Конденсированные изоиндолоны в качестве ингибиторов протеинкиназы с

Конденсированные изоиндолоны в качестве ингибиторов протеинкиназы с

Реферат

 

Изобретение относится к новым конденсированным изоиндолонам формулы I где кольца В и F независимо друг от друга представляют 6-членное карбоциклическое кольцо; R¹ означает Н, C₁-C₄ алкил; А¹ и А² попарно выбирают из группы, включающей =O, Н, -OR", где R" означает Н; В¹ и В² попарно означают =O; Х во всех положениях независимо друг от друга выбирают из группы: а) незамещенный С₁-С₃ алкилен, b) -S-; R³, R⁴, R⁵, R⁶ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей Н, ₁-C₄ алкил; соединения 1 можно использовать для ингибирования протеинкиназы С (PKC) и подавления активности тирозинкиназы (trk). Выявленные свойства позволяют использовать соединения 1 для ингибирования пролиферации раковых клеток. 2 з.п. ф-лы, 15 ил., 3 табл.

Область техники Данное изобретение относится к конденсированным арил- или гетеро-арилзамещенным изоиндол-2- и -2,4-дионам, которые далее именуются "конденсированными изоиндолонами". Объектами этого изобретения являются также способы получения и применения указанных соединений.

Предпосылки изобретения Публикации, приведенные в этом описании изобретения, включены в него в качестве ссылки.

Выделяемое из микроорганизмов вещество, известное как "К-252а", в последние годы привлекает к себе пристальное внимание благодаря многосторонней функциональной активности, которую оно проявляет. К-252а представляет собой алкалоид индолкарбазола, который первоначально был выделен из культуры Nocordiosis sp. (Kase, H. et al., 39 J. Antibiotics 1059, 1986). К-252а является ингибитором нескольких ферментов, в том числе протеинкиназы С ("РКС") и тирозинкиназы (trk). Функциональные активности К-252а являются многочисленными и разнообразными, например, ингибирование роста опухолей (патенты США 4877776 и 5063330; публикация европейского патента 238011, выданного Номато), противоинсектицидная активность (патент США 4735939), ингибирование воспалительных процессов (патент США 4816450), лечение заболеваний, связанных с нервными клетками (публикация WIPO WO 94/02488, выданный Cephalon, Inc. и Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., опубликованная 3 февраля 1994 г.).

Указанные индолкарбазолы обладают несколькими общими свойствами. В частности, все они имеют бис-индольную гетероциклическую часть. Стауроспорин (выделяемый из Streptomyces sp.) и К-252а (выделяемый из Nocordiosis sp.) содержат часть молекулы сахара, которая присоединена двумя N-гликозидными связями (к атомам азота индола). Как К-252а, так и стауроспорин всесторонне исследованы относительно их применения в качестве терапевтических средств. Индолкарбазолы, как правило, являются липофильными веществами, благодаря чему они сравнительно легко проникают через биологические мембраны, и в отличие от белковых веществ характеризуются более длительным периодом полураспада in vivo.

Единственным недостатком К-252а, обладающего разнообразным и полезным действием, является то, что источником его получения служат микроорганизмы, поэтому это вещество приходится выделять из культуральной среды путем ферментации. В научной литературе описан процесс синтеза К-252а, но он не пригоден для коммерческого применения (Wood, J. et al., J. Am.Chem. Soc., 1995, 117, 10413). Поэтому соединения, обладающие функциональным действием, присущим К-252а, но получаемые посредством химического синтеза, имели бы большое преимущество по сравнению с индолкарбазольными соединениями, известными в настоящее время.

Краткое изложение существа изобретения Данное изобретение относится к соединениям, которые далее именуются "конденсированными изоиндолонами". Эти соединения являются биологически активными. Конденсированные изоиндолоны представляют собой не содержащие индола молекулы, которые могут быть синтезированы de novo химическим путем.

Конденсированные изоиндолоны по настоящему изобретению отличаются от индолкарбазолов тем, что они не имеют атома азота в 12- или 13-положениях (алфавитные обозначения колец, приведенные в статье Porter et al., 57, J. Org. Chem. 2105, 1992, использованы в справочных целях). Кроме того, конденсированные изоиндолоны не содержат часть молекулы сахара, присоединенную двумя N-гликозидными связями. Благодаря тому, что у этих соединений отсутствует указанная часть молекулы сахара, они могут быть легко синтезированы. Полезным и привлекательным является то, что эти не содержащие индола соединения, источником которых не являются микроорганизмы, можно легко синтезировать, а также то, что они обладают биологической активностью, делающей их пригодными для целого ряда применений, где раньше использовали только определенные индолкарбазолы.

Конденсированные изоиндолоны по настоящему изобретению имеют следующую общую формулу (формула I): Предпочтительные конденсированные изоиндолоны выражены формулой II Ниже подробно описываются структурные элементы этих соединений. В соединениях формул I и II элемент "X" в кольцах С и Е не является азотом.

В этом описании изобретения рассматриваются также предпочтительные способы синтеза, в том числе методы получения изомеров лактама.

Конденсированные изоиндолоны предназначены для разных целей, например, их можно использовать отдельно или в сочетании с одним или несколькими нейтротропными факторами и/или индолкарбазолами для усиления функционирования и/или жизнеспособности нервных клеток, для ингибирования протеинкиназы С (РКС) и подавления активности тирозинкиназы (trk). Указанное последним действие имеет непосредственное отношение к ингибированию пролиферации раковых клеток, в том числе при раковых заболеваниях предстательной железы. Благодаря разнообразному действию соединения по настоящему изобретению могут найти применение в ряде областей, включая научные исследования и терапию.

Подробное описание изобретения I. Краткое описание чертежей На фиг. 1 изображен график, показывающий воздействие производных I-1 и I-2 конденсированных изоиндолонов на активность СhАТ спинного мозга.

На фиг. 2 изображен график, показывающий стимулирующее действие конденсированных изоиндолонов на активность СhАТ в основании переднего мозга.

На фиг.3 изображена схема синтеза производных бисиндена.

На фиг.4 изображена схема синтеза конденсированных изоиндолонов.

На фиг.5 изображена схема синтеза конденсированных изоиндолонов, в которых Х является -С(=0)-.

На фиг.6 изображена схема синтеза конденсированных изоиндолонов (X = карбонил) из 1-инданонов.

На фиг.7 изображена схема синтеза конденсированных изоиндолонов, имеющих две карбонильные группы.

На фиг. 8 изображена схема синтеза конденсированных изоиндолонов с помощью реакции Михаэля.

На фиг. 9 изображена схема синтеза выбранных конденсированных изоиндолонов с помощью реакции Виттига.

На фиг.10 изображена схема синтеза Х-бис-алкилированных конденсированных изоиндолонов.

На фиг.11 изображена схема синтеза гетероциклических изоиндолонов с конденсированным кольцом В.

На фиг.12 изображена схема синтеза бис-гетероциклических изоиндолонов с конденсированными кольцами В и F.

На фиг.13 изображена схема синтеза производных бис-бензотиафена.

На фиг.14 изображена схема синтеза производных инденилбензотиафена.

На фиг. 15 изображена схема синтеза конденсированных изоиндолонов с помощью реакции Дильса-Альдера при использовании ацетилендикарбоксилата.

II. Конденсированные изоиндолоны Объектом настоящего изобретения являются конденсированные изоиндолоны формулы I где кольца В и F независимо друг от друга выбирают из группы, включающей (a) 6-членное карбоциклическое ароматическое кольцо, в котором до 3 атомов углерода замещены атомами азота; (b) 5-членное карбоциклическое ароматическое кольцо; и (c) 5-членное карбоциклическое ароматическое кольцо, в котором (1) один атом углерода замещен атомом кислорода, азота или серы; и (2) два атома углерода замещены атомом азота и серы или атомом азота и кислорода; R¹ выбирают из группы, включающей Н; алкил с 1-4 атомами углерода; арил; арилалкил; гетероарил; гетероарилалкил; COR⁹, где R⁹ выбирают из группы, включающей алкил с 1-4 атомами углерода, арил и гетероарил; -OR¹⁰ где R¹⁰ выбирают из группы, включающей Н и алкил с 1-4 атомами углерода; -CONH₂, -NR⁷R⁸, -(CH₂)_n NR⁷R⁸ и -О (СН₂)_n NR⁷R⁸, где n равен 1-4, и (a) R⁷ и R⁸ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей Н и алкил с 1-4 атомами углерода; или (b) R⁷ и R⁸, вместе взятые, образуют связующую группу формулы - (СН₂)₂-Х¹-(СН₂)₂-, где X¹ выбирают из группы, включающей -О-, -S- и -СН₂-; А¹ и А² попарно выбирают из группы, включающей Н, Н; Н, -OR¹¹, где R¹¹ обозначает Н, алкил с 1-4 атомами углерода, арил с 6-10 атомами углерода или гетероарил; Н, -SR¹¹; Н, -N(R¹¹)₂; =0; =S и =NR¹¹, где А¹ и А², вместе взятые, могут обозначать атом с двойной связью; B¹ и В² попарно выбирают из группы, включающей Н, Н; Н, -OR¹¹; Н, -SR¹¹; H, -N(R¹¹); = 0; =S и -NR¹¹, где В¹ и В², вместе взятые, могут обозначать атом с двойной связью; при условии, что по крайней мере одна из пар А¹ и А², и В¹ и В² обозначает =0; Х во всех положениях независимо друг от друга выбирают из группы, включающей: (a) незамещенный алкилен с 1-3 атомами углерода; (b) алкилен с 1-3 атомами углерода, замещенный R², где R² выбирают из группы, включающей: (1) OR¹⁰; -SR¹⁰; R¹⁵, где R¹⁵ является алкилом с 1-4 атомами углерода; фенил; нафтил; арилалкил с 7-15 атомами углерода; Н; -SO₂R⁹; -CO₂R⁹; -COR⁹; алкил, алкенил и алкинил с 1-8 атомами углерода, где (i) каждый алкил, алкенил или алкинил с 1-8 атомами углерода не замещен; или (ii) каждый алкил, алкенил или алкинил с 1-8 атомами углерода замещен одним из заместителей, выбираемым из группы, включающей 1-3 арил с 6-10 атомами углерода; гетероарил; F; Cl; Вr; I; -CN; -NO₂; ОН; -OR⁹; -О(СН₂)_nNR⁷R⁸, где n равен 1-4; -OCOR⁹, -OCONHR⁹; 0-тетрагидропиранил; NH₂; -N R⁷R⁸, -NR¹⁰COR⁹; -NR¹⁰CO₂R⁹; -NR¹⁰CONR⁷R⁸; -NHC(=NH)NH₂; -NR¹⁰SO₂R⁹; -S(O)_yR¹¹, где у равен 1 или 2; -SR¹¹; -CO₂R⁹; -CONR⁷R⁸; -CHO; -COR⁹; -CH₂OR⁷; -CH= NNR¹¹R¹², где R¹² выбирают из группы, включающей Н, алкил с 1-4 атомами углерода, арил с 6-10 атомами углерода и гетероарил; -CH=NOR¹¹; -CH=NR⁹; -CH= NNHCH(N= NH)NH₂; -SO₂NR¹²R¹³, где R¹³ выбирают из группы, включающей Н, алкил с 1-4 атомами углерода, арил с 6-10 атомами углерода и гетероарил, либо R¹² и R¹³, вместе взятые, образуют связующую группу; -PO(OR¹¹)₂, -OR¹⁴, где R¹⁴ является остатком аминокислоты, получаемым после удаления гидроксильной группы из карбоксильной группы; или (2) моносахарид с 5-7 атомами углерода, в котором каждая гидроксильная группа независимо от других может быть не замещена или замещена Н, алкилом с 1-4 атомами углерода, алкилкарбонилоксигруппой с 2-5 атомами углерода или алкоксильной группой с 1-4 атомами углерода; и с) функциональную группу, выбираемую из группы, включающей -СН= СН-; -СНОН-СНОН-; -О-; -S-; -S(= O)-; -S(S=O)₂-; -C(R¹⁰)₂-; -C= C(R₂)₂; -C(= O)-; -C(=NOR¹¹); -С(OR¹¹) (R¹¹)-; -C(=O)CH(R¹⁵)-; -CH(R¹⁵)C(= O)-; -(=NOR¹¹)CH(R¹⁵); -CH(R¹⁵)C(=NOR¹¹)-; CONR¹⁵; NR¹⁵CO; -CH₂Z-; -ZCH₂- и -CH₂ZCH₂-, где Z является -CR¹¹; -O-; -S-; -C(=O)OR¹¹; -C(=NOR¹¹) и -NR¹¹; R³, R⁴, R⁵ и R⁶ независимо друг от друга выбирают из группы, включающей Н; арил; гетероарил; F; Cl; Br; I; -CN; СF₃; -NO₂; ОН; -OR⁹; -O(CH₂)_nNR⁷R⁸; -OCOR⁹; -OCONHR⁹; NH₂; -СН₂ОН; -CH₂OR¹⁴; -NR⁷R⁸; -NR¹⁰OR⁹; -NR¹⁰CONR⁷R⁸; -SR¹¹; -S(O)_yR¹¹, где у равен 1 или 2; -CO₂R⁹; -COR⁹; -CONR⁷R⁸; -CHO; -CH= NOR¹¹; -CH= NR⁹; -CH=NNR¹¹R¹²; -(CH₂)_nSR⁹, где n равен 1-4; -(CH₂)_nS(O)yR⁹; -CH₂SR¹⁵, где R¹⁵ является алкилом с 1-4 атомами углерода; -CH₂S(O)_yR¹⁴; - (СН₂)_n, NR⁷R⁸; - (CH₂)_nNHR¹⁴; алкил, алкенил, алкинил с 1-8 атомами углерода, где (a) каждый алкил, алкенил или алкинил с 1-8 атомами углерода не замещен; или (b) каждый алкил, алкенил или алкинил с 1-8 атомами углерода замещен одним из заместителей, выбираемых из группы, включающей 1-3 арил с 6-10 атомами углерода; гетероарил; F; Cl; Вr; I; -CN; NO₂; ОН; -OR⁹; -O(CH₂)_nNR⁷R⁸; -OCOR⁹; -OCONHR⁹; 0-тетрагидропиранил; NH₂; -NR⁷R⁸; -NR¹⁰COR⁹; -NR¹⁰CO₂R⁹; -NR¹⁰ONR⁷R⁸; -NHC (=NH) NH₂; -NR¹⁰SO₂R⁹; -S(O)_yR¹¹, где у равен 1 или 2; -SR¹¹; -CO₂R⁹; -CONR⁷R⁸; -CHO; COR⁹; -CH₂OR⁷; -CH=NNR¹¹R¹²; -CH= NOR¹¹, -CH= NR⁹; -CH=NNHCH(N=NH)NH₂; -SO₂NR¹²R¹³; -PO(OR¹¹)₂; OR¹⁴ или моносахарид с 5-7 атомами углерода, в котором каждая гидроксильная группа независимо от других может быть не замещена или замещена Н, алкилом с 1-4 атомами углерода, алкилкарбонилоксигруппой с 2-5 атомами углерода или алкоксильной группой с 1-4 атомами углерода.

Предпочтительные варианты осуществления данного изобретения относятся к конденсированным изоиндолонам формулы II Предпочтительно А¹ и А² попарно выбирают из группы, включающей Н, Н; Н, ОН; и =0; и В и В попарно выбирают из группы, включающей Н, Н; Н, ОН; и =0; при условии, что А¹ и А² или В¹ и В² обозначают = 0.

R¹ предпочтительно является Н. Когда R¹ обозначает COR⁹ и R⁹ обозначает арил, R⁹ предпочтительно является фенилом или нафтилом.

Х в одном из положений или в обоих положениях предпочтительно является незамещенным алкиленом с 1-3 атомами углерода, -О- или -S-. Когда Х замещен R², предпочтительной группой R² является OR¹⁰. Когда R² обозначает арилалкил с 7-14 атомами углерода, такая группа предпочтительно является бензилом. Когда R² обозначает алкил, алкенил или алкинил, такая группа предпочтительно является алкилом, алкенилом или алкинилом с 1-4 атомами углерода. Когда R² обозначает замещенный алкил, алкенил или алкинил, где заместитель является арилом, этот арил предпочтительно является фенилом или нафтилом. Когда заместителем группы R² является -S(O)_yR¹¹, где R¹¹ обозначает арил, он предпочтительно является фенилом или нафтилом. Когда заместителем группы R² является -CH= NNR¹¹R¹² или -SO₂NR¹²R¹³, где R¹² или R¹³ обозначает арил, он предпочтительно является фенилом или нафтилом. Когда R¹² и R¹³, вместе взятые, обозначают связующую группу, такой связующей группой предпочтительно является - (СН₂)₂-Х¹- (СН₂)₂-, где Х¹ выбирают из группы, включающей -О-, -S- и -СН₂-.

R³, R⁴, R⁵ и R⁶ предпочтительно являются Н. Когда по крайней мере один из R³, R⁴, R⁵ и R⁶ обозначает арил, он предпочтительно является арилом с 6-10 атомами углерода, более предпочтительно он является фенилом или нафтилом, при условии, что R³ или R⁴ обозначает Н, и R⁵ или R⁶ обозначает Н. Когда по крайней мере один из R³, R⁴, R⁵ и R⁶ обозначает алкил, алкенил или алкинил с 1-8 атомами углерода, он предпочтительно является алкилом, алкенилом или алкинилом с 1-4 атомами углерода, при условии, что R³ или R⁴ обозначает Н, и R⁵ или R⁶ обозначает Н.

Приводимые здесь числовые интервалы включают все указанные числа. Например, интервал, определяемый как "1-4 атома углерода", охватывает значения 1, 2, 3 и 4. За исключением особо оговоренных случаев, термины "арил" или "гетероарил" предполагают, что арильная или гетероарильная группа может быть замещенной или незамещенной.

Используемый в определении R¹⁴ термин "аминокислота" означает молекулу, содержащую как аминогруппу, так и карбоксильную группу. В объем определений этого термина входит "а-аминокислота", представляющая собой карбоновую кислоту, к атому углерода которой, смежному с карбоксильной группой, присоединена функциональная аминогруппа. а-Аминокислоты могут быть натуральными или синтетическими. Аминокислоты могут также включать "дипептиды", которые определяются здесь как две аминокислоты, соединенные пептидной связью. Таким образом, структурные элементы дипептидов не ограничиваются а-аминокислотами и могут представлять собой любую молекулу, содержащую как аминогруппу, так и карбоксильную группу. Предпочтение отдается а-аминокислотам, дипептидам, таким как лизил--аланин, и аминоалкановым кислотам с 2-8 атомами углерода, например, 3-диметиламиномасляной кислоте.

В объем настоящего изобретения входят также фармацевтически приемлемые соли производных конденсированных изоиндолонов. Используемый здесь термин "фармацевтически приемлемые соли" означает соли присоединения неорганических кислот, такие как гидрохлорид, сульфат и фосфат, или соли присоединения органических кислот, такие как ацетат, малеат, фумарат, тартрат и цитрат. Примерами фармацевтически приемлемых солей металлов являются соли щелочных металлов, такие как соль натрия и соль калия, соли щелочноземельных металлов, такие как соль магния и соль кальция, соль алюминия и соль цинка. Примерами фармацевтически приемлемых солей аммония являются соль аммония и соль тетраметиламмония. Примерами фармацевтически приемлемых солей присоединения органического амина являются соли морфолина и пиперидина. Примерами фармацевтически приемлемых солей присоединения аминокислот являются соли лизина, глицина и фенил-аланина.

Рассматриваемые здесь соединения могут входить в состав фармацевтических композиций, получаемых путем смешивания указанных соединений с фармацевтически приемлемыми нетоксичными наполнителями и разбавителями. Как указывалось выше, такие композиции можно использовать для парентерального введения, например, в виде жидких растворов или суспензий; для перорального введения, например, в виде таблеток или капсул; для назального введения, например, в виде порошков, капель в нос или аэрозолей; или для дермального применения, например, в виде лейкопластыря.

Указанные композиции можно использовать в виде дозированных лекарственных форм и можно получать известными в фармакологии методами, например, в соответствии с описанием, приведенным в справочнике Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980). Препараты для парентерального введения могут содержать в качестве разбавителей дистиллированную воду или солевой раствор, полиалкиленгликоли, такие как полиэтиленгликоль, растительные масла, гидрированные нафталины и тому подобные. В частности, полезными наполнителями, регулирующими высвобождение активных соединений, являются биологически совместимые и биологически разрушаемые лактиды, сополимеры лактида и гликолида или сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена. Другими потенциально полезными веществами, способствующими парентеральному введению указанных активных соединений, являются сополимеры этилена и винилацетата, осмотические насосы, имплантируемые нагнетающие системы и липосомы. Препараты для ингаляции содержат в качестве наполнителей лактозу или могут быть водными растворами, содержащими, например, полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, гликохолат и деоксихолат, или масляными растворами, используемыми как капли в нос или гель, наносимый на слизистую оболочку носа. Указанные препараты могут также содержать гликохолат для трансбуккального введения, салицилат для ректального введения или лимонную кислоту для вагинального введения. Составами для лейкопластырей предпочтительно являются липофильные эмульсии.

Вещества по настоящему изобретению можно использовать в качестве единственного активного компонента в фармацевтической композиции или в сочетании с другими активными ингредиентами, например, с другими факторами роста, которые усиливают жизнеспособность нервных клеток или регенерацию аксонов при лечении раковых заболеваний или ВИЧ-инфекции.

Содержание соединений по настоящему изобретению в лекарственных композициях зависит от ряда факторов, в том числе от дозы лекарственного средства, химических свойств (например, гидрофобности) используемых соединений и способа введения. Как правило, соединения по данному изобретению можно использовать для парентерального введения в водном физиологическом буферном растворе, содержащем от около 0,1 до 10% соединения в отношении веса к объему. Типичные дозы составляют от около 1 мкг/кг до около 1 г/кг массы тела в день; предпочтительная доза составляет от около 0,01 мг/кг до 100 мг/кг массы тела в день. Требуемая доза вводимого лекарственного средства, по-видимому, зависит от типа и серьезности заболевания, общего состояния здоровья нуждающегося субъекта, относительной биологической эффективности выбранного соединения, состава наполнителей и способа применения лекарственного средства.

III. Применение конденсированных изоиндолонов Конденсированные изоиндолоны обладают важной функциональной фармакологической активностью, которая может найти применение в ряде областей, включая научно-исследовательскую работу и терапию. Конденсированные изоиндолоны, как правило, положительно воздействуют на функционирование и/или жизнеспособность клеток, реагирующих на трофический фактор, и ингибируют ферментативную активность, в частности, таких ферментов, как trk и РКС.

Воздействие на функционирование и/или жизнеспособность клеток, реагирующих на трофический фактор, например, нервных клеток, можно определить с помощью любого из следующих анализов: (1) анализа холинацетилтрансферазы ("ChAT") в культуре клеток спинного мозга; или (2) анализа активности ChAT в культуре нервных клеток основания переднего мозга ("BFN"). Подавление ферментативной активности можно определить с помощью анализов на ингибирование РКС и тирозинкиназы trk.

Термин "воздействие", используемый вместе с терминами "функционирование" и "жизнеспособность", означает положительное или отрицательное изменение их деятельности. Положительное воздействие можно рассматривать как "усиление" или "стимулирование", а отрицательное воздействие определяется как "ингибирование" или "подавление".

Термины "усиление" или "стимулирование", используемые вместе с терминами "функционирование" или "жизнеспособность", означают, что присутствие конденсированного изоиндолона оказывает положительное действие на функционирование и/или жизнеспособность клеток, реагирующих на трофический фактор, по сравнению с клетками, не подвергающимися воздействию конденсированного изоиндолона. В частности, на примере холинэргических нейронов, не ограничивающем данное изобретение, можно показать, что конденсированный изоиндолон усиливает жизнеспособность холинэргических нейронов с повышенным риском гибели (вследствие повреждения, заболевания, дегенеративного состояния или естественного развития) по сравнению с холинэргическими нейронами, которые не подвергаются воздействию такого конденсированного изоиндолона, если период функционирования обработанной популяции клеток увеличивается по сравнению с необработанной популяцией клеток.

Используемые здесь термины "ингибирование" и "подавление" означают, что указанная реакция конкретного вещества (например, ферментативная активность) не проявляется в присутствии конденсированного изоиндолона.

Используемый здесь термин "нейрон", "клеточная линия нейронов" и "нервная клетка" означает, не ограничиваясь этим определением, гетерогенную популяцию типов нервных клеток, имеющих один или несколько медиаторов и/или выполняющих одну или несколько функций; такими клетками предпочтительно являются холинэргические и сенсорные нейроны. Используемая здесь фраза "холинэргические нейроны" означает нейроны центральной и периферической нервной системы, нейромедиатором которых является ацетилхолин; примерами таких клеток являются нейроны основания переднего мозга и спинного мозга. Используемая здесь фраза "сенсорные нейроны" означает нейроны, реагирующие на раздражители (например, температуру, движение) кожи, мышц и суставов; примерами таких клеток являются нейроны DRG.

Рассматриваемые здесь "клетки, реагирующие на трофический фактор" являются клетками с рецепторами, с которыми может специфически связываться трофический фактор; примерами таких клеток являются нейроны (например, холинэргические и сенсорные нейроны) и клетки, не являющиеся нейронами (например, моноциты и неопластические клетки).

Термин "trk" относится к семейству высокоаффинных рецепторов нейротрофина, который включает trk А, trk В и trk С, а также другие относящиеся к мембране белки, с которыми может связываться нейротрофин.

А. Воздействие на функционирование и/или жизнеспособность клеток, реагирующих на трофический фактор Рассматриваемые конденсированные изоиндолоны можно использовать для усиления функционирования и/или жизнеспособности клеточной линии нейронов. В этой связи конденсированные изоиндолоны можно применять отдельно или вместе с другими конденсированными изоиндолонами, а также в сочетании с другими эффективными молекулами, такими как индолкарбазолы, которые также обладают способностью воздействовать на функционирование и/или жизнеспособность указанных клеток.

Ряд неврологических нарушений связан с гибелью, повреждением, разрушением аксонов, повышенным риском гибели нервных клеток и т.д. Эти нарушения включают, не ограничиваясь ими, болезнь Альцгеймера; заболевания, связанные с двигательными нейронами (например, боковой амиотрофический склероз); болезнь Паркинсона; цереброваскулярные нарушения (например, инсульт, ишемия); болезнь Хантингтона; слабоумие при СПИДе; эпилепсию; рассеянный склероз; периферическую невропатию (например, поражение нейронов DRG при периферической невропатии вследствие химиотерапии), в том числе диабетическую невропатию; нарушения, вызываемые возбуждающими аминокислотами; нарушения, связанные с сотрясениями или проникающими травмами головного или спинного мозга.

Как показано в примерах, приведенных в этом разделе описания изобретения, способность конденсированного изоиндолона усиливать функционирование и/или жизнеспособность клеточной линии нейронов, можно определить с помощью (1) анализа активности ChAT спинного мозга или (2) анализа активности ChAT основания переднего мозга.

ChAT катализирует синтез ацетилхолина нейромедиаторов и считается ферментативным маркером для функционильных холи-нэргических нейронов. Функциональные нейроны также способны к выживанию. Жизнеспособность нейронов анализируют путем количественного определения специфического поглощения и ферментативного превращения красителя (например, calcein AM) жизнеспособными нейронами.

Благодаря разнообразному действию конденсированных изоиндолонов, они проявляют эффективность в ряде анализов. Эти соединения можно использовать для создания in vitro моделей жизнеспособности нервных клеток, их функционирования и идентификации или для анализа других синтетических соединений, которые обладают таким же действием, что и конденсированные изоиндолоны. Эти соединения можно использовать в научно-исследовательской работе, целью которой является исследование, выявление и определение клеток-мишеней на молекулярном уровне, имеющих отношение к функциональным реакциям. Например, если конденсированные изоиндолоны, вызывающие определенные функции клеток (например, митогенеэ), пометить радиоактивным изотопом, можно идентифицировать, выделить и очистить клетки-мишени, с которыми связываются конденсированные изоиндолоны, с целью их последующего исследования.

Дегенерация, гибель или нефункционирование нейронов являются признаками многих неврологических нарушений у человека, к которым относятся, не ограничиваясь ими, болезнь Альцгеймера; заболевания, связанные с двигательными нейронами (например, боковой амиотрофический склероз); болезнь Паркинсона; цереброваскулярные нарушения (например, инсульт, ишемия); болезнь Хантингтона; слабоумие при СПИДе; эпилепсия; рассеянный склероз; нарушения, связанные с сотрясениями или проникающими травмами головного или спинного мозга; периферическая невропатия; нарушения, вызываемые возбуждающими аминокислотами. Поскольку рассматриваемые соединения эффективно повышают активность ChAT, то в объем настоящего изобретения входит применение указанных соединений для лечения нарушений, связанных, например, с пониженной активностью или гибелью нейронов DRG.

Пример III (A)(1). Анализ активности ChAT спинного мозга Как указывалось выше, ChAT является специфическим бихимическим маркером для функциональных холинэргических нейронов. Холинэргические нейроны имеют непосредственное отношение к образованию гиппокампа, обонятельных ядер, ядер межмозгового вещества, коркового вещества, миндалевидного тела и частей таламуса. Расположенные в спинном мозге двигательные нейроны являются холинэргическими нейронами, содержащими ChAT (Phelps et al., J. Соmр. Neurol. 273:459-472 (1988)). Активность ChAT используют для исследования воздействия нейротрофинов (например, NGF или NT-3) на жизнеспособность и/или функционирование холинэргических нейронов. Анализ ChAT служит также для определения изменения уровней ChAT в холинэргических нейронах.

Производные конденсированных изоиндолонов увеличивают активность ChAT при выполнении анализа в культуре диссоциированного спинного мозга зародыша крысы (фиг. 1). Соединение 1-2 увеличивает активность ChAT на 150% по сравнению с контрольными культурами (которые не обрабатывали конденсированным изоиндолоном) после культивирования клеток на планшете в течение 2-3 часов с целью их прикрепления к контрольным лункам с тканевой культурой. При выполнении этих анализов конденсированный изоиндолон добавляют непосредственно к культуре диссоциированного спинного мозга. Соединения по настоящему изобретению увеличивают активность ChAT спинного мозга. Активными считаются соединения, которые увеличивают активность ChAT по крайней мере на 120% по сравнению с активностью контрольной культуры. Увеличение активности ChAT наблюдается после однократного введения конденсированного изоиндолона. Указанное соединение вводили в тот же день, когда получали культуру диссоциированных клеток спинного мозга. Повышение активности ChAT обнаружено через 48 часов.

Методы.

Клетки спинного мозга зародыша крысы диссоциировали и использовали для выполнения анализов в соответствии с описанными методами (Smith et al., J. Cell Biology 101:1608-1621 (1985); Glicksman et al., J. Neurochem. 61:210-221 (1993)). Диссоциированные клетки получали из спинного мозга крыс (14-15 день развития эмбриона) с помощью стандартных методов диссоциации трипсином (Smith et al., J. Cell Biology 10:1608-1621 (1985)). Клетки помещали в количестве 6 х 10⁵ клеток/см² в лунки с тканевой культурой пластикового планшета, покрытого поли-1-орнитином, в среде N₂ без сыворотки, дополненной 0,05% бычьего сывороточного альбумина (Bottenstein et al., PNAS USA 76:514-517 (1979)). Культуры инкубировали в течение 48 часов при температуре 37^oС во влажной атмосфере, состоящей из 5% СО₂ и 95% воздуха. Активность ChAT определяли через 2 дня in vitro no методу Фоннума (Fonnum, J. Neurochem. 24: 407-409 (1975)), модифицированному МакМанаманом и др. и Гликсманом и др. (McManaman et al. . Developmental Biology 125:311-320 (1988); Glicksman et al., J. Neurochem. 61:210-221 (1993)).

Пример III(А)(2). Анализ активности ChAT основания переднего мозга Производные конденсированного изоиндолона анализировали в отношении их способности увеличивать активность ChAT в культурах основания переднего мозга. Установлено, что конденсированные изоиндолоны увеличивают активность ChAT в культурах основания переднего мозга (фиг.2). Контрольные культуры не обрабатывали конденсированным изоиндолоном.

При выполнении предварительных анализов активности ChAT основания переднего мозга соединения 1-3 и 1-4 не увеличивали активность ChAT.

Методы.

У эмбрионов крыс иссекали основание переднего мозга (17 или 18 день развития эмбрионов) и диссоциировали клетки нейтральной протеазой (Dispase^ТМ, Collaborative Research). Нейроны помещали с плотностью 5 х 10⁴ клеток/лунку (1,5 х 10⁵ клеток/см²) на планшеты, покрытые поли-1-орнитином и ламинином. Клетки культивировали при температуре 37^oС в среде N₂ без сыворотки, содержащей 0,05% бычьего сывороточного альбумина, во влажной атмосфере, состоящей из 5% СО₂ и 95% воздуха. Активность ChAT определяли через 5 дней после культивирования с помощью анализа ChAT, описанного в примере III(А) (1).

В. Ингибирование ферментативной активности Способность индолкарбазола К-252а ингибировать ферментативную активность РКС хорошо известна и описана в научной литературе. Ингибирование активности РКС считается одним из возможных путей подавления, опосредования, ослабления и/или предупреждения различных болезней, в том числе воспалительных заболеваний, аллергических и раковых состояний, как это указано в приводимых ниже справочных материалах, а именно в патентах США 4877776 и 4923986; в опубликованном описании изобретения к европейскому патенту 558962 (выдан 8 сентября 1993 г. компании E.R. Squibb & Sons, Inc.); Tadka, Т. et al., 170(3) Biochem. Biophys. Res. Comm. 1151, 1980). Тирозинкиназы, к которым относится trk, являются ферментами, катализирующими перенос -фосфата аденозинтрифосфата (АТР) в гидроксильную группу тирозина многих основных белков. Установлено, что тирозинкиназы активированных белков являются продуктами примерно половины известных онкогенов (см., Chang, C-J & Geahlen, R.L. 55(11) J. Nat. Prods. 1529, 1992), поэтому для подавления, опосредования, ослабления и/или профилактики ряда раковых заболеваний необходимо ингибировать активность протеинкиназы (см. выше, Chang, C-J).

Благодаря взаимосвязи, существующей между активностью протеинкиназы и определенными заболеваниями и нарушениями (например, раком), конденсированные изоиндолоны можно эффективно использовать в научно-исследовательской работе и лечебной практике. В научно-исследовательской работе эти соединения можно использовать, например, для создания анализов и моделей, позволяющих понять, какую роль играет ингибирование протеинкиназы (например, РКС, тирозинкиназы trk) в механизме возникновения некоторых нарушений и заболеваний. В лечебной практике соединения, ингибирующие подобную ферментативную активность, можно использовать для устранения губительных последствий этих ферментов, выражающихся в возникновении таких нарушений, как рак.

Приводимые ниже данные свидетельствуют об ингибировании ферментативной активности рассматриваемыми конденсированными изоиндолонами в результате выполнения следующих анализов: (1) анализ ингибирования активности РКС; (2) анализ ингибирования активности тирозинкиназы trkA.

Пример III(B) (1). Анализ ингибирования активности РКС Конденсированные изоиндолоны ингибируют активность протеинкиназы С (таблица VI). Описанный в литературе анализ протеинкиназы С (Murakata et al., патент США 4923986; Kikkawa et al., J. Biol. Chem. 257:13341-13348 (1982)) выполняли при нескольких концентрациях конденсированных изоиндолонов и определяли концентрацию, позволяющую ингибировать 50% протеинкиназы С (IC₅₀), таблица I и III.

Пример III(В) (2). Анализ ингибирования активности тирозинкиназы trkA Конденсированные изоиндолоны ингибируют активность тирозинкиназы при выполнении твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). trkA является высокоаффинным рецептором для нейротрофинов. Конденсированные изоиндолоны помещали на 96-луночные титрационные микропланшеты, которые предварительно покрывали фосфорилирующим субстратом (фосфолипаза С- (PLC) /слитый белок pGEX) (см. Rotin et al., 11 EMBO J. 559, 1992). Эти соединения затем анализировали на способность ингибировать фосфорилирование субстрата тирозинкиназой trkA, табл. II и III Методы 96-луночные планшеты для выполнения твердофазного иммуноферментного анализа (Nunc) покрывали 100 мкл/лунку фосфорилирующего субстрата (40 мкг/мл PLC / слитого белка pGEX) в 20 ммолях трисбуфера, рН 7,6, 137 ммоль NaCl и 0,02% NaN₃ и оставляли на ночь при тем