Лиганд, специфически связывающий ствол рецептора полимерного иммуноглобулина (pigr) клетки, способ интродукции лиганда в клетку и способ присоединения лиганда к клетке, экспрессирующей рецептор полимерного иммуноглобулина

Лиганд, специфически связывающий ствол рецептора полимерного иммуноглобулина (pigr) клетки, способ интродукции лиганда в клетку и способ присоединения лиганда к клетке, экспрессирующей рецептор полимерного иммуноглобулина

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается лиганда и способов специфического его связывания со стволом рецептора полимерного иммуноглобулина (pIgR) клетки при условии, что лиганд практически не связывает секреторный компонент pIgR в физиологических условиях. Лиганд может быть направлен на клетку, в клетку или для прохождения через нее и может содержать биологически активные вещества. Данное изобретение может быть использовано для транспорта терапевтических и диагностических композиций на эпителиальные клетки слизистых оболочек, внутрь данных клеток или через них. 3 с. и 25 з. п. ф-лы.

Изобретение в основном относится к лиганду и способам специфического связывания лиганда с участком ствола рецептора полимерного иммуноглобулина для интернализации в клетку или транспорта через нее.

Уровень техники Одной из наиболее острых проблем, стоящих перед фармацевтической и биофармацевтической промышленностью, является доставка терапевтических агентов через различные полупроницаемые мембраны в организме. В частности, когда дело касается макромолекул, эффективному с точки зрения стоимости, а также удобному или подходящему методу лечения часто препятствует отсутствие адекватной системы доставки лекарственного вещества. В свою очередь данная проблема продиктована экономической осуществимостью производства лекарственного препарата. Таким образом, поиск альтернативных систем доставки часто конкурирует с поиском самих новых лекарственных веществ.

Способы переноса генов могут рассматриваться как пример доставки макромолекулярного лекарственного вещества. Данные способы можно разделить на три категории: физические (например, электропорация, прямой перенос гена и бомбардировка частицами), химические (например, протеиноиды, микроэмульсии и липосомы) и биологические (например, векторы на основе вирусов и обусловленное рецепторами поглощение). Среди биологических способов переноса обусловленное рецепторами поглощение является наиболее перспективным подходом. Направление лиганда на поглощаемый посредством эндоцитоза рецептор становится средством переноса (транспортировки) данного лиганда в клетку. Однако одним недостатком систем, связанных с рецепторами, является общая для них зависимость от внутривенного способа введения, что существенно ограничивает возможности их применения.

Клетки слизистого эпителия выстилают ряд легко доступных тканей, таких как ткани, имеющиеся в верхних дыхательных путях и желудочно-кишечном тракте. Доступность данных клеток делает их привлекательной мишенью для доставки лекарственного вещества. См., например, статьи Fercol и соавт. (J. Clin. Invest. 92: 2394-2400 (1993)); Fercol и соавт. (J. Clin. Invest. 95: 493-502 (1995)). В работе Breitfeld и соавт. (J. Cell Biology 109:475-486 (1989) описан ретроградный (по типу обратной связи) транспорт антитела из полости к базолатеральной поверхности эпителиальных клеток, хотя осуществляемый на очень низких уровнях. В данном исследовании обнаружено, что после продвижения через клетку антитело связывается с секреторным компонентом рецептора полимерного иммуноглобулина (pIgR). Касательно уровня транспорта с базолатеральной поверхности к апикальной Breitfeld и соавт. сообщили, что менее 5% транспорта было ретроградным по своей природе. Номинальный уровень противоположно направленного транспорта снижает до минимума использование секреторного компонента в качестве средства для доставки биологически активных композиций в клетку. Более того, вследствие преобладания в полости расщепленного pIgR связывание лиганда с расщепленным pIgR, а не с интактным pIgR клеточной поверхности, снижало бы возможность использования противоположно направленного транспорта pIgR в качестве механизма доставки лекарственного вещества.

Соответственно, в уровне техники настоятельно требуются средства для переноса лигандов внутрь клетки или насквозь через клеточную поверхность с высокой эффективностью. В частности, в уровне техники требуются средства для доставки макромолекул к клетке, выстилающей желудочно-кишечный тракт или дыхательные пути, в данную клетку или для прохождения через нее. Данное изобретение представляет указанные или иные преимущества.

Сущность изобретения Согласно одному аспекту данное изобретение направлено на лиганд, который специфически связывает ствол рецептора полимерного иммуноглобулина pIgR клетки при таком условии, что лиганд практически не связывает секреторный компонент pIgR в физиологических условиях. В типичном случае антитело специфически связывает только ствол. В одном варианте осуществления лиганд является антителом, предпочтительно человеческим антителом. В другом варианте осуществления лиганд является фрагментом вариабельного участка рекомбинантного антитела из одной цепи. В еще одном варианте осуществления лиганд связывает внеклеточный эпитоп на участке из первых 33 аминокислот, которые в клеточной мембране являются проксимальными сайту расщепления рецептора.

Лиганд может содержать связывающий компонент для связывания со стволом и биологически активный компонент, такой как нуклеиновая кислота, белок, радиоизотоп, липид и углеводород. Биологически активные компоненты содержат противовоспалительные агенты, антисмысловые олигонуклеотиды, антибиотики и антибактериальные агенты. В одном варианте осуществления биологически активный компонент представлен нуклеиновой кислотой, кодирующей муковисцидозный регулятор трансмембранной проводимости дикого типа. В предпочтительном варианте осуществления клетка представлена эпителиальной клеткой, наиболее предпочтительно эпителиальной клеткой млекопитающего.

В другом аспекте данное изобретение направлено на способ интродукции лиганда в клетку, экспрессирующую рецептор полимерного иммуноглобулина, посредством присоединения лиганда к стволу рецептора полимерного иммуноглобулина клетки при условии, что лиганд практически не связывает секреторный компонент pIgR в физиологических условиях. В одном варианте осуществления лиганд присоединяется к стволу на апикальной поверхности клетки, а в других вариантах осуществления лиганд подвергается трансцитозу на базолатеральную поверхность клетки и высвобождается из ствола на базолатеральной поверхности.

В другом аспекте данное изобретение касается способа присоединения лиганда к клетке, экспрессирующей рецептор полимерного иммуноглобулина, который предусматривает стадию связывания лиганда со стволом рецептора при условии, что лиганд практически не связывает секреторный компонент pIgR в физиологических условиях. В одном варианте осуществления лиганд интродуцируют в клетку после связывания. Альтернативные варианты осуществления данного изобретения могут стать понятными при ссылке на различные аспекты данного изобретения.

Среди различных вариантов применения in vitro и in vivo данное изобретение может быть использовано для транспорта терапевтических и диагностических композиций на эпителиальные клетки слизистых оболочек, внутрь данных клеток или через них. Таким образом, изобретение представляет высоко эффективное и удобное средство для переноса нуклеиновых кислот или белков в эпителиальные клетки.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Данное изобретение направлено на лиганд, который специфически связывает рецептор полимерного иммуноглобулина (pIgR) клетки при условии, что лиганд практически не связывает секреторный компонент pIgR в физиологических условиях. Изобретение представляет среди прочего способы присоединения и интродукции лиганда в клетку, экспрессирующую PlgR.

После транспорта к апикальной поверхности эпителиальных клеток большая часть pIgR расщепляется с высвобождением секреторного компонента. Мы к своему удивлению неожиданно обнаружили, что расщепление интактного pIgR в полости сохраняет интактным остаточный экстрацеллюларный (внеклеточный) участок pIgR (т.е. "ствол") и более того, что ствол сохраняет способность к связыванию, несмотря на обилие протеаз, которые обычно присутствуют в среде полости. Способность к связыванию, эндоцитоз и трансцитоз лиганда, связанного со стволом pIgR, частично представляет изобретение, как описано и заявлено здесь.

Данное изобретение имеет применение как средство для транспорта терапевтических или диагностических композиций к клеткам, экспрессирующим pIgR, внутрь данных клеток (эндоцитоз) и через них (трансцитоз). Таким образом изобретение может быть использовано для транспорта биологически активных композиций, таких как белки, нуклеиновые кислоты или определяемые метки, конкретно к клеткам, экспрессирующим pIgR. Изобретение также представляет средство для мечения и распознавания эпителиальных клеток из смешанной клеточной популяции при исследованиях патологий. Далее, поскольку экспрессия pIgR в карциномах понижена относительно таковой у клеток нормального эпителия, мечение pIgR имеет применение в качестве диагностического вспомогательного средства в способах эндоскопии или радиологии. Кроме того, связывание терапевтических лигандов с pIgR может найти применение для увеличения периода их пребывания в полости различных путей и повышения их эффективности.

Определения До тех пор, пока здесь не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в контексте заявки, имеют то же самое значение, что обыкновенно подразумевается специалистами, в области, к которой относится изобретение. Словари Singleton и соавт. (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, второе издание, John Wiley and Sons (New York)и Hale and Marham (1991) The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY предлагают специалисту словарную основу многих терминов, используемых в данном изобретении. Аминокислоты могут быть определены либо своими общеизвестными трехбуквенными символами, либо однобуквенными символами, рекомендованными Биохимической номенклатурной комиссией IUPAC-IUB. Нуклеотиды подобным образом могут быть определены общепринятыми однобуквенными обозначениями. Для целей данного изобретения ниже определены следующие термины.

Термины "лиганд" или "связывающая структура (часть) лиганда" означают все молекулы, способные к специфическому связыванию рецептора полимерного имуноглобулина (pIgR). Лиганды включают, но не ограничиваются антителами, белками, пептидами, нуклеиновыми кислотами, липидами и углеводами.

Термин "биологически активный компонент" означает соединение, которое in vivo непосредственно вызывает или ингибирует увеличение или уменьшение клеточной транскрипции, трансляции, связывание рецептора, активный или пассивный транспорт, клеточный сигнал, сигнальную трансдукцию, деление клетки, клеточную дифференциацию, гибель клетки, клеточную адгезию, движение клетки, морфологию клетки, метаболизм, ферментную активность, апоптоз, деградацию белков, продвижение белков (например, секрецию), стабильность белков или фосфорилирование. Биологически активные компоненты также содержат диагностические композиции, которые позволяют проводить оценку вышеупомянутых событий.

Термины "связывают(ет) специфически" или "специфически связывают(ет) или "связанный (присоединенный)" или "связывающий (присоединяющий)" означают предпочтительную ассоциацию лиганда (полностью или частично) с клеткой или тканью, несущей определенную молекулу-мишень или маркер, но не с клетками или тканями, в которых отсутствует данная молекула-мишень. Понятно, конечно, что может существовать определенная степень неспецифического взаимодействия между молекулой и клеткой или тканью-немишенью. Тем не менее, специфическое связывание может быть распознано и выделено, так как оно обусловлено специфическим узнаванием молекулы-мишени. Как правило, специфическое связывание приводит к гораздо более сильной ассоциации (связи) между доставленной молекулой и клетками, несущими молекулу-мишень, чем между связанной молекулой и клетками, у которых отсутствует молекула-мишень. Специфическое связывание обычно приводит к увеличению больше чем в 2 раза, предпочтительно больше чем в 5 раз, более предпочтительно больше чем в 10 раз и наиболее предпочтительно больше чем в 100 раз количества связанного лиганда (на единицу времени) на клетку или ткань, несущую молекулу-мишень, по сравнению с клеткой или тканью, у которых отсутствует молекула-мишень или маркер.

Термин "ствол" означает экстрацеллюларный (внеклеточный) компонент рецептора полимерного иммуноглобулина (pIgR), соответствующий участку pIgR, который связывается с клеткой после расщепления сегмента pIgR, образующего секреторный компонент. Ствол присутствует независимо от того, является ли сегмент pIgR, который соответствует секреторному компоненту, отщепленным или не отщепленным от pIgR.

Термин "pIgR" или "рецептор полимерного иммуноглобулина" означает рецептор, который экспрессируется в эпителиальных клетках слизистых оболочек, включая эпителиальные клетки дыхательных путей, железистые клетки подслизистых оболочек, клетки кишечника, эпителий носа, эпителий молочной железы, слизистой оболочки рта, мочевых и половых путей, а также конъюктивальной ткани, и участвует в трансцитозе димерного иммуноглобулина A (dIgA) и/или пентамерного IgM от базолатеральной к апикальной поверхности.

Термин "практически не связывает" означает, что не больше чем 15% лиганда, специфически связывающего молекулу-мишень, связывает определенную молекулу-немишень. Более предпочтительно, не больше 10% связывает молекулу-немишень, даже более предпочтительно менее 5% и наиболее предпочтительно менее 1%.

Термин "секреторный компонент" означает экстрацеллюларную часть pIgR, которая обычно отщепляется после завершения процесса трансцитоза от базолатеральной к апикальной поверхности. В типичном случае секреторный компонент содержит димерный связывающий фрагмент pIgR, именно IgA (dIgA). Секреторный компонент как правило выделяется в полость совместно или без связанного с ним dIgA.

Термин "физиологические условия" означает внеклеточную среду, имеющую условия (например, температуру, рН или осмолярность), которые обеспечивают питательные вещества или рост представляющей интерес клетки.

Термин "антитело" означает молекулу иммуноглобулина, полученную при генерации гуморального ответа in vitro или in vivo, и включает как поликлональные, так и моноклональные антитела. Термин также включает генно-инженерные формы, такие как химерные антитела (например, гуманизированные мышиные антитела), гетероконъюгированные антитела (например, биспецифические антитела) и рекомбинантные фрагменты Fv из одной цепи (scFv). Термин "антитело" также включает антиген-связывающие формы антител (например, Fab, F(аb)₂).

Термин "гуманизированное антитело" означает антитело, которое содержит аминокислотную последовательность нечеловека, константный участок которой был изменен с целью снижения иммуногенности у человека.

Термин "муковисцидозный регулятор трансмембранной проводимости дикого типа" означает функциональную (активную) форму муковисцидозного регулятора трансмембранной проводимости (CFTR). См. статью Riordan и соавт., Science, 245:1066-1073 (1989).

Термин "апикальная поверхность" означает ту поверхность клетки, к которой происходит трансцитоз интактного pIgR после эндоцитоза с базолатеральной поверхности. В основном апикальная поверхность клетки прилегает к полости, в которой интактный pIgR расщепляется с высвобождением секреторного компонента.

Термин "базолатеральная поверхность" означает ту поверхность клетки, с которой после синтеза в эндоплазматической сети и прохождения через аппарат Гольджи доставляется интактный pIgR.

Термин "поверхность ствола" означает экстрацеллюларный участок ствола.

Термин "высвобожденный (выделенный)" означает вмешательство в специфическую ассоциацию лиганда (в целом или частично) с его молекулой-мишенью.

Термин "подвергнутый трансцитозу" или "трансцитоз" означает перенос из одной плазматической мембраны клетки на другую внутриклеточным путем. Как правило трансцитоз происходит с базолатеральной на апикальную или с апикальной на базолатеральную плазматическую мембрану клетки.

Термин "проксимально клеточной мембране" означает около или вблизи клеточной мембраны.

Термин "экстрацеллюларный (внеклеточный)" означает участок, простирающийся наружу из двойного липидного слоя, окружающего клетку.

Идентификация pIgR Последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот рецептора полимерного иммуноглобулина были идентифицированы у многих таксономически различных видов. См. работу Piskurich и соавт. Journal of Immunology 154:1735-1747 (1995). Идентификация pIgR из других видов может быть выполнена любым хорошо известным специалистам способом. Например, может быть сконструирован зонд нуклеиновой кислоты к pIgR с использованием опубликованных последовательностей pIgR. Зонд как правило следует создавать на основе консервативного участка pIgR. Гибридизация зонда с библиотекой геномной или кДНК может быть использована для идентификации pIgR у неизученных видов. Специалисту следует понимать, что последовательность нуклеиновой кислоты зонда pIgR должна быть в большинстве случаев последовательностью вида, который наиболее близок к виду, анализируемому зондированием. Обширный материал по гибридизации нуклеиновых кислот представлен в монографии Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Гибридизация с помощью зондов нуклеиновых кислот, часть 1, глава 2 "Обзор принципов гибридизации и стратегии анализов с помощью зонда нулеиновой кислоты", Elsevier, New York.

В альтернативном подходе pIgR или его пептидные фрагменты (например, секреторный компонент) могут быть использованы для скрининга экспрессирующих библиотек. См., например, статью Fercol с соавт., J. Clin. Invest. 95:493-502 (1995). Данные и иные способы, хорошо известные специалистам, могут быть обнаружены, например, в руководствах Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook с соавт. (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2 изд.), тома 1-3 и Current Protocols in Molecular Biology, под ред. F.M. Ausubel с соавт., Current Protocols, объединение Greene Publishing Associates Inc. и John Wiley & Sons, Inc. (1994, Дополнение) (Ausubel). Подтверждение того, что нуклеиновая кислота (или белок) идентична той, которая кодирует pIgR, может быть выполнено с помощью таких подходов, как конструирование антител к предполагаемому белку pIgR и подтверждение способности данных антител связывать белок, которому присущи свойства pIgR (например, присутствие на поверхности эпителиальных клеток, связывание димерного IgA или пентамерного IgM и т.п.).

Идентификация ствола Ствол может быть идентифицирован множеством хорошо известных специалистам способов. Была выявлена предполагаемая гептапептидная консенсусная последовательность, которая тождественна участку расщепления pIgR и определяет таким образом идентифицированный амино-конец ствола. Последовательность Phe-Ala-Xaa-Glu (SEQ ID No 1), где Хаа является полярной или заряженной аминокислотой, была идентифицирована как расположенная непосредственно перед данным предполагаемым участком расщепления. См. статью Piskurich с соавт. Journal of Immunology 154: 1735-1747 (1995). Расщепление по консенсусному участку высвобождает секреторный компонент и определяет его карбокси-конец. Карбоксильный конец секреторного компонента может быть изменен событиями вторичного расщепления (например, с помощью экзопептидазной или эндопептидазной активности), которые приводят к получению вторичных карбокси-концов. Однако амидная связь, которая изначально определяет амино-конец ствола и карбокси-конец секреторного компонента, может быть выявлена путем сравнительного анализа последовательности и идентификацией расщепляемой консенсусной последовательности.

Способы анализа последовательностей с целью их сравнения известны в уровне техники. Оптимальный сравнительный анализ последовательностей может быть выполнен с использованием алгоритма локальной гомологии, предложенного в работе Smith и Waterman (1981) Adv. Appl. Math., 2:482; алгоритма сравнительного анализа гомологий последовательностей Needleman и Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; способом поиска аналогий, предложенного в работе Pearson и Lipman (1988) Ргос. Natl. Sci. USA 85:2444; посредством компьютеризированного применения данных алгоритмов (включая, но не ограничиваясь CLUSTAL в программе PC/Gene Intelligenetics, Mountain View, California, GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr. Madison, Wisconsin, USA); программа CLUSTAL подробно описана в публикациях Higgins и Sharp (1988) Gene, 73:237-244 и Higgins и Sharp (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet и соавт. (1988) Nucleic Acids Research 16, 10881-90; Huang и соавт. (1992) Computer Applications in the Biosciences 8, 155-65 и Pearson и соавт. (1994) Methods in Molecular Biology 24, 307-31. Сравнительный анализ также часто проводят путем исследования и сравнения "вручную".

При другом подходе секреторный компонент может быть выделен из жидкостей в апикальной полости (например, из молока или желчи) и определен хорошо известными специалистам способами секвенирования аминокислотной последовательности, такими как деградация по Edman или масс-спектрометрия, как описано в статье Eiffert и соавт., Hoppe-Seyler's Z. Physiol Chem. 365:1489-1495 (1984). Среди различных вторичных карбоксильных концов, определенных с помощью событий вторичного расщепления, может быть идентифицирована карбокси-концевая аминокислота, которая прилегает к сайту расщепления.

Пептиды, которые соответствуют стволу pIgR выбранных видов, включают: Мышиный: Glu-Arg-Glu-Ile-Gln-Asn-Val-Arg-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu-Asn-Arg-Ala-Ser- Gly-Asp-Ala-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Gln-Ser-Arg-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys(SEQ ID No 2) Крысиный: Glu-Arg-Glu-Ile-Gln-Asn-Ala-Gly-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu-Asn-Arg-Ala-Ser- Gly-Asn-Ala-Gly-Ser-Ala-Gly-Gly-Gln-Ser-Gly-Ser-Ser-Lys (SEQ ID No 3) Человеческий: Glu-Lys-Ala-Val-Ala-Asp-Thr-Arg-Asp-Gln-Ala-Asp-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser -Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg (SEQ ID No 4) Бычий: Glu-Ser-Val-Lys-Asp-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Pro-Ala-Asp-Pro-Gly-Arg-Pro -Thr-Gly-Tyr-Ser-Gly-Ser-Ser-Lys (SEQ ID No 5) Кроличий: Leu-Ala-Glu-Val-Ala-Val-Gln-Ser-Ala-Glu-Asp-Pro-Ala-Ser-Gly-Asp-Pro-Ala-Ser-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser -Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg-Ser-Lys (SEQ ID No 6).

Клетки, экспрессирующие pIgR Несмотря на то, что данное изобретение в широком плане касается эукариотных клеток, pIgR-экспрессирующие клетки, соответствующие данному изобретению, предпочтительно являются клетками млекопитающих и более предпочтительно эпителиальными клетками млекопитающих, которые в норме секретируют IgA. Клетки млекопитающих могут быть трансфицированы нуклеиновой кислотой, кодирующей pIgR, выделенный, синтезированный или полученный иным образом из одного или более желаемых видов. Способы трансфекции и экспрессии генов в клетках млекопитающих известны в уровне техники. Трансдукция данных клеток вирусными векторами может включать, например, инкубирование вирусов с клетками из круга хозяев вирусов в условиях и концентрациях, которые необходимы для того, чтобы вызвать инфекцию. См., например, руководства Methods in Enzymology, том 185, Academic Press, Inc. San Diego, CA (под ред. D.V.Goeddel) (1990) или М. Krieger, Gene Transfer and Expression - A Laboratory Manual, Stockton Press, New York, NY (1990) и цитированные здесь ссылки.

Культура клеток, которая может быть использована в данном изобретении, включающая клеточные линии и культивируемые клетки из образцов ткани или крови, хорошо известна в уровне техники. Руководство Freshney (Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 3-е издание, Wiley-Liss, New York (1994)) и приведенные здесь ссылки дают основные указания для культивирования клеток. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие pIgR из желаемого вида, могут быть экспрессированы в ряде эукариотных клеток-хозяев, включая дрожжи и различные клетки высших эукариот, такие как клеточные линии COS, CHO и HeLa и клеточные линии миеломы, а также MDCK и клетки, выделенные из карциномы толстой кишки человека, такие как Сасо2. Ген рекомбинантного белка будет функционально связан с подходящими для каждого хозяина последовательностями контроля экспрессии. Для эукариотных клеток последовательности контроля будут включать промотор и предпочтительно энхансер, выделенные, например, из генов иммуноглобулина, SV40, цитомегаловируса и т.п., и последовательность полиаденилирования, а также могут включать донорную и акцепторную сплайс-последовательности.

Связывание лигандов со стволом Специфический ствол-связывающий лиганд не является решающим для данного изобретения и могут быть использованы различные лиганды. Большинство способов конструирования и селекции лигандов, таких как нуклеиновые кислоты, белки или пептиды (обозначаемые общим термином "пептиды"), или антитела, или маленькие органические или неорганические молекулы (например, Патент США No 5143854; WO 90/15070; WO 92/10092; WO 96/11878) с желательными характеристиками специфического связывания хорошо известны в уровне техники. Предпочтительно лиганды, соответствующие данному изобретению, будут в физиологических условиях связывать ствол, практически не связывая секреторный компонент pIgR. Более предпочтительно, когда лиганды, соответствующие данному изобретению, специфически связывают только ствол в физиологических условиях. Обычно физиологические условия для разных тканей различны. Однако примером физиологических условий являются условия, встречающиеся в желудочно-кишечном тракте или дыхательных путях млекопитающих, включая, но не ограничиваясь человеком. Для связывания с экстрацеллюларным лиганд-связывающим сайтом ("эпитопом"), содержащимся в первых 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30 или 33 проксимальных мембране аминокислотах ствола, может быть выбран любой лиганд.

Для использования в качестве лигандов в данном изобретении могут быть сконструированы антитела, включая поликлональные, моноклональные или рекомбинантные антитела Fv из одной цепи. Способы получения поликлональных и моноклональных антител известны специалистам. См., например, публикации Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY и Harlow и Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY; Stites и соавт. Basic and Clinical Immunology (4-е изд.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, а также приведенные в контексте изобретения ссылки; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2-е изд.) Academic Press, New York, NY и Kohler и Milstein (1975) Nature 256:495-497; см. Huse и соавт. (1989) Science 246:1275-1281 и Ward и соавт. (1989) Nature 341: 544-546; Birch и Lennox, Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, New York, New York (1995).

Другие подходящие способы получения лигандов в виде антител или пептидов включают селекцию библиотек рекомбинантных антител/пептидов в фаговых или подобных им векторах. Высокоаффинные в отношении ствола антитела или пептиды могут быть быстро выделены с использованием способов фагового воспроизведения для экспрессии рекомбинантных фрагментов Fv из одной цепи (scFv) или пептидных лигандов на поверхности фага. Вкратце, гены, кодирующие поверхностный белок фага, изменяют таким образом, чтобы это позволило провести инсерцию гена антитела или пептида, который экспрессируется в виде слитого белка на поверхности фага, несущего этот ген. Возможно селективное обогащение фага, экспрессирующего желаемое антитело или пептидный лиганд, и его выделение с использованием аффинности/авидности в отношении ствола. ДНК, кодирующую лиганд, упаковывают в этот же фаг, что позволяет выделить ген, кодирующий лиганд. Ряд подобных способов подробно описан в литературе и хорошо известен специалистам. См., например, статьи Winter и соавт. Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455 (1994); Marks и соавт. J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991); Vaughan и соавт. Nature Biotechnology 14: 309-314 (1996), Патенты США No 4642334, 4816397, 4816567, 4704692, WO 86/01533; WO 88/09344, WO 89/00999, WO 90/02809; WO 90/04036, ЕР 0324162, ЕР 0239400.

В химическом синтезе пептидов способ, называемый "Разделение, Связывание и Рекомбинация" ("Divide, Couple and Recombine" (DCR)) был использован для получения комбинаторных пептидных библиотек. См. статьи Furka и соавт. Int. J. Pept. Protein Res. 37: 487-493 (1991) и Houghten и соавт. Nature 354: 84-86 (1991). В качестве альтернативы DCR пептидные смеси также готовили прямым связыванием мономерных смесей. См. Патент США Rutter и соавт. No 5010175. Было предложено применение данных способов для приготовления смесей других линейных полимеров, таких как "пептоиды". См. публикацию Simon и соавт. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371 (1991). При синтезе олигонуклеотидов "дегенерированные" или "неустойчивые" смеси олигонуклеотидных продуктов могут быть получены, например, путем подачи эквимолярных смесей мономеров на определенных стадиях синтеза к олигонуклеотидному полимеру. См. работу Atkinson и Smith в "Oligonucleotide Synthesis. A Practical Approach", 1984, IRL Press, Oxford, под ред. М. Gait, с. 35-81. Данные способы синтеза пептидов или олигонуклеотидов представляют значительное число соединений для тестирования, которые легко могут быть идентифицированы, если они являются активными.

Предпочтительным будет конструирование лигандов с целью снижения иммуногенности у хозяина, например, путем максимального увеличения числа аутологичных (собственных) последовательностей в лиганде. Соответственно химерные антитела, имеющие нексеногенные вариабельные участки, являются предпочтительными. Особенно предпочтительно применение антител, у которых ксеногенные участки отсутствуют или существенноограничены участками, определяющими комплементарность, как в гуманизированных антителах.

Связывание и тестирование лигандов Связывание (т.е. присоединение) лиганда к стволу pIgR может происходить перед или одновременно с расщеплением секреторного компонента, и лиганд может быть связан с базолатеральной или апикальной поверхностью. Таким образом, эндоцитоз лиганда может происходить базолатерально или апикально, или лиганд может быть объектом трансцитоза от апикальной к базолатеральной или от базолатеральной к апикальной поверхности. Судьба лиганда или какого-либо его элемента будет различной в зависимости от его физико-химических характеристик. Соответственно, свойства лиганда могут быть выбраны или сконструированы для реализации желаемой функции на поверхности клетки, в эндосоме или после трансцитоза. Например, варьируя чувствительность лиганда к средам, вызывающим протеолиз или восстановление, можно определять распределение связанного, интернализованного или транспортируемого через клетку лиганда. Если желательно, может быть создан лиганд, сохраняющий специфическое связывание с клеткой после присоединения или трансцитоза или, альтернативно, высвобождающийся в окружающую среду. Таким образом, свойства любого из различных элементов лиганда, включая связывающий компонент, биологически активный компонент или линкер, могут быть сконструированы или выбраны с целью обеспечения различных степеней аффинности, стабильности или активности в отношении различных внутриклеточных отделов или поверхностей клетки так, как это желательно.

А. Тестирование связывания лиганда ex vivo Для оценки связывания лиганда со стволом in vitro удобно измерять эндоцитоз или трансцитоз связанного лиганда в эпителиальных клетках млекопитающих. Термин "эндоцитоз" в основном относится к феномену поглощения материала клеткой, например, посредством фагоцитоза или пиноцитоза. Опосредованный рецепторами эндоцитоз представляет собой эффективное средство, побуждающее клетку поглотить материал, который связывается с рецептором клеточной поверхности. См. работы Wu и Wu (1987) J.Biol.Chem. 262:4429-4432; Wagner и соавт. (1990) Proc. Natl. Sci. USA 87:3410-3414 и ЕР-А1 0388758. Для оценки связывания может быть использован любой из числа известных способов анализа эндоцитоза. Например, анализы связывания, трансцитоза и интернализации подробно описаны в статье Breitfeld и соавт. J. Cell Biol. 109:475-486 (1989).

Апикальный эндоцитоз удобно измерять по связыванию лиганда, такого как фрагмент Fab, со стволом на апикальной поверхности клеток почки собаки Madin-Darby (MDCK) при 4^oС, нагревании до 37^oС на короткое время (0-10 мин) и охлаждении клеток снова до ^oС. Способы экспрессии pIgR в клетках MDCK известны в уровне техники (статья Breitfeld и соавт. Methods in Cell Biology 32: 329-337 (1989)). Оставшиеся на поверхности Fab удаляют, разрушая их при рН 2,3. Внутриклеточными Fab являются Fab, которые сохраняют ассоциацию с клетками после разрушения, тогда как связанными с поверхностью Fab являются Fab, которые удаляются путем кислотного промывания. Контроли для неспецифического связывания включают использование преиммунного Fab и/или клеток MDCK, не трансфицированных pIgR.

Трансцитоз можно легко оценить, позволяя клеткам MDCK связывать Fab на апикальной поверхности при 4^oС, нагревая их до 37^oС на 0-240 мин и определяя затем количество Fab, доставленного в базолатеральную среду. Данные базолатерально доставленные Fab сравнивают с суммой Fab, которые сохраняют ассоциацию с клетками (внутриклеточную или разрушенную кислотой), и Fab, выходящих обратно в апикальную среду. Альтернативно, трансцитоз может быть оценен с помощью непрерывной обработки клеток Fab в апикальной среде и измерения накопления Fab в базолатеральной среде. Данный способ исключает стадию охлаждения клеток, но не обеспечивает кинетику транспорта одной группы лиганда. В обоих способах деградация Fab может быть оценена путем анализа подвергнутых трансцитозу Fab с помощью SDS-PAGE (электрофореза в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия) и использования зондирования противокуриных антител в вестерн-блоттинге. Неспецифический транспорт (например, обусловленный жидкофазным эндоцитозом и трансцитозом или парацеллюларным просачиванием между клетками) может контролироваться посредством использования клеток MDCK, не трансфицированных pIgR и/или преиммуным Fab.

В. Тестирование связывания лиганда in vivo Для оценки трансцитоза in vivo удобно использовать не содержащих патогены экспериментальных животных, таких как крысы Sprague-Dawley. Меченый лиганд (например, антитело, меченное радиоактивным иодом) может быть введен в ноздри. Как будет понятно специалистам, "метка" является композицией, определяемой спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электромагнитными, радиохимическими или химическими средствами, такими как флуоресценция, хемофлуоресценция или хемолюминесценция. Трансцитоз с апикальной к базальной поверхности может быть легко определен измерением доставки лиганда в систему кровообращения, что устанавливают по присутствию метки. Целостность лиганда, выделенного из кровотока, может быть оценена с помощью анализа лиганда электрофорезом в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия.

Биологически активный компонент Биологически активный компонент лиганда может быть ковалентно или нековалентно связан с лигандом. Например, для связывания различных изотопов могут быть использованы хелаторы, или нуклеиновые кислоты могут быть связаны с лигандом водородными связями. Биологически активные компоненты могут также находиться в эмульсиях, протеиноидах или липосомах. Специалистам будет ясно, что такие структуры могут быть ковалентно связаны с лигандом посредством дериватизированных полярных головных групп или целых белков мембраны. Связывающие компоненты лиганда могут также содержать биологически активный компонент.

Биологически активные компоненты содержат любое число соединений, известных специалистам как противовоспалительные агенты, цитокины, антиинфекционные агенты, активаторы или ингибиторы ферментов, аллостерические модификаторы или антибиотики. Таким образом, биологически активный компонент включает такие соединения, как нуклеиновые кислоты, белки, пептиды, аминокислоты или производные, гликопротеины, радиоактивные изотопы, липиды, углеводороды или рекомбинантные вирусы. Термин "нуклеиновая кислота" означает дезоксирибонуклеотидный или рибонуклеотидный полимер в однонитевой или двунитевой форме и до тех пор, пока не ограничено иным образом, охватывает известные аналоги природных нуклеотидов. Нуклеиновые кислоты включают антисмысловые нуклеиновые кислоты, дериватизированные олигонуклеотиды для ковалентного перекрестного связывания с однонитевой или двунитевой ДНК, образующие триплекс олигонуклеотиды или нуклеиновые кислоты, кодирующие белки или пептиды. Нуклеиновые кислоты также включают композиции для генотерапии, такие как нуклеиновые кислоты, кодирующие муковисцидозный регулятор трансмембранной проводимости дикого типа.

Присоединение биологически активных композиций к лиганду Способ присоединения биологически активного компонента к лиганду будет меняться в соответствии с химической структурой компонента. В основном лиганды будут содержать ряд функциональных групп, которые доступны для реакции с подходящей функциональной группой на биологически активной молекуле для связывания посредством нее агента. Альтернативно лиганд и/или биологически активный компонент могут быть дериватизированы таким образом, что они имеют или присоединяют дополнительные реактивные функциональные группы. Дериватизация мо