Синтетический мутантный ген rb (варианты), синтетический мутантный ген p53, плазмида (варианты), мутантный белок (варианты), способ ингибирования клеточной пролиферации (варианты), способ индуцирования апоптоза

Синтетический мутантный ген rb (варианты), синтетический мутантный ген p53, плазмида (варианты), мутантный белок (варианты), способ ингибирования клеточной пролиферации (варианты), способ индуцирования апоптоза

Реферат

 

Изобретение относится к области регуляции роста клеток. Синтетический мутантный ген Rb и p53 мутированы путем изменения нуклеотидов, кодирующих аминокислоты в консервативных гомологичных областях на кодирующие неконсервативные аминокислоты. Аминокислотные последовательности приведены в описании. Мутированные области содержат то же количество, больше или меньше аминокислот, чем области дикого типа. Синтетический мутантный ген Rb мутирован путем изменения нуклеотидной последовательности, которая кодирует аминокислоты в сайтах фосфорилирования белка Rb. Плазмида сконструирована на основе плазмиды Rb HuBa cpr-1-neo-PQ с включением в нее синтетического мутантного гена Rb или p53. Клеточную пролиферацию ингибируют введением в незлокачественную пролиферирующую клетку этих плазмид. Ретинобластомный белок кодируется синтетическим мутантным геном Rb. Ретинобластомный белок p53 кодируется синтетическим мутантным геном p53. В клетку вводят ретинобластомный белок p53 для индуцирования апоптоза. Пролиферацию опухолевой клетки с мутацией циклинового белка ингибируют введением в клетку ретинобластомного белка p53. Изобретение позволяет лечить патологические клеточнопролиферативные состояния. 11 с. и 6 з.п. ф-лы, 14 ил., 2 табл.

Предпосылки создания изобретения Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится, вообще, к области регуляции роста клеток и пролиферативных заболеваний. Конкретнее, настоящее изобретение относится к мутантам генов RB-1 и р53 и терапевтическому применению таких мутантов.

Описание известного уровня техники Регуляция клеточной пролиферации является комплексным процессом с участием многих взаимодействующих компонентов. Растет клетка или нет зависит от баланса экспрессии негативнодействующих и позитивнодействующих генов - регуляторов роста. Негативнодействующими генами-регуляторами являются гены, которые, когда экспрессированы или предоставлены клетке, ведут к супрессии роста клеток. Позитивнодействующими генами-регуляторами являются гены, которые, когда экспрессированы или предоставлены клетке, стимулируют пролиферацию.

В последнее время идентифицированы несколько генов-регуляторов, негативно действующих на рост клеток, названных опухолевыми генами-супрессорами, которые оказывают негативное действие на клеточную пролиферацию. К этим генам относятся, но не ограничиваются перечисленным, ген ретинобластомы человека RB-1 и ген р53. Отсутствие инактивации некоторых из этих негативных генов-регуляторов роста коррелирует с некоторыми типами рака.

Ген ретинобластомы человека RB-1 является прототипом этого класса генов-супрессоров опухолей, у которого отсутствие обоих аллелей гена в клетке или ингибирование экспрессии гена или его генного продукта будет приводить к опухолевой или аномальной клеточной пролиферации. На молекулярном уровне потеря инактивации обоих аллелей RB-1 участвует в клиническом проявлении опухолей, таких как ретинобластома, и клинически родственных опухолей, таких как остеосаркомы, фибросаркомы, саркомы мягких тканей и меланомы. Кроме того, потеря функции RB-1 также ассоциирована с другими типами первичного рака, такими как первичный мелкоклеточный рак легких, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, цервикальный рак и рак предстательной железы.

Опухолевые гены-супрессоры Rb и р53 подавляют пролиферацию раковых и нераковых клеток Показано, что реинтродукция кДНК дикого типа RB-1 или р53 частично восстанавливает нормальную регуляцию роста, так как реинтродуцированные гены вызывают задержку роста или ретардацию во многих различных типах опухолевых клеток. Определение гена Rb как гена супрессии опухолей исходит из того факта, что инактивация аллеля Rb-гена является предрасположением к развитию рака. Однако супрессирующее действие на рост гена Rb не ограничивается опухолевыми клетками. Нормальные клетки, у которых имеется две копии, могут испытать задержку роста или ретардацию при введении дополнительных копий гена Rb при некоторых условиях роста. Подобным образом, имеются данные о способности дикого типа р53 подавлять рост нераковых клеток. Таким образом, стадия, регулируемая Rb и р53, не может непосредственно влиять на туморогенный фенотип, а влияют также стадии, которые регулируют рост опухолей и нормальных клеток.

Механизм патологической пролиферации нормальных клеток Существует множество патологических клеточно-пролиферативных состояний, для которых необходимы новые способы, обеспечивающие благоприятное лечение. Такие патологические состояния могут иметь место почти во всех типах клеток, способных к аномальной клеточной пролиферации. К числу указанных типов клеток, которые обнаруживают патологический или аномальный рост, относятся (1) фибробласты, (2) васкулярные эндотелиальные клетки и (3) эпителиальные клетки. Из вышесказанного можно видеть, что существует потребность в способах лечения локальных или распространенных патологических состояний во всех или почти во всех органах и тканях индивидуума.

Например, только в случае глаза, новые методы могут использоваться при лечении такого разнообразия патологических болезненных состояний, которые являются следствием аномальной пролиферации нормальных, доброкачественных или злокачественных опухолевых клеток или тканей, включая, но не ограничиваясь перечисленным, фибропролиферативные, вазопролиферативные и/или относящиеся к опухолевым заболеваниям глаза: ретинопатии преждевременного развития, пролиферативной витреоретинопатии, пролиферативной диабетической ретинопатии, капиллярной гемангиомы, хороидальных неоваскулярных сетей, субретинальных неоваскулярных сетей, сенильной дегенерации желтого пятна вследствие субретинальной неоваскуляризации, корнеальной неоваскуляризации, сморщивания желтого пятна вследствие эпиретинальной мембранной пролиферации, катаракты взрослых вследствие нуклеарного склероза, волокнистого врастания после травмы или операции, оптических нервных глиом, ангиоматозных сетчаток, неоваскулярной глаукомы, кавернозной гемангиомы, покраснения радужки, пролиферативной (серповидных клеток) ретинопатии, снижения роста эпителия (epitelial downgrowth) после глазной операции или повреждения глаза, пленки вторичной катаракты, папилломы, ретинальной неоваскуляризации при талассемии, субретинальной неоваскуляризации вследствие эластичности псевдоксантомы, и нейрофиброматоза типа 1 и 11, ретинобластомы, увеальной меланомы и ложной опухоли глазницы. Другие заболевания с пролиферацией доброкачественных клеток, для которых полезно настоящее изобретение, включают, но не ограничиваются перечисленным, псориаз, ихтиоз, папилломы, базилиомы, плоскоклеточный рак и синдром Стивенса-Джонсона.

Следует отметить, что в случае нормальных клеток уже существуют два нормальных аллеля каждого из Rb-гена и гена р53, и уже эти белки дикого типа не в состоянии предохранить клетки от пролиферации, когда клетки обеспечены факторами роста, как, например, в условиях роста культуры ткани. Нерегулируемая пролиферация других покоящихся клеток при патологических состояниях также является следствием воздействия на клетки факторов роста, индуцированных патологическими состояниями (см. ниже). Например, нерегулируемая пролиферация кровеносных сосудов глаза при талассемии может привести к отслоению сетчатки, если пролиферацию не остановить. Введение дополнительных копий гена Rb или гена р53 в такие клетки может или не может быть достаточным для подавления роста клеток. На самом деле, введение экзогенного гена Rb во многие опухолевые клетки только замедляет скорость роста клеток вместо полного его прекращения. Ранее описанные клеточные линии, такие как Saos-2 и DU145, являются хорошими примерами этого явления. Может потребоваться ввести гораздо больше копий гена, и это, с одной стороны, затрудняет контроль за числом копий, которое необходимо ввести или может быть введено. С другой стороны, воздействие факторов роста может привести к инактивации экспрессированных Rb-белков.

Регуляция активности Rb-белка посредством фосфорилирования Если инактивация генов-супрессоров роста является существенной стадией при снятии ограничения на рост клеток, должны существовать механизмы, посредством которых активность этих генных продуктов регулируется таким образом, что клетка может пролиферировать под контролем. Возможно, что экспрессия данного гена-супрессора роста может регулироваться количественно или качественно. В случае гена Rb отношение уровня равновесного состояния белка к клеточному объему постоянно во всем клеточном цикле. Такая потеря изменения концентрации Rb-белка наводит на мысль, что должны существовать другие механизмы, с помощью которых клетка может регулировать активность этого белка. Имеется ряд данных, показывающих, что активность Rb-белка (pRb) регулируется степенью его фосфорилирования. Различные факторы, стимулирующие или подавляющие рост, проявляют свое действие через отклонение от нормы фосфорилирования продуктов генов-супрессоров роста, таких как Rb-белок. Доказательство роли факторов стимуляторов роста при индукции фосфорилирования Rb-белков получены из результатов исследований, что Rb-белки в покоящихся клетках существуют в недостаточно фосфорилированной форме. Кроме того, когда покоящиеся клетки стимулированы к пролиферации при воздействии либо сыворотки, либо факторов роста, таких как EGF (эпидерамальный фактор роста), вместе с инсулином и трансферрином, преобладающей формой Rb-белка была недостаточно фосфорилированная в G1, но становящаяся гиперфосфорилированной форма, когда клетки попадают на границу G1/S и клеток. Эти данные наводят на мысль, что Rb-белок является мишенью каскада сигнальной трансдукции, вызванной сывороткой или факторами роста. В конечном счете, фибробласты стареющего человека неспособны отвечать на стимулирующие пролиферацию действия факторов роста, также неспособны фосфорилировать Rb-белок.

Также имеются доказательства роли факторов ингибирования роста в супрессирующем механизме фосфорилирования Rb-белков. Когда активно растущие лейкозные или нейробластомные клетки обрабатывают ретиноевой кислотой или витамином D3, отличными от ДМСО индуцирующими дифференцировку реагентами, обнаружено, что Rb-белки являются недостаточно фосфорилированными перед преднамеренной задержкой роста на ранней стадии G1 и стимулированы к дифференцировке. Кроме того, обработка эпителильных клеток легкого паракринным ингибирующим рост трансформирующим полипептиды фактором роста бета 1 (TGF-1) ведет к снижению регуляции фосфорилирования Rb-белка и сопутствующей задержке клеточного роста в позднем Gl. Все вместе эти факты приводят к мысли, что недостаточно фосфорилированная форма Rb-белка активно супрессирует клетки от перехода границы G1/S, и что киназа (S), активированная в Gl, может инактивировать Rb-белок, так что клетки могут перемещаться в S-фазу.

В то время как удаление Rb-гена посредством делеции или мутации допускало рост в опухолевых клетках, удаление ограничения на рост в нормальных клетках, имеющих нормальную экспрессию Rb-гена, достигается зависимой от клеточного цикла посттрансляционной модификацией их генного продукта, т.е. Rb-белка (pRb). Rb-белок существует в полифосфорилированных формах, и факты предполагают, что недостаточно фосфорилированная форма является активной формой. Например, большой Т-антиген SV40 преимущественно связывается с недостаточно фосфорилированной формой Rb-белка. Фосфорилирование Rb-белка отделяет его от большого Т-антигена SV40, и только недостаточно фосфорилированные формы pRb связываются и ингибируют транскрипцию из Е2-промотора. Таким образом, недостаточно фосфорилированная форма Rb-белка активно супрессирует рост клеток, в то время как клеточная пролиферация ассоциируется с гиперфосфорилированием Rb-белка. Различные факторы стимулирования или ингибирования роста могут проявить свое действие посредством нарушения фосфорилирования Rb-белка. Следовательно, хотя нормальная клетка может экспрессироваться Rb-белками, она может быть индуцирована к росту, когда подвергается действию соответствующих факторов роста, какие можно обнаружить при различных условиях роста, в том числе, при патологических состояниях. При некоторых патологических состояниях другая нормальная клетка может быть, нежелательно, индуцирована к пролиферации. Пролиферация нормальных покоящихся фибробластов в глазах при диабетической ретинопатии является примером такой нежелательной индукции роста клеток. Оставшись необработанными, пролиферирующие фибробласты будут, в конечном счете, достигать сетчатки и приводить к ее быстрому отслаиванию.

Активация белка р53 Подобно гену Rb, инактивация или мутация гена р53 часто наблюдается в опухолевых и неопухолевых клеточных линиях. Белок дикого типа р53 также негативно регулируется, когда он связывается с вирусными антигенами, такими как большой Т-антиген SV40. Белок р53 функционирует как фактор транскрипции и связывается со специфическими ДНК-последовательностями. Способность белка дикого типа р53 связываться с ДНК критична для его правильного функционирования. В мутанте р53 теряется способность белка связываться со специфическими ДНК-мишенными последовательностями или активировать транскрипцию, что приводит к мысли о важности такой активности для супрессивной функции белка. Однако недавно также показано, что активность связывания специфической ДНК-последовательности белка р53 является скрытой. Вновь синтезированный белок р53 инактивен в том отношении, что не может связываться со своей специфической ДНК-последовательностью, если белок не модифицирован. Одним из сайтов модификации являются аминокислотные остатки 365-393 у С-конца. Эта область является сайтом присоединения РНК-группы, так же, как и связывания с бактериальными хитшоковыми белками dnaK. Связывание антитела Раb421 с аминокислотными остатками 365-389 активирует белок посредством изменения его конформации, так что он может связываться со своей специфической ДНК-последовательностью.

Различия в типе функции pRb и р53 Хотя как Rb, так и р53 считаются опухолевыми супрессорными генами, тип их действия весьма различен. Ранее получены данные, что эти два гена могут работать различными путями. Мышиные нули (null) для гена Rb эмбрионально летальны, в то время как мышиные нули для гена р53 развиваются нормально, хотя они более восприимчивы к развитию рака. На клеточном уровне можно замедлить или задержать рост раковых клеток, которые лишены р53, посредством сверхэкспрессии гена Rb даже при отсутствии экзогенного р53. С другой стороны, клетки, лишенные Rb, восприимчивы к эффекту супрессии роста гена р53. На молекулярном уровне р53 и pRb взаимодействуют с различными белками-мишенями и ДНК-последовательностями (прямо или косвенно).

Применение генов Rb и р53 в терапии Хотя эти два белка различаются по типу действия, они подобны в одном отношении, т.е. в сверхэкспрессии активных форм двух белков при экспериментальных условиях, приводящих в супрессии или запаздыванию роста клеток. Зная, что рост клеток регулируется экспрессией генов-супрессоров, таких как pRb и р53, и что их белкам необходимо находиться в активной конформации, чтобы функционировать, желательно иметь активные формы указанных генов для генной терапии. В случае pRb заново синтезированные белки недостаточно фосфорилированы и являются активными. Инактивация может иметь место, когда на клетки действуют факторы роста. Было бы желательно иметь мутантные формы pRb, которые могут оставаться в активной форме и быть устойчивыми к инактивации путем фосфорилирования. В случае р53 вновь синтезированный белок является инактивным в том отношении, что не может связываться с ДНК, если он не модифицирован. При генной терапии весьма необходимо иметь мутантные формы гена р53, белок которого уже активен даже без дополнительной модификации. В конечном счете, так как эти два белка имеют различные типы действия, было бы желательно использовать при терапии сочетание как генов Rb, так и генов р53, с тем, чтобы мутации или условия роста, которые представляют устойчивость клетки к эффекту супрессии роста одного гена, могут быть допустимыми для другого.

При известном уровне техники сохраняется нехватка опухолевых супрессорных генов, мутированных таким образом, чтобы генный продукт (белок) являлся перманентно активным и мог функционировать даже если на клетку действуют факторы роста. Конкретнее, при известном уровне техники недостаточно эффективных и функционально мутированных форм генов р53 и Rb. Известный уровень техники также недостаточно применяет одновременно дикий тип и/или мутантные формы генов Rb и р53 при раковых и нераковых клеточно-пролиферативных заболеваниях.

Краткое изложение сущности изобретения В одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к общему подходу к лечению несоответствующего или патологического роста клеток, который происходит при заболеваниях, связанных с пролиферацией нераковых клеток, а также с пролиферацией раковых клеток. Конкретнее, настоящее изобретение относится к способам лечения патофизиологических клеточно-пролиферативных заболеваний посредством введения мутированных генов-супрессоров роста и/или генных продуктов, т.е. мутированных белков.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к изолированной молекуле ДНК, при этом указанная молекула является синтетическим мутированным геном Rb, кодирующим мутированный функционально активный белок ретинобластомы.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к изолированной молекуле ДНК, при этом указанная молекула является синтетическим мутированным геном р53, кодирующим мутированный функционально активный белок р53.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к новой плазмиде, содержащей функционально активный мутант ретинобластомы или гена р53.

И еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу последовательного или одновременного введения дикого типа и/или активных мутантов как гена Rb, так и гена р53 в терапевтических целях.

Другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам лечения патологических клеточно-пролиферативных заболеваний, включающим введение, совместно или последовательно, в нераковую пролиферирующую клетку мутированного гена Rb и мутированного гена р53.

Кроме того, дается способ лечения индивидуумов с заболеваниями, характеризующимися злокачественными клетками, включающий введение, совместно или последовательно, в пролиферирующую раковую клетку мутированного гена Rb и мутированного гена р53.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу индуцирования апоптоза, включающему стадию введения в клетку мутантного белка р53 настоящего изобретения.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения опухолевой клетки с мутацией белка циклина, включающему стадию введения в клетку белка по п.39.

Другие и дополнительные аспекты, признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из последующего описания предлагаемых предпочтительных вариантов осуществления изобретения, приведенных с целью пояснения.

Краткое описание чертежей.

На фиг.1 показано обнаружение области гомологии между pRb и р53 посредством иммунопреципитации клеточных белков с использованием поликлональных антител против Rb RBl-Ab #18 и #20.

На фиг.2 (А, Б) показано подтверждение области гомологии между pRb и р53 посредством иммунопреципитации клеточного белка с использованием поликлональных антител против Rb RBl-Ab #18 и #20.

Фиг. 3 показывает способность мутантных белков р53 Р1, Р3 и Р5 связывать специфические ДНК-последовательности в отсутствие Раb421.

На фиг.4 (А-Г) приводится анализ методом двухмерного картирования картины фосфорилирования мутантных Rb-белков по сравнению с белками дикого типа: (А) меченные белки in vivo, (В) меченные белки in vitro.

На фиг.5 (А, Б) показаны связывание белка ретинобластомы с большим Т-антигеном SV40 и диссоциация комплекса посредством фосфорилирования.

На фиг.6 приводится анализ методом двухмерного картирования двух различных форм фосфорилированного белка ретинобластомы (которые связаны большим Т-антигеном SV40 и которые им не связаны).

На фиг. 7 (А, Б) проводится анализ методом двухмерного картирования - изменения картины фосфорилирования белка ретинобластомы при различных условиях роста.

Фиг.8 (А, Б) показывает способность мутанта Rb m89 подавлять рост нормальной клетки WS1.

Фиг.9 (А, Б) показывает способность мутанта Rb m89 подавлять рост клеточной линии опухоли мочевого пузыря TCCSUP.

На фиг. 10 приводится принципиальная схема как белка дикого типа р53, показывающая домен F и домен R, так и белка мутантного р53, показывающая домен F и домен R.

Фиг.11 показывает, что мутантный р53-белок способен связывать специфические ДНК-последовательности.

Фиг. 12 (А, Б) показывает, что области гомологии регулируют доступность С-конца р53, так что специфические сайты не фосфорилированы.

Фиг. 13 показывает, что мутанты с областью гомологии р53 транскрипционно активны in vivo. Фиг.13А показывает, что мутанты р53 области гомологии р3 или р5 в консервативных аминокислотах активны при промоторной транскрипционной активации. Фиг.13Б показывает, что для всех конструкций р53 используются равные количества белков.

Фиг. 14 показывает, что синтетический мутант р53 индуцирует апоптоз в клеточной линии рака легких Н358. Фиг.14А относится к дикому типу р53 без цисплатина; фиг. 14Б относится к дикому типу р53 с добавлением цисплатина; фиг. 14В относится к мутанту р53 Р4 без цисплатина; фиг.14Г - к мутанту р53 Р4 с добавлением цисплатина; фиг.14Д относится к мутанту р53 Р5 без цисплатина; и фиг.14Е относится к мутанту р53 Р5 с добавлением цисплатина.

Подробное описание изобретения Определения Термин "функциональная экспрессия гена" включает супрессию транскрипции гена, деградацию генного транскрипта (премРНК), ингибирование сплайсинга, деструкцию мРНК, предупреждение трансляции мРНК, предупреждение посттрансляционных модификаций белка, деструкцию белка или ингибирование нормальной функции белка.

Термин "трансфектированная плазмида" относится к бактериальной плазмиде, которая содержит мутированный ретинобластомный ген или ген р53, которые вносят (трансфектируют) в выбранную клетку.

Термин "генная терапия" включает инсерцию части или всего гена, ДНК-конструкции, РНК или генного продукта в клетку, группу клеток, ткань, патологическое изменение, орган или организм с целью модуляции генной экспрессии и/или функции генного продукта.

Термин "профилактическая генная терапия" включает гены, которые можно использовать для частичного или полного ингибирования или предупреждения заболевания и распространения заболевания, а также включает гены, которые можно использовать для восполнения или замены отсутствующего или недостаточного негативного роста в клетке, тканях или зародышах.

Термин "клеточно-пролиферативное заболевание" относится к любому заболеванию человека или животного или к нарушению, поражающему любой один или сочетание органов, полостей или частей тела, которое отличается единственной или множественной местной аномальной пролиферацией клеток, групп клеток или ткани (тканей), доброкачественных или злокачественных.

Термин "прокариот" охватывает все бактерии, которые можно трансформировать ДНК для экспрессии рекомбинантных молекул настоящего изобретения.

Термин "эукариот" относится ко всем дрожжам, грибам, животным или растительным клеткам, которые можно трансформировать ДНК для экспрессии рекомбинантных молекул настоящего изобретения.

ДНК для ДНК-конструкций настоящего изобретения может быть синтетической или может происходить от млекопитающего любого вида. Все, что от нее требуется - это чтобы генетическая последовательность для генов Rb или р53 функционально экспрессировалась в прокариотном или эукариотном организме. Предпочтительной является синтетическая ДНК.

Молекула рекомбинантной ДНК, кодирующей ДНК-конструкции настоящего изобретения, может использоваться для трансформации хозяина с использованием любых методов, хорошо известных специалистам в этой области техники.

Способы получения гибридных, операбельно связанных генов и их экспрессия в бактериях известны и описаны, например, в патенте США 4366246, включенном в настоящее изобретение в качестве ссылки. Генные конструкции и методы, описанные в нем, могут использоваться для создания ДНК-конструкций настоящего изобретения и трансфекции в прокариотные или эукариотные организмы-хозяева.

Прокариотными хозяевами могут являться грамотрицательные, а также грамположительные бактерии, такие как Е. coli, S. tymphimurium, Serratia marcescens и Bacillus subtilis. Эукариотными хозяевами могут быть дрожжи, такие как Pichia pastoris, или клетки млекопитающих.

Как правило, экспрессионные векторы, содержащие промоторные последовательности, которые облегчают эффективную транскрипцию вставленного ДНК-фрагмента, используют в соединении с хозяином. Обычно экспрессионный вектор содержит ориджин репликации, промотор (промоторы), терминатор (терминаторы), а также специфические гены, которые способны обеспечить фенотипную селекцию в трансформированных клетках. Трансформированные хозяева могут быть ферментированы и культивированы способами, известными в технике для достижения оптимального роста клеток.

Примерами промоторов, которые можно использовать в изобретении, являются, но не ограничиваются перечисленным, человеческий -актиновый промотор, металлотиониновый промотор, ориджин SV40 репликации, промотор MMTV LTR и промотор MuLV LTR. Примеры некоторых плазмид или бактериофагов, которые могут использоваться в изобретении, перечислены в работе Maniatis с сотр., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982, и специалистам в этой области техники известны и могут быть установлены другие плазмиды.

Ген является ДНК-последовательностью, которая кодирует через свою матрицу или матричную РНК последовательность аминокислот, характеризующую специфический пептид. Название кДНК включает гены, из которых удалены интроны. Термин "рекомбинантная ДНК" (рДНК) относится к молекуле, которая рекомбинирована путем сплайсинга последовательностей кДНК или геномной ДНК in vitro.

Клонирующим "проводником" является плазмида или фаговая ДНК или другая ДНК-последовательность, которая способна к репликации в клетке-хозяине, которая характеризуется одним или небольшим числом эндонуклеазных сайтов узнавания, у которых такие ДНК-последовательности могут быть вырезаны определенным образом без потери существенной биологической функции ДНК, и которые содержат маркер, подходящий для использования при идентификации трасформированных клеток. Маркерами, например, являются устойчивость к тетрациклину или устойчивость к ампициллину. Слово "вектор" иногда используется для обозначения клонирующего "проводника".

Экспрессионный "проводник" является проводником, подобным клонирующему проводнику, но который способен на экспрессию данного структурного гена в хозяине, обычно, под контролем определенных регуляторных последовательностей.

Термин "индивидуум" относится к животным и людям.

Термин "биологическое ингибирование" или "ингибирование" роста пролиферирующих клеток обозначает частичное или полное ингибирование, а также относится к снижению степени пролиферации или роста клеток. Доза биологического ингибирования мутантов настоящего изобретения может быть определена путем оценки действия испытываемых элементов на рост мишенной злокачественной или аномально пролиферирующей клетки в культуре ткани, на рост опухоли у животных и в клеточной культуре, или любым другим методом, известным специалистам в этой области техники.

Используемый здесь термин "консервативная гомологичная область" относится к аминокислотной области, которая гомологична между Rb и р53, как показано в табл. 1.

Введение белков настоящего изобретения может быть осуществлено местным, внутриглазным, парентеральным, пероральным, интраназальным, внутривенным, внутримышечным, подкожным или любым другим способом. Предпочтительным способом введения при лечении глазных болезней является внутриглазная или окологлазная инъекция. Предпочтительным способом введения при лечении кожных клеточно-пролиферативных заболеваний является топическое нанесение или подкожная инъекция.

При другом варианте осуществления изобретения ДНК-конструкции настоящего изобретения могут быть доставлены непосредственно в очаг пролиферативного заболевания. В случае глазной пролиферативной болезни ДНК-конструкции настоящего изобретения могут быть инъецированы непосредственно в глаз. ДНК-конструкции настоящего изобретения могут быть доставлены в основные места заболевания во внутренние органы, в полости тела и т.п. с использованием формирователей изображения, применяемых для направления инъекционной иглы непосредственно в место заболевания. ДНК-конструкции настоящего изобретения также можно вводить в места заболевания во время хирургического вмешательства.

Дозировка вводимой ДНК зависит от возраста, клинической стадии и степени заболевания или генетического предрасположения индивидуума, локализации, массы, вида сопутствующего лечения, если таковое используется, и природы патологического или малигнизированного состояния. Система эффективной доставки, полезная при способе настоящего изобретения, может использоваться в таких формах, как капсулы, таблетки, жидкие растворы, суспензии или эликсиры для перорального введения, или в стерильных жидких формах, таких как растворы, суспензии или эмульсии. Предпочтительно используют любой инертный носитель, такой как физиологический раствор или забуференный фосфатом физиологический раствор, или любой такой носитель, в котором соединения, используемые в способе настоящего изобретения, растворяются в подходящей степени.

Для внутриглазной доставки и для доставки в другие локализованные места заболевания системы доставки, полезные при способе настоящего изобретения, могут использоваться предпочтительно в таких жидких стерильных формах, как растворы, суспензии или эмульсии. Для местного применения они могут использоваться в такой форме как мази, кремы или спреи. Используется предпочтительно любой инертный носитель, такой как физиологический раствор или забуференный фосфатом физиологический раствор, или любой такой носитель, в котором соединения, используемые в способе настоящего изобретения, растворяются в подходящей степени.

Для локального введения в клетки введение может осуществляться любым способом, известным специалистам в этой области техники, включая, но не ограничиваясь перечисленным, трансфекцию, электропорацию, микроинъекцию клеток, или в таких носителях, как липосомы, липофектин, или просто как ДНК или РНК. ДНК настоящего изобретения можно доставлять с помощью известных систем доставки генов, таких как, например, но не ограничиваясь перечисленным, ретровирусные векторы (Gil-boa (1982) J. Virology 44:845; Hocke (1986) Nature 320: 275; Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014), система вируса осповакцины (Chakrabatry et al., (1985) Mol. Cell Biol. 5:3403), или с помощью других систем доставки ДНК (Yates et al., (1985) Nature 313:812), известных специалистам в этой области техники. Указанные ссылки являются только примерами. Чтобы специфически доставить или трансфектировать клетки, которые являются аномально пролиферирующими, и сберечь неделящиеся клетки, предпочтительно использовать ретровирусную систему доставки, известную специалистам. Так как для интеграции ретровирусной ДНК требуется репликация ДНК хозяина, и ретровирус будет неспособен к саморепликации из-за потери ретровирусных генов, необходимых для его жизненного цикла, применение такой ретровирусной системы доставки в настоящем изобретении будет нацеливать указанные антипролиферативные элементы на аномально пролиферирующие клетки и будет оберегать неделящиеся нормальные клетки от любого вторжения.

Мутантные белки настоящего изобретения могут вводиться в любом биологически эффективном носителе. Биологически эффективными носителями могут быть ретровирусы, липосомы и любое другое устройство для трансфекции, способное ввести чужеродные белки в геном клетки. Такие устройства для трансфекции известны специалистам в этой области техники. Носителем также может быть любой агент или растворитель, с которым совмещаются конструкции настоящего изобретения, и которые в вводимых количествах нетоксичны для индивидуумов или клеток, которые подвергаются лечению.

Паталогические клеточно-пролиферативные состояния, которые лечат Существует множество патологических раковых и нераковых клеточно-пролиферативных состояний, для которых способ настоящего изобретения даст терапевтическую пользу. Такие патологические состояния могут встречаться почти во всех типах клеток, способных к аномальной клеточной пролиферации. К числу типов клеток, которые обнаруживают патологический или аномальный рост, относятся (1) фибробласты, (2) васкулярные эндотелиальные клетки и (3) эпителиальные клетки. Из вышесказанного видно, что способ настоящего изобретения полезен при лечении местных или распространенных патологических состояний во всех, или почти во всех, органах и тканях индивидуума.

Например, только в случае глаза, способ настоящего изобретения можно использовать для лечения такого широкого спектра патологических болезненных состояний, вызванных аномальной пролиферацией нормальных (доброкачественных) или злокачественных клеток или тканей, в который входят, и не ограничиваются перечисленным, следующие фибропролиферативные, вазопролиферативные и/или относящиеся к опухолевым болезням глаза: ретинопатия преждевременного развития, пролиферативная витреоретинопатия, пролиферативная диабетическая ретинопатия, капиллярная гемангиома, хороидальные неоваскулярные сети, сенильная дегенерация желтого пятна вследствие субретинальной реваскуляризации, корнеальная неоваскуляризация, сморщивание желтого пятна вследствие эпиретинальной мембранной пролиферации, катаракты взрослых вследствие нуклеарного склероза, волокнистое врастание после травмы или операции, оптические нервные глиомы, ангиоматозная сетчатка, неоваскулярная глаукома, кавернозная гемангиома, покраснение радужки, пролиферативная (серповидных клеток) ретинопатия, снижение роста эпителия (epitelial downgrowth) после глазной операции или повреждения глаза, пленка вторичной катаракты, папиллома, ретинальная неоваскуляризация при талассемии, субретинальная неоваскуляризация вследствие эластичности псевдоксантомы и нейрофиброматоз типа 1 и 11, ретинобластома, увеальная меланома и ложная опухоль глазницы. Другие заболевания с пролиферацией доброкачественных клеток, для которых полезно настоящее изобретение, включают, но не ограничиваются перечисленным, псориаз, ихтиоз, папилломы, базалиомы, плоскоклеточный рак и синдром Стивенса-Джонсона.

Вообще, настоящее изобретение применимо ко всем формам рака, включая, но не ограничиваясь перечисленным, раковые заболевания, к которым причастна инактивация гена Rb и/или гена р53, такие как остеосаркома, саркомы мягких тканей, меланомы, фибросаркомы, ретинобластома, рак молочной железы, мочевого пузыря, цервикальный рак, рак легких, толстой кишки, яичников, почек, поджелудочной железы и предстательной железы. Кроме того, новые мутантные белки р53 могут использоваться для индукции апоптоза в различных клетках. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу индуцирования апоптоза, включающему стадию введения нового мутантного белка р53 настоящего изобретения.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения опухолевой клетки с мутацией белка циклина, включающему стадию введения в клетку нового мутантного белка р53 настоящего изобретения. Типичные мутации, например транслокации, амплификации циклина D1, циклина D2 или циклина D3, можно лечить новыми мутантными белками р53 настоящего изобретения.