2189254 - Вакцины против вирусов гепатита

Вакцины против вирусов гепатита

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и генной терапии и касается вакцины против вирусов гепатита. Сущность изобретения включает молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержит неполный геном слитых вирусов гепатита С и гепатита В или неполный геном вируса гепатита С, включающие нуклеотидную последовательность, кодирующую полный коровый белок гепатита С и S-генный белок гепатита В, или неполный вирусный геном гепатита С, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую полный коровый белок гепатита С, операбельно соединенную с регуляторными элементами, функциональными в человеческих клетках. Описываются также фармацевтические композиции, содержащие такие конструкции. Преимущество изобретения заключается в создании генных конструкций, которые могут быть эффективны для защиты против вирусов гепатита В и/или гепатита С. 8 с. и 6 з.п.ф-лы, 3 ил.

Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к генным конструкциям, которые пригодны в качестве компонентов вакцин против вируса гепатита С в протоколах генетической иммунизации, к способам защиты индивидуумов от заражения вирусом гепатита С, к способам лечения индивидуумов, страдающих от заражения вирусом гепатита С, к рекомбинантным химерным генным конструкциям, которые полезны в качестве компонентов вакцин против вируса гепатита В и/или вируса гепатита С в протоколах генетической иммунизации, к способам защиты индивидуумов от заражения вирусом гепатита В и/или вирусом гепатита С и к способам лечения индивидуумов, страдающих от заражения вирусом гепатита В и/или вирусом гепатита С. Настоящая заявка родственна заявке на патент США, зарегистрированной 5 октября 1994, регистрационный номер 08/318248, и заявке на патент США, зарегистрированной 6 июня 1995, регистрационный номер 08/467859, которые обе включены в настоящее изобретение в качестве ссылок.

Предпосылки создания изобретения Вирус гепатита С (HCV), основной этиологический фактор приобретаемого при трансфузии не-А и не-В гепатита, ответственен приблизительно за 150000 новых случаев острого вирусного гепатита в США ежегодно. См. Greenberger, N. J. , 1983, "New Approaches for Hepatitis C", Contemporary Internal Medicine Feb:64. Примерно половина этих случаев заражения переходит в хронические инфекционные заболевания, которые могут ассоциироваться с циррозом и/или печеночно-клеточным раком (Alter, et al., Science, 1992, 258, 135-140; и Alter, et al. , New Eng. J. Med., 1992, 327, 1899-1905). Кроме того, HCV-инфекция является независимым фактором риска для развития печеночно-клеточного рака, как показывает широкое распространение антител против HCV (Colombo, et al., Lancet, 1989, ii, 1006-1008; Saito, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 6547-6549; Simonetti, et al., An. Int. Med., 1992, 116, 97-102; и Tsukuma, et al., New Eng. J. Med., 1993, 328, 1797-1801).

HCV представляет собой оболочечный, плюс-нитевой РНК-вирус, длиной приблизительно в 9500 нуклеотидов, который в последнее время относят к отдельному роду в семействе Flavivirus (Heinz, F.X., Аrсh. Virol. (Suppl.), 1992, 4, 163-171). Различные иэоляты показывают большое разнообразие нуклеотидных последовательностей, приводящее к подразделению геномов HCV по крайней мере на восемь генотипов (Simmonds, et al., J. Gen. Virol., 1993, 74, 2391-2399). Во всех генотипах вирусный геном содержит большую открытую рамку считывания (ORF), которая кодирует белок-предшественник из 3010-3033 аминокислот приблизительно в 330 кД (Choo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 2451-2455; Inchauspe, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 10292-10296; Kato, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 9524-9528; Okamoto, et al., J. Gen. Virol., 1991, 72, 2697-2704; и Takamizava, et al., J. Gen. Virol., 1991, 65, 1105-1113).

Отдельные полипептиды HCV продуцируются протеолитическим процессингом полипептида-предшественника с образованием корового белка (С), белков оболочки (El, E2) и неструктурных белков (NS2-NS5) (Bartenschlager, et al., J. Gen. Virol., 1993, 67, 3835-3844; Grakoui, et al., J. Gen. Virol., 1993, 67, 2832-2843; и Selby, et al., J. Gen. Virol., 1993, 74, 1103-1113). Такой протеолиз катализируется сочетанием как клеточных, так и вирусных кодированных протеаз.

Помимо транслируемой области, геном HCV содержит как 5'-нетранслируемую область (5'-UTR), так и 3'-нетранслируемую область (3'-UTR). 5'-UTR из 324-341 нуклеотидов представляет наиболее консервативную последовательность среди всех изолятов, о которых приводятся данные (Han, et al., Proc. Natl. Acad. Scl. USA, 1991, 88, 1711-1715; и Bukh, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 4942-4946). Постулировано, что эта 5'-UTR содержит важные регуляторные элементы для репликации и/или трансляции РНК HCV. 5'-UTR также содержит несколько небольших открытых рамок считывания (ORF), но в настоящее время нет оснований полагать, что эти ORF-последовательности действительно являются транслируемыми.

Коровый ген HCV может представлять собой важную мишень для противовирусного подхода, основанного на нуклеиновых кислотах. Полагают, что первые 191 аминокислот полипротеинового предшественника HCV представляют собой вирусный нуклеокапсидный белок. Этот белок состоит из основного РНК-связывающего аминоконцевого домена и высокогидрофобной области карбоксильного конца (Bukh, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 8239-8243; и Santolini et al., J. Virol., 1994, 68, 3631-3641). Зрелый коровый белок в 21 кД отщепляется от полипротеинового предшественника клеточной сигнальной пептидазой, и есть основания предполагать, что нуклеокапсидный белок HCV устойчиво ассоциируется с цитоплазматической поверхностью мембраны эндоплазматического ретикулума (Hijikata, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 5547-5551; и Santolini, et al. , J. Virol., 1994, 68, 3631-3641). В противоположность гликопротеинам оболочки, которые включают гипервариабельную область в аминоконцевой области Е2 (Weiner, et al., Virol., 1991, 180, 842-848; и Weiner, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 3468-3472), коровый белок является весьма консервативным среди различных генотипов HCV и генерирует иммунный ответ организма-хозяина (Bukh, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 8239-8243; и Houghton, et al., Hepatology, 1991, 14, 381-388). Предыдущие исследования показали, что большинство инфицированных HCV индивидуумов вырабатывают антитела к коровому белку HCV в начале заражения. (Chiba, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 4641-4645; Hosein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 3647-3651; Hsu, et al., Hepatology, 1993, 17, 763-771; Katayama, et al., Hepatology, 1992, 15, 391-394; Nasoff, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 5462-5466; и Okamoto, et al., Hepatology, 1992, 15, 180-186). Более того, нуклеокапсидный белок представляется важной мишенью для клеточного иммунного ответа против HCV (Botarelli, et al., Gastroenterol., 1993, 104, 580-587; Koziel, et al., J. Virol., 1993, 67, 7522-7532; и Shirai, et al., J. Virol. , 1993, 68, 3334-3342). Наконец, последние наблюдения позволяют предположить, что коровый белок HCV может также иметь некоторые регуляторные функции (Shin, et al., J. Virol., 1993, 67, 5823-5832). Мутация вирусного генома с высокой частотой происходит, вероятно, во время репликации генома вируса и через иммунную селекцию. Это явление может быть связано с установлением персистентной вирусной инфекции и последующим хроническим характером болезни (Weiner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 3468-3472; Kato, et al., Biochem.Biophys. Res. Comm., 1992, 189, 119-127; и Alter, et al., New Eng. J. Med., 1992, 327, 1899-1905).

Клеточные иммунные события, вовлеченные в повреждение печени и вирусный клиренс во время HCV-инфекции, установлены только частично. При попытке изучить потенциальную патогенную роль инфильтрирующих печень лимфоцитов у пациентов с хронической HCV-инфекцией, Koziel, et al. изучили ответ цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) таких клеток и продемонстрировали НLA класса I-ограниченный СD8+ЦТЛ-ответ, направленный против как структурных, так и неструктурных областей HCV-полипептидов (Koziel, et аl., J. Virol., 1993, 67, 7522-7532; и Koziel, et al., J. Immunol., 1992, 149, 3339-3344). Другие исследователи также отметили наличие ЦТЛ в популяциях мононуклеарных клеток периферической крови, которые во время хронической HCV-инфекции распознают эпитопы на коровом и других родственных вирусных белках (Kita, et аl., Hepatol., 1993, 18, 1039-1044; и Cerny, et al., Intl. Symp. Viral. Hepatitis Liver Dis., 1993, 83 (реферат)).

Botarelli, et al., (Botarelli, et al., Gastroenterol.,1993, 104, 580-587) и Ferrari, et al., (Ferrari et al., Hepatol., 1994, 19, 286-295) обнаружили HLA класса II-ограниченный CD4+ опосредуемый Т-клетками пролиферативный ответ на некоторые рекомбинантные белки, полученные из различных областей HCV, у пациентов с хронической HCV-инфекцией. Примечательно, что существовала корреляция между ответами Т-клеток на коровый белок HCV и клинически доброкачественным течением болезни печени так же, как и последующим уничтожением вируса. Однако подобные исследования показали, что пролиферативный ответ на коровый белок HCV не предсказывает доброкачественное клиническое течение относительно серьезности болезни печени (Schupper, et al., Hepatol. , 1993, 18, 1055-1060). Таким образом, важно прояснить связь между активным клеточным иммунитетом и клиническим течением вирусной инфекционной болезни в отношении типа повреждения печени и клинической реакции HCV-инфекции на интерфероновую (IFN) терапию. В этом отношении проводились исследования, включающие ответы мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) на рекомбинантный GST-HCV коровый слитый белок, которые включали оценку способности таких клеток продуцировать IFN-; и проводились корреляции с различными клиническими результатами заражения HCV. Обнаружено, что мононуклеарные клетки 24 из 46 пациентов (52%) с хронической болезнью печени отвечали на коровый белок; бессимптомные носители HCV показали низкую степень ответа (15%, р<0,05). Что более существенно, пациенты, которые получили лечение IFN- и пришли к клинической и вирусологической эмиссии, имели более высокую степень реакции (75%, р<0,05) к коровому белку HCV по сравнению с пациентами с постоянным гепатитом, лечение которых не удалось (31%). Из 25 пациентов, мононуклеарные клетки которых реагировали на коровый белок HCV, 18 имели заметную реакцию на один или несколько пептидов; 12 пациентов реагировали на пептидную смесь, содержащую гидрофильные последовательности. Аминокислотная последовательность корового пептида 140-160 распознавалась 9 пациентами. Интересно, что 7 из 8 пациентов, несущих HLA DR4 и гаплотипы w53, узнавали пептидную последовательность 140-160. Таким образом, оказалось, что ответ мононуклеарных клеток ограничен HLA DR, и отвечающие клетки идентифицированы как CD4+ Т-клетки. Это исследование показывает присутствие иммунодоминантных Т-клеточных эпитопов в коровом белке HCV в ассоциации с фенотипами HLA DR у пациентов с заболеванием печени, связанным с HCV.

Вирус гепатита В (HBV) является основным человеческим патогеном, для которого не существует эффективного лечения. Установлено, что более 300 миллионов человек в мире хронически инфицированы этим вирусом. Воздействие HBV может привести к острому или хроническому гепатиту, циррозу печени и развитию печеночно-клеточного рака. Клинические последствия этой серьезной инфекционной болезни являются предметом особого отношения в разработках всего мира, особенно там, где HBV-инфекция является одной из ведущих причин смертности, а также является основной причиной острых или хронических болезней печени в Соединенных Штатах, как и в Европе. HBV является эталонным членом семейства hepadnavirus, группы близкородственных вирусов (Ganem, et al. , Annu. Rev. Blochem., 1987, 56, 651-693), которая включает, среди прочих, вирус гепатита В утки (DHBV) и вирус гепатита лесного североамериканского сурка (WHV). Экспериментально инфицированные утки или лесные американские сурки точно воспроизводили многие признаки болезни человека, такой как острая или хроническая инфекционная болезнь, и, в случае хронически инфицированных лесных американских сурков развитие печеночно-клеточного рака (Shodel, et al. , "The Biology of Avian Hepatitis В viruses", в Molecular Biology of the Hepatitis В Virus, 1991, Vol. 3, CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 53-80; Korba, et al., J. Virol., 1989, 63, 1360-1370; и Коrbа, et al., Hepatology, 1989, 9, 461-470). Хотя вирусные репликативные промежуточные формы обнаружены в других тканях, печень является органом-мишенью, и гепатоцитное повреждение ассоциируется с персистентной вирусной инфекцией. Представляется, что сам по себе HBV не является цитопатическим вирусом. Поэтому вероятно, что иммунный ответ организма-хозяина, продуцированный против вирусных эпитопов, продуцирует повреждение печени, и стратегия лечения, разработанная для уменьшения геномной репликации вируса в печени, может иметь положительное клиническое действие.

Геном HBV кодирует 4 открытые рамки считывания (ORF), которые включают 1) 5-ген, кодирующий белок оболочки, с 2 полипептидами pre-Sl и pre-S2 внутри рамки; 2) полимеразную ORF, кодирующую белок обратную транскриптазу, которая ответственна за обратную транскрипцию предгеномной РНК в 3,6 кб в ДНК; 3) коровый ген, кодирующий белок, который собран для завершения вирусного нуклеокапсида; и 4) НВх ORF, которая кодирует белок неизвестной функции. Ген ро1 заключает в себе 80% генома и перекрывает три другие ORF. Коровый ген предваряется внутрирамочной последовательностью, которая кодирует сигнальный пептид, и последующее протеолитическое расщепление приводит к антигенно отличному белку, названному HBeAg. Обнаружено, что НВх-белок не является существенным для вирусного жизненного цикла in vitro (Blum, et al., J. Virol. , 1992, 66, 123-127), но выясняется, что он является необходимым для установления продуктивной инфекции in vivo (Chen, et al., J. Virol., 1993, 67, 1218-1226). НВх может функционировать как транскрипционный трансактиватор на множестве клеточных и вирусных генов, и предполагается, что он может вносить вклад в развитие НСС (Schek, et аl., "The Hepadnaviral X Protein" в Molecular Biology of the Hepatitis В Virus, 1991, Vol. 3, CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 181-192).

Прямая инъекция ДНК животным является перспективным способом доставки специфических антигенов в целях иммунизации (Barry, et al., Bio Techniques, 1994, 16, 616-619; Davis, et al., Hum. Mol. Genet., 1993, 11, 1847-1851; Tang, et al., Nature, 1992, 356, 152-154; Wang, et al., J. Virol., 1993, 67, 3338-3344; и Wolff, et al., Science, 1990, 247, 1465-1468). Такой подход с успехом применяют для создания защитного иммунитета против вируса гриппа у мышей и кур, против бычьего вируса 1 герпеса у мышей и крупного рогатого скота и против вируса бешенства у мышей (Сох, et al., J. Virol., 1993, 67, 5664-5667; Fynan, et al., DNA and Cell Biol., 1993, 12, 785-789; Ulmer, et al. , Science, 1993, 259, 1745-1749; и Xiang, et al., Virol., 1994, 199, 132-140). В большинстве случаев с контролем инфекции ассоциируются сильное, но высоковариабельное антитело и цитотоксические Т-клеточные ответы. В действительности, возможность генерации ЦТЛ с долго сохраняющейся памятью без использования печеночного переносчика делает такой подход особенно привлекательным по сравнению со способами, включающими вакцины с убитыми вирусами и генерирования реакции ЦТЛ, которая не только защищает против острой инфекции, но также может быть благоприятной при уничтожении персистентной вирусной инфекции (Wolff, et al., Science, 1990, 247, 1465-1468; Wolff, et al., Hum. Mol. Genet., 1992, 1, 363-369; Manthorpe, et al., Human Gene Therapy, 1993, 4, 419-431; Ulmer, et al., Science, 1993, 259, 1745-1749; Yankauckas, et al. , DNA and Cell Biol., 1993, 12, 777-783; Montgomery, et al., DNA and Cell Biol., 1993, 12, 777-783; Fynan, et al., DNA and Cell Blol., 1993, 12, 785-789; Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 4156-4160; Wang, et al. , DNA and Cell Biol., 1993, 12, 799-805; Xiang, et al., Virol., 1994, 199, 132-140; и Davis, et al., Hum. Mol. Genet., 1993, 11, 1847-1851), а заражение HCV и HBV являются заболеваниями человека, имеющими значение во всем мире.

В настоящее время не существует универсального высокоэффективного способа лечения хронической HBV- и/или HCV-инфекции. Разработка вакцинной стратегии против HBV и/или HCV осложнена не только значительной гетерогенностью изолятов HBV и HCV, но также смесью гетерогенных геномов в пределах изолята (Martell, et al. , J. Virol., 1992, 66, 3225). Кроме того, вирус содержит высоковариабельную область оболочки.

Вакцинация и иммунизация обращаются, главным образом, к введению невирулентного фактора, против которого иммунная система индивидуума может инициировать иммунный ответ, который затем будет полезен для защиты против заражения патогеном. Иммунная система идентифицирует вторгающиеся "чужеродные" композиции и факторы, в первую очередь, путем опознавания белков и других больших молекул, которые, по природе, отсутствуют у индивидуума. Чужеродный белок представляет мишень, против которой осуществляется иммунный ответ.

В заявке на международный патент PCT/US90/01348 дается информация о последовательностях клонов генома HCV, аминокислотных последовательностях белков вируса HCV и способах приготовления и применения таких композиций, включая вакцины против HCV, содержащие белки HCV и пептиды, полученные из них.

В каждой из заявок на патент США, зарегистрированных 26 января 1993, регистрационный номер 08/008342, 11 марта 1993, регистрационный номер 08/029336, 21 сентября 1993, регистрационный номер 08/125012, в заявке на международный патент, зарегистрированной 26 января 1994, регистрационный номер PCT/US94/00899, и в заявке на патент США, зарегистрированной 1 апреля 1994, регистрационный номер 08/221579, содержится описание протоколов генетической иммунизации. В каждой из них описываются вакцины против HCV.

В заявке на патент США, зарегистрированной 5 октября 1994, регистрационный номер 08/318248, которая включена в настоящее изобретение в качестве ссылки, описываются генетические конструкции, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие коровый белок HCV, которые пригодны в качестве вакцины. Вакцина на основе корового белка HCV экспрессирует высокий уровень корового антигена in vitro и индуцирует сильный иммунный ответ in vivo.

Сохраняется потребность в вакцинах, пригодных для защиты индивидуумов от заражения вирусом гепатита В и/или вирусом гепатита С. Сохраняется и потребность в способах защиты индивидуумов от заражения вирусом гепатита В и/или вирусом гепатита С.

Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение относится к молекулам рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащим нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок. Слитый белок содержит S-генный продукт вируса гепатита В, соединенный с аминокислотами 1-69 корового белка вируса гепатита С.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок. Слитый белок содержит S-генный продукт вируса гепатита В, соединенный с аминокислотами 1-69 корового белка вируса гепатита С. Нуклеотидная кодирующая последовательность, которая кодирует слитый белок, операбельно связана с регуляторными элементами, функциональными в человеческих клетках. Фармацевтическая композиция также содержит фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

Настоящее изобретение относится к способам иммунизации индивидуума, восприимчивого к или инфицированного вирусом гепатита С и/или вирусом гепатита В, которые включают стадию введения такому индивидууму фармацевтической композиции, содержащей молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок. Слитый белок содержит S-генный продукт вируса гепатита В, соединенный с аминокислотами 1-69 корового белка вируса гепатита С. Нуклеотидная кодирующая последовательность, которая кодирует слитый белок, операбельно связана с регуляторными элементами, функциональными в человеческих клетках. Фармацевтическая композиция также содержит фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Индивидуум получает количество, эффективное для индуцирования защитного или лечебного иммунного ответа против гепатита В и/или гепатита С.

Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим неполный вирусный геном гепатита С, включающий послед. 14.

Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим неполный вирусный геном гепатита С, включающий нуклеотидную последовательность, которая кодирует коровый белок HCV, и по крайней мере последние 9 нуклеотидов 5'-нетранслируемой области.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую неполный вирусный геном гепатита С и по крайней мере кодирующие последовательности послед. 14, операбельно соединенные с регуляторными элементами, функциональными в человеческих клетках.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую неполный вирусный геном гепатита С, включающий нуклеотидную последовательность, которая кодирует коровый белок HCV, и по крайней мере последние 9 нуклеотидов 5'-нетранслируемой области, операбельно связанные с регуляторными элементами, функциональными в человеческих клетках.

Настоящее изобретение относится к способу иммунизации индивидуума, восприимчивого к или инфицированного вирусом гепатита С, включающему стадию введения индивидууму количества плазмиды pHCV2-1 или плазмиды pHCV4-2, эффективного для индуцирования защитного или лечебного иммунного ответа против гепатита С.

Краткое описание чертежей На фиг.1 дается схематическое изображение некоторых конструкций, содержащих коровый ген HCV, S-ген HBV, pre S1 ген HBV и pre S2 ген HBV.

На фиг. 2 приводится диаграмма экспрессионного вектора, в который могут быть вставлены кодирующие последовательности, кодирующие химерный слитый белок HCV/HBV, или в который вставляют кодирующую последовательность HCV, чтобы получить плазмиды pHCV2-1 и pHCV4-2.

На фиг.3 изображаются способы построения гибридных конструкций HBV/HCV.

Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к композициям и способам, которыми иммунизируют индивидуум для профилактики и/или лечения от HBV- и/или HCV-инфекции. Для иммунизации против HBV- и/или HCV-инфекции индивидууму вводят молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок, который содержит S-генный продукт HBV, соединенный с аминокислотами 1-69 корового белка HCV. Слитый белок, кодированный генной конструкцией, экспрессируется клетками индивидуума и служит в качестве иммуногенной мишени, против которой индуцируются анти-HBV и/или анти-HCV иммунные ответы. Для иммунизации против заражения HCV индивидууму вводят генетический материал, содержащий неполный геном вируса гепатита С, но который кодирует коровый белок HCV. Белок, кодированный генной конструкцией, экспрессируется клетками индивидуума и служит в качестве иммуногенной мишени, против которой индуцируется анти-HCV иммунный ответ. Получающиеся в результате иммунные ответы являются вполне фундаментальными; кроме гуморального иммунного ответа выявляются обе ветви клеточного иммунного ответа. Способы настоящего изобретения пригодны для создания профилактического и лечебного иммунитета. Таким образом, способ иммунизации включает как способы защиты индивидуума от заражения HBV и/или HCV, так и способы лечения индивидуума, страдающего от заражения HBV и/или HCV.

Показано, что многие белки, известные ранее для индуцирования гуморального и клеточного иммунного ответа после иммунизации ДНК, являются либо нативными белками клеточной поверхности, либо секретируемыми белками, такими как, например, NP вируса гриппа, HBsAg и гликопротеины вируса бешенства. Хотя вакцина на основе коровой ДНК HCV экспрессирует коровый антиген на высоком уровне in vitro и индуцирует иммунный ответ in vivo, вероятно, что коровый белок HCV остается фиксированным в цитоплазме и не экспрессируется на поверхности клетки или не выделяется из клетки. Следовательно, иммунная реакция может быть увеличена посредством обеспечения экспрессии белка на клеточной поверхности и/или секреции белка. Соответственно, в одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения нуклеотидная кодирующая последовательность, кодирующая коровый белок HCV, соединяется с областями нуклеотидной кодирующей последовательности, кодирующей поверхностный антиген HBV, как показано на фиг.1. Таким образом, слитый химерный белок HBV/HBC может индуцировать иммунный ответ к HBV и/или HCV.

Используемое здесь выражение "неполный геном вируса гепатита С" означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая не содержит полной кодирующей последовательности для полипротеина HCV, который кодируется вирусным геномом HCV. Включение неполного генома HCV в клетку не привносит достаточной генетической информации для продуцирования инфекционного вируса.

Используемый здесь термин "коровый белок HCV" означает белок, относящийся к усеченным коровым белкам HCV, таким как белки, имеющие аминокислотную последовательность, представленную послед. 1 и послед. 2, которая содержит 154 аминокислоты, или коровый белок HCV полной длины, имеющий аминокислотную последовательность, представляемую послед. 14 и послед. 15, которая является аминокислотной последовательностью корового белка HCV специфического изолята HCV. Полноразмерный коровый белок HCV обычно имеет 191 аминокислоту, но для целей настоящего изобретения, относящихся к усеченному коровому белку HCV, С-концевые 37 аминокислот (аминокислоты 155-191) удаляют, чтобы усилить способность к секреции слитого белка. Постулировано, что двадцать С-концевых аминокислот полноразмерного корового белка HCV содержат сайты связывания с эндоплазматическим ретикулумом, что приводит, в результате, к удержанию корового белка внутри клеточной цитоплазмы. Кроме того, термин "коровый белок HCV" относится к соответствующим коровым белкам HCV, полноразмерным или усеченным, из дополнительных изолятов HCV, которые могут изменяться. Специалисты в этой области техники могут легко идентифицировать коровый белок HCV из дополнительных изолятов. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности корового белка HCV описываются в заявке на патент США, зарегистрированный 5 октября 1994, регистрационный номер 08/318248, которая включена в настоящее изобретение в качестве ссылки. Следует иметь в виду, что нуклеотидные замещения в кодоне могут быть приемлемыми, когда кодирована та же аминокислота. Кроме того, следует также иметь в виду, что нуклеотидные изменения могут быть приемлемыми, когда при этом в результате нуклеотидного замещения получается консервативная аминокислота.

Замечено, что коровый белок HCV существует в двух различных формах в форме закрепленного (заякоренного) корового белка и в форме корового белка вириона. Во время трансляции HCV полипептид-предшественник транслируется и затем процессируется клеточными протеазами и вирусными протеазами, образуя индивидуальные вирусные полипептиды. Полагают, что клеточная сигнальная пептидаза расщепляется в сайте, который отделяет часть полипротеина, которая становится коровым белком, отчасти, которая становится белком оболочки, освобождая, посредством этого, закрепленный коровый белок от белка оболочки. Закрепленный коровый белок, который ассоциирован с эндоплазматическим ретикулумом, затем процессируется до зрелого вирионного корового белка. Закрепленный коровый белок отличается от корового белка вириона тем, что он содержит 18 дополнительных аминокислот на С-конце. В действительности, на вирусных частицах закрепленный белок не обнаружен.

Используемый здесь термин "генная конструкция" относится к молекуле рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок, который содержит по крайней мере 69 N-концевых аминокислот корового белка HCV и полный S-генный продукт HCV, или полноразмерный коровый белок HCV, а также сигналы инициации и терминации, операбельно соединенные с регуляторными элементами, включающими промотор и сигнал полиаденилирования, способные регулировать экспрессию в клетках вакцинированного индивидуума. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения генная конструкция также содержит энхансер, последовательность Козака (GCCGCCATG, послед. 13) и, по крайней мере, фрагмент 5'-UTR HCV.

Используемый здесь термин "генетическая вакцина" относится к фармацевтическому препарату, который содержит генную конструкцию. Генетические вакцины включают фармацевтические препараты, пригодные для индукции профилактического и/или терапевтического иммунного ответа к HCV и/или HBV.

В соответствии с настоящим изобретением, генные конструкции вводят в клетки индивидуума, где они экспрессируются, продуцируя, таким образом, слитый белок корового белка HCV и поверхностного антигена HBV или полноразмерный коровый белок HCV. Регуляторные элементы генных конструкций изобретения способны управлять экспрессией в человеческих клетках. Регуляторные элементы включают промотор и сигнал полиаденилирования. Кроме того, в генную конструкцию также могут включаться другие элементы, такие как энхансер и последовательность Козака.

При захвате клеткой генная конструкция настоящего изобретения может оставаться в клетке в качестве функционирующей внехромосомной молекулы, или она может объединиться с хромосомной ДНК клетки. ДНК может быть введена в клетки, где она остается как отдельный генетический материал в форме плазмиды. С другой стороны, в клетку может быть введена линейная ДНК, которая может объединяться с хромосомой. При введении ДНК в клетку могут быть добавлены реагенты, которые промотируют интеграцию ДНК с хромосомой. В молекулу ДНК также могут быть включены ДНК-последовательности, которые пригодны для промотирования интеграции. С другой стороны, в клетку можно ввести РНК. Также предполагается создать генную конструкцию в виде линейной минихромосомы, включающей центромеру, теломеры и источник репликации.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения генная конструкция содержит молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок, содержащий области S-генного продукта HBV, соединенного с коровым белком HCV, предпочтительно с усеченным коровым белком HCV.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок, содержащий полный S-генный продукт HBV, соединенный с аминокислотами 1-69 корового белка HCV. Нуклеотиды, кодирующие С-концевые аминокислоты S-генного продукта HBV, соединяются с нуклеотидами, кодирующими N-концевые аминокислоты усеченного корового белка HCV.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок, содержащий полный S-генный продукт HBV, соединенный с аминокислотами (1-70)-(1-154) усеченного корового белка HCV. Усеченный коровый белок HCV может содержать аминокислоты 1-70, 1-71, 1-72, 1-73, 1-74, ..., 1-150, 1-151, 1-152, 1-153 или 1-154. Использованные здесь обозначения" (1-70)-(1-154)" или "1-70, 1-71, 1-72, 1-73, 1-74, . .., 1-150, 1-151, 1-152, 1-153 или 1-154" применяются как взаимозаменяемые для описания каждой из аминокислотных последовательностей фрагментов усеченного корового белка HCV, которые включают аминокислоты 1-69 плюс дополнительные С-концевые остатки до 154 остатка. Нуклеотиды, кодирующие С-концевые аминокислоты S-генного продукта HBV, соединены с нуклеотидами, кодирующими N-концевые аминокислоты усеченного корового белка HCV.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок, содержащий фрагмент рrе S2-генного продукта HBV, соединенного с полным S-генным продуктом HBV, соединенного с аминокислотами 1-69 усеченного корового белка HCV. Фрагмент рrе S2-генного продукта HBV может включать С-концевую аминокислоту, или 2 С-концевых аминокислоты, или 3 С-концевых аминокислоты, или 4 С-концевых аминокислоты, . . . , или полный рrе S2-генный продукт HBV. Используемое здесь выражение "фрагмент рrе S2-генного продукта HBV может включать С-концевую аминокислоту, или 2 С-концевых аминокислоты, или 3 C-концевых аминокислоты, или 4 C-концевых аминокислоты, ..., или полный рrе S2-генный продукт HBV" предназначено для описания аминокислотных последовательностей, которые включают фрагменты pre S2-генного продукта HBV, начиная с фрагмента, который включает только С-концевой остаток, до фрагментов, которые включают дополнительные остатки непосредственно от N-концевого до С-концевого остатка, т. е. последний С-концевой остаток, последние два С-концевых остатка, последние три С-концевых остатка и так далее до присутствия полного pre S2 белка. Нуклеотиды, кодирующие С-концевые аминокислоты pre S2-генного продукта HBV, соединяются с нуклеотидами, кодирующими N-концевые аминокислоты S-генного продукта HBV. Нуклеотиды, кодирующие С-концевые аминокислоты S-генного продукта HBV, в свою очередь, соединяются с нуклеотидами, кодирующими N-концевые аминокислоты усеченного корового белка HCV.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок, содержащий фрагмент pre S1-генного продукта HBV, соединенного с полным S-генным продуктом HBV, соединенного с аминокислотами 1-69 усеченного корового белка HCV. Фрагмент pre S1-генного продукта HBV может включать С-концевую аминокислоту, или 2 С-концевых аминокислоты, или 3 С-концевых аминокислоты, или 4 С-концевых аминокислоты, . .., или полный pre S1-генный продукт HBV. Используемое здесь выражение "фрагмент pre S1-генного продукта HBV может включать С-концевую аминокислоту, или 2 С-концевых аминокислоты, или 3 С-концевых аминокислоты, или 4 С-концевых аминокислоты, ..., или полный pre S1-генный продукт HBV" предназначено для описания аминокислотных последовательностей, которые включают фрагменты pre S1-генного продукта HBV, начиная с фрагмента, который включает только С-концевой остаток, до фрагментов, которые включают дополнительные остатки непосредственно от N-концевого до С-концевого остатка, т. е. последний С-концевой остаток, последние два С-концевых остатка, последние три С-концевых остатка и так далее до присутствия полного pre S1 белка. Фрагмент pre S2-генного продукта HBV может включать С-концевую аминокислоту, или 2 С-концевых аминокислоты, или 3 С-концевых аминокислоты, или 4 С-концевых аминокислоты, ..., или полный pre S2-генный продукт HBV. Нуклеотиды, кодирующие С-концевые аминокислоты pre S1-генного продукта HBV, соединяются с нуклеотидами, кодирующими N-концевые аминокислоты pre S2-генного продукта HBV. Нуклеотиды, кодирующие С-концевые аминокислоты pre S2-генного продукта HBV, в свою очередь, соединяются с нуклеотидами, кодирующими N-концевые аминокислоты S-генного продукта HBV. Нуклеотиды, кодирующие С-концевые аминокислоты S-генного продукта HBV, в свою очередь, соединяются с нуклеотидами, кодирующими N-концевые аминокислоты усеченного корового белка HCV.

Вакцины против вирусов гепатита

Патент 2189254