Производные изоксазола и амида кротоновой кислоты

Производные изоксазола и амида кротоновой кислоты

Реферат

 

Изобретение относится к новым производным изоксазола и амида кротоновой кислоты общей формулы I, где R¹ обозначает остаток формулы II или III, R² обозначает -О-(СН₂)_n-CH= CH₂, n обозначает целое число 1-3, -О-(СН₂)_m-CH₂ - галоген, m обозначает целое число 1-3, галоген обозначает фтор, хлор, бром или йод, остаток формулы V, где ³ обозначает галоген или NH₂, R⁴ обозначает атом водорода, и/или их физиологически приемлемым солям. Производные изоксазола и амида кротоновой кислоты формулы IV, где R¹ обозначает остаток формулы II или III, L обозначает мостиковое звено из группы (а) -О-(СН₂)_n-СН₂-, где n обозначает целое число 1-3, (б) -NH-С(О)-СН(R⁴)(R³), где R³ обозначает атом водорода, Х обозначает полимер или твердое тело. Соединение формулы IV может использоваться для обнаружения специфически связывающих протеинов из клеточных экстрактов, сыворотки, крови или синовиальных жидкостей, для очистки протеинов, для модификации микротитровальных планшетов или для получения хроматографического материала, особенно материала афинной хроматографии. Технический результат - получение новых производных изоксазола и амида кротоновой кислоты. 2 с. и 5 з.п. ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к новым производным изоксазола и амида кротоновой кислоты, к их получению и применению в качестве лекарственных средств, а также к их применению в качестве антигена для изготовления антител и к их применению в способах диагностики и очистки.

Производные изоксазола и амида кротоновой кислоты с уменьшающим интенсивность воспаления, иммуноподавляющим или антипролиферативным действием известны /ЕР 0 013 376; ЕР 0 217 206; ЕР 0 527 736/. Аналитическое определение этих соединений в сыворотке крови животного и человека можно проводить с помощью обычных хроматографических методов. Недостатком этих хроматографических методов являются высокие затраты на аппаратуру, дорогостоящие подготовительные стадии опытов и небольшая пропускная способность опыта.

Способы иммунологического определения и анализа представляют быструю и надежную альтернативу хроматографическим способам. Решающим для осуществления этих альтернативных способов является получение подходящих антител.

Задачей изобретения является модифицирование производных изоксазола и амида кротоновой кислоты для получения соединений, которые пригодны для получения антител, могут связываться с полимерами и могут применяться в качестве индикаторов в радиоиммуноизмерениях.

Было найдено, что соединения формулы I пригодны для решения этой задачи, причем на ароматическом кольце части анилина находятся одна или несколько функциональных групп, которые как таковые или через промежуточную функцию могут связываться ковалентно с полимером.

Изобретение относится, следовательно, к соединениям формулы I и/или к физиологически приемлемой соли соединения формулы I, и/или в случае необходимости к стереоизомерной форме соединения формулы I, причем R1 обозначает остаток формулы II или III и R2 обозначает а) -O-(СН₂)_n-СН=СН₂, где n обозначает целое число 1, 2 или 3, б) -О-(СН₂)_m-СН₂-галоген, где m обозначает целое число 1, 2 или 3 и галоген обозначает фтор, хлор, бром или йод, с) обозначает остаток формулы V где R3 обозначает 1) галоген или 2) -NH₂, R4 обозначает 1) атом водорода или 2) остаток аминокислоты, или 3) обозначает -NH₂.

Предпочтительны соединения формулы I, которые отличаются тем, что R1 обозначает остаток формулы II или III и R2 обозначает а) -О-(СН₂)_m-СН₂-галоген, где m обозначает целое число 2 и галоген обозначает бром или йод, б) -O-СН₂-СН=СН₂ или с) обозначает -NH-C(O)-CH(R3)(R4), где R3 обозначает бром, -NH₂ или хлор и R4 обозначает атом водорода.

Особенно предпочтительны соединения формулы I как (4-аллилокси-фенил)-амид 2-циано-3-гидрокси-бут-2-ен-карбоновой кислоты; (4-(3-йодпропокси)-фенил)-амид 2-циано-3-гидрокси-бут-2-ен-карбоновой кислоты; (4-(2-амино-ацетиламино)-фенил)-амид 2-циано-3-гидрокси-бут-2-ен-карбоновой кислоты; (4-(2-амино-ацетиламино)-фенил)-амид 5-метил-изоксазол-4-карбоновой кислоты; (4-(2-бромацетиламино)-фенил)-амид 2-циано-3-гидрокси-бут-2-ен-карбоновой кислоты или (4-(2-бромацетиламино)-фенил)-амид 5-метил-изоксазол-4-карбоновой кислоты.

Остаток R2 на фениловом кольце в формуле I может быть в мета-, орто- или пара-положении по отношению к "NH" -группе.

Соединения формулы I могут существовать в случае необходимости в виде оптических изомеров, диастереомеров, рацематов или в виде их смесей. Под понятием "аминокислота" подразумевают стереоизомерные формы, например D- u L-формы, следующих соединений: аспарагин, валин, аргинин, аспарагиновая кислота, глютамин, глютаминовая кислота, триптофан, -аланин, лизин, пролин, глицин, Y-аминобутират, N-ацетиллизин, NБ-ацетилорнитин, Ny-ацетилдиаминобутират, Na-ацетилдиаминобутират, гистидин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилалалин, серии, цистеин, треонин, аланин и тирозин. Предпочтительны L-аминокислоты. Особенно предпочтителен остаток аминокислоты Gly.

Остатки аминокислот образуются от соответствующих аминокислот. Краткое обозначение аминокислот приводится в соответствии с общепринятым обозначением. Остаток (R4) представляет боковую цепь соответствующей аминокислоты.

Подходящие физиологически переносимые соли соединения формулы I представляют, например, соли щелочных, щелочноземельных металлов и аммония, включая соли органических аммониевых оснований и соли протонированных остатков аминокислот.

Изобретение относится также к способу получения соединения формулы I и/или физиологически приемлемой соли соединения формулы I, и/или в случае необходимости стереоизомерной формы соединения формулы I, который отличается тем, что а) соединение формулы VI причем R6 обозначает остаток ОН, С1 или Вr, подвергают взаимодействию с соединением формулы VII причем R7 обозначает 1) -NH₂, 2) -NH-C(О)-СН₂-NН-защитную группу, где защитная группа представляет защитную амино группу, например Воc, 3) -NH-C(О)-СН₂-галоген или 4) -ОН с получением соединения формулы I, где R1 представляет остаток формулы II и R2 представляет -NH₂, -NH-C(О)-СН₂ -NH-защитную группу, -ОН или -NH-C(О)-СН₂-галоген, или b) полученное по способу а) соединение, где R7 обозначает -ОН, подвергают взаимодействию с алкилгалогенидом или с дигалогеналканом, где алкильная часть имеет 2, 3 или 4 атома углерода, до соответствующего соединения формулы I, или c) полученное по способу а) соединение, где R7 обозначает -ОН, подвергают взаимодействию с ненасыщенным алкилгалогенидом, в котором алкильная часть имеет 3, 4 или 5 атомов углерода, до получения соответствующего соединения формулы I, или d) полученное по способу а) соединение, где R7 обозначает -NH₂, подвергают взаимодействию с галогенидом карбоновой кислоты, как бромацетилбромид, до получения соединения формулы I, где R2 представляет остаток формулы V, R3 обозначает галоген и R4 обозначает атом водорода, или e) ароматический диамин, как пара-фенилендиамин, подвергают взаимодействию с защищенной по аминогруппе аминокислотой до получения соединения формулы VII, где R7 представляет остаток формулы V, R3 обозначает -NH₂ и R4 обозначает защищенную аминокислоту и затем, как в способе а), подвергают взаимодействию до получения соответствующего соединения формулы I, или f) в полученном по способам а) или е) соединении формулы I удаляют защитную группу или g) полученное по способам a) - f) соединение формулы I, причем R1 обозначает остаток формулы II, переводят в соединение формулы I, причем R1 обозначает остаток формулы III, или h) полученное по способам а) - g) соединение формулы I или выделяют в свободной форме, или в случае наличия кислых или основных групп превращают в случае необходимости в физиологически приемлемые соли.

На стадии способа а) можно, например, изоксазол-4-карбоновую кислоту /R6 обозначает -ОН/ переводить известными из литературы способами, например, при помощи хлористого тионила или оксихлорида фосфора в апротонном растворителе /например, толуол, тетрагидрофуран (THF) или хлорированный углеводород/ в хлорангидрид кислоты и после этого подвергать взаимодействию с ароматическим, в случае необходимости соответственно замещенным амином при добавлении органического основания, например, с третичным амином /например, триэтиламин или N-этилморфолин/, в диполярном апротонном растворителе, например, в THF или хлорированном углеводороде. Альтернативно можно получать амид непосредственно из карбоновой кислоты при добавлении известного из химии пептидов реагента конденсации, например, дициклогексилкарбодиимида. Второй вариант пригоден особенно для ароматических аминов с другими аминовыми или спиртовыми остатками.

На стадиях b) или с) введенная через анилиновую часть гидроксигруппа функционализирует дальше, причем последнюю 1) подвергают взаимодействию с алкилгалогенидом или с дигалогеналканом, как 1,3-дийодпропан, при добавлении органического или неорганического основания, например, карбоната калия, до получения соответственно замещенного алифатического эфира, причем в последнем случае благодаря соответственно большому избытку алкилирующего средства или применению последнего в качестве растворителя можно избежать димеризации, так что в продукте сохраняется алкилгалогенидная функция для дальнейшего связывания продукта с неподвижной фазой, или 2) подвергают взаимодействию с ненасыщенным алкилгалогенидом, например, аллил- или пропаргилгалогенидом, предпочтительно с аллилбромидом, в диполярном апротонном растворителе, как тетрагидрофуран (THF), ацетон или хлорированные углеводороды в аналогичных условиях до получения аллилового или пропаргилового эфира, причем при использовании ацетона в качестве растворителя и карбоната калия в качестве основания одновременно происходит описанное в g) раскрытие кольца в изоксазольной части /остаток формулы 11/.

На стадии способа d) аминогруппу подвергают взаимодействию с галогенидом карбоновой кислоты, например бромацетилбромидом, при добавлении органического основания, как третичные ароматические амины /например, триэтиламин или этилморфолин/ в диполярном апротонном растворителе, как THF или хлорированный углеводород.

На стадии е) ароматический диамин, например, п-фениллендиамин, с помощью защищенной по аминогруппе аминокислотой, например N-Boс-глицином, при применении конденсирующего средства, например дициклогексилкарбодиимида, переводят целенаправленно в моноамид, затем осуществляют образование анилина, как описано для стадии а), и, наконец, удаляют имеющуюся защитную группу амина в известных в химии пептидов стандартных условиях /стадия f)/.

На стадии g) полученное на стадиях a) - f) соединение подвергают реакции раскрытия кольца изоксазольной части, индуцированной основанием, при этом работают предпочтительно, в водно-органических смесях растворителей, например, THF-вода или этанол-вода, при избытке органического или неорганического основания, например, NaOH, раствор аммиака или карбонат калия.

Поскольку соединения общей формулы I встречаются в диастереоизомерных или энантиомерных формах и при выбранном синтезе получают их смеси, разделяют чистые стереоизомеры или хроматографией в случае необходимости на хиральном носителе, или, поскольку рацемические соединения формулы I способны к солеобразованию, дробной кристаллизацией образованных с оптически активным основанием или кислотой в качестве вспомогательного вещества диастереомерных солей. В принципе таким же путем рацемические соединения формулы I, которые содержат основную группу в виде аминогруппы, с оптически активными кислотами, как (+)-камфара-10-сульфокислота, D- и L-винная кислота, D- и L-молочная кислота или (+) и (-)-миндальная кислота, можно переводить в чистые энантиомеры.

Изобретение относится также к лекарственным средствам, отличающимся эффективным содержанием, по меньшей мере, одного соединения формулы I и/или стереоизомерной формы соединения формулы I и/или физиологически приемлемой соли соединения формулы I, наряду с фармацевтически пригодными и физиологически приемлемыми носителями, добавками и/или активными и вспомогательными веществами. Лекарственные средства по изобретению можно назначать внутривенно, парентерально, локально, ректально или орально.

Лекарственные средства по изобретению применяются предпочтительно для профилактики и/или терапии раковых заболеваний, воспалений и аутоиммунных заболеваний.

К ним относятся, например, ревматические заболевания, острые хронические воспаления мышц, суставов или желудочно-кишечного тракта, аллергические заболевания дыхательных путей, псориаз, аутоиммунные заболевания, например, системная красная волчанка (SLE), диабет типа 11, тяжелая миастения, синдром Cьгрена, дерматомиозит, склеродермия или рассеянный склероз (MS). К раковым заболеваниям относятся, например, рак легкого, лейкемия, саркома Капоси, рак яичника, саркомы, менингиома, рак кишки, рак лимфатических узлов, опухоли головного мозга, рак груди, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы или рак кожи.

Изобретение относится также к способу получения лекарственного средства по изобретению, которое отличается тем, что, по меньшей мере, одно соединение формулы I с фармацевтически пригодным и физиологически переносимым носителем и в случае необходимости с другими подходящими активными веществами, добавками или вспомогательными веществами приводят в подходящую форму применения.

Подходящие твердые или жидкие галогеновые лекарственные формы представляют, например, грануляты, порошки, драже, таблетки, (микро)капсулы, свечи, сиропы, соки, суспензии, эмульсии, капли или растворы для инъекций, а также препараты с протрагированным выделением активного вещества, находят применение обычные вспомогательные вещества, как носители, разбрызгивающие средства, связующие средства для покрытия, агенты набухания, мягчители или смазочные средства, вкусовые добавки, подслащивающие средства и агенты растворения. В качестве часто применяемых вспомогательных веществ следует назвать, например, тальк, крахмал, карбонат магния, двуокись титана, лактозу, маннит и другие сахара, молочный белок, желатина, целлюлоза и их производные, животные и растительные масла, как рыбий жир, подсолнечное масло, арахисовое масло и кунжутное масло, полиэтиленгликоли и растворители, как стерильная вода и одно- или многоатомные спирты, например, глицерин.

Предпочтительно фармацевтические препараты получают и назначают в дозировочных единицах, причем каждая единица содержит в качестве активной компоненты определенную дозу соединения формулы I по изобретению. При твердых дозировочных единицах, как таблетки, капсулы, драже или свечи, эта доза может составлять около 1000 мг, однако предпочтительно около 50 до 300 мг и для растворов для инъекций в форме ампулы около 300 мг, а предпочтительно около 10-100 мг. Для лечения взрослого пациента весом около 70 кг - в зависимости от эффективности соединения формулы I - у человека и животного показаны суточные дозы около 50-3000 мг активного вещества, предпочтительно около 150 до 1000 мг при оральном назначении и около 50 до 1000 мг, предпочтительно около 100 до 300 мг при внутривенном применении. Однако при известных обстоятельствах можно применять также более высокие и более низкие суточные дозы. Назначать суточные дозы можно как однократным приемом в форме отдельной дозировочной единицы, или же многократным приемом в форме меньших дозировочных единиц, так и многократным приемом разделенных доз - через определенные интервалы.

Изобретение относится далее к соединению формулы I, которое в случае необходимости связано через мостиковое звено с полимером или с твердым телом.

Это соединение формулы IV причем R1 обозначает остаток формулы II или III L обозначает мостиковое звено из группы a) -О-, b) -NR5-, где R5 обозначает атом водорода, c) -О-(CH₂)_n-CH₂-, где n обозначает целое число 1, 2 или 3, d) где R3 а) ковалентная связь или b) -NH- и R4 а) обозначает атом водорода или b) обозначает остаток аминокислоты, или е) обозначает мостиковое звено L, определенное как в a) - d), располагающее спейсером, представляющим остаток из группы 1) -NH-(СН₂)_m-S-, где m обозначает целое число от 1 до 12, и X обозначает полимер или твердое тело.

Остаток "L-X" в формуле IV может находиться на фениловом кольце в мета-, орто- или пара-положении по отношению к "NH"-группе, предпочтительно в пара-положении.

Под "полимером" подразумевают, например, синтетические или природные полимеры из группы полистирол, полипропилен, поливинилхлорид, латекс, полисахариды, сефароза, протеины, липиды, силикаты или нуклеиновые кислоты. Следует использовать полимеры в случае необходимости с одним или несколькими функциональными остатками из группы -ОН, -COOH, -NH₂ и -СО-, чтобы они могли связываться с соединениями формулы I. Общие методы для связывания соединения формулы I с твердым веществом описаны, например, в BI Aapplication Handbook, изд. 1994, фиг.4.1, (Мерк АВ, Уппсала, Швеция). Понятие "твердое тело" обозначает нерастворимые твердые тела, которые могут существовать в форме частиц или в виде геометрических форм исполнения как трубочки, шарики или микротитровальные планшеты.

Предпочтительны соединения формулы IV, при этом соединение формулы I связано с твердым телом или полимером. Особенно предпочтительны соединения формулы IV, при этом соединение формулы I, как (4-(2-бромацетиламино)-фенил)-амид 5-метилизоксазол-4-карбоновой кислоты или (4-(2-бромацетиламино)-фенил)-амид 2-циано-3-гидрокси-бут-2-ен-карбоновой кислоты, связано с твердым телом или с полимером.

Соединения формулы IV применяются также для обнаружения специфически связывающих протеинов из клеточных экстрактов, сыворотки, крови или синовиальных жидкостей для очистки протеинов, для модификации микротитровальных планшетов или для получения хроматографического материала, особенно материала афинной хроматографии. Применяемые для очистки протеины находятся в непосредственном взаимодействии с соединениями формулы I, связанными с полимером или с твердым телом. Соединения применяются также для использования в диагностических средствах.

В частности, в качестве твердых тел для соединений формулы IV применяются @BIA core CM5-Chip или неподвижную фазу для хроматографических исследований или разделений, а также микротированных планшетов.

Пример 1: (4-(2-бромацетиламино)-фенил)-амид 5-метил-изоксазол-4-карбоновой кислоты Стадия а). (4-амино-фенил)-амид 5-метил-изоксазол-4-карбоновой кислоты 10,1 г (0,08 мол) 5-метил-изоксазол-4-карбоновой кислоты и 8,65 г (0,08 мол) п-фенилендиамина растворяют в 300 мл тетрагидрофурана и добавляют 18,05 г (0,088 мол) дициклогексилкарбодиимида. Через 5 часов отсасывают из осажденного осадка, концентрируют органическую фазу, хроматографируют продукт на силикагеле при помощи этилацетата/петролейного эфира при добавлении 1%-ной ледяной уксусной кислоты и, наконец, кристаллизуют из этилацетата/петролейного эфира. Выход: 6,8 г соли ацетата с точкой плавления 123-128^oC.

Стадия b). (4-(2-бромацетиламино)-фенил)-амид 5-метил-изоксазол-4-карбоновой кислоты 2,17 г (0,01 мол) продукта со стадии а) вместе с 1,9 г (0,016 мол) N-этилморфолина вводят в 50 мл тетрагидрофурана и в ледяной бане прикапывают раствор 2,4 г (0,012 мол) бромацетилбромида, а затем перемешивают 5 часов при комнатной температуре. После добавления 5 мл воды подкисляют при помощи 1 Н НСl до рН 2, экстрагируют продукт этилацетатом, промывают органическую фазу водой, сушат и сгущают. Продукт кристаллизуют из этилацетата/петролейного эфира. Выход: 2,0 г, точка плавления 179^oС.

IH-ЯMP (DMSO-d₆): 2,7 (s, 3H), 4,05 (s, 2H), 7,5-7,75 (m, 4H), 9,1 (s, 1H), 10,1 и 10,45 (соот. sb, 1Н).

Пример 2: (4-(2-бром-ацетиламино)-фенил)-амид 2-циано-3-гидрокси-бут-2-ен-карбоновой кислоты 0,5 г (0,0015 мол) продукта из примера 1 растворяют в 10 мл тетрагидрофурана и добавляют при охлаждении льдом 2 мл 1 Н водной NaOH. За реакцией наблюдают при помощи тонкослойной хроматографии и после окончания (около 60-90 минут) осаждают продукт подкисления с помощью 2,25 мл 1 Н водной соляной кислоты и добавлением 100 мл воды, фильтруют, промывают водой, затем перемешивают с небольшим количеством этилацетата и сушат при пониженном давлении. Выход: 0,28 г, точка плавления более 210^oС.

IH-ЯМР (DMSO-d₆): 2,28 (s, 3H), 4,04 (s, 2H), 7,4-7,7 (m, 4H), 8,5-10 (sb, lH), 10,4 (sb, 2H).

Пример 3: Гидрохлорид (4-(2-амино-ацетиламино)-фенил)-амида 5-метил-изоксазол-4-карбоновой кислоты Стадия а). 2-трет-бутоксикарбониламино-ацетиламино-п-фенилен-диамин 8,65 г (0,08 мол) п-фенилендиамина растворяют вместе с 15,3 г (0,088 мол) N-Boc-глицина в 300 мл абсолютного тетрагидрофурана (THF) и добавляют порциями 18,05 г (0,088 мол) дициклогексилкарбодиимида. Через 5 часов отсасывают осажденный осадок, сгущают, очищают продукт хроматографией на силикагеле при помощи этилацетата/метанола/уксусной кислоты и затем кристаллизуют из этилацетата/петролейного эфира. Выход: 13,5 г, точка плавления 144^oС.

Стадия b). Хлорангидрид 5-метил-изоксазол-4-карбоновой кислоты Вводят 127,1 г (1,0 мол) 5-метил-изоксазол-4-карбоновой кислоты в 1 л толуола, прикапывают 129,8 г (1,1 мол) хлористого тионила и затем нагревают 6 часов до 80^oС. Концентрируют объем при пониженном давлении приблизительно до половины объема и применяют раствор толуола непосредственно для дальнейших превращений.

Стадия с). (4-(2-трет-бутоксикарбониламиноацетиламино)-фенил)-амид 5-метил-изоксазол-4-карбоновой кислоты 13,5 г (0,05 мол) продукта стадии а) вводят вместе с 7,6 мл (0,06 мол) N-этилморфолина в 100 мл THF и прикапывают 30 мл раствора стадии b) /соответственно 0,06 мол/ при 0^oС. Перемешивают еще 5 часов при комнатной температуре, гидролизуют с водным раствором лимонной кислоты и экстрагируют продукт с этилацетатом, промывают водой, сушат над сульфатом натрия и концентрируют при пониженном давлении. Выход: 12 г, точка плавления 139^oС.

Стадия d). Гидрохлорид (4-(2-амино-ацетиламино)-фенил)-амида 5-метил-изоксазол-4-карбоновой кислоты 6 г (0,017 мол) продукта стадии с) растворяют в 180 мл дихлорметана и добавляют 18 мл трифторуксусной кислоты. Перемешивают 1 час при комнатной температуре, концентрируют и переводят продукт в гидрохлорид растворением в этаноле, добавлением избытка НС1 в этаноле, сгущением и перемешиванием остатка с этилацетатом. Выход: 2,5 г, точка плавления 210^oС.

IН-ЯМР (DMSO-d₆): 2,7 (s, 3H), 3,7-3,9 (m, 2H), 7,6 и 7,72 (соотв. 2Н, AA'BB'), 8,25 (sb, 2H), 9, 3, 10, 2 и 10,75 (соотв. s, 1H).

Пример 4: Трифторацетат (4-(2-амино-ацетиламино)-фенил)-амида 2-циано-3-гидрокси-бут-2-ен-карбоновой кислоты 6 г (0,017 мол) продукта примера 3, стадия с) растворяют в 20 мл 1 Н едкого натра 2 мл этанола и перемешивают при комнатной температуре до полного /около 3 часов/ раскрытия кольца. При подкислении водным раствором лимонной кислоты Вос-защищенный продукт получают в твердой форме, его фильтруют на нутч-фильтре и сушат (точка плавления 189^oС, выход 5,5 г). 5 г этого промежуточного продукта обрабатывают в дихлор-метане при помощи трифторуксусной кислоты аналогично примеру 3d) и кристаллизуют продукт в виде трифторацетата из этанола с помощью этилацетата и петролейного эфира. Выход: 5,0 г, точка плавления 209^oС.

IН-ЯМР (DMSO-d₆): 2,15 (s, 3H), 3,7-3,85 (m, 2H), 7,49 (s, 4H), 8,1 (sb, 3H), 10,3-11,2 (соотв. sb, 1H).

Пример 5: (4-(3-йодпропокси)-фенил)-амид 2-циано-3-гидрокси-бут-2-ен-карбоновой кислоты Стадия а). (4-(3-йодпропокси)-фенил)-амид 5-метил-изоксазол-4-карбоновой кислоты 6,5 г (0,03 мол) (4-гидрокси-фенил)-амида 5-метил-изоксазол-4-карбоновой кислоты растворяют в 57 мл (0,5 мол) 1,3-дийодпропана и добавляют при интенсивном перемешивании 26,2 г (0,19 мол) тонко измельченного карбоната калия. Реакцию заканчивают приблизительно через 4 часа. Обработку производят фильтрованием, сгущением и хроматографией на силикагеле при помощи этилацетата/петролейного эфира 1:1 при добавлении 1% ледяной уксусной кислоты. Выход: 6,7 г.

Стадия b). (4-(3-йодпропокси)-фенил)-амид 2-циано-3-гидрокси-бут-2-ен-карбоновой кислоты.

5,5 г продукта из стадии а) обрабатывают в 200 мл 1 Н раствора аммиака в метаноле до полного раскрытия кольца, сгущают, поглощают в разбавленной уксусной кислоте и хроматографируют при помощи этилацетата/петролейного эфира при добавлении 1% ледяной уксусной кислоты, затем кристаллизуют из этилацетата/петролейного эфира. Выход: 2,3 г, точка плавления 149^oС.

IН-ЯМР (DMSO-d₆): 2,1-2,4 (m, 2H и s, 3H при 2,3 nnм), 3,4 и 4,02 (соотв. t, 2H), 6,92 и 7,42 (соотв. 2Н, АА'ВВ'), 7,2-8,5 (ssb, lH), 10,2 (s, lH).

Пример 6: (4-аллилокси-фенил)-амид 2-циано-3-гидрокси-бут-2-ен-карбоновой кислоты 1,5 г (0,0068 мол) (4-гидрокси-фенил)-амида 5-метил-изоксазол-4-карбоновой кислоты растворяют в ацетоне, добавляют 5,8 мл (0,068 мол) аллилбромида и при интенсивном перемешивании 9,3 г (0,068 мол) тонко измельченного карбоната калия, затем перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Фильтруют, сгущают фильтрат, поглощают остаток в воде и перекристаллизовывают из этилацетата/петролейного эфира. Выход: 0,8 г, точка плавления 162-164^oС.

IН-ЯМР (DMSO-d₆): 2,3 (s, 3H), 4,45-4,63 (m, 2H), 5,15-5,38 (m, 2H), 5,9-6,2 (m, 1H), 6,95 и 7,42 (соотв. 2H, AA'BB'), 10,0 (sb, lH), 12,5-14,5 (ssb, lH).

Фармакологические испытания: В качестве теста на эффективность соединения формулы I использовали тест с профилерацией клеточных культур в пробирке.

Пример 7: Опыт с профилерацией Среду Clicks-/RPMI 1640 (50-50) с L-глютамином без Na-НСО₃ в форме порошка для 10 литров (серомед, биохром, Берлин, ФРГ) растворяют в 9 литрах дважды дистиллированной воды и стерильно фильтруют в бутылочки по 900 мл.

Моющая среда 900 мл основной среды демпфируют с 9,5 мл 7,5%-ного раствора бикарбоната натрия и 5 мл HEPES (N-2-гидроксиэтил-пиперазин-N-2-этансульфокислота) (Гибко, Эггенштайн, ФРГ).

Используемая среда 900 мл основной среды плюс 19 мл раствора NaHCO₃ (7,5%; 10 мл HEPES-раствора и 10 мл раствора L-глютамина (200 мМ)).

В качестве среды для индуцированной митогеном профилерации лимфоцитов служит используемая среда, которую обогащают при помощи 1% активированного в горячем состоянии (30 минут, 56^oC) сыворотки эмбриона теленка (FCS).

Среда опухолевых клеток Для наблюдения за действием опухолевых клеток и клеток гибридомы выбирают используемую среду с 5% FCS.

Питательная среда для клеточных линий Для наблюдения за действием клеточных линий 900 мл используемой среды смешивают с 10% FCS, 10 мл NEA (раствор не основной аминокислоты) (Гибко), 10 мл раствора пирувата натрия (100 мМ, Гибко) и 5 мл 10^-2 М меркаптоэтанола.

Получение и обработка клеток селезенки для индуцированной митогеном пролиферации лимфоцитов Мышей умерщвляли смещением шейки и извлекали в стерильных условиях селезенки. На стерильном сите с размером отверстий 80 меш разрезают селезенки и при помощи пуансона пластикового шприца (10 мл) осторожно переносят в чашку Петри используемой средой. Для удаления эритроцитов из мицеллярной суспензии смесь инкубируют около 1 минуты при попеременном встряхивании в гипотоническом 0,17 М растворе хлористого аммония при комнатной температуре. При этом эритроциты растворяются, в то время как жиснеспособность и реактивность не испытывают никакого влияния. После центрифугирования (7 мин/340 g) лизат отбрасывают, клетки промывают два раза и затем поглощают в соответствующую тест-среду.

Индуцированная митогеном пролиферация лимфоцитов 510⁵ обработанных клеток селезенки из NMRI-мышей женского пола вместе с различными митогенами и препаратом (соединение формулы I) в 200 мкл тест-среды на одну лунку подавали пипеткой на микротитровальные планшеты с плоским дном. Применяют следующие концентрации митогена и препарата: конканавалин А [Серва]: - 0,5-0,25-0,12 мкг/мл липополисахарид [Калбиохем]: - 1,0-0,5-0,1 мкг/мл фитогемагглютин [Гибко] : - 0,5-0,25-0,12% маточного раствора 1 или 2 с добавлением митогена [Гибко] соединение 50,25,10,7,5,5,2,5,1,05,0,1 мкмМол В качестве положительных контрольных групп определяют группу с добавками митогена без препарата. При отрицательных контрольных группах речь идет о клетках в питательной среде с препаратом без добавок митогена. Каждая концентрация митогена многократно испытывается со всеми концентрациями препарата. После 48 часов инкубирования при 37^oС/5% СО₂ добавляют к клеткам 25 мкл/лунку тритий-тимидин (амерсам) с активностью 0,25 мкСi/лунку (9,25l0³ Bq). Затем проводят дальнейшее инкубирование в одинаковых условиях в течение 16 часов. Для обработки данных по исследуемой смеси клетки собирают через специальный прибор (Flow Laboratories) на фильтровальной бумаге, причем невстроенный тимидин собирают в отдельную емкость для отходов. Фильтровальную бумагу сушат, разрезают и вместе с 2 мл сцинтиллятора (Ротизцинт 22, фирма Рот) подают в сцинтилляционные сосуды, которые затем охлаждают еще 2 часа при 4^oС. Количество радиоактивностей, обусловленных клетками, измеряют при помощи бета-счетчика (фирма Паккард, Трикарб-460с).

Подготовка опухолевых клеток и клеточных линий для теста пролиферации Применяемые в тесте опухолевые клетки или клеточные линии берут в логарифмической фазе роста содержания штамма, два раза промывают водой и суспендируют в соответствующей среде.

Проведение и оценка теста с профилерацией Тест с профилерацией проводят на микротитровальных планшетах с плоским дном. Соединения формулы I и интерлейкин растворяют в 50 мкл/лунку соответствующей среды и устанавливают число клеток (510⁵) 100 мкл/лунку таким образом, что конечный объем составляет 200 мкл/лунку. Во всех тестах значения определяют четыре раза. Клетки без препаратов и без фактора роста определяют как отрицательный контроль, а клетки без препарата с фактором роста дают значения для положительного контроля. Значения отрицательного контроля вычитают из всех определенных значений, и разность положительного контроля минус отрицательный контроль составляет 100%. Микротитровальные планшеты инкубируют 72 часа при 37^oС/5%СО и определяют степень пролиферации, как при индуцированной митогеном пролиферации лимфоцитов.

Клеточные линии были взяты из коллекции штаммов, американский тип коллекции культур (АТСС).

Таблица 1 показывает концентрации, при которых наступает 50%-ное ингибирование.

Пример 8: Способ связывания соединения по примеру 2 с @BIAcore CMS-матрицей Исходный материал представляет CM5-Chip фирмы Фармациа Биосенсор с поверхностью карбоксиметилдекстрана (BIApplication Handbook, изд. 1994, Мерк АВ, Уппсала, Швеция). Все стадии связывания происходят при норме потока 5 мкл/мин. Все стадии осуществляют при 25^oС с демпфированным при помощи HEPES солевым раствором (HBS) рН 7,4, в качестве буфера.

1 стадия: 35 мкл 1:1-смеси 0,05 M NHS (N-гидроксисукцинимида) и 0,2 M EDC (N-этил-N'-(диметиламинопропил) карбодиимида), чтобы активировать Chip-поверхность.

2 стадия: 35 мкл 40 мМ раствора цистаминдигидрохлорида в 0,1 М буферном растворе бората натрия рН 8,5.

3 стадия: 35 мкл гидрохлорида этаноламина рН 8,5 для насыщения непокрытых структур матрицы.

4 стадия: 35 мкл 0,1 М дитиотреитола в 0,1 М буферном растворе бората натрия рН 8,5.

5 стадия: 35 мкл раствора, содержащего соединение по примеру 2 (10 мг/мл) в 0,1 М буферном растворе бората натрия рН 7,5.

Пример 9: @BIAcore-метод, используемый для анализов Анализ проводят, в основном, как описано в Current Biology (том 3, 12, 1993, стр. 913-915).

Система: @BIAcore 2000 с соответствующей программой обеспечения. Фармация Биосенсор АВ, Уппсала, Швеция.

Chip: CM5 Сенсорхип, Фармация Биосенсор АВ.

Покрытие: по примеру 8.

Буфер: HBS, BIA сертификат. Фармация Биосенсор АВ.

Норма потока: 10 мкл/мин.

Инъекция: по 50 мкл анализируемой пробы на протяжении 5 мин ассоциативной фазы.

Время промывки: фаза диссоциации 180 секунд, 3 минуты.

Регенерация: 215 секунд с 0,05% додецилсульфата натрия.

А). Связывание различных сывороточных альбуминов Вид - Единицы резонанса крупный рогатый скот - 50 человек - 294 крыса - 1061 мышь - 151 курица - 8 осел - 480 овца - 331 Понятие "единицы резонанса" обозначает количественную единицу, пропорциональную связанному количеству протеина.

В). Связывание различных дегидрогеназ Энзим - Единицы резонанса глицеринальдегидфосфат-DН(25 нМ) - 69 глицеринальдегидфосфат-DН(50 нМ) - 148 глицеринальдегидфосфат-DH(100 нM) - 297 глицеринальдегидфосфат-DH(250 нM) - 603 дигидрооротат-DH(50 нМ) - 203 дигидрооротат-DH (100 нМ) - 425 дигидрооротат-DH(250 нМ) - 1064 пируваткиназа (50 нМ) - 85 пируваткиназа (100 нМ) - 189 пируваткиназа (250 нМ) - 505 DH обозначает название энзима дегидрогеназы.

Относительные прочности связывания исследованных дегидрогеназ при определенной концентрации протеина можно было сравнивать друг с другом. При концентрации протеина 1 мкМ оказалось, что связывание дигидрооротата-DH было самым сильным, при сопровождении лактата-DH, глицеринальдегидфосфата-DH, и пируваткиназы.

Пример 10: Афинная хроматография Соединение по примеру 1 через его реактивную группу брома связывают с матрицей носителя. В качестве материала-носителя применяют Fractogel @EMD-SH (фирма Мерк KGaA, Дармштадт). Ковалентное связывание происходит по стандартному протоколу согласно патенту ФРГ 43 10 964. Полученный гель помещают в Superformance@ (1 см x 5 см) колонку (фирма Мерк KGaA) и подключают к установке высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).

Получение растворимых клеточных протеинов Штамм RAW 264.7 (АТСС собрание штаммов) культивируют 48 часов (h) до достижения слияния и три раза промывают при помощи холодного PBS-буферного раствора с температурой 4^oC для освобождения от питательной среды, клетки переводят в PBS-буферный раствор и центрифугируют при 200 g в течение 10 минут. Обработку клеток проводят при 4^oС. Клеточный гранулят снова суспендируют в буферном растворе А, состоящем из 20 мМ трис-основания, 2 мМ MgCl₂6 Н₂О и 1 мМ дитиотреитола (DTT). Добавляют смесь различных ингибиторов протеазы, чтоб препятствовать протолизу благодаря собственным клеткам протеаз. Затем гомогенизируют в стеклянной емкости. После этого суспензию для получения растворимых протеинов центрифугируют при 4^oС 30 минут при 22000 g.

Надосадочную жидкость сразу применяют дальше для афинной хроматографии. Аликвоту надосадочной жидкости оставляют как эталон, остаток подают насосом на афинную колонку.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC) Для афинной хроматографии используют аппаратуру Контрон Инструментc, Милан, Италия. Система состоит из компонентов: аутопробоотборник 465, HPLC насос 422 и 422S, смесительный клапан высокого давления М800, мотоклапан Веста и диод Аррей Детектор 440. Прием данных и оценка производятся при помощи системы данных 450-MT2/DAD серий. Надосадочную клеточную жидкость разбавляют водой до объема 30 мл и поток подают насосом при норме 1 мл/мин. Проскок улавливают и как фракцию хранят до окончания хроматографии при 4^oС. Для градиентного элюирования протеинов применяют следующие буферы.

Состав PBS-буфера: NaCl - 8,00 г/л КС1 - 0,20 г/л КН₂РО₄ - 0,20 г/л Na₂HPO₄7 Н₂О - 2,16 г/л Состав используемых в таблице 2 буферов: Буфер - Состав 1 - PBS 2 - PBS+0,5 M NaCl 3 - PBS+150 мM A 77 1726б (натриевая соль амида N-(4-трифторметилфенил)-2-циан-3-гидроксикротоновой кислоты 4 - Н₂О 5 - 6 М мочевина 6 - 60% ацетонитрила+0,1% трифторуксусной кислоты (TFA).

После подачи насосом раствора протеина начинают с потока 3 мл/мин градиента по таблице 2.

Фракции собирают, подвергают диализу в течение 48 часов при 4^oС относительно Н₂О /предел исключения используемой мембраны диализа 6000-8000 Da/ /кроме фракции ацетонитрила/ и затем подвергают лиофилизации.

Определение протеинов После лиофилизации протеины растворяют в 1 мл 1%-ного додецилсульфата натрия (SDS) и разбавляют водой до 0,5% SDS. От этого раствора отбирают аликвоту и для определения протеина осуществляют ВСА-тест (Пирс). Протеины вы