Кодируемая ядерной днк система транскрипции в пластидах высших растений

Кодируемая ядерной днк система транскрипции в пластидах высших растений

Реферат

 

Конструкции ДНК для стабильной трансформации пластид включают трансформирующую ДНК с ориентирующим сегментом, маркерный ген, придающий селектируемый фенотип растительным клеткам, содержащим трансформированные пластиды, и сайт клонирования для инсерции дополнительной ДНК, кодирующей представляющий интерес чужеродный ген. Наличие в конструкции ДНК 5'-промоторного элемента, распознаваемого и транскрибируемого пластидной РНК-полимеразой, кодируемой ядерной ДНК, а также дополнительного 5'-промоторного элемента, который распознается и транскрибируется пластидой РНК-полимеразой, кодируемой пластидной ДНК, существенно облегчает трансформацию широкого круга растений и позволяет осуществлять тканеспецифическую экспрессию ДНК, которой трансформируют пластиды многоклеточных растений. 3 с. и 8 з.п. ф-лы, 13 ил., 3 табл.

Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к генной инженерии растений, в частности к трансформации пластид высших растений. Изобретение относится к новым промоторным последовательностям, обеспечивающим экспрессию представляющих интерес чужеродных генов в различных видах растений.

Предпосылки создания изобретения Гены хлоропласта транскрибируются с участием РНК-полимеразы, содержащей кодируемые пластидной ДНК субъединицы, гомологичные -, - и -субъединицам РНК-полимеразы Е. соli. Промоторы, используемые для экспрессии этого фермента, аналогичны ⁷⁰-промоторам Е. coli, состоящим из консенсусных элементов -35 и -10 (G.L. Igloi и Н. Kossel, Crit. Rev. Plant Sci., 10: 525, 1992; W. Gruissem и J.C. Tonkyn, Crit. Rev. Plant ScL, 12, -19, 1993). Выбор промотора для РНК-полимеразы, кодируемой пластидной ДНК, зависит от кодируемых ядерной ДНК сигмаподобных факторов (Link и др., 1994, Plant promoters and transcription factors, изд-во Springer Verlag, Heidelberg, стр. 63-83). Кроме того, транскрипционная активность некоторых промоторов модулируется кодируемыми ядерной ДНК факторами транскрипции, взаимодействующими с элементами, расположенными против хода транскрипции ядерного промотора (LA. Allison и Р. Maliga, EMBO J., 14: 3721-3730; R. Iratni, L. Baeza, A. Andreeva, R. Mache, S. Lerbs-Mache, Genes Dev., 8, 2928, 1994). Эти факторы обусловливают ядерный контроль экспрессии пластидных генов в ответ на сигналы, связанные с процессом развития и с окружающей средой.

Умозрительно было сделано предположение о существовании в пластидах второй системы транскрипции. Однако к настоящему времени не получено прямого доказательства, подтверждающего это предположение. Выявление в пластидах новой второй системы транскрипции представляет собой важное достижение в области генной инженерии растений. Такая система позволяет увеличить пластичность и расширить диапазон видов растений, у которых можно трансформировать пластиды, и облегчает тканеспецифическую экспрессию чужеродных протеинов и РНК посредством конструкций, которыми можно манипулировать с помощью методов рекомбинантной ДНК.

Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение относится к конструкциям ДНК и к способам стабильной трансформации пластид многоклеточных растений. Конструкции ДНК по изобретению расширяют диапазон видов растений, которые могут быть трансформированы, и облегчают тканеспецифическую экспрессию представляющих интерес чужеродных генов.

В соответствии с первым вариантом осуществления изобретения предложены конструкции ДНК, содержащие новые промоторные последовательности, которые распознаются кодируемой ядерной ДНК пластидной [NEP = nuclear encoded plastid] РНК-полимеразой. Конструкция ДНК содержит трансформирующую ДНК, которая включает ориентирующий сегмент, по крайней мере один сайт клонирования, адаптированный для встраивания (инсерции) по крайней мере одного представляющего интерес чужеродного гена, причем экспрессия представляющего интерес чужеродного гена регулируется промотором, который распознается NEP-полимеразой, и пластидный селектируемый ген-маркер.

Согласно второму варианту осуществления настоящего изобретения предлагается применение элементов промотора, распознаваемых кодируемой пластидной ДНК пластидной [PEP = plastid encoded plastid] PHK-полимеразой, для усиления экспрессии представляющего интерес чужеродного гена. Подобно описанным выше конструкциям эти конструкции также содержат ориентирующий сегмент и сайт клонирования для экспрессии представляющего интерес чужеродного гена.

Промоторы, распознаваемые кодируемой пластидной ДНК пластидной РНК-полимеразой, ранее были хорошо охарактеризованы в фотосинтезирующих тканях, таких, как лист. В отличие от этого система транскрипции по настоящему изобретению, включающая кодируемую ядерную полимеразу, позволяет осуществлять экспрессию пластидных генов также в корнях, семенах и в меристематической ткани. У большинства растений, включая кукурузу, хлопчатник и пшеницу, регенерация растения осуществляется путем соматического эмбриогенеза (т.е. включая меристематическую ткань). В предпочтительном варианте осуществления изобретения эффективная трансформация пластид этих культурных растений может быть в значительной степени облегчена благодаря применению NEP-системы транскрипции в пластиде, промоторов и полимераз по настоящему изобретению.

NEP-промоторы по изобретению встраивают в доступные в настоящее время векторы для трансформации пластид и в протоколы по их применению, такие, как представленные в патенте США 5451513 и в находящейся на рассмотрении заявке на патент США 08/189256, а также описанные у Svab и Maliga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 913 (1993), при этом все эти публикации в полном объеме включены в настоящее описание в качестве ссылки. Для получения трансгенных растений пластиды из нефотосинтезирующих тканей трансформируют селектируемыми генами-маркерами, экспрессируемыми с помощью NEP-промоторов, и транскрибируют полимеразой, кодируемой ядерной ДНК. Для экспрессии представляющих интерес протеинов также конструируют кассеты экспрессии, обеспечивающие высокий уровень экспрессии в нефотосинтезирующей ткани с использованием NEP-промотора, получаемого в результате транскрипции полимеразой, кодируемой ядерной ДНК. В другом варианте РЕР-промоторы по изобретению включают в доступные в настоящее время векторы для трансформации пластид и в протоколы по их применению.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения NEP-система транскрипции также может быть объединена с системой ⁷⁰-типа путем использования двойственных NEP/PEP-промоторов.

Краткое описание чертежей Фиг. 1: Деления гена rроВ из пластидного генома табака путем направленного замещения гена. (А) Гомологичная рекомбинация (диагональные линии) с использованием последовательностей пластидной ДНК, расположенных рядом с геном aadA в плазмиде pLAA57, приводит к замещению rроВ (SacI-SmaI-фрагмент) в пластидном геноме дикого типа (птДНК) на последовательности aadA, что позволяет получить пластидный геном rроВ (rроВ-птДНК). Аббревиатуры: rроВ, rpoC1, rроС2 представляют собой пластидные гены, кодирующие , и -субъединицы РНК-полимеразы, подобной РНК-полимеразе Е. coil; aadA представляет собой химерный устойчивый к спектиномицину ген. Сайты, распознаваемые рестрикционным ферментом: Р, PstI; Sm, SmaI; Sc, SacI. (Б) Дефицит пигмента связан с делецией гена rроВ. Общую клеточную ДНК выделяли из зеленой (полосы 1, 3, 5) и белой (полосы 2, 4, 6) листовой ткани трех независимо друг от друга трансформированных линий растений табака (линия Nt-pLAA57-11B, полосы 1 и 2; линия Nt-pLAA57-16В, полосы 3 и 4; линия Nt-pLAA57-18C, полосы 5 и 6) и из зеленой листовой ткани растений дикого типа (Nt, полоса 7). ДНК расщепляли с помощью PstI и путем гель-блоттинга гибридизовали с фрагментом ДНК [положения нуклеотидов 22883-24486 птДНК, пронумерованные согласно К. Shinozaki и др. (ЕМВО J., 5, 2043, 1986)], содержащим часть rpoC1 (жирная черная линия на фиг. 1А). Зонд гибридизуется с фрагментом длиной 9,0 т.п.н. из генома дикого типа и с фрагментом длиной 4,2 т. п. н. из rроВ-птДНК. (В) Анализ ДНК методом гель-блоттинга подтверждает отсутствие копий птДНК дикого типа в побегах белого цвета линии Nt-pLAA57-10A (полоса 2) и в потомстве белого цвета, полученном из семян трансплантированного химерного растения той же линии (полоса 3). ДНК из зеленой листовой ткани дикого типа вносили в полосу 1. Заметно отсутствие фрагмента птДНК длиной 9,0 т.п.н. в растениях линии rроВ. Блоттинг проводили аналогично тому, как это описано для фиг. 1Б.

Фиг. 2: Деления гена rроВ приводит к получению фенотипа с дефицитом пигмента. (А) Показаны зеленые растения дикого типа (слева), растения с дефицитом rроВ (справа) и химерные растения (в центре). (Б) Цветущее химерное растение в теплице. Видны белые края листьев, что свидетельствует о присутствии rроВ-пластид во втором листовом слое, который формирует зародышевую линию клеток.

Фиг. 3: (А) Пластиды (Р) в мезофильных клетках листа растений линии rроВ лишены организованных соответствующим образом фотосинтезирующих мембран. Аббревиатуры: N - ядро; V - везикулы; М - митохондрия. (Б) Для сравнения приведена электронная микрофотография хлоропласта (Ср) листа дикого типа с тилакоидными мембранами (Т). Увеличение на фиг. (А) и на фиг. (Б) составляет 7800 раз (7800Х).

Фиг. 4. (Вверху) Накопление пластидных мРНК (А) фотосинтезирующих генов и (Б) генов генетической системы в растениях линии rроВ. Для гель-блоттинга использовали общую клеточную РНК (А - 3 мкг/полоса; Б - 5 мкг/полоса) из листовой ткани растений дикого типа (полосы 1, 3, 5) и rроВ-типа (полосы 2, 4, 6) и гибридизовали с указанными последовательностями пластидных генов. (Внизу) Указанные выше блотты подвергали повторному зондированию с последовательностями 25S-pДHK. Сигналы гибридизации количественно оценивали с помощью прибора Molecular Dynamics PhosphorImager и стандартизировали по отношению к сигналу 25S-pPHK. Относительное превышение интенсивности сигналов дикого типа над rроВ-типом приведено для каждого зонда под полосами.

Фиг. 5: Транскрипция в растениях линии rроВ инициируется неканоническим промотором. (А) Для картирования 5'-концов транскриптов rbcL и 16S-рДНК в растениях дикого типа (полосы 1, 3) и rроВ-типа (полосы 2, 4) применяли анализ удлинения праймера. Первичные транскрипты обозначены кружками (не закрашенными для дикого типа, закрашенными для rроВ), а образовавшиеся при процессинге транскрипты обозначены треугольниками. Транскрипты неизвестного происхождения обозначены звездочками. Соответствующие ступени последовательности (наличие загрузки GATC) получали с использованием таких же праймеров, которые применяли в реакциях удлинения праймера. Номера, указанные сбоку от каждого продукта удлинения, обозначают расстояние от первого нуклеотида кодирующей последовательности гена rbcL и от первого нуклеотида зрелой 16S-pPHK. (Б) Картирование первичных транскриптов 16S-pPHK в растениях дикого типа (полоса 2) и rроВ-типа (полоса 3). Общую РНК листа (20 мкг) кэппировали in vitro, и кэппированные виды 16S-pPHK выявляли методом защиты от РНКазы после гибридизации с комплементарным РНК-зондом. Кэппированные защищенные продукты имеют такое же обозначение, что и на фиг. 5(А). Полоса 1 содержит стандарты РНК известного размера. (В) Последовательность ДНК 16S-рДНК, расположенная против хода транскрипции, с транскриптами, начинающимися от промоторов кодируемой пластидной ДНК (⁷⁰-тип = Р1) и кодируемой ядерной ДНК (Р2) полимераз (обозначения Р1 и Р2 соответствуют таковым, принятым у A. Vera и М. Sigiura, Curr. Genet. 27, 280, 1995). Консенсусные элементы ⁷⁰-промотора (-35 и -10) обозначены прямоугольниками. Сайты инициации обозначены кружками, как на фиг. 5 (А) и 5 (Б). Нумерация начинается с первого нуклеотида против хода транскрипции области, кодирующей 16S-рДНК (-1 соответствует нуклеотиду 102757 в пластидном геноме табака).

Фиг. 6: Накопление пластидных мРНК в листьях табака дикого типа (дикий тип обозначен через wt) и rроВ-типа. Блотты, несущие пластидные гены (см. пример I), группируют следующим образом. (А) мРНК присутствует в существенно большем количестве в листьях дикого типа по сравнению с rроВ-типом. (Б) Уровни мРНК сопоставимы в листьях дикого типа и rроВ-типа или (В) мРНК больше в листьях rроВ-типа. Гель-блоттинг проводили с использованием общей клеточной РНК (3 мкг/полоса) из листовой ткани дикого типа (полосы 1) и rроВ-типа (полосы 2) и гибридизовали для выявления последовательностей пластидных генов. (Нижняя часть) Для контроля загрузки приведенные выше блотты повторно зондировали последовательностями 25S-рДНК.

Фиг. 7: Картирование сайтов инициации транскрипции оперона atpB в листьях табака дикого типа и rроВ-типа. (А) Анализ удлинения праймера. Меченные по концам продукты удлинения праймера из образцов дикого типа (wt) и rроВ-типа (Т57) подвергали анализу параллельно с гомологичными последовательностями, полученными при использовании этого же праймера. Номера, проставленные сбоку от последовательности, обозначают расстояние от кодона инициации трансляции ATG. Первичные транскрипты, полученные от NEP- и РЕР-промоторов, обозначены закрашенными и незакрашенными кружками соответственно. (Б) Применение кэппирования in vitro и метода защиты от РНКазы для идентификации 5'-концов первичных транскриптов. В полосы вносили образцы РНК rроВ-типа (Т57 - 1, 2) и дикого типа (wt - 4, 5) с (2, 4) и без (1, 5) защищающей комплементарной антисмысловой РНК. В полосу 3 вносили маркеры для определения молекулярной массы (ММ) (100, 200, 300, 400 и 500 нуклеотидов). 5'-конец транскрипта на фиг. 7(А) соответствует указанному в скобках размеру защищенного фрагмента: -254 (277 нуклеотидов, н.т.), -289 (311). Следует отметить артефакт, имеющий место несколько ниже маркера в 200 н.т., который присутствует в образцах незащищенной РНК. (В) Физическая карта межгенной области atpB-rbcL. Положение на карте 5'-концов первичных транскриптов для NEP- и РЕР-промоторов atpB обозначено так же, как и на фиг. 7 (А).

Фиг. 8: Картирование сайтов инициации транскрипции оперона atpI в листьях табака дикого типа и rроВ-типа. (А) Анализ удлинения праймера. Меченные по концам продукты удлинения праймера из образцов дикого типа (wt) и rроВ-типа (Т57) подвергали анализу параллельно с гомологичными последовательностями, полученными при использовании этого же праймера. Номера, проставленные сбоку от последовательности, обозначают расстояние от кодона инициации трансляции ATG. Первичные транскрипты, полученные с помощью NEP- и РЕР-промоторов, обозначены закрашенными и незакрашенными кружками соответственно. (Б) Применение кэппирования in vitro и метода защиты от РНКазы для идентификации 5'-концов первичных транскриптов. В полосы вносили образцы РНК rроВ-типа (Т57 - 1, 2) и дикого типа (wt - 4, 5) с (2, 4) и без (1, 5) защищающей комплементарной антисмысловой РНК. В полосу 3 вносили маркеры для определения молекулярной массы (ММ) (100, 200, 300, 400 и 500 нуклеотидов). 5'-конец транскрипта на фиг. 8 (А) соответствует указанному в скобках размеру защищенного фрагмента: -130 (235 н.т.), -207, 209, 212 (303, 305, 309; не выявлены). Следует отметить артефакт, имеющий место несколько ниже маркера в 200 н. т., который присутствует в образцах незащищенной РНК. (В) Физическая карта межгенной области rps2-atpI. Положение на карте 5'-концов первичных транскриптов для NEP- и РЕР-промоторов atpI оперона обозначено так же, как и на фиг. 8(А).

Фиг. 9: Картирование сайтов инициации транскрипции с1рР в листьях табака дикого типа и rроВ-типа. (А) Анализ удлинения праймера. Меченные по концам продукты удлинения праймера из образцов дикого типа (wt) и rроВ-типа (Т57) подвергали анализу параллельно с гомологичными последовательностями, полученными при использовании этого же праймера. Номера, проставленные сбоку от последовательности, обозначают расстояние от кодона инициации трансляции ATG. Первичные транскрипты, полученные с помощью NEP- и РЕР-промоторов, обозначены закрашенными и незакрашенными кружками, соответственно. (Б) Применение кэппирования in vitro и метода защиты от РНКазы для идентификации 5'-концов первичных транскриптов. В полосы вносили образцы РНК rроВ-типа (Т57 - 1, 2) и дикого типа (wt - 4, 5) с (2, 4) и без (1, 5) защищающей комплементарной антисмысловой РНК. В полосу 3 вносили маркеры для определения молекулярной массы (ММ) (100, 200, 300, 400 и 500 нуклеотидов). 5'-конец транскрипта на фиг. 9 (А) соответствует указанному в скобках размеру защищенного фрагмента: -53 (96 н.т.), -95 (138 н.т.), -173 (216 н.т.) и -511 (69 н.т.). Следует отметить артефакт, имеющий место несколько ниже маркера в 200 н. т., который присутствует в образцах незащищенной РНК. (В) Физическая карта межгенной области clpP-psbB. Положение на карте 5'-концов первичных транскриптов для NEP- и РЕР-промоторов с1рР обозначено так же, как и на фиг. 9 (А).

Фиг. 10. Картирование сайтов инициации транскрипции accD в листьях табака дикого типа и rроВ-типа. (А) Анализ удлинения праймера. Меченные по концам продукты удлинения праймера из образцов дикого типа (wt) и rроВ-типа (Т57) подвергали анализу параллельно с гомологичными последовательностями, полученными при использовании этого же праймера. Номера, проставленные сбоку от последовательности, обозначают расстояние от кодона инициации трансляции ATG. Первичный транскрипт, полученный от NEP-промотора PaccD-129, обозначен закрашенным кружком. (Б) Применение кэппирования in vitro и метода защиты от РНКазы для идентификации 5'-концов первичных транскриптов. В полосы вносили образцы РНК rроВ-типа (Т57 - 1, 2) и дикого типа (wt - 4, 5) с (2, 4) и без (1, 5) защищающей комплементарной антисмысловой РНК. В полосу 3 вносили маркеры для определения молекулярной массы (ММ) (100, 200, 300, 400 и 500 нуклеотидов). 5'-конец транскрипта -57 на фиг. 10 (А) соответствует защищенному фрагменту размером 103 н.т. Следует отметить артефакт, имеющий место несколько ниже маркера в 200 н.т., который присутствует в образцах незащищенной РНК. (В) Физическая карта межгенной области accD--rbcL. Обозначено положение на карте 5'-конца первичного транскрипта для NEP-промотора PaccD-129.

Фиг. 11: Сранительный анализ первичной структуры последовательностей ДНК, соседних с сайтами инициации транскрипции NEP-промотора. Прямоугольниками обозначены нуклеотиды, имеющие более 6 совпадений. Консенсусная последовательность, соседняя с сайтом инициации транскрипции, приведена ниже. Положение 5'-концов обозначено закрашенными кружками. Следует отметить, что 5'-концы Prpsl2-153 и Prpsl6-107 не кэппировались и могут не относиться к первичным транскриптам.

Фиг. 12: NEP- и РЕР-полимеразы благодаря способности распознавать различные промоторы обеспечивают механизм избирательной транскрипции пластидных генов. Следует отметить, что некоторые гены имеют только РЕР-промоторы (фотосинтезирующая система I и фотосинтезирующая система II), а другие имеют как PEP-, так и NEP-промоторы (большинство генов "домашнего хозяйства", или только NEP-промоторы (accD)).

Фиг. 13: Схематическая диаграмма химерного пластидного гена, экспрессируемого с помощью NEP-промотора.

Описание изобретения В некоторых исследованиях было высказано предположение о существовании дополнительной локализованной в пластиде РНК-полимеразы, кодируемой ядерной ДНК (эти данные обобщены у Gruissem и Tonkyn, 1993; Igloi и Kossel, 1992; Mullet, 1993; Link, 1994).

Путем удаления гена rроВ, кодирующего основную -субъединицу РНК-полимеразы табака, подобной РНК-полимеразе Е. coli, доказано существование в пластиде второй системы транскрипции, которая кодируется ядерной ДНК (Allison и др. , 1996, EMBO J. 15: 2802-2809). Деления гена rроВ приводила к получению растений, дефектных с точки зрения фотосинтеза с дефицитом пигмента. Изучение ультраструктуры пластид в клетках мезофилла листа растений с делецией rроВ (rроВ) позволило выявить пропластидоподобные органеллы, у которых отсутствовало упорядочнное строение тилакоидных мембран, характерное для активных в отношении фотосинтеза хлоропластов. Уровни транскриптов фотосинтезирующих генов rbcL, psbA и psbD были очень невысокими, тогда как мРНК генов rрl16, atpI и 16S-рДНК накапливались до уровней, близких к таковым в диком типе или до более высоких уровней, чем у дикого типа. Отсутствие накопления транскриптов для фотосинтезирующих генов являлось следствием отсутствия промоторной активности ⁷⁰-типа. В то время как в листьях табака дикого типа оперон рибосомной РНК в норме транскрибируется с помощью промотора ⁷⁰-типа, в растениях rроВ-типа оперон рРНК транскрибировался с помощью промотора, не относящегося к ⁷⁰-типу. Оперон рРНК является первой единицей транскрипции, для которой выявлена и кодируемая пластидной ДНК, и кодируемая ядерной ДНК пластидная РНК-полимераза (PEP- и NEP-полимераза соответственно).

Анализ промоторных областей других генов показал, что оперон рРНК не явлется единственным. Он является представителем большого класса пластидных генов, каждый из которых имеет по крайней мере один промотор для PEP- и NEP-полимеразы, и обладает способностью экспрессировать любую из двух пластидных РНК-полимераз. Кроме того, были выявлены пластидные гены, которые транскрибируются исключительно при участии NEP-РНК-полимеразы. Таким образом, эти результаты позволяют предположить, что дополнительные генспецифические механизмы регулируют уровни NEP-транскриптов в пластидах различных типов.

Сайт инициации транскрипции NEP был выявлен на расстоянии приблизительно 62 основания против хода транскрипции от 5'-конца зрелой 16S-pPHK. Последовательность, окружающая сайт инициации, является высококонсервативной у многочисленных изученных видов растений и не имеет сходства с консенсусной последовательностью РЕР-промотора. Консенсусные последовательности NEP-промотора, важные для распознавания и связывания полимеразы, кодируемой ядерной ДНК (аналогично последовательностям -10 и -35 сайта инициации транскрипции E. coli-типа), предпочтительно локализованы внутри области длиной приблизительно 50 нуклеотидов в любом направлении от сайта инициации транскрипции NEP. Как описано более подробно в примере I, существуют несколько различных NEP-промоторов, и иногда обнаруживали NEP-промоторы, конъюгированные с РЕР-промоторами.

Полимеразы по изобретению могут быть очищены с помощью хроматографии с использованием стандартных методов. NEP-полимеразная активность в колоночных фракциях может быть проанализирована в реакциях транскрипции in vitro с использованием сегментов ДНК, содержащих область NEP-промотора в качестве матриц. В альтернативном варианте последовательности NEP-промотора могут быть присоединены к матриксу, который может быть разделен с помощью ряда способов (например, с помощью магнитных гранул). Связанную с матриксом ДНК инкубируют с растительным экстрактом в условиях, при которых ожидается, что полимераза, кодируемая ядерной ДНК, будет связываться с ДНК. Комплекс матрикс/ДНК/полимераза затем отделяют от растительного экстракта и связанный протеин далее может быть выделен и охарактеризован. Очищенный любым из вышеуказанных способов протеин может использоваться для получения антител для зондирования библиотек экспрессии, для цели выделения ядерных генов или кДНК, кодирующих полимеразу, кодируемую ядерной ДНК.

В качестве альтернативного подхода к выделению NEP-полимеразы может быть использовано выделение протеинов, обладающих специфической аффинностью по отношению к фрагменту промотора, а N-концевая аминокислотная последовательность может быть определена путем микросеквенирования. Затем аминокислотная последовательность может быть использована для конструирования соответствующих ПЦР-праймеров, предназначенных для выделения генов.

Активность ранее известной кодируемой пластидной ДНК системы транскрипции ⁷⁰-типа была в достаточной степени охарактеризована в тканях с высокой фотосинтезирующей активностью, таких, как лист. В отличие от этого предлагаемая система транскрипции с использованием полимеразы, кодируемой ядерной ДНК, управляет экспрессией пластидных генов также и в корнях, семенах и в меристематической ткани. У большинства растений, включая кукурузу, хлопчатник и пшеницу, регенерация растения осуществляется путем соматического эмбриогенеза (т.е. включая меристематическую ткань). Эффективная пластидная трансформация этих культурных растений может быть осуществлена или в значительной степени облегчена благодаря применению предлагаемой NEP-системы транскрипции в пластиде.

NEP-промоторы по изобретению могут быть включены в доступные в настоящее время векторы для трансформации пластиды согласно протоколам по их применению, таким, как описанные в патенте США 5451513 и в находящейся на рассмотрении заявке на патент США 08/189256, а также приведенные у Svab и Maliga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 913 (1993), при этом все эти публикации в полном объеме включены в настоящее описание в качестве ссылки. Для получения трансгенных растений пластиды из нефотосинтезирующих тканей трансформируют селектируемыми генами-маркерами, экспрессируемыми с помощью NEP-промоторов, и транскрибируют с помощью полимеразы, кодируемой ядерной ДНК. Аналогично этому для экспрессии представляющих интерес протеинов конструируют кассеты экспрессии, обеспечивающие высокий уровнь экспрессии в нефотосинтезирующей ткани с использованием NEP-промотора, транскрибируемого полимеразой, кодируемой ядерной ДНК. NEP-система транскрипции также может быть объединена с системой ⁷⁰-типа с использованием двойных NEP/PEP-промоторов. В некоторых случаях также может требоваться экспрессия трансгенов с помощью NEP-промоторов в фотосинтезирующей ткани.

В приведенном ниже в примерах I-III подробном описании изложены предпочтительные способы создания и применения конструкций ДНК по настоящему изобретению и практического воплощения способов по изобретению. Любые конкретно не описанные методики молекулярного клонирования и рекомбинантных ДНК осуществляют в соответствии со стандартными способами, как это в общих чертах изложено, например, у Ausubel (ред.), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley и Sons, Inc. (1994).

Ниже изобретение более подробно проиллюстрировано на примерах, не ограничивающих его объем.

Пример I Демонстрация существования в пластидах второй, отличающейся от известной, системы транскрипции путем делеции гена rроВ Для доказательства существования в пластидах РНК-полимеразы, не подобной таковой Е. coli, ген одной из основных субъединиц подобного Е. coli фермента удаляли путем делеции из пластидного генома табака. Затем определяли уровни мРНК в мутантных пластидах. Данные свидетельствуют о том, что в отсутствие кодируемого пластидной ДНК подобного Е. coli фермента экспрессия некоторых фотогенов резко снижается. В противоположность этому уровни транскриптов пластидных генов, кодирующих аппарат экспрессии генов, близки к уровням в растениях дикого типа. Следовательно, РНК-полимераза, не подобная таковой Е. coli, избирательно транскрибирует определенную подгруппу пластидных генов. Этот второй аппарат транскрипции не инициируется обычными для Е. coli ⁷⁰-промоторами, но обладает способностью распознавать новую промоторную последовательность.

Материалы и методы примера I Конструирование плазмиды. Плазмида pLAA57 является производной pBSKS+ (фирма Stratagene), которая несет SacI-BamHI-фрагмент (нуклеотиды с 22658 по 29820) птДНК. Внутренний фрагмент SacI-SmaI ДНК внутри вставки между нуклеотидами 24456 и 28192 птДНК замещали химерным устойчивым к спектиномицину (aadA) геном. Ген aadA идентичен таковому, описанному у Z. Svab и Р. Maliga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 913 (1993), за исключением того, что 3'-область psbA короче и находится в фрагменте XbaI-DraI, как описано у J.M. Staub и Р. Maliga, Plant J. 6, 547, (1994).

Трансформация растения. Для трансформации пластиды частицы вольфрама покрывали (Z. Svab и Р. Maliga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 913, 1993) ДНК pLAA57 и интродуцировали в листья растений табака Nicotiana tabacum, используя инжектор для биобаллистического метода типа DuPount PDS10000He при давлении 1100 фунтов/кв. дюйм. Трансгенные побеги отбирали в асептических условиях на среде RMOP (Z. Svab, P. Hajdukiewicz, P. Maliga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 8526, 1990), содержащей 500 мг/мл дигидрохлорида спектиномицина. Трансгенные черенки укореняли и выращивали на RM-среде, состоящей из затвердевших в агаре MS-солей (Т. Murashige и F. Skoog, Physiol. Plant., 15, 493, 1962), содержащей 3% сахарозы.

Электронная микроскопия. С помощью электронной микроскопии исследовали полностью распустившиеся листья черенков дикого типа и линии rроВ, выращенные в стерильной культуре на RM-среде с 3% сахарозы. Ткань фиксировали в течение 2 ч в 2%-ном глутаровом альдегиде, 0,2М сахарозе и 0,1М фосфатном буфере (рН 6,8) при комнатной температуре и трижды промывали в 0,2М сахарозе, 0,1М фосфатном буфере. Зафиксированные ткани подвергали постфиксации в буфере из 1%-ного тетроксида осмия с 0,2М сахарозой, дегидрировали в постепенно меняющихся концентрациях этанола, заливали в эпоксидную смолу Спурра (твердая), делали срезы и окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца для трансмиссионной электронной микроскопии.

Гель-блоттинг. Общую ДНК листа получали по методике, описанной у I.J. Mettler, Plant Mol. Biol. Rep., 5, 346 (1987), обрабатывали рестрикционной эндонуклеазой PstI, разделяли на 0,7%-ных агарозных гелях и переносили на Hybond N (фирма Amersham), используя устройство для переноса типа Posiblot Transfer (фирма Stratagene). Гибридизацию со случайным образом примированным меченым фрагментом проводили в буфере для быстрой гибридизации (Rapid Hybridization Buffer, фирма Amersham) в течение ночи при 65^oС. Общую РНК листа получали с использованием TRIzol (GIBCO BRL), следуя протоколу производителя. РНК подвергали электрофорезу на гелях 1% агарозы/формальдегид, затем переносили на найлоновую мембрану и зондировали аналогично тому, как это описано для блоттинга ДНК.

Синтез зондов. Двухцепочечные ДНК-зонды для psbA, atpI и rрl16 получали с помощью случайным образом примированных, меченных с помощью ³²Р фрагментов ДНК, полученных с использованием ПЦР. Последовательность применяемых для ПЦР праймеров, а также их положения в птДНК табака (К. Shinozaki и др., EMBO J., 5, 2043, 1986) следующие: psbA, 5'-праймер = 5'-CGCTTCTGTAACTGG-3' (комплементарный нуклеотидам 1550-1536 птДНК), 3'-праймер = 5'-TGACTGTCAACTACAG-3' (нуклеотиды 667-682); atpI, 5'-праймер = 5'-GTTCCATCAATACTC-3' (комплементарный нуклеотидам 15985-15971), 3'-праймер = 5'-GССGСGGСТАААGТТ-3'(нуклеотиды 15292-15306); rрl16, 5'-праймер = 5'-TCCCACGTTCAAGGT-3'(комплементарный нуклеотидам 84244-84230), 3'-праймеp = 5'-TGAGTTCGTATAGGC-3'(нуклеотиды 83685-83699). Для создания зондов к rbcL, psbD/C и 16S-pPHK метили с помощью ³²P следующие расщепленные рестриктазами фрагменты ДНК: rbcL, BamHI-фрагмент (нуклеотиды 58047-59285 в птДНК); psbD/C, SacII-HindIII-фрагмент оперона табака psbD/C (нуклеотиды 34691-36393); 16S-pPHK, EcoRI-EcoRV-фрагмент (нуклеотиды 138447-140855 в птДНК).

Зонд для 25S-рРНК табака получали из плазмиды pKDRl (D. Dempsey, K.W. Wobbe, D. F. Klessig, Mol. Plant Path., 83, 1021, 1993), содержащей EcoRI-фрагмент длиной 3,75 т. п. н. из локуса 25S/18S табака, клонированного в плазмиде pBR325. При гибридизации с помощью гель-блоттингов для 25S-pPHK меченный с помощью ³²Р двухцепочечный ДНК-зонд смешивали с немеченой плазмидой pKDRl в количестве, соответствующем 2-кратному избытку относительно количества РНК, присутствующего на фильтре.

Стандартизация уровней ДНК по количеству копий пластидного генома. С целью определить, влияют ли изменения в количестве копий пластидного генома на выявленные различия в экспрессии генов, получали общую клеточную ДНК и РНК из равных количеств листовой ткани растений дикого типа и rроВ-типа. Для сравнения количества копий пластидного генома на эквивалент листовой массы гель-блоттинги ДНК проводили с равным объемом каждого препарата ДНК и зондировали радиоактивномеченным EcoRI-EcoRV-фрагментом (нуклеотиды 138447-140845 птДНК) (К. Shinozaki и др. , EMBO J., 5, 2043, 1986) последовательности 16S-рДНК. Количественная оценка с помощью PhosporImage-анализа показала одинаковое количество копий пластидного генома в каждом образце. Количество 16S-pPHK, полученное из одинаковых образцов ткани и измеренное с помощью гель-блоттингов РНК при использовании равных объемов каждого препарата РНК, оказалось сниженным в 2,5 раза в растениях линии rроВ. Это значение соответствует 3-кратному снижению, выявленному при стандартизации с сигналом цитоплазматической 25S-pPHK (фиг. 3Б).

Реакции удлинения праймеров. Реакции удлинения праймеров проводили с использованием 3 мкг (дикий тип) или 10 мкг (rроВ-типа) общей РНК листа, как описано у L.A. Allison и Р. Maliga, EMBO J., в печати), применяя следующие праймеры: для 16S-pPHK: 5'-TTCATAGTTGCATTACTTATAGCTTC-3' (комплементарный нуклеотидам 102757-102732); для rbcL: 5'-ACTTGCTTTAGTCTCTGTTTGTGGTGACAT-3'(комплементарный нуклеотидам 57616-57587). Ступени последовательности получали с этими же праймерами, используя набор секвиназы II (набор Sequenase II, фирма USB).

Идентификация первичных транскриптов с помощью кэппинга in vitro. Общую РНК (20 мкг) листа из растений дикого типа и линии rроВ подвергали кэппингу в присутствии [-³²P]-ГТФ (J.C. Kennell и D.R. Pring, Mol. Gen. Genet., 216, 16, 1989). Меченые 16S-pPHK выявляли путем защиты от рибонуклеазы (A. Vera и М. Sigiura, Plant Mol. Biol, 19, 309, 1992), используя набор RPAII (фирма Ambion). Для получения защищенной комплементарной РНК расположенную против хода транскрипции область 16S-pДHK (нуклеотиды 102526-102761 птДНК) подвергали ПЦР-амплификации с использованием следующих праймеров: 5'-праймер представлял собой праймер соответствующий нуклеотидам 102526-102541 птДНК (К. Shinozaki и др., EMBO J., 5, 2043, 1986), (подчеркнуты) плюс сайт XbaI; 3'-праймер представлял собой праймер комплементраный нуклеотидам 102761-102742 птДНК (подчеркнуты) плюс сайт KpnI. Амплифицированный продукт клонировали в виде XbaI-KpnI-фрагмента в расщепленном рестриктазами ХbаI и KpnI векторе pBSKS+ (фирма Stratagene). Для создания немеченой РНК, комплементарной 5'-концу 16S-pPHK, полученную плазмиду линеаризовали с помощью XbaI и транскрибировали с использованием реакции типа Megascript (фирма Ambion) с Т3-РНК-полимеразой. Маркеры (100, 200, 300, 400 и 500 нуклеотидов) получали с помощью набора матриц РНК (RNA Centure Markers Template Set, фирма Ambion), следуя протоколу производителя. Маркер нуклеотида 72 представлял собой зрелый транскрипт, полученный в результате процессинга из пластидного гена trnV и созданный с помощью защиты от РНКазы.

Результаты Нарушение активности РНК-полимеразы, подобной РНК-полимеразе Е. coli, в пластидах табака приводит к появлению фенотипа дефицита пигмента. Для предотвращения нарушения других функций пластидных генов в качестве мишени для делеции был выбран ген rроВ, поскольку является первым в рамке считывания оперона, кодирующего исключительно субъединицы Е. coli-подобной пластидной полимеразы (К. Shinozaki и др., EMBO J., 5, 2043, 1986). Делецию осуществляли путем замещения большей части кодирующей области rроВ (3015 из 3212 пар оснований) и 691 пары оснований некодирующей области, расположенной против хода транскрипции, на химерный устойчивый к