14096 (Eli Lilly).

Соединения настоящего изобретения могут образовывать соли с различными неорганическими и органическими кислотами и основаниями, которые также входят в объем настоящего изобретения. Такими солями являются соли аммония, соли щелочных металлов, такие как натриевые и калиевые соли, соли щелочно-земельных металлов, такие как соли кальция и магния; соли, образованные органическими основаниями, например, дициклогексиламиновые соли, N-метил-D-глюкаминовые соли, соли, образованные аминокислотами, такими как аргинин, лизин; и т. п. Могут быть также получены соли с органическими и неорганическими кислотами, такими, как, например, НСl, НВr, Н₂SO₄, Н₃РO₄, метансульфоновая, толуолсульфоновая, малеиновая, фумаровая и камфорсульфоновая кислота. При этом предпочтительными являются нектоксичные физиологически приемлемые соли, хотя для выделения или очистки продукта могут быть также использованы и другие соли.

Указанные соли могут быть получены стандартными методами, например, путем проведения реакции продукта, взятого в форме свободной кислоты или свободного основания, с одним или несколькими эквивалентами соответствующего основания или кислоты в растворителе или среде, в которой данная соль является нерастворимой, либо в таком растворителе, как вода, который может быть затем удален в вакууме, либо путем лиофилизации, либо путем обмена катионов имеющейся соли на другие катионы, присутствующие на соответствующей ионообменной смоле. Соединения настоящего изобретения могут быть также использованы в композициях, таких как таблетки, капсулы или эликсиры для перорального введения; суппозитории для ректального введения; стерильные растворы или супензии для парентерального или внутримышечного введения и т.п.

Соединения настоящего изобретения могут быть введены пациентам (животным или человеку), нуждающимся в таком лечении, в дозах, обеспечивающих оптимальный фармацевтический эффект. Эти дозы могут варьироваться в зависимости от природы и тяжести заболевания, веса и режима питания пациента, сопутствующего лечения и других факторов, хорошо известных специалистам; однако, в основном, соединения настоящего изобретения могут быть введены в количестве от около 1 до 4000 мг в день в виде одноразовой или дробной дозы. Предпочтительная доза для одного пациента составляет в пределах от около 100 до 4000 мг в день, а более предпочтительно от около 500 до 3000 мг в день.

При лечении рака наиболее эффективный способ и схема введения конъюгатов и пролекарственных соединений настоящего изобретения зависят от ряда факторов, таких как тяжесть заболевания, состояние здоровья пациента, а также его восприимчивость к данному лечению, и должны быть установлены лечащим врачом. В соответствии с этим дозы конъюгатов и пролекарственных соединений должны быть подобраны для каждого конкретного пациента. Тем не менее эффективная доза конъюгата может составлять в пределах от 20 до около 200 мг/м². Эффективная доза пролекарственного соединения зависит от конкретно используемого лекарственного средства и его токсичности. Поскольку пролекарственное соединение является менее токсичным, чем исходное лекарственное вещество, то отправной точкой должна служить максимально переносимая доза (MTD), если, конечно, она известна. При использовании пролекарственных соединений на основе фенолхлорэтиламинов, где клинические данные относительно лекарственного вещества отсутствуют, трудно установить точную терапевтическую дозу, и для ее установления необходимо провести токсикологические исследования in vivo с использованием стандартной методики, а также исследования по расширению диапазона доз для пациентов, начиная с низкой дозы. Однако, в основном, терапевтическая доза составляет в пределах от 500 до 2000 мг/м².

Разумеется, при необходимости, эти диапазоны доз могут быть скорректированы для получения суточной разделенной дозы, причем, как указано выше, эта доза может варьироваться в зависимости от природы и тяжести заболевания, веса и режима питания пациента и других факторов.

Описанные комбинации могут быть использованы для получения фармацевтических композиций, описанных ниже.

Для изготовления унифицированной лекарственной формы в соответствии с общепринятой фармацевтической практикой около 1-100 мг соединения или смеси соединений Формулы 1 или их фармацевтически приемлемой соли смешивают с физиологически приемлемым наполнителем, носителем, разбавителем, связующим, консервантом, стабилизатором, ароматизатором и т.п. Активное соединение в этих композициях или препаратах присутствует в количествах, соответствующих вышеуказанным диапазонам доз.

Примерами адъювантов, которые могут быть введены в таблетки, капсулы и т. п., являются связующие агенты, такие как трагакантовая камедь, аравийская камедь, кукурузный крахмал или желатин; наполнители, такие как микрокристаллическая целлюлоза; дезинтегрирующие агенты, такие как кукурузный крахмал, крахмал, набухающий в холодной воде, альгиновая кислота и т.п., замасливатель, такой как стеарат магния; подслащивающий агент, такой как сахароза, лактоза или сахарин; ароматизирующий агент, такой как перечная мята, винтергреновое масло или вишневое масло. Если лекарственная форма представляет собой капсулу, то помимо вышеуказанных компонентов она может содержать жидкий носитель, такой как жирное масло. Для модификации физической формы унифицированного лекарственного препарата могут быть использованы другие различные материалы в качестве покрытия. Так, например, таблетки могут быть покрыты шеллаком, сахаром или тем и другим. Сироп или эликсир может содержать активное соединение, сахарозу в качестве подслащивающего агента, метил- и пропилпарабены в качестве консервантов, а также краситель и ароматизирующие агенты, такие как вишневая или апельсиновая отдушка.

Стерильные композиции для инъекций могут быть изготовлены в соответствии со стандартной фармацевтической практикой, например, путем разбавления или суспендирования активного вещества в наполнителе, таком как вода для инъекций; натуральном растительном масле, таком как кунжутное масло, кокосовое масло, арахисовое масло, масло из семян хлопчатника и т.п., или в синтетическом жирном наполнителе, таком как этилолеат или т.п. Если необходимо, то могут быть также введены буферы, консерванты, антиоксиданты и т.п.

В соответствии с другим своим аспектом настоящее изобретение относится к вышеописанной системе, используемой в способе подавления роста опухолевых клеток в организме хозяина, где указанный способ предусматривает введение указанному хозяину эффективного количества первого компонента; выделение значительного количества первого компонента из общего кровотока; и введение эффективного количества второго компонента. Введение указанных компонентов осуществляют предпочтительно внутривенно.

В соответствии с другим своим аспектом настоящее изобретение относится к способу подавления роста опухолевых клеток в организме хозяина, предусматривающему введение указанному хозяину эффективного количества первого компонента, определенного выше; выведение первого компонента из общего кровотока хозяина; и введение эффективного количества второго компонента, определенного выше.

В соответствии с другим своим аспектом настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей эффективное локализующееся в опухоли количество первого компонента, определенного выше, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. При этом предпочтительной является композиция, пригодная для внутривенного введения. Первый компонент предпочтительно получают в виде сухого твердого вещества, которое затем, непосредственно перед использованием, разбавляют подходящим разбавителем.

В соответствии с другим своим аспектом настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей эффективное противоопухолевое количество второго компонента, определенного выше, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. При этом предпочтительной является композиция, пригодная для внутривенного введения. Второй компонент получают предпочтительно в виде сухого твердого вещества, которое затем, непосредственно перед использованием, разбавляют подходящим разбавителем.

В соответствии с другим своим аспектом настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей первый компонент, определенный выше.

В соответствии с другим своим аспектом настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, определенной выше.

Фармацевтические композиции являются предпочтительно стерильными (т.е. пригодными для внутривенного введения).

В соответствии с другим своим аспектом настоящее изобретение относится к первому компоненту, определенному выше.

В соответствии с другим своим аспектом настоящее изобретение относится к мутированному ферменту, определенному выше.

В соответствии с другим своим аспектом настоящее изобретение относится к плазмиде pQR162. В соответствии с Будапештским договором указанная плазмида была депонирована 16 августа 1994 г. под номером NCIMB 40678 В NCIMB Limited, 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 IRY, Scotland, UK.

Согласно Будапештскому договору Е. coli MSD 1646, содержащая плазмиду pCG330 (известную также как р1С11698), была депонирована 23 ноября 1994 г. в Национальной коллекции промышленных и морских бактерий (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Scotland, Великобритания (UK) AB2 1RY под номером допуска NCIMB 40694. Бактерия С1МВ 40694 является другим аспектом настоящего изобретения.

Согласно Будапештскому договору антитело А5В7 было депонировано как гибридома под номером 93071411 14 июля 1993 г. в EСАСС, PHLS Centre for Applied Microbiology & Research, Portion Dow, Salisbury, Wiltshire SP4 OJGY, UK.

При этом предпочтительным является "очеловеченное" антитело А5В7 в виде F(ab')₂-фрагмента.

Другие антитела, используемые в ADЕРТ, описаны ниже. Антитело В BW431/26 было описано Haisma Z.J. и др. в Cancer Immunol. Immunother., 34: 343-348 (1992). Антитела L6, 96.5 и 1F5 были описаны в Европейском патенте 302 473. Антитело 16.88 было описано в Международной патентной заявке WO 90/07929. Антитело В72.3 было описано в Европейском патенте 392745. Антитело СЕМ231 было описано в Европейском патенте 382411. Антитела HMPG-1 и HMPG-11 (Unipath Ltd. Ba