Композиция и способ стабилизации биологических материалов путем сушки без замораживания

Композиция и способ стабилизации биологических материалов путем сушки без замораживания

Реферат

 

Сухие, частично аморфные продукты содержат биологически активный материал и стабилизирующие смеси веществ, включающие, по меньшей мере, два компонента. Одно вещество стабилизирующей смеси выбирают из группы, включающей моносахариды, дисахариды и цвиттерион с полярным остатком. Указанный цвиттерион представляет собой аргинин, аспарагиновую кислоту, цитруллин, глутаминовую кислоту, орнитин, гистидин, лизин. Второе вещество стабилизирующей смеси является цвиттерионом с неполярным остатком и представляет собой сложный эфир ацетилфенилаланина, аланин, цистеин, глицин, лейцин, метионин, триптофан, валин, саркозин. Биологически активный материал представляет собой пептиды, протеины, гликопротеины, антитела, вирусы, вакцины, клетки и другие вещества. Согласно способу получения аморфных продуктов готовят раствор биологически активного материала и указанных стабилизирующих веществ, затем раствор высушивают без его замораживания. Стабилизированные биологические материалы обладают устойчивостью при хранении при комнатной температуре и используются для диагностических и терапевтических целей. 2 с. и 18 з.п. ф-лы, 3 ил., 29 табл.

Изобретение относится к композициям и способу стабилизации биологических материалов путем сушки без замораживания. При этом описываются целенаправленно выбранные смеси сахаров и аминокислот и их производных, а также различных аминокислот и их производных, с помощью которых, после получения сухих, частично аморфных продуктов путем сушки без замораживания, можно достигать особенно предпочтительной стабилизации пептидов, протеинов, гликопротеинов, антител и других веществ.

Получение устойчивых при хранении (в особенности, при комнатной температуре) композиций биологически активных и терапевтических веществ, как пептиды, протеины, гликопротеины, нуклеотиды, плазмиды, фрагменты клеток, вирусы и т.д., для диагностических и терапевтических целей в настоящее время имеет большое, постоянное возрастающее значение.

Описаны различные способы и композиции для получения сухого биологически или терапевтически активного материала. Под сухим материалом понимают вещества и смеси веществ, которые имеют остаточную влажность самое большее 8 мас. %, предпочтительно самое большее 4 мас.%, особенно предпочтительно самое большее 2 мас. %. Широко распространены способы сушки вымораживанием [F. Franks, Cryo Lett. , 11, 93-110 (1990); M.J.Pikal, Biopharm., 3 (9), 26-30 (1990); M.Hora, Pharm. Research, 8 (3), 285-291 (1992); F.Franks, Jap.Freezing Drying, 38, 15-16 (1992)], однако им присущи недостатки. При их реализации расходуются большие количества энергии, требуется использование отчасти вредных хладагентов (фреоны), а также они длительны по времени. Для множества веществ, в особенности протеинов, необходимая для сушки вымораживанием стадия замораживания является вредной, то есть дестабилизирующей. Поэтому этот способ совершенно неприменим для некоторых биологических материалов.

Альтернативами сушке вымораживанием при получении сухих протеиновых композиций являются способы, при которых материал высушивают за счет использования тепла и/или вакуума [F.Franks, R.M.H.Hatley: "Стабильность и стабилизация ферментов", изд. W.J.J. van den Teel, A.Harder, R.M. Butlaar, Elsevier Sci. Publ, 1993, с.45-54; B. Roser, Biopharm., 4 (9), 47-53 (1991); J.F. Carpenter, J.H.Crowe, Cryobiol., 25, 459-470 (1988)]. Здесь, например, нужно назвать вакуумную сушку с использованием или без использования повышенной температуры, способ распылительной сушки в различных модификациях, включая комбинированное использование вакуума и техники распыления, а также вальцовую сушку и другие способы высушивания в тонком слое.

В работах J.F.Carpenter, J.H.Crowe, Biochemistry, 28, 3916-3922 (1989); K. Tanaka, T.Taluda, K.Miyajima, Chem.Pharm.Bull., 39 (50, 1091-1094 (1991); патенте ДЕ-С-3520228, патенте ЕР-В-0229810, международной заявке 91/18091, патенте ЕР-В-0383569, патенте США 5 290 765 описываются композиции, которые содержат сахара или сахароподобные вещества. При получении сухих композиций на основе сахаров в случае описанных в уровне техники способов установлены следующие недостатки и проблемы: действительно, в достаточной степени сухие композиции на основе сахаров невозможно получить без значительной затраты энергии. Это относится особенно к композициям в конечной емкости. При этом учитывают применение тепла/нагрева, которое, однако, нужно оценивать крайне критически относительно стабильности используемых биологических материалов. Для достижения достаточной степени высушивания при незначительном подводе тепла альтернативно используют очень продолжительные времена процесса или крайне незначительной толщины слой. Оба варианта способа не приводят к цели. Длительное время крайне неблагоприятно с экономической точки зрения, кроме того, длительное время пребывания биологически активного вещества в матрице, только медленно обедняемой водой, является дестабилизирующим и таким образом также критическим. Высушивание тонкого слоя во многих случаях не приводит к экономически рациональному выходу продукта, то есть в единицу времени и/или в расчете на поверхность высушивания получают только минимальные количества продукта. Кроме того, обработка биологических материалов на очень больших открытых поверхностях высушивания едва реализуема для стерильности, часто требующейся в целях фармацевтического и диагностического применения.

Способы сушки, которые протекают с помощью вакуума при низкой температуре или температуре, незначительно повышенной по отношению к комнатной, являются более щадящими. Однако получение сухих, устойчивых при хранении композиций на основе сахаров во многих случаях практически едва осуществимо. При высыхании растворов сахаров образуются в возрастающей степени вязкие массы. Остающееся в этих массах количество остаточной воды или остаточную влажность нельзя удалить за время, рациональное с экономической точки зрения, во многих случаях высушивание останавливается на непригодном для стабилизации, высоком уровне. Деградация проявляется, например, в уменьшении активности хранящегося материала, в образовании продуктов агрегации или в появлении продуктов деструкции с меньшей молекулярной массой. Пригодное для стабилизации протеинов и т.д., низкое содержание остаточной воды можно определять с помощью физических измеряемых параметров. Из вышецитированной литературы следует, что пригодные для стабилизации протеинов и т.д. композиции должны иметь стекловидную, то есть аморфную структуру, температура стеклования которой находится выше целевой температуры хранения. Температурой стеклования является такая температура, при которой аморфное твердое тело из стеклообразного состояния переходит в вязкое состояние и наоборот. При этом происходят резкие изменения вязкости и связанные с этим изменения коэффициента диффузии и кинетической мобильности протеинов и других молекул. Физические параметры, как твердость и модуль, изменяются точно также, как и термодинамические параметры: объем, энтальпия и энтропия. Температура стеклования, например, содержащей сахар массы и содержание в ней остаточной воды связаны физически друг с другом таким образом, что увеличение количества остаточной воды приводит к понижению температуры стеклования и наоборот. Таким образом, из определения температуры стеклования, например, путем дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), можно сделать вывод, обладает ли композиция пригодным для стабилизации содержанием остаточной воды, соответственно, как указано выше, успешным или нет является способ сушки. Наряду с определением температуры стеклования с помощью ДСК также можно подтверждать наличие аморфных структур с помощью исследований дифракции рентгеновских лучей (рентгеноструктурный анализ), визуальных и электрономикроскопических наблюдений.

Поэтому желательно приготовление стабилизирующей матрицы для биологически или фармацевтически активных материалов с температурой стеклования выше температуры хранения, которая имеет незначительную остаточную влажность, и желателен недорогостоящий способ приготовления такой стабилизирующей матрицы.

Неожиданно найдено, что путем добавления цвиттерионов с неполярными остатками к массам, содержащим углеводы, их поведение при высушивании можно изменять в положительную сторону таким образом, что прежде плохо высыхающие материалы, которые, соответственно, не обладают никакими в достаточной степени стабилизирующими свойствами, теперь могут очень быстро высыхать и придавать отличную стабильность находящимся в них биологически, в особенности терапевтически, активным материалам.

Далее неожиданно найдено, что также препаративные формы, не содержащие углеводов, состоящие из смесей определенных цвиттерионов могут очень быстро высыхать и обладают очень хорошими стабилизирующими свойствами. При этом цвиттерион с полярным остатком нужно применять вместе с цвиттерионом с неполярным остатком. Такими цвиттерионами являются предпочтительно аминокарбоновые кислоты и их производные, особенно предпочтительно фармацевтически приемлемые аминокислоты. Под цвиттерионами понимают низкомолекулярные соединения, молекулярная масса которых ниже 10 кДа, предпочтительно ниже 5 кДа. Описываются способы, которые без использования повышенной температуры, то есть при комнатной температуре, позволяют высушивать предлагаемые согласно изобретению композиции так, что в случае композиций для стабилизации биологически активных, в особенности терапевтически активных, веществ достигают пригодных температур стеклования. Биологически активными веществами, наряду с терапевтически активными веществами, являются также вещества, используемые в биотехнологических способах, как, например, ферментация, а также такие вещества, которые используют, например, для защиты растения или в качестве инсектицидов. Такие биологически, в особенности терапевтически, активные материалы можно выбирать, например, из одного или нескольких веществ следующих групп: протеины, пептиды, гликопротеины, липопротеины, ферменты, коферменты, биологические мембраны, антитела, фрагменты антител, клетки, составные части клеток, вирусы, составные части вирусов, вакцины, ДНК, РНК, агглютинины (PNA), плазмиды, векторы, феромоны, биологически активные терапевтические и диагностические средства и их производные. Под биологически активными веществами не подразумевают никаких пищевых продуктов как таковых.

Особые преимущества описанных в данном случае композиций и способа состоят в том, что - избегают замораживания во время сушки; - высушивание можно осуществлять с помощью уже имеющихся в химико-фармацевтической промышленности установок для сушки вымораживанием без всякого переоснащения; - можно сохранять неизменной особенно предпочтительную для асептического приготовления расфасовку в стандартных сосудах, например в стеклянных пузырьках; - времена процесса сопоставимо со способами сушки вымораживанием и намного меньше; - можно использовать токсикологически безопасные вспомогательные вещества; - можно сберегать всю необходимую для замораживания энергию, резко снижать расход вредных для окружающей среды хладагентов; - полученные продукты представляют собой хорошо различимые, быстро снова растворяющиеся "лепешки"; - за счет быстрого достижения частично аморфного состояния биологический материал меньше деградирует, чем в описанных в уровне техники способах.

Установлено, что особые преимущества представленных в данном случае рецептур из определенных смесей сахаров и аминокислот, а также определенных смесей по меньшей мере из двух аминокислот также действительны, когда используют их в рамках других способов сушки, в которых избегают замораживания. Также при распылительной сушке, вальцовой сушке и т.д. известно действие добавок, ускоряющее высыхание, а также свойство композиций образовывать аморфные или частично аморфные системы.

Существенным является то, что имеются обнаруживаемые с помощью ДСК и/или рентгеноструктурного анализа или других пригодных способов значительные аморфные фракции и композиция не носит полностью кристаллического характера. Кристаллические композиции непригодны для достижения достаточной стабильности в случае чувствительных биологических веществ. Полностью аморфные композиции пригодны для стабилизации и таким образом предлагаемые согласно изобретению, особенно частично аморфные, композиции.

Описание фигур Фиг.1а: температуры стеклования отдельных смесей мальтоза-L-фенилаланин; Фиг.1б: остаточная влажность отдельных смесей мальтоза-L-фенилаланин; Фиг.2: дифрактограмма порошка высушенных в вакууме (а) фенилаланина (содержание кристаллизационной воды 1,2%); (б) мальтозы (содержание воды 4,0%; Тg [температура стеклования] = 50^oС) и (в) фенилаланина и мальтозы, приготовленных согласно изобретению (содержание воды 0,7; Tg=88^oC).

Дифрактограммы сняты с помощью обычного прибора (Phillips 1730 X-ray) и относящегося к нему математического обеспечения; температура измерения составляет 25^oС; угол разрешения (2) составляет 0,05^oС.

Условия измерения: 1 с. На угол при приложенном к трубке напряжении 40 киловольт и силе тока 40 миллиампер; Фиг.3: временная зависимость (а) остаточной влажности и (б) температуры стеклования композиции мальтоза/фенилаланин согласно изобретению.

Изобретение представлено в 13 примерах и 10 сравнительных примерах и поясняется ниже. При этом найдены готовые формы и способы, которые резко улучшают и ускоряют высыхание масс, содержащих сахар, с помощью вакуумной сушки и пригодны для стабилизации биологических материалов, имеющих значение для терапии и диагностики. Далее, указываются совершенно нового рода композиции, которые удовлетворяют цели стабилизации при сохранении оптимизированной характеристики сушки.

Композиции содержат предпочтительно либо по крайней мере один цвиттерион с неполярным остатком (например, аминокислота, как фенилаланин) и сахар, причем температура стеклования сахара за счет этой добавки цвиттериона значительно повышается. Альтернативно, также можно использовать смеси различных, специально подобранных аминокислот или их производных. Эти смеси составляют из цвиттериона с неполярным остатком и цвиттериона с полярным остатком. К этим смесям можно добавлять также еще сахар.

В качестве рабочей гипотезы найдено, что желательный согласно изобретению результат достигают особенно смесями сахара или полярного цвиттерионного вещества (как, например, аргинин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, гистидин, цитруллин, лизин) и неполярного цвиттерионного вещества (как, например, фенилаланин, изолейцин, метионин, валин, аланин, глицин, триптофан, цистеин) или их производных (как, например, этиловый эфир ацетилфенилаланина). Можно легко как изменять способ, так и расширять описанный в примерах список веществ.

Особенно предпочтительными биологически или терапевтически активными материалами являются антитела (моноклональные или поликлональные), ферменты и человеческие протеины, соответственно, человеческие пептиды, как, например, рекомбинантный человеческий эритропоэтин (rh-EPO), рекомбинантный человеческий фактор стимуляции колоний гранулоцитов (rh-G-CSF) или рекомбинантный плазминогенный активатор (rPA), nGF, PTH, уларитиды, плазмиды, вирусы, GUP, BP-5.

На композициях, не содержащих биологически активного вещества, определяют, каким образом добавление аминокислот изменяет высыхание матрицы из сахаров. В пример 1 показано, что добавление фенилаланина и аргинина к мальтозе изменяет ее поведение при высушивании в зависимости от введенного количества этих добавок. Температуру стеклования за счет целевой добавки этих вспомогательных веществ при одинаковых условиях высушивания можно повышать на величину выше 65^oС, остаточную влажность можно легко снижать до величины менее 1%. Из примера 1 следует, что используемый при этом способ приводит к желательному результату в течение 48 часов без всякого воздействия тепла. Мальтоза, без добавляемых согласно изобретению вспомогательных веществ, при этих условиях имеет остаточную влажность 7-8%, температура стеклования находится ниже комнатной температуры и, таким образом, эта система непригодна для стабилизации протеинов.

Получение предлагаемых согласно изобретению композиций из сахарозы и аминокислоты из группы аминокислот, пригодных согласно изобретению для получения стабилизирующих, частично аморфных продуктов позволяет избегать определенных недостатков при приготовлении препаративной формы с сахарозой, в то время как можно полностью сохранять присущие сахарозе преимущества. По сравнению с другими сахарами, упомянутыми в литературе, сахароза имеет относительно низкую температуру стеклования при соответственно нормированных содержаниях воды. Поэтому при приготовлении содержащих сахарозу, сухих композиций особенно трудно достигать высоких температур стеклования, которые отчетливо выше целевых температур хранения. Далее, путем сушки испарением вообще затруднительно переводить сахарозу в аморфную форму, сахар легко кристаллизуется и таким образом легко образует неблагоприятную для стабилизации биологически активных веществ кристаллическую структуру. Кроме того, можно наблюдать, что аморфные массы сахарозы в процессе хранения сравнительно быстро образуют в большом объеме кристаллы и по истечение определенных сроков хранения могут полностью кристаллизоваться. Также при этом процессе такого рода композиция теряет свои стабилизирующие свойства. Все эти связанные с применением сахарозы проблемы, опасности и недостатки можно устранять путем добавления согласно изобретению аминокислот соответствующей группы. При этом особенно предпочтительно использование фенилаланина и аргинина (пример 2). В сравнительном примере А показано, что также при использовании более длительных времен сушки и повышенных температур массы (утфельные массы), состоящие из одних сахаров, не могут эффективно высыхать. Улучшающего высыхание воздействия аминокислот и сахаров можно достигать как с помощью отдельных аминокислот, так и также с помощью смесей аминокислот. В примерах 3 и 4 на этот счет приводятся соответствующие результаты, полученные на системах мальтозы и сахарозы. Также обнаружены аминокислоты, которые не оказывают никаких улучшающих высыхание воздействий, например гистидин (сравнительный пример 1). В примере 5 показано, что наряду с аминокислотами улучшающими высыхание эффектами могут обладать также их структурно-родственные производные. Выбор аминокислот подробно, хотя и не исчерпывающе, описывается в примере 6. Установлено, что далеко не всякая аминокислота приводит к желательному эффекту, а только определенные аминокислоты. Также величина эффектов различная, так что можно указать особенно предпочтительные комбинации или композиции. Такими аминокислотами являются прежде всего фенилаланин, триптофан, лейцин и изолейцин. Из примеров 1 и 6, далее, можно сделать вывод, что возможна смесь аминокислот при сохранении улучшающего высыхание эффекта. Аргинин, используемый индивидуально, не оказывает никакого положительного воздействия, однако может оказывать в смеси с фенилаланином.

Исследовали поведение аминокислот при вакуумной сушке, чтобы установить, можно ли также без матрицы из сахара получать с помощью аминокислот композиции, которые имеют температуру стеклования выше комнатной. Неожиданно обнаружено, что используемая индивидуально чистая аминокислота образует только кристаллическую структуру, в то время как определенные соли аминокислот и смеси аминокислот образуют стекловидную матрицу (сравнительный, пример С и пример 7). Для получения аморфных структур необходимо целенаправленно выбирать различные аминокислоты. Неожиданно найдено, что аминокислоты можно разделять на две группы, которые очевидно обладают различными свойствами. Необходимо выбирать из каждой группы по крайней мере одну аминокислоту, приготовлять соответствующую смесь и высушивать ее. Как и при составлении смесей сахар-аминокислота, также в данном случае необходимо иметь определенное соотношение компонентов смеси, чтобы получить предлагаемые согласно изобретению композиции (пример 7). Тогда получают матрицу с аморфными фракциями, которая пригодна для стабилизации биологически активных веществ.

Эффективность улучшенного высыхания в отношении преследуемой цели, то есть стабилизации биологически активного материала, показанная на примере протеинов, подробно представлена в примерах 8-12 и сравнительных примерах D-J. В примерах 8 и 9 вместе со сравнительными примерами D-G описывается стабилизация rh-G-CSF, в примере 10 и сравнительном примере Н описывается стабилизация эритропоэтина и в примерах 11 и 12, а также в сравнительных примерах I и J описывается стабилизация лактатдегидрогеназы. Руководствуясь временами хранения протеина (rh-G-CSF, примеры 8 и 9 соответственно, сравнительные примеры D, Е и F, G), гликопротеина (rh-EPO, пример 10 и сравнительный пример Н) и фермента (лактатдегидрогеназа, примеры 11, 12 и сравнительные примеры I и J) показана, например, неожиданно сильно улучшенная стабильность при хранении предлагаемых согласно изобретению композиций по сравнению с подвергнутыми вакуумной сушке композициями без вспомогательных веществ и другими композициями. В примерах представлены изменения в различных композициях с rh-G-CSF в условиях хранения при различных температурах. Только предлагаемые согласно изобретению, то есть частично аморфные, стекловидные композиции спустя 6 месяцев не проявляют никакой деградации в диапазоне температур хранения от менее градуса Цельсия (холодильник) вплоть до 40^oС (примеры 8 и 9). Соответствующие композиции, не содержащие вспомогательного вещества и подвергнутые вакуумной сушке, (сравнительный пример D) при комнатной температуре и повышенной температуре хранения (40^oС) показывают отчетливое уменьшение содержания мономера вплоть до 20%. Не аморфные, но вязкие композиции, которые хранятся при температуре выше температуры стеклования, уже при комнатной температуре спустя 5 недель показывают значительное снижение концентрации мономеров (сравнительные примеры D+E). Кристаллические композиции (сравнительные примеры G и J) точно также имеют более короткие времена хранения. Из сравнения данных примера 8 и сравнительного примера Е видно, что при повышенной температуре хранения (40^oС) добавление аминокислот к мальтозе в качестве стабилизаторов более чем в 10 раз увеличивает время хранения, за которое агрегируются менее чем 10% мономеров G-CSF. Сравнение данных примера 9 с таковыми сравнительного примера G показывает, что также выбор аминокислот является решающим для значительно увеличенного времени хранения. Сравнение мономерной доли в случае гликопротеина ЕРО (пример 10, сравнительный пример Н) показывает, что предлагаемые согласно изобретению композиции в случае хранения при комнатной температуре и повышенной температуре отчетливо превосходят высушенный в вакууме ЕРО без вспомогательных веществ. При хранении в течение 5 недель чувствительного фермента лактатдегирогеназы в виде предлагаемых согласно изобретению композиций (примеры 11 и 12) по сравнению с высушенной в вакууме лактатдегидрогеназой без вспомогательных веществ (сравнительный пример I) и кристаллической композицией (сравнительный пример J) оказывается, что только предлагаемые согласно изобретению композиции могут храниться при комнатной температуре или при повышенной температуре (30^oС) без резкой потери активности. При этом интерес представляет также дополнительная стабилизация фермента за счет предлагаемой согласно изобретению композиции непосредственно после приготовления образцов (активность при 0 недель >80%, до 65% в случае не содержащей вспомогательных веществ композиции, соответственно, 10% в случае кристаллической композиции). Типичная зависимость от времени процесса сушки предлагаемой согласно изобретению смеси представлена в примере 13.

Для приготовления предлагаемых согласно изобретению смесей по крайней мере из двух аминокислот в целях получения быстровысыхающих, стекловидных композиций при необходимости по крайней мере одну аминокислоту и ее производные нужно выбирать из нижеуказанных двух групп: группа 1: аргинин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, гистидин, цитрулин, лизин, орнитин; группа 2: фенилаланин, изолейцин, лейцин, метионин, валин, аланин, глицин, триптофан, этиловый эфир ацетилфенилаланина, цистеин, саркозин.

Применение только одной аминокислоты или нескольких аминокислот только из одной из обеих групп не приводит к предпочтительным согласно изобретению композициям. Предлагаемые согласно изобретению смеси можно получать, как показано в примерах, тем, что к раствору стабилизатора биологически или терапевтически активных веществ примешивают цвиттерион с неполярным остатком, например фенилаланин или его производные, в различных количествах. Высушенные при комнатной температуре смеси затем исследуют с помощью ДСК для определения, обладают ли они повышенной за счет добавления цвиттериона температурой стеклования. При этом температура стеклования по сравнению с композициями без добавок согласно изобретению повышается на 10^oС, предпочтительно на 20^oС, особенно предпочтительно на 40^oС. Предлагаемые согласно изобретению предпочтительные композиции являются частично аморфными, имеют температуру стеклования выше 4^oС, предпочтительно выше 20^oС, особенно предпочтительно выше 40^oС, и обладают соответствующей остаточной влажностью менее чем 6%, предпочтительно менее чем 4%. Их кажущаяся плотность, соответственно, насыпной вес составляет величину по меньшей мере на 10%, предпочтительно на 50%, выше таковой соответствующих лиофилизатов. Они сохраняют свою хрупкую, стекловидную, компактную, частично аморфную структуру в течение по меньшей мере двух недель, предпочтительно двух месяцев, особенно предпочтительно в течение одного года. Кроме того, время их высыхания (то есть время, за которое достигают одинаковой остаточной влажности), по сравнению со смесями, которые содержат только углевод или цвиттерион с неполярным остатком, уменьшается предпочтительно на 25%, особенно предпочтительно в два раза или даже в четыре раза. Эти смеси веществ можно также размалывать или подвергать дальнейшей обработке, например использовать в терапевтических или диагностических средствах в комбинации с обычными вспомогательными веществами или носителями. Терапевтическими средствами являются лекарственные формы, которые содержат один или несколько терапевтически активных компонентов наряду с обычными вспомогательными веществами и добавками. Они могут находиться в форме таблеток, капсул с лекарством или твердых веществ, из которых путем добавления жидкости (например, стерильной воды или буфера) получают терапевтически активные растворы (например, растворы для внутривенного введения). Далее, они особенно пригодны для введения с помощью различных способов в виде твердых веществ, например, в виде спрея для носа, лекарственной формы для ингаляции или трансдермального порошка и т.д.

ПРИМЕР 1 Вакуумная сушка смесей мальтозы с L-аргинином и L-фенилаланином Готовят раствор, содержащий 50 мг моногидрата мальтозы и 0,1 мг полисорбата 80 на мл. К нему затем добавляют возрастающие количества L-аргинина и L-фенилаланина в равных количествах (по массе). Таким образом, полученные растворы стерильно фильтруют (фильтр из нитрата целлюлозы; 0,22 мкм) и затем по 1 мл каждого раствора вносят в пузырьки емкостью 2 мл и затем закрывают пробками для сушки вымораживанием. Таким образом, подготовленные образцы подвергают вакуумной сушке одинаковым образом при температуре 20^oС в течение 48 часов при пониженном давлении. После высушивания определяют содержание воды в образцах по способу Карла Фишера и температуру стеклования с помощью дифференциального термического анализа (Перкин Эльмер DCS 7 - скорость нагревания образцов = 10^oС в минуту). Результаты измерения показывают, что поведение при высушивании мальтозы за счет добавления определенных количеств аминокислот отчетливо изменяется. Начиная с 7,5 г каждой аминокислоты содержание воды в образцах отчетливо снижается и температура стеклования соответственно этому повышается. При использовании 10 мг L-аргинина и 10 мг L-фенилаланина достигают значений, которые более не могут увеличиваться за счет дальнейшего повышения долей аминокислот в высушенном продукте. К раствору сахара, содержащему 50 мг моногидрата мальтозы и 0,1 мг полисорбата 80 на мл, добавляют возрастающие количества аминокислот. Полученные после высушивания продукты имеют указанные ниже содержания воды и температуры стеклования (см. табл.1).

ПРИМЕР 2 Вакуумная сушка смесей сахарозы с L-аргинином и L-фенилаланином К раствору сахарозы, который содержит 50 мг сахарозы и 0,1 мг полисорбата 80 на мл, добавляют возрастающие количества L-аргинина и L-фенилаланина в равных количествах (по массе). Образцы готовят, высушивают и анализируют, как указано в примере 1. При использовании количеств аминокислот вплоть по 10 мг получают полностью кристаллические продукты. Лишь, начиная с 10 мг L-аргинина и 10 мг L-фенилаланина на мл можно идентифицировать частично аморфные продукты со стеклованием. В этом примере за счет добавления аминокислот улучшают не только поведение при высушивании раствора, но и с помощью этой добавки систему переводят в частично аморфное состояние. К раствору сахаров, содержащему 50 мг сахарозы и 0,1 мг полисорбата 80 на мл, добавляют возрастающие количества аминокислот. Полученные после высушивания продукты имеют нижеуказанные содержания воды и температуры стеклования (см. табл.2).

Сравнительный пример А Вакуумная сушка чистых растворов сахаров Готовят раствор моногидрата мальтозы и раствор сахарозы с концентрацией 50 мг/мл. Эти растворы сахаров затем фильтруют, расфасовывают и анализируют, как описано в примере 1. Обнаружено, что даже при высушивании в течение 72-х часов при температуре 50^oС при пониженном давлении невозможно высушить 50 мг сахара в пузырьке емкостью 2 мл до удовлетворительной остаточной влажности так, чтобы температура стеклования была выше 25^oС. Содержащий мальтозу продукт имеет вязкую консистенцию и остаточную влажность 6,4%. Стеклование происходит при 20^oС. В случае сахарозы имеются еще 6,0% остаточной воды, стеклование происходит при 14^oС. Для сравнения, чистые растворы сахаров также высушивают в течение 48 часов при температуре 20^oС и при пониженном давлении. Полученные продукты еще влажные и поэтому стеклование происходит при еще более низкой температуре, чем в случае высушенных при температуре 50^oС образцов. Этот опыт отчетливо показывает, что только за счет добавки определенных аминокислот можно высушивать слои сахаров в пузырьках для инъекции или подобных емкостях путем вакуумной сушки до незначительной остаточной влажности. Таким образом, налицо улучшенное поведение при высушивании за счет добавления аминокислот (см. табл.3).

ПРИМЕР 3 Вакуумная сушка смесей мальтозы с L-фенилаланином и мальтозы с L-изолейцином В этом опыте готовят теперь бинарные смеси аминокислот с моногидратом мальтозы. Опыт проводят с целью проверки, обладают ли используемые здесь аминокислоты улучшающими высушивание свойствами и какова количественная зависимость улучшающего высушивание эффекта в случае отдельных аминокислот. К раствору, содержащему 50 мг моногидрата мальтозы на мл, добавляют возрастающие количества L-фенилаланина и L-изолейцина. Таким образом, приготовленные растворы стерильно фильтруют (фильтр из нитрата целлюлозы; 0,22 мкм) и затем по 1 мл каждого раствора вносят в пузырьки емкостью 2 мл и закрывают пробками для сушки вымораживанием. Таким образом, подготовленные образцы подвергают вакуумной сушке при температуре 20^oС и при пониженном давлении в течение 48 часов. После высушивания определяют содержание воды в образцах по способу Карла Фишера, в каждом случае четырехкратно и измеряют температуру стеклования с помощью дифференциального термического анализа (Перкин Эльмер DSC 7 - скорость нагрева образцов = 10^oС в минуту), используя по две пробы на смесь.

а) Результат в случае смесей мальтозы с L-фенилаланином Результаты измерения отчетливо показывают положительное влияние L-фенилаланина на поведение мальтозы при высушивании. Уже незначительных количеств L-фенилаланина достаточно для того, чтобы повысить температуру стеклования сахара в стекловидном состоянии при сохранении условий высушивания примерно на 50^oС (фиг.1а и 1б). При содержании 10 мг/мл L-фенилаланина улучшающий высушивание эффект достигает максимума. Путем добавления больших количеств L-фенилаланина более невозможно достигать никакого улучшения. Таким образом, за счет добавления L-фенилаланина температура стеклования по сравнению с таковой чистой мальтозы повышается примерно на 80^oС. В случае больших количеств L-фенилаланина (10-20 мг/мл) в этом опыте нельзя обнаружить никакого различия в поведении при высушивании. Однако оно изменяется при более коротких временах высушивания. В этом случае при использовании возрастающих количеств L-фенилаланина можно наблюдать повышение температуры стеклования также в области 10-20 мг L-фенилаланина. В таблице 4 представлены количество L-аланина в растворе сахара, достигаемая в результате высушивания полученных растворов остаточная влажность и температура стеклования Тg.

Кроме того, снимают дифрактограммы порошка повергнутых вакуумной сушке фенилаланина, мальтозы и предлагаемой согласно изобретению смеси фенилаланина с мальтозой (фиг.2а, 2б, 2в). Чистый фенилаланин дает типичную дифрактограмму кристаллического вещества (фиг.2а), в то время как мальтоза имеет дифрактограмму аморфного вещества (фиг. 2а). Только в случае предлагаемой согласно изобретению смеси приходят к образованию частично аморфных структур, обнаруживаемому по дискретным максимумам дифракции на широком фоновом сигнале (фиг.2в).

6) Результат в случае смесей мальтозы с L-изолейцином К концентрированному запасному раствору, содержащему 50 мг моногидрата мальтозы на мл, добавляют различные количества L-изолейцина и отдельные смеси высушивают при температуре 20^oС. С увеличивающимся количеством аминокислоты становится отчетливым улучшающий высушивание эффект. При добавлении 20 мг/мл L-изолейцина (соотношение компонентов смеси 5:2 по массе) Тg содержащего мальтозу продукта можно повышать примерно на 20^oС. В таблице 5 представлены количество L-изолейцина в растворе сахара, достигаемая в результате высушивания полученных растворов остаточная влажность и температура стеклования Тg.

ПРИМЕР 4. Вакуумная сушка смесей сахарозы с L-лейцином В нижеследующих опытах готовят бинарные смеси сахарозы с различными аминокислотами. Эти опыты проводят с целью проверки, оказывают ли используемые аминокислоты на сахарозу воздействие, улучшающее высушивание. К раствору, содержащему 50 мг сахарозы на мл, добавляют возрастающие количества L-лейцина. Растворы обрабатывают, как описано в примере 3.

Результат случае смесей сахарозы с L-лейцином С небольшими количествами L-лейцина сахароза образует кристаллический продукт. Это образование кристаллических продуктов можно было также наблюдать в примере 2 при использовании L-аргинина и L-фенилаланина. Следовательно, при смешении с определенными аминокислотами сахароза образует кристаллические продукты. Чистый сахар и смеси с большими количествами L-лейцина образуют системы, способные стекловаться. Это означает, что имеется частично аморфная структура. Так, обнаружено, что лишь концентрации L-лейцина начиная с 15 мг/мл улучшают характеристику высыхания чистой сахарозы и за счет добавления этой аминокислоты температуру стеклования можно повышать примерно на 18^oС. Таким образом, L-лейцин представляет собой аминокислоту с улучшающим высушивание эффектом. В табл.6 представлены количество L-лейцина в растворе сахара, достигаемая в результате высушивания полученных растворов остаточная влажность и температура стеклования Тg конечных продуктов.

Сравнительный пример В Вакуумная сушка смес