Устройство для измерения люминесценции биологических образцов

Устройство для измерения люминесценции биологических образцов

Реферат

 

Изобретение относится к аналитической технике, может быть использовано в биологии, биохимии и медицине для проведения многоаналитных анализов и позволяет улучшить отношение сигнал/шум и сигнал/фон, что дает возможность повысить селективность анализа малых концентраций биологических объектов в исследуемой среде. Устройство содержит оптически сопряженные источник возбуждающего излучения, оптическую систему возбуждения и оптическую систему регистрации люминесценции, держатель образца и фотодетектор, выход которого связан со входом усилителя-дискриминатора, выход которого связан со входами счетчиков импульсов, выходы которых связаны со входом электронной схемы управления и обработки измеряемого сигнала. Между держателем образца и первым элементом оптической системы регистрации установлено средство для удаления прямого потока возбуждающего излучения из оптической системы регистрации люминесценции, выполненное в виде вогнутого зеркала, а апертурный угол первого элемента оптической системы находится в пределах 40-70^o. Технический результат - повышение селективности анализа. 4 ил.

Изобретение относится к аналитической технике, в частности к устройствам для измерения люминесценции образцов, и может быть использовано в биологии, биохимии и медицине для проведения многоаналитных анализов.

В настоящее время существует большое количество различных типов клинических анализаторов для тестирования биологических образцов. Однако повышающиеся требования к уровню обслуживания населения в клинических лабораториях, необходимость детектирования нескольких аналитов в одном образце и проведение большого количества анализов, например, при масс-скрининге населения требуют как усовершенствования технологии проведения анализов (экономия исследуемого образца и реагентов, снижение трудозатрат, повышение производительности и т.п.), так и разработки высокочувствительных устройств для проведения многоаналитного анализа при ограниченном объеме пробы. Уменьшение объема пробы существенно уменьшает величину полезного сигнала люминесценции, делая технику детектирования чрезвычайно чувствительной к сигналу детектируемого флуоресцентного и люминесцентного фона.

Для проведения клинических анализов крови и других биологических жидкостей нашли широкое применение флуориметры (WO 88/07670, WO 97/11354, WO 99/08096, патент Англии 2330904, класс МКИ G 01 N 21/64). Принцип работы флуориметров основан на том, что интенсивность эмиссии флуоресценции является индикатором присутствия и/или количества вещества (аналита) в исследуемом образце. Однако количество света, испускаемое образцом, находящимся в ячейке микротитровальной платы с большим количеством ячеек, имеет очень малую величину. В связи с этим, чтобы получить надежные результаты измерений, флуориметры оборудуются одним или несколькими источниками возбуждающего излучения с высокой выходной мощностью, фотоумножителем и системой обработки измеряемого сигнала, сложными оптическими системами возбуждения и регистрации эмиссии исследуемого образца. Это усложняет подобные устройства и приводит к повышению их стоимости. Кроме того, подобные источники возбуждающего излучения не только дорогие, но обладают такими недостатками, как выделение чрезмерного количества тепла, внесение необратимых изменений в образец, и служат источниками шумов и причиной обесцвечивания связанных с аналитом флуоресцентных материалов меток, что приводит к ухудшению соотношения сигнал/шум (с/ш) и сигнал/фон (с/ф) и, соответственно, к ухудшению чувствительности измерений.

Как видно из вышесказанного, дальнейшее развитие флуоресцентных методов анализа и, соответственно, флуориметров исчерпало себя, так как при измерении очень малых сигналов методы флуориметрии не дают однозначного ответа о концентрации аналита. При осуществлении этих методов спектральные и временные характеристики входного сигнала измеряются с использованием импульсного режима регистрации. При этом для уменьшения влияния на полезный сигнал короткоживущей люминесценции фона и импульса возбуждающего люминесценцию излучения регистрацию осуществляют с задержкой после окончания светового импульса возбуждения, сравнимой с постоянной времени жизни измеряемого сигнала, в течение интервала времени, примерно равного этой же величине. Однако это не обеспечивает отстройку от фоновой люминесценции, имеющей в 2-3 раза более короткое и более длительное время жизни, чем время жизни измеряемого сигнала люминесценции метки.

Кроме того, при анализе микрообъектов размером 50х50 мкм (чипов) дальнейшее повышение мощности источника возбуждающего излучения для достижения необходимой чувствительности бесперспективно. Это объясняется тем, что в области высоких плотностей мощности возбуждения зависимость интенсивности люминесценции от концентрации искомого аналита становится нелинейной.

Известно устройство для количественного измерения флуоресценции образцов в ячейках микротитровальной платы (патент США 5355215, класс НКИ 356-317). Устройство предназначено для измерения флуоресценции в тонком слое образца (обычно порядка 10 мкм) на дне ячеек с минимальным значением фона, вызываемого флуоресценцией культуральной среды, стенок и дна ячеек. Устройство содержит источник возбуждающего излучения, световой поток которого под определенным углом наклона освещает только часть поверхности дна ячейки. Оптический сенсор расположен так, что излучение флуоресценции измеряется под другим углом наклона, а между дном микротитровальной платы и оптическими каналами возбуждения и регистрации установлена диафрагма для исключения взаимного влияния ячеек друг на друга; в диафрагме выполнено столько отверстий, сколько ячеек в микротитровальной плате. Благодаря угловому соотношению световых потоков возбуждения и эмиссии флуоресценции и использованию диафрагмы в поле зрения оптического сенсора не попадает основная часть освещенной флуоресцирующей среды и флуоресценции стенок ячейки, то есть уменьшается вклад мешающей флуоресценции фона в измеряемый сигнал.

Однако в связи с тем, что в поле зрения оптического сенсора попадает только небольшая часть поверхности дна ячейки, чувствительность измерений снижается из-за уменьшения полезного сигнала, поэтому данное устройство не может быть использовано для детектирования искомых аналитов в концентрации 10^-13-10^-16 М.

Использование анализаторов с временным разрешением, основанных на регистрации амплитуды и/или времени затухания длительной люминесценции флуоресцентной метки, связанной с определяемым аналитом в образце, позволяет в значительной степени исключить из регистрируемого сигнала подавляющее большинство мешающих короткоживущих флуоресцентных составляющих измеряемого сигнала и получить высокую помехоустойчивость регистрации, а в сочетании с принципом счета фотонов значительно повысить чувствительность регистрации.

Известно устройство для считывания информации с ячеек микротитровальных плат, используемое для измерения сигналов флуоресценции, люминесценции и поглощения (ЕР 0841557, класс МКИ G 01 N 21/64). Устройство используют для исследования биологических образцов, меченных флуоресцентной меткой, находящихся в ячейках микротитровальной платы, которая может содержать от 6 до 384 ячеек, причем каждая ячейка может иметь несколько регистрируемых зон. Устройство содержит источник возбуждающего излучения, оптические системы возбуждения и регистрации люминесценции, держатель микротитровальной платы, выполненный с возможностью перемещения в двух взаимно перпендикулярных направлениях, фотоприемное устройство и средство обработки результатов измерений. Устройство может быть использовано для исследования биологических образцов. Фотодетектор может быть расположен над или под исследуемым образцом, диапазон длин волн возбуждения люминесценции может находиться в пределах 250 нм-2 мкм. Для увеличения диапазона длин волн возбуждения комбинируют выходы двух и более источников излучения. Рассеянный исследуемым образцом световой поток возбуждения удаляют из канала регистрации с помощью селективного зеркала. Величину соотношения с/ф регулируют изменением глубины расположения фокуса облучающего пучка света по высоте ячейки. Работой устройства можно управлять вручную или с помощью процессора. В качестве фотодетектора может быть использован фотоумножитель (ФЭУ). При использовании нескольких флуоресцентных меток или их сочетания устройство позволяет проводить анализ многоаналитных исследуемых образцов.

Использование полупрозрачных селективных зеркал в оптической системе регистрации приводит к высокому флуоресцентному фону, что ухудшает отношение сигнал/фон. Перефокусировка системы не дает существенного ослабления фона даже для объектов малого размера.

Недостатком устройства является ухудшение отношения с/ф из-за наличия высокого флуоресцентного фона, источником которого является селективное зеркало, которое служит как для возбуждения люминесценции, так и для передачи эмиссии люминесценции образца в канал детектирования.

Наиболее близким является устройство для измерения абсорбции или эмиссии света, которое может быть использовано для определения присутствия и/или количества аналитов в образце таких, как лиганды, антитела, энзимы, лектины, нуклеиновые кислоты, в очень низких концентрациях (патент США 5315375, класс НКИ 356-417). Устройство содержит источник возбуждающего излучения, оптическую систему возбуждения, прозрачный держатель образца, оптическую систему регистрации излучения эмиссии образца, фотодетектор, усилитель-дискриминатор и электронную систему обработки измеренных сигналов и управления. Держатель образца может перемещаться в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Оптическая система выполнена с возможностью изменения диаметра возбуждающего светового потока, падающего на образец. В качестве источника возбуждающего излучения используют лазер, в качестве фотодетектора - фотоумножитель. Устройство предназначено для измерения низких концентраций аналита, порядка 10^-13-10^-15 М, работает в режиме счета фотонов и может быть использовано для анализа как жидких образцов, так и образцов на твердом носителе. Между исследуемым образцом и фотодетектором, за первым входным элементом оптической системы регистрации установлен фильтр для поглощения рассеянного образцом возбуждающего излучения. При работе устройства световой поток от источника излучения проходит через оптическую систему возбуждения, прозрачный держатель с образцом, первый оптический элемент оптической системы регистрации (линза Френеля) и поглощается фильтром. Удаление прямого потока возбуждающего излучения из системы регистрации уменьшает фоновую короткоживущую флуоресценцию оптических элементов и реакцию ФЭУ на световой поток возбуждения, что улучшает отношение с/ф при измерениях.

При работе устройства импульсы тока с выхода ФЭУ поступают на вход усилителя-дискриминатора, преобразуются в нем в импульсы напряжения и поступают далее на вход счетчика импульсов, с выхода которого сигнал поступает на вход электронной системы управления и обработки сигналов. Исследуемый объем может изменяться в пределах 10-1 мкл, а поперечное сечение исследуемого образца - в пределах 10-0,1 мм².

Высокая чувствительность устройства достигается как за счет большой апертуры входного элемента системы регистрации, так и за счет использования отражателя, установленного за держателем исследуемого образца. Однако это приводит к повышению фонов при работе с реальными объектами из-за наличия в них примесей, люминесцирующих в широком спектральном диапазоне длин волн. Кроме того, расположение фильтра, поглощающего прямой поток возбуждения люминесценции, прошедший через образец, после линзы Френеля приводит к тому, что сама линза вносит дополнительный флуоресцентный фон, который детектируется фотоумножителем.

Устройство не может быть использовано для проведения многоаналитного анализа малых количеств образцов, находящихся на твердом носителе или в объеме ячеек (лунок) микротитровальных плат с высокой чувствительностью и высокой селективностью в пробах биологических материалов, содержащих большое количество флуоресцирующих примесей.

Задачей является создание устройства для многоаналитного анализа биологических образцов, например, биоматериала из пятен крови, сконцентрированных на твердом носителе или находящихся в объеме ячеек микротитровальных плат.

Техническим результатом, достигаемым при использовании предлагаемого изобретения, является улучшение отношения сигнал/шум и сигнал/фон, что позволяет повысить селективность анализа очень малых концентраций биологических объектов (10^-14 M) в исследуемой среде и проводить с достаточной чувствительностью многоаналитный анализ в микротитровальных платах с ячейками как большого (0,4 мл), так и малого (0,01 мл) объема и на плоских носителях.

Технический результат достигается предлагаемым изобретением.

Сущность изобретения заключается в том, что в устройстве для измерения люминесценции биологических образцов, содержащем оптически сопряженные источники возбуждающего излучения, оптическую систему возбуждения и оптическую систему регистрации люминесценции, держатель образца, средство для удаления прямого потока возбуждающего излучения из оптической системы регистрации люминесценции и фотодетектор, выход которого связан со входом усилителя-дискриминатора, выход которого связан со входом по крайней мере одного счетчика импульсов, выход которого связан со входом электронной системы управления и обработки измеряемого сигнала, в оптическую систему регистрации люминесценции введен по крайней мере один фильтр высокого контраста, средство для удаления прямого потока возбуждающего излучения из оптической системы регистрации люминесценции выполнено в виде вогнутого зеркала, установленного между держателем образца и первым входным элементом оптической системы регистрации люминесценции, апертурный угол которого находится в пределах 40-70^o, выход усилителя-дискриминатора связан со входами нескольких счетчиков импульсов, выходы которых связаны со входом электронной системы управления и обработки измеряемого сигнала, при этом число счетчиков импульсов N определяется из выражения Nn+2, где n - число определяемых составляющих измеряемого сигнала.

Предлагаемое изобретение отличается от прототипа введением новых признаков и новыми связями между признаками. Использование входного элемента оптической системы регистрации с указанной апертурой позволяет ввести в эту систему один фильтр или набор сменных фильтров высокого контраста, обеспечивающих подавление возбуждающего света и, соответственно, фона люминесцентных примесей вне спектра излучения определяемой метки, связанной с определяемым аналитом, что приводит к повышению селективности измерений и улучшению отношения с/ф. Использование вогнутого зеркала и размещение его между держателем образца и первым элементом оптической системы регистрации также приводит к улучшению отношения с/ф как за счет повторного излучения образца отраженным световым потоком, так и за счет уменьшения влияния на измеряемый сигнал фоновой флуоресценции элементов оптической системы регистрации. Использование нескольких счетчиков импульсов вместо одного позволяет выделить полезный сигнал из общего сигнала, исключая влияние сигналов мешающих составляющих, при этом чем выше отношение с/ф и селективность, достигаемые за счет вышеуказанных признаков, тем с большей точностью достигается выделение полезного сигнала из общего измеренного сигнала. Вся совокупность признаков при использовании изобретения позволяет получить указанный выше технический результат. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию новизны.

Известны устройства, в которых для увеличения сигнала эмиссии от исследуемого образца используют отражательные элементы, установленные за образцом для увеличения пространственного угла сбора полезного сигнала (патент США 5315375 - один из вариантов выполнения устройства; патент США 5018866, класс НКИ 356-417). Однако при использовании для проведения анализов стандартных микротитровальных плат, особенно с большим числом ячеек, выполнение таких отражателей связано с большими трудностями, в то время как использование отражающего зеркала в заявляемой совокупности признаков позволяет увеличить полезный сигнал примерно в 1,8 раза, а конструктивное исполнение относится к рутинной технике проектирования и изготовления. Авторам не известны технические решения, совокупность отличительных признаков которых аналогична заявляемой. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию уровня техники.

Предлагаемое изобретение найдет широкое применение в здравоохранении, в клинических и исследовательских лабораториях при анализах большого количества образцов, например, при масс-скрининге населения. В ГосНИИ БП изготовлен и прошел предварительные испытания экспериментальный образец устройства, разработанный на основе заявляемой совокупности признаков. Устройство будет использовано для разработки новых тест-систем (реагентов) для проведения анализа крови и других биологических образцов, что имеет большое значение для выявления комплекса заболеваний различных категорий населения. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию промышленной применяемости.

На фиг. 1 показана блок-схема варианта выполнения предлагаемого устройства; на фиг.2 показана кривая затухания интенсивности измеряемого суммарного сигнала после окончания действия светового импульса, позиции 18-23 представляют собой порядковые номера импульсов, накапливаемых счетчиками в каждой серии световых импульсов за период времени t_н-t_к; на фиг.3 показаны зависимости изменения частоты следования импульсов: составляющей долгоживущей люминесценции полезного сигнала - кривая 24; короткоживущей мешающей составляющей (реакция ФЭУ на световой импульс) - кривая 25; долгоживущей мешающей составляющей люминесценции (материала носителя образца, не участвующих в реакции компонентов реагентов и т.п.) - кривая 26; "темновых" импульсов ФЭУ - кривая 27; на фиг.4 показан ход лучей через ячейку микротитровальной платы в момент измерения сигналов.

Устройство, показанное на фиг. 1, содержит источник возбуждающего излучения 1; оптическую систему возбуждения 2; держатель исследуемого образца 3; оптическую систему регистрации 4; входной объектив 5 оптической системы регистрации 4; первый входной элемент 6 входного объектива 5; вогнутое зеркало 7; фильтрующее устройство 8 для выделения требуемой длины волны люминесценции; выходной объектив 9 оптической системы регистрации 4; фотодетектор 10; усилитель-дискриминатор 11; блок счетчиков 12; электронную систему 13 управления и обработки сигнала; контроллер 14; внешний компьютер 15; поз. 16 - прямой поток возбуждающего излучения; поз. 17 - поток измеряемого суммарного сигнала.

Источник возбуждающего излучения 1 может быть выполнен в виде одного или нескольких источников излучения для обеспечения необходимого диапазона длин волн возбуждения.

Оптическая система возбуждения 2 выполнена с возможностью изменения длины волны возбуждающего потока излучения и его диаметра, сфокусированного на образец.

Держатель образца 3 выполнен с возможностью перемещения по двум взаимно перпендикулярным осям.

Вогнутое зеркало 7 может быть выполнено либо в виде зеркального покрытия, нанесенного на центральную поверхность первой линзы 6 входного объектива 5, либо в виде отдельного элемента - зеркала, установленного на оптической оси между держателем образца 3 и первой линзой 6. Диаметр зеркала рассчитывается исходя из условий отражения как можно большей части светового потока возбуждения, прошедшего через образец, и сохранения основного сигнала, снимаемого с образца.

Фильтрующее устройство 8 может быть выполнено в виде блока сменных интерференционных фильтров высокого контраста, обеспечивающих выделение длин волн люминесценции соответствующих меток. Выбор длины волны и смена фильтров осуществляются приводом (не показан) по программе с контроллера 14.

Выходной объектив 9 предназначен для фокусирования выходного светового потока на фотодетекторе 10.

В качестве источника возбуждающего излучения используют лазер.

В качестве фотодетектора используют фотоумножитель.

Усилитель-дискриминатор 11 предназначен для селекции импульсов тока с выхода ФЭУ по амплитуде и преобразования выделенных импульсов (поз 18-23, фиг.2) к виду, пригодному к регистрации в блоке счетчиков 12.

Электронная система 13, предназначенная для управления работой устройства, обработки измеряемого сигнала и корреляции полученных данных с величиной концентрации искомого аналита в пробе, может включать контроллер 14, компьютер 15 и другие, необходимые для решения задачи, блоки и элементы.

Устройство работает следующим образом.

Микротитровальная плата 29 с исследуемыми образцами 30 в ячейках 28 устанавливается на держатель образца 3. Работой привода, перемещающего держатель образца, управляет контроллер 14. При максимальной длине хода 120 мм приводом обеспечивается шаг одного перемещения 0,015 мм, что позволяет с большой точностью проводить детектирование сигналов в многоячеистых титровальных платах (384 ячейки и больше) или на чипах. Кроме того, это позволяет исследовать (сканировать) плоскость дна или чипа с целью выявления конгломератов выявляемого аналита при низкой его концентрации. Световой поток от источника возбуждения 1 в виде серии импульсов через оптическую систему возбуждения 2 направляется на исследуемый образец 30, находящийся в тонком слое на дне или в объеме ячейки 28, проходит через исследуемый образец, попадает на зеркальное покрытие 7 линзы 6, отражается от него и повторно проходит через исследуемый образец (поз. 16 на фиг.1, 4). Часть светового потока люминесценции образца и флуоресценции материала микротитровальной платы и компонентов реагентов, не участвующих в проведении реакции, собирается входным объективом 5 и через фильтр 8 и выходной объектив 9 сформированный по спектральному составу псевдопараллельный пучок излучения поступает на фотокатод фотоумножителя 10. Зеркало 6 препятствует прохождению возбуждающего излучения в оптическую систему регистрации, многократно уменьшая мешающую (фоновую) люминесценцию оптических элементов системы регистрации и электрический сигнал реакции ФЭУ на световой импульс возбуждения.

Повторное прохождение возбуждающего света через исследуемый образец приводит к увеличению эмиссии люминесценции примерно в 1,8 раза без увеличения выходной мощности источника излучения. Однако при этом аналогично увеличивается сигнал мешающей люминесценции материала микротитровальной платы. ФЭУ преобразует световой поток, попавший на фотокатод, в пропорциональную ему частоту следования импульсов тока, снимаемого с анода ФЭУ (при работе ФЭУ в режиме счета фотонов). Импульсы тока с анода ФЭУ поступают на вход усилителя-дискриминатора 11, в котором осуществляются селекция импульсов по амплитуде и преобразование их к виду, пригодному для регистрации и накопления в счетчиках 12.

В зависимости от концентрации определяемых аналитов, материала и количества ячеек микротитровальной платы, типа используемой флуоресцентной метки диапазон интенсивности сигналов на входе оптической системы регистрации люминесценции достигает величины порядка 10⁵. В связи с этим контроллер 14 управляет работой усилителя-дискриминатора 11, переключая его в режим 1/10, если частота следования его выходных импульсов превышает 5 МГц.

Очень часто постоянная времени затухания фоновой составляющей длительной люминесценции, темнового тока и реакции ФЭУ на остаточный световой поток возбуждения сравнимы с постоянной времени затухания люминесценции полезного сигнала, что не позволяет эффективно выделить полезный сигнал. Для выделения полезного сигнала в предлагаемом устройстве счетчиками 12 регистрируют измеряемый сигнал в течение нескольких следующих друг за другом интервалов времени (стробов). Начало этой группы стробов t_н (фиг.2) должно отстоять от момента окончания светового импульса на время t_з (фиг.2), равное примерно 1/2 величины постоянной времени затухания фоновой составляющей, а конец - на 1-3 постоянной времени затухания детектируемой метки t_к (фиг.2). При этом суммирование сигналов в каждом из счетчиков 12 происходит в определенные для каждого счетчика интервалы времени и в определенной последовательности этих интервалов: первый счетчик накапливает все импульсы (всех серий импульсов) в интервале времени 18 (фиг.2), второй счетчик - в интервале времени 19 (фиг. 2) и т.д., а все счетчики накапливают импульсы в течение интервала времени t_н-t_к. Работой счетчиков управляет контроллер 14, который считывает сигналы, накопленные счетчиками за время действия световых импульсов, обрабатывает их и передает в компьютер для окончательной обработки и индикации результатов измерений.

При многоаналитном анализе в качестве меток используют вещества, имеющие экспоненциальный характер затухания люминесценции с постоянными времени затухания от 50 мкс до 800 мкс. Зная спектры люминесценции и постоянные времени их затухания и изменяя частоту следования импульсов возбуждения и время регистрации амплитуды затухающей люминесценции после окончания действия каждого светового импульса, можно оптимизировать прием сигнала каждой метки, достигая максимума отношения с/ф и с/ш для каждой концентрации аналита. Однако необходимо учесть следующее.

Световой поток, попадающий на фотокатод ФЭУ, имеет несколько составляющих: световой поток длительной люминесценции используемого маркера; остаточный световой поток возбуждения, не отразившийся зеркалом 7; световой поток флуоресценции (короткоживущей люминесценции) элементов оптической системы регистрации; световой поток длительной люминесценции материала микротитровальной платы, компонентов реагентов, не участвующих в проведении реакции, и т.д. Регистрацию измеряемых сигналов в устройстве осуществляют через некоторый интервал времени после окончания действия светового импульса t_з. Это позволяет исключить из измеряемого сигнала короткоживущие мешающие составляющие, влияющие на точность и чувствительность измерений, обусловленные короткоживущей флуоресценцией материала микротитровальной платы, примесей в реагентах и исследуемом образце и элементов оптической системы регистрации, вызываемой прямым световым потоком возбуждения. В этом случае суммарный сигнал, снимаемый с анода ФЭУ, в основном содержит следующие составляющие: полезный сигнал, соответствующий интенсивности длительной люминесценции используемого маркера (кривая 24, фиг.3); короткоживущую составляющую - реакцию ФЭУ на остаточный световой поток импульса возбуждающего излучения и флуоресценцию примесей (кривая 25, фиг.3); долгоживущую составляющую материала микротитровальной платы и т.п. (кривая 26, фиг.3); составляющую "темнового" фона ФЭУ (кривая 27, фиг.3).

Времена жизни каждой составляющей определяются экспериментально и вносятся в электронную систему регулирования и обработки сигнала (записываются в память контроллера 14, например), значения амплитуд этих составляющих определяются в процессе проведения измерений на устройстве.

Суммарный сигнал, снимаемый с анода ФЭУ, может быть описан следующим выражением: где А и _a - максимальное значение частоты следования импульсов и постоянная времени короткоживущей мешающей составляющей соответственно.

Именно эта составляющая оказывает доминирующее влияние на возможность определения люминесценции меток с малыми постоянными времени затухания (~100 мкс). Амплитуда этой составляющей значительно уменьшается введением зеркала 7.

В и _b - максимальное значение частоты следования импульсов и постоянная времени затухания составляющей люминесценции определяемой метки соответственно.

Введение зеркала 7 увеличивает амплитуду этой составляющей примерно в 1,8 раза, что улучшает отношение сигнал/фон и сигнал/шум.

С и _c - максимальное значение частоты следования импульсов и постоянная времени затухания долгоживущей мешающей составляющей люминесценции соответственно.

D - частота следования "темновых" импульсов.

Причем _a<_b<_c. Предварительные испытания экспериментального образца устройства показали, что за счет компенсации помех и увеличения полезного сигнала можно улучшить отношение с/ф и с/ш в предлагаемом устройстве.

Чтобы выделить полезный сигнал, соответствующий сигналу долгоживущей люминесценции используемого маркера, и, соответственно, определить концентрацию искомого аналита, необходимо из суммарного сигнала вычесть амплитуды мешающих составляющих. С этой целью используют статистические методы анализа данных измерений, например метод наименьших квадратов. При осуществлении математической обработки данных часть полученных чисел в счетчиках может быть отбракована как ошибочная, в связи с чем для получения достаточной точности измерений количество счетчиков 12, накапливающих импульсы, должно быть больше числа определяемых составляющих сигнала. Проведенные на экспериментальном образце исследования показали, что число счетчиков может быть определено из выражения Nn+2, где n - число определяемых составляющих измеряемого сигнала.

Накопление сигналов в счетчиках и дальнейшая их обработка в электронной системе управления позволяют выделить полезный сигнал, в 20-50 раз улучшить отношение с/ф и понизить порог обнаружения искомых аналитов. Однако для надежной идентификации искомых аналитов в пробе образца этого недостаточно. Вогнутое зеркало увеличивает амплитуду люминесценции общего сигнала, уменьшая фоновые составляющие, что приводит к увеличению отношения с/ф. Апертура входного элемента входного объектива указанной величины позволяет ввести в оптическую систему регистрации блок сменных фильтров высокого контраста, что при сохранении чувствительности позволяет повысить отношение с/ф и селективность анализа за счет значительного подавления люминесценции мешающих примесей вне спектра излучения определяемой флуоресцентной метки (аналита).

Обязательным условием использования интерференционных фильтров высокого контраста является их установка в параллельном световом пучке, при этом отклонение лучей в пучке от параллельности не должно превышать 5^o. Невыполнение этого условия приводит к "размыванию" спектра пропускания за счет того, что ширина спектра по уровню 0,5 увеличивается и растет значение "фона". Технологические ограничения не позволяют получить фильтры высокого контраста со световым диаметром более 40-50 мм при подавлении "фона" более чем в 10⁵ раз. Световой диаметр фильтра, непараллельность пучка, размеры объекта излучения (ширина, глубина и высота) и входная апертура (апертурный угол) - величины взаимосвязанные. Для объекта диаметром 6 мм при глубине 6-8 мм (размер ячейки 96-ячеистой микротитровальной платы) можно построить оптические системы, реализующие условие параллельности, с апертурой 40^o-70^o. С уменьшением размеров объекта значения апертуры увеличиваются, и при плоском объекте диаметром 1,0 мм (дно ячейки микротитровальной платы с 1536 ячейками) можно построить оптические системы регистрации с апертурным углом примерно 90^o.

При этих условиях вся совокупность признаков позволяет, при сохранении высокой чувствительности, получить отношение с/ф, достаточное для детектирования сверхнизких концентраций аналита - 10^-13-10^-15 М.

Кроме того, использование входного элемента оптической системы регистрации с апертурой, меньшей, чем апертура такого же элемента прототипа, позволяет использовать предлагаемое устройство для анализа образцов как на плоском носителе (дно ячейки, чипы), так и жидких образцов в объеме ячейки при высоте столба жидкости 6-8 мм.

Экспериментальный образец устройства изготовлен из элементов и материалов, достаточно распространенных как в России, так и за рубежом.

Устройство может быть использовано для проведения массовых анализов и фундаментальных исследований при разработке тест-систем для выявления различных заболеваний человека путем одновременного определения в исследуемом образце гормонов тиротропина, тироксина, 170Н-прогестерона, иммунореактивного трипсина и т.п.

Формула изобретения

Устройство для измерения люминесценции биологических образцов, содержащее оптически сопряженные источник возбуждающего излучения, оптическую систему возбуждения и оптическую систему регистрации люминесценции, держатель образца, средство для удаления прямого потока возбуждающего излучения и фотодетектор, выход которого связан со входом усилителя-дискриминатора, выход которого связан со входом по крайней мере одного счетчика импульсов, выход которого связан со входом электронной схемы управления и обработки измеряемого сигнала, отличающееся тем, что в оптическую систему регистрации люминесценции введен по крайней мере один фильтр высокого контраста, средство для удаления прямого потока возбуждающего излучения из оптической системы регистрации люминесценции выполнено в виде вогнутого зеркала, установленного между держателем образца и первым входным элементом оптической системы регистрации люминесценции, апертурный угол которого находится в пределах 40-70^o, выход усилителя дискриминатора связан со входами нескольких счетчиков импульсов, выходы которых связаны со входом электронной системы управления и обработки измеряемого сигнала, при этом число счетчиков импульсов N определяется из выражения Nn+2, где n - число определяемых составляющих измеряемого сигнала.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4