Манипулирование ферментативной активностью протопорфириногеноксидазы у эукариот

Манипулирование ферментативной активностью протопорфириногеноксидазы у эукариот

Реферат

 

Изобретение относится к генетической инженерии и может быть использовано, например, в селекции растений. Введение молекулы ДНК, кодирующей протопорфириногеноксидазу (протокc) в клетки растений, придает им устойчивость к гербицидам. Последовательности ДНК могут быть использованы также в качестве зондов для тестирования химических соединений на способность ингибировать активность протокса, для идентификации модифицированного протокса, а также для отбора растений, устойчивых к гербицидам. 9 с. и 36 з.п.ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к манипулированию ферментативной активностью, ответственной за превращение протопорфириногена IX в протопорфирин IX в процессе биосинтеза, общего для всех эукариот. Один из предметов изобретения относится к развитию устойчивости к гербицидам у растений, тканей растений и семян. Другой предмет изобретения относится к разработке методов диагностики и лечения дефицита этой ферментативной активности у животных, в частности у людей.

Процессы биосинтеза, приводящие к производству хлорофилла и гема, включают ряд общих стадий. Хлорофилл представляет собой поглощающий свет пигмент, присутствующий во всех зеленых фотосинтезирующих организмах. Гем представляет собой кофактор гемоглобина, цитохромов, Р450-оксигеназ со смешанной функцией, пероксидаз и каталаз (см., например, у Lehninger, Biochemistry, Worth Publishers, New York (1975)) и, следовательно, является необходимым компонентом всех аэробных организмов.

Последней общей стадией биосинтеза хлорофилла и гема является окисление протопорфириногена IX в протопорфирин IX. Протопорфириногеноксидаза (обозначенная в данном описании как "протокс") представляет собой фермент, который катализирует эту последнюю стадию окисления (Matringe и др., Biochem. J. 260: 231 (1989)).

Фермент протокс был очищен полностью или частично из многочисленных организмов, включающих дрожжи Saccharomyces cerevisiae (Labbe-Bois и Labbe, Biosynthesis of Heme and Chlorophyll, E. H. Dailey, ред. McGraw Hill: New York, стр. 235-285 (1990)), этиопласты ячменя (Jacobs и Jacobs, Biochem. J. 244: 219 (1987)) и печень мыши (Dailey и Karr, Biochem. 26: 2697 (1987)). Гены, кодирующие протокс, были выделены из двух прокариот: Escherichia coli (Sasarman и др. , Can. J. Microbiol. 39: 1155 (1993)) и Bacillus subtilis (Dailey и др., J.Biol. Chem. 269: 813 (1994)). Эти гены не обладают сходной последовательностью; кодируемые ими протеиновые продукты не имеют каких-либо идентичных аминокислотных последовательностей. Протеин E. coli имеет массу приблизительно 21 кДа и связан с клеточной мембраной. Протеин В. subtilis имеет массу 51 кДА и является растворимым, активным в цитоплазме.

В настоящее время слишком мало известно о ферменте протоксе, чтобы получить возможность выделить кодирующие протокс гены из высших эукариот (т.е. животных, растений и всех других многоклеточных, имеющих ядро организмов, отличных от низших эукариотических микроорганизмов, таких как дрожжи, одноклеточные водоросли, простейшие и т.д.), используя известные подходы.

В частности многие стандартные методы выделения новых протеинов и генов базируются на предположении, что они обладают значительным сходством по первичной структуре (т. е. по аминокислотной последовательности и последовательности ДНК) с известными протеинами и генами, обладающими аналогичной функцией. Такие стандартные методы включают гибридизацию нуклеиновых кислот и амплификацию путем полимеразно-цепьевой реакции с использованием олигонуклеотидных праймеров, соответствующих мотивам консервативной аминокислотной последовательности. Не следует ожидать, что эти методы будут пригодны для выделения генов протокса эукариот при использовании современной информации о структуре, которая ограничена данными о генах протокса прокариот, поскольку не существует значительного структурного сходства даже между известными генами и протеинами протокса прокариот.

Другой подход, который был применен для выделения генов биосинтеза в других метаболических процессах из высших эукариот, представляет собой комплементацию в микробных мутантах дефицита представляющей интерес активности. Для этого подхода библиотеку кДНК из высших эукариот клонируют в векторе, который может управлять экспрессией кДНК в хозяине-микроорганизме. Затем вектор трансформируют или каким-либо иным образом вводят в мутантный микроорганизм и отбирают колонии, которые фенотипически больше не являются мутантами.

Эту стратегию применяли для выделения генов из высших эукариот, вовлеченных в несколько метаболических процессов, включая биосинтез гистидина (см., например, патент США 5290926 и WO 94/026909 на имя Ward и др., полностью включенных в настоящее описание в качестве ссылки), биосинтез лизина (см., например, Frish и др., Mol. Gen. Genet. 228: 287 (1991)), биосинтез пурина (см. , например, Aimi и др., J. Biol. Chem. 265: 9011 (1990)) и биосинтез триптофана (см., например, Niyogi и др., Plant Cell 5: 1011 (1993)). Однако несмотря на доступность микробных мутантов, у которых, вероятно, недостаточна активность протокса (например, Е. coli (Sasarman и др., J. Gen. Microbiol. 113: 297 (1979)), Salmonella typhimurium (Xu и др., J. Bacteriol. 174: 3953 (1992)) и Saccharomyces cerevisiae (Camadro и др., Biochem. Biophys. Res. Comm. 106: 724 (1982)), применение этого метода для выделения кДНК, кодирующих ферментативную активность протокса у эукариот, на основе доступной информации в основном непредсказуема.

Для этого есть несколько причин. Во-первых, последовательность кДНК протокса эукариот может не экспрессироваться с адекватными уровнями в мутантных микроорганизмах, например, вследствие применения кодона, не совместимого с обычно предпочтительными кодонами для хозяина-микроорганизма. Во-вторых, первичный продукт трансляции из клонированной кодирующей последовательности эукариот может не производить функциональный полипептид, например, если для пост-трансляционной модификации, такой как гликозилирование, необходима активность, которой микроорганизм не обладает. В-третьих, протеин эукариот может оказаться неспособным принимать свою активную конформацию в хозяине-микроорганизме, например, если протеин в норме ориентирован к мембранной системе конкретной органеллы, которой микробный хозяин лишен. Эта последняя возможность особенно вероятна для фермента протокса растений, который связан в клетке растения с органеллами, отсутствующим у микробных хозяев, применяемых в методе комплементации. В частности, фермент протокс растений связан как с оболочкой хлоропласта, так и с тилакоидными мембранами (Matringe и др. , J. Biol. Chem. 267: 4646 (1992)) и, вероятно, достигает указанных мембранных систем в результате пост-трансляционного механизма ориентации, включающего как N-концевую транзитную последовательность, так и внутренние свойства зрелого полипептида (см., например, у Kohorn и Tobin, Plant Cell 1: 159 (1989); Li и др., Plant Cell 3: 709 (1991); Li и др., J. Biol. Chem. 267: 18999 (1992)).

Известно, что фермент протокс играет определенную роль при некоторых болезненных состояниях человека. Пациенты, страдающие от смешанной порфирии, аутосомного доминантного расстройства, характеризующегося как нейропсихическими симптомами, так и повреждениями кожи, имеют пониженные уровни активности протокса (Brenner и Bloomer, New Engl. J. Med. 302: 765 (1980)). Вследствие отсутствия данных о ферменте протоксе человека и соответствующем ему гене возможности для диагностики и лечения этого расстройства в настоящее время весьма ограничены.

Применение гербицидов для борьбы с нежелательной растительностью, такой как сорняки или растения в сельскохозяйственных культурах, стало почти повсеместной практикой. Соответствующий рынок превышает миллиард долларов ежегодно. Несмотря на такое широкое применение борьба с сорняками остается для фермеров важной и дорогой проблемой.

Для эффективного применения гербицидов необходим достаточно жесткий контроль. Например, время и способ обработки и стадия развития сорного растения являются важным фактором для получения хороших результатов при борьбе с сорняками с помощью гербицидов. Поскольку различные виды сорняков устойчивы к гербицидам, важность получения эффективных гербицидов существенно возрастает.

К сожалению, гербициды, проявляющие более высокую эффективность, предназначенные для более широкого спектра сорняков и обладающие ускоренным разложением в почве, могут также обладать большей фитотоксичностью для культурных растений. Одним из решений этой проблемы была разработка культурных растений, устойчивых или толерантных к гербицидам. Гибриды или сорта культурных растений, устойчивые к гербицидам, позволяют применять гербициды без сопутствующего риска повредить культурное растение. Развитие устойчивости может дать возможность обрабатывать гербицидом культурное растение, где его применение ранее было исключено или ограничено (например, применение для предвсходовой обработки) вследствие чувствительности полезных растений к гербициду. Например, патент США 4761373 на имя Anderson и др. относится к устойчивости растений к различным гербицидам из классов имидазолинона или сульфонамида. Устойчивость обусловлена изменением фермента синтазы ацетооксикислоты (AHAS). В патенте США 4975374 на имя Goodman и др. описаны растительные клетки и растения, содержащие ген, кодирующий мутантную глутамин-синтетазу (GS), устойчивую к ингибированию гербицидами, для которых известна способность ингибировать GS, например, к фосфинотрицину и к метионинсульфоксимину. В патенте США 5013659 на имя Bedbrook и др. описаны растения, экспрессирующие мутантную ацетолактат-синтазу, что делает растения устойчивыми к ингибированию гербицидами из класса сульфонилмочевины. В патенте США 5162602 на имя Somers и др. описаны растения, толерантные к ингибированию гербицидами циклогександионом и арилоксифеноксипропановой кислотой. Эта толерантность обусловлена изменением ацетил-СоА-карбоксилазы (АККазы).

Фермент протокс служит в качестве мишени для различных гербицидных соединений. Гербициды, которые ингибируют протокс, включают многие различные по структуре классы молекул (Duke и др., Weed Sci. 39: 465 (1991); Nandihalli и др. , Pesticide Biochem. Physiol. 43: 193 (1992); Matringe и др., FEBS Lett. 245: 35 (1989); Yanase и Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35: 70 (1989)). Эти гербицидные соединения включают дифениловые эфиры {например, ацифлуорфен, 5-[2-хлор-4-(трифторметил)фенокси]-2-нитробензойная кислота; ее метиловый эфир; или оксифлуорфен, 2-хлор-1-(3-этокси-4-нитрофенокси)-4-(трифторбензол)} , оксидиазолы (например, оксидиазон, 3-[2,4-дихлор-5-(1-метилэтокси)фенил]-5-(1,1-диметилэтил)-1,3,4-оксадиазол-2-(3Н)-он), циклические имиды (например, S-23142, N-(4-xлop-2-фтоp-5-пропаргилоксифенил)-3,4,5,6-тетрагидрофталимид; хлорфталим, N-(4-хлорфенил)-3,4,5,6-тетрагидрофталимид), фенилпиразолы (например, ТНПП-этил, этил-2[1-(2,3,4-трихлорфенил)-4-нитропиразолил-5-окси] пропионат; М&В 39279), производные пиридина (например, LS 82-556) и фенопилат и его О-фенилпирролидино- и пиперидинкарбаматные аналоги. Многие из этих соединений конкурентно ингибируют нормальную реакцию, катализируемую ферментом, вероятно, выступая в качестве аналогов субстрата.

Вероятный механизм действия ингибирующих протокс гербицидов включает накопление в хлоропласте протопорфириногена IX. Это накопление, вероятно, приводит к проникновению протопорфириногена IX в цитозоль, где он окисляется с помощью пероксидазной активности в протопорфирин IX. При экспозиции светом протопорфирин IX может вызвать образование в цитозоле атомарного кислорода. Этот атомарный кислород в свою очередь может привести к образованию других реактивных видов кислорода, которые могут вызвать переокисление липидов и разрушение мембраны, что приводит к быстрой гибели клетки (Lee и др.. Plant Physiol. 102: 881 (1993)).

Не все ферменты протокса чувствительны к гербицидам, которые ингибируют ферменты протокса растений. Ферменты протокса, кодируемые генами, выделенными как из Escherichia coli (Sasarman и др.. Can. J. Microbiol. 39: 1155 (1993)), так и из Bacillus subtilis (Dailey и др., J.Biol. Chem. 269: 813 (1994), устойчивы к этим гербицидным ингибиторам. Кроме того, были описаны мутанты одноклеточной водоросли Chlamydomonas reinhardtii, устойчивые к фенилимидному гербициду S-23142 (Kataoka и др., J. Pesticide Sci. 15: 449 (1990); Shibata и др., Research in Photosynthesis, том III, N. Murata, ред. Kluwer: Netherlands, стр. 567-570 (1992)). По крайней мере один из этих мутантов, как полагают, имеет измененную активность протокса, который устойчив не только к гербицидному ингибитору, по которому проходил отбор этого мутанта, но также и к другим классам ингибиторов протокса (Oshio и др., Z. Naturforsch. 48с: 339 (1993); Sato и др., ACS Symposium on Porphyric Pesticides, S. Duke, ред. ACS Press: Washington, D.C. (1994)). Также есть данные о том, что мутантная линия клеток табака обладает устойчивостью к ингибитору S-21432 (Che и др., Z. Naturforsch. 48с: 350 (1993)).

Настоящее изобретение относится к выделенной молекуле ДНК, кодирующей фермент протопорфириноген-оксидазу (протокс) из эукариота, который предпочтительно представляет собой высший эукариот. В частности, настоящее изобретение относится к выделенным молекулам ДНК, кодирующим фермент протопорфириноген-оксидазу (протокс), источником которого явлется растение или человек.

В соответствии с изобретением предпочтительными являются выделенные молекулы ДНК, кодирующие фермент протопорфириноген-оксидазу (протокс) из двудольных растений, однако особенно предпочтительны таковые из растений р. Arabidopsis, такие как представленные в последовательностях SEQ ID NO: 1, 3 и 9.

Также предпочтительными являются выделенные молекулы ДНК, кодирующие фермент протопорфириноген-оксидазу (протокс) из однодольных растений, и наиболее предпочтительно из растений кукурузы, такие, как представленные в последовательностях SEQ ID NO: 5 и 7. Особенно предпочтительной согласно изобретению является выделенная молекула ДНК, кодирующая протеин фермента протопорфириноген-оксидазы (протокса) из двудольных растений, где указанный протеин имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 2, 4 и 10. Также предпочтительной является выделенная молекула ДНК, кодирующая протеин фермента протопорфириноген-оксидазы (протокса) из однодольных растений, где указанный протеин имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 6 и 8.

Используя информацию, предоставленную настоящим изобретеним, кодирующая последовательность ДНК для фермента протопорфириноген-оксидазы (протокса) из любого эукариота может быть получена с использованием стандартных методов. Таким образом, еще один предмет настоящего изобретенния относится к зондам, способным к специфичной гибридизации с эукариотической последовательностью ДНК, кодирующей протопорфириноген-оксидазную активность, или с соответствующей мРНК, и способам обнаружения указанных последовательностей ДНК в эукариотах с использованием зондов по изобретению.

Настоящее изобретение, кроме того, включает полигенные экспрессирующие кластеры и рекомбинантные векторы, содержащие эти полигенные экспрессирующие кластеры, которые главным образом содержат промотор, а именно промотор, активный в растении, действенным образом сцепленный с молекулой ДНК, кодирующей фермент протопорфириноген-оксидазу (протокс) из эукариота по изобретению. Полигенный экспрессирующий кластер по изобретению может в дополнение к этому также включать сигнальную последовательность, действенным образом сцепленную с молекулой ДНК, причем эта сигнальная последовательность способна направлять протеин, кодируемый молекулой ДНК, в хлоропласт или в митохондрию.

Кроме того, настоящее изобретение относится к растениям, клеткам растений, тканям растений и семенам растений с измененной активностью протокса, которые устойчивы или по крайней мере толерантны к ингибированию концентрациями гербицида, которые в норме ингибируют естественную активность протокса в растении. В частности одними из вариантов осуществления изобретения являются растения, у которых измененная активность протокса обусловлена сверхэкспрессией фермента протокса дикого типа или экспрессией молекулы ДНК, кодирующей толерантный к гербициду фермент протокс. Этот толерантный к гербициду фермент протокс может представлять собой модифицированную форму фермента протокса, которая в естественных условиях встречается в эукариоте или прокариоте, или модифицированную форму фермента протокса, которая в естественных условиях встречается в растении, или толерантный к гербициду фермент протокс может в естественных условиях встречаться в прокариоте. Растения, подпадающие под объем настоящего изобретения, включают однодольные и двудольные растения, но прежде всего гибридные растения. Предпочтительными являются такие растения, которые могут представлять собой потенциальные мишени для ингибирующих протокс гербицидов, в частности такие важные сельскохозяйственные культуры, как кукуруза и другие зерновые культуры, такие как пшеница, овес, рожь, сорго, рис, ячнень, просо, густой травяной покров (дерн или газонные травы), кормовые травы и т.п., а также хлопчатник, табак, сахарный тростник, сахарная свекла, масличный рапс и соя.

Кроме того, настоящее изобретение включает материал для размножения растений в соответствии с изобретением, предпочтительно семена растений, обработанные защитным покрытием и прежде всего защитным покрытием, содержащим препарат, выбранный из группы, состоящей из гербицидов, инсектицидов, фунгицидов, бактерицидов, нематоцидов, моллюскицидов или их смесей.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам получения растений, клеток растений, тканей растений и семян растений и их трансгенного потомства, которые содержат фермент протокс, устойчивый или толерантный к ингибированию гербицидом в концентрации, которая ингибируют естественную активность протокса. Эта устойчивость или толерантность может быть получена путем экспрессии в трансгенных растениях любой молекулы ДНК, которая кодирует модифицированную форму фермента протокса, которая в естественных условиях встречается в эукариоте, или модифицированную форму фермента протокса, которая в естественных условиях встречается в растении, или фермент протокс, который может в естественных условиях встречаться в прокариоте, или фермент протокс, который представляет собой модифицированную форму протеина, который в естественных условиях встречается в прокариоте.

Конкретный вариант осуществления изобретения относится к получению трансгенных растений кукурузы, ткани кукурузы или семени кукурузы и их трансгенного потомства, которые стабильно трансформированы рекомбинантной молекулой ДНК, включающей пригодный промотор, функционирующий в растениях, действенным образом сцепленный со структурным геном, кодирующим немодифицированный фермент протокс прокариота, который устойчив к гербициду.

Кроме того, изобретение относится к получению трансгенных растений, клеток растений, тканей растений и семян растений и их трансгенного потомства, которые были стабильно трансформированы рекомбинантной молекулой ДНК, включающей пригодный промотор, функционирующий в растениях, действенным образом сцепленный со структурным геном, кодирующим немодифицированный фермент протокс эукариота. Это приводит к сверхэкспрессии немодифицированного протокса в растении в количестве, достаточном для преодоления ингибирования фермента гербицидом.

Настоящее изобретение также включает получение растений, которые экспрессируют измененный фермент протокс, толерантный к ингибированию гербицидом в концентрации, которая в нормальных условиях ингибирует активность неизмененного протокса дикого типа. В этом варианте осуществления растение может быть стабильно трансформировано рекомбинантной молекулой ДНК, содержащей структурный ген, кодирующий устойчивость протокса, или получено методами направленной селекции, с помощью которых устойчивые к гербициду линии выделяют, характеризуют и совершенствуют.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу борьбы с ростом нежелательной растительности, включающему обработку популяции растения с измененной активностью протокса, устойчивой к ингибированию гербицидом в концентрациях, которые обычно ингибируют встречающуюся в естественных условиях активность протокса в этом растении, эффективным количеством ингибирующего протокс гербицида. Растения, подлежащие защите описанным способом, прежде всего представляют собой таковые, которые могут быть потенциальными мишенями для ингибирующих протокс гербицидов, в частности такие важные сельскохозяйственные культуры, как, например, кукуруза и другие зерновые культуры, такие как пшеница, овес, рожь, сорго, рис, ячмень, просо, густой травяной покров (дерн или газонные травы), кормовые травы и т.п., а также хлопчатник, сахарный тростник, сахарная свекла, масличный рапс и соя. Гербициды, которые относятся к ингибиторам протокса, представляют собой таковые, выбранные из группы, состоящей из арилурацила, дифенилового эфира, оксидиазола, имида, фенилпиразола, производного пиридина, фенопилата и О-фенилпирролидин- и пиперидинкарбаматных аналогов этого фенопилата.

Настоящее изобретение также относится к получению фермента протокса рекомбинантным путем и способам применения полученного рекомбинантным путем протокса. Таким образом, изобретение дополнительно включает клетки-хозяева и прежде всего клетки, выбранные из группы, состоящей из клеток растений, клеток животных, бактериальных клеток, дрожжевых клеток и клеток насекомых, стабильно трансформированных рекомбинантной молекулой ДНК, содержащей пригодный промотор, функционирующий в соответствующей клетке-хозяине, действенным образом сцепленный со структурным геном, кодирующим немодифицированный или модифицированный фермент протокс эукариота, причем клетка-хозяин обладает способностью экспрессировать эту молекулу ДНК.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам применения очищенного протокса для скрининга новых гербицидов, которые воздействуют на активность протокса, и для идентификации мутантов протокса, устойчивых к гербициду.

В частности, изобретение относится к способу тестирования химического соединения на его способность ингибировать активность фермента протокса из растения, включающему: (а) объединение фермента протокса и протопорфириногена IX в первой реакционной смеси в условиях, при которых фермент протокс обладает способностью катализировать превращение протопорфириногена IX в протопорфирин IX; (б) объединение химического соединения, фермента протокса и протопорфириногена IX во второй реакционной смеси в тех же условиях, что и для первой реакционной смеси; (в) возбуждение первой и второй реакционных смесей волнами длиной от приблизительно 395 до приблизительно 410 нм; (г) сравнение флуоресценции первой и второй реакционных смесей при длинах волн от приблизительно 622 до приблизительно 635 нм, причем химическое соединение обладает способностью ингибировать активность фермента протокса, если флуоресценция второй реакционной смеси существенно меньше, чем флуоресценция первой реакционной смеси.

Кроме того, в изобретении предложен способ идентификации модифицированного фермента протокса, устойчивого к ингибитору протокса, присутствующего в популяции клеток, включающий следующие стадии: (а) культивирование популяции в присутствии ингибитора протокса в количествах, которые ингибируют немодифицированную форму фермента протокса; (б) отбор клеток, полученных на стадии (а), рост которых не был ингибирован и (в) выделение и идентификацию фермента протокса, присутствующего в клетках, отобранных на стадии (б).

Гены, кодирующие измененный протокс, могут применяться в качестве селектируемых маркеров в методах трансформации растительной клетки. Таким образом, настоящее изобретение также включает способ селекции растений, тканей растения или клеток растения, трансформированных представляющим интерес трансгеном из нетрансформированных растений, включающий стадии: (а) трансформацию растения, ткани растения или клетки растения представляющим интерес трансгеном, способным экспрессироваться растением, и геном, кодирующим измененный протокс, устойчивый к ингибитору протокса; (б) перенос трансформированных таким образом растений или растительных клеток в питательную среду, содержащую ингибитор протокса и (в) отбор растений или растительных клеток, выживших в питательной среде.

Кроме того, настоящее изобретение относится к зондам и способам обнаружения присутствия и выявления формы гена протокса и количественной оценки уровней транскриптов протокса в организме. Эти способы могут применяться для диагностики болезненных состояний, связанных с измененной формой фермента протокса или с измененными уровнями экспрессии фермента протокса.

Один из предметов настоящего изобретения относится к выделеной молекуле ДНК, которая кодирует эукариотическую форму протопорфириноген-оксидазы (обозначенную в настоящем описании как "протокс"), т.е. фермента, который катализирует окисление протопорфириногена IX в протопорфирин IX. Кодирующие последовательности ДНК и соответствующие аминокислотные последовательности для ферментов протокса из Arabidopsis thaliana представлены в виде последовательностей SEQ ID NO: 1-4 и 9-10. Кодирующие последовательности ДНК и соответствующие аминокислотные последовательности для ферментов протокса кукурузы представлены в виде последовательностей SEQ ID NO: 5-8.

Любая требуемая эукариотическая ДНК, кодирующая фермент протокс, может быть выделена в соответствии с изобретением. Один способ, касающийся выделения последовательности, кодирующей протокс эукариота, представлен в примере 1. В этом способе клоны кДНК, кодирующей фермент протокс, определяют из библиотеки клонов кДНК, имеющей происхождение из представляющего интерес эукариота, основываясь на их способности придавать ферментативную активность протокса мутантному организму-хозяину, имеющему дефицит этой активности. Пригодными организмами-хозяевами для применения в этом способе являются таковые, которые могут быть использованы для скрининга библиотек экспрессии кДНК и для которых мутанты с дефицитом активности протокса либо доступны, либо могут быть получены традиционными способами. Такие организмы-хозяева включают, но не ограничены ими, E.coli (Sasarman и др., J. Gen. Microbiol. 113: 297 (1979)), Salmonella typhimurium (Xu и др., J. Bacteriol. 174: 3953 (1992)) и Saccharomyces cerevisiae (Camadro и др., Biochem. Biophys. Res. Comm. 106: 724 (1982)).

В другом варианте последовательности, кодирующие протокс эукариота, могут быть выделены в соответствии с хорошо известными способами, основанными на гомологии их последовательности с кодирующими протокс последовательностями по настоящему изобретению из Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 1, 3 и 9) и из Zea mays (SEQ ID NO: 5 и 7). В этих способах всю или часть известной кодирующей протокс последовательности применяют в качестве зонда, который селективно гибридизируется с другими кодирующими протокс последовательностями, присутствующими в популяции клонированных фрагментов геномной ДНК или фрагментов кДНК (т.е. библиотек геномной или кДНК) из выбранного организма. Такие способы включают скрининг на основе гибридизации посеянных на пластинке библиотек ДНК (либо бляшек, либо колоний; см., например, у Sambrook и др. , ред. , Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)) и ПЦР-амплификацию с использованием олигонуклеотидных праймеров, соответствующих доменам последовательности, сохранившимся среди известных аминокислотных последовательностей протокса (см., например, у Innis и др., ред., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)). Эти способы наиболее пригодны для выделения кодирующих протокс последовательностей из организмов, родственных организму, из которого имеет происхождение последовательность зонда. Например, следует ожидать, что применение этих способов с использованием в качестве зонда кодирующей последовательности из Arabidopsis thaliana или из Zea mays будет особенно пригодно для выделения кодирующих протокс последовательностей из других видов растений.

Выделенные последовательности протокса эукариота по настоящему изобретению могут подвергаться манипуляциям в соответствии со стандартными методами генной инженерии для достижения любой поставленной цели. Например, полная последовательность протокса или ее части может применяться в качестве зондов, способных к специфической гибридизации с последовательностями, кодирующими протокс, и с матричными РНК. Для достижения специфической гибридизации в различных условиях такие зонды включают последовательности, которые являются уникальными среди кодирующих протокс последовательностей, и предпочтительно имеют длину по крайней мере 10 нуклеотидов и наиболее предпочтительно по крайней мере 20 нуклеотидов. Такие зонды могут применяться для амплификации и анализа кодирующих протокс последовательностей из выбранного организма путем хорошо известного процесса полимеразно-цепьевой реакции (ПЦР). Этот метод может быть пригоден для выделения дополнительных кодирующих протокс последовательностей из требуемого организма или в качестве диагностического метода для определения присутствия в организме кодирующих протокс последовательностей и для выявления взаимосвязи измененных кодирующих последовательностей с определенными вредными условиями, такими как аутосомное доминантное нарушение у имеющих пониженные уровни активности протокса людей, что характеризуется как нейропсихическими симптомами, так и повреждениями кожи (Brenner и Bloomer, New Engl. J. Med. 302: 765 (1980)).

Специфичные для протокса зонды гибридизации также могут быть использованы для картирования положения нативного(ных) гена(ов) протокса эукариота в геноме выбранного организма с использованием стандартных методов, основанных на селективной гибридизации зонда с геномными последовательностями протокса. Эти методы включают, но не ограничены ими, идентификацию полиморфизмов ДНК, выявленных или содержащихся внутри последовательности зонда для протокса, и применение таких полиморфизмов для последующего отщепления гена протокса от других маркеров с известным положением на карте в картируемой популяции, полученной в результате самооплодотворения гибрида двух полиморфных родительских линий (см. , например, у Helentjaris и др., Plant Mol. Biol. 5: 109 (1985); Sommer и др., Biotechniques 12: 82 (1992); D'Ovidio и др.. Plant. Mol. Biol. 15: 169 (1990)). Хотя можно ожидать, что любая последовательность протокса эукариота будет пригодна в качестве зонда для картирования генов протокса из любого эукариота, предпочтительными зондами являются такие последовательности протокса из организмов, которые наиболее близкородственны к выбранному организму, и наиболее предпочтительными зондами являются таковые последовательности протокса из выбранного организма. Можно ожидать, что картирование таким образом генов протокса будет наиболее целесообразным для целей селекции растений. Например, на основе знания о положении на генетической карте мутантного гена протокса, который обусловливает устойчивость к гербицидам, могут быть идентифицированы фланкирующие маркеры ДНК из соответствующей генетической карты (см., например, у Helentjaris, Trends Genet. 3: 217 (1987)). При интрогрессии признака устойчивости к гербицидам в новую селектируемую линию эти маркеры могут быть затем применены для мониторинга длины сцепленной с протоксом фланкирующей хромосомной ДНК, еще присутствующей в родительской форме, с которой гибрид скрещивают вновь после каждого круга обратного скрещивания.

Специфичные для протокса зонды гибридизации также могут применяться для количественной оценки уровней мРНК протокса в организме с использованием стандартных методов, таких как назерн-блоттинг. Этот метод может быть пригоден в качестве способа диагностики для обнаружения измененных уровней экспрессии протокса, что может быть связано с определенными вредными условиями, такими как аутосомное доминантное нарушение у людей, характеризующееся как нейропсихическими симптомами, так и повреждениями кожи, имеющих пониженные уровни активности протокса (Brenner и Bloomer, New Engl. J. Med. 302: 765 (1980)).

Для рекомбинантного получения фермента в организме хозяина кодирующая протокс последовательность может быть встроена в полигенный экспрессирующий кластер, сконструированный для выбранного хозяина и интродуцированный в хозяина, где его получают рекомбинантным образом. Выбор специфических регуляторных последовательностей, таких как промотор, сигнальная последовательность, 5' и 3'-нетранслируемые последовательности и энхансер, может быть осуществлен специалистом в данной области техники. Полученная молекула, содержащая отдельные элементы, сцепленные в соответствующей рамке считывания, может быть встроена в вектор, способный к трансформации в клетке-хозяине. Пригодные для этой цели вектры экспрессии и способы рекомбинантного получения протеина хорошо известны для организмов-хозяев, таких как E.coli (см., например, у Studier и Moffatt, J. Mol. Biol. 189: 113 (1986); Brosius, DNA, 8: 759 (989)), дрожжи (см., например, у Schneider и Guarente, Meth. Enzymol. 194: 373 (1991)) и клетки насекомых (см., например, у Luckow и Summers, Bio/Technol. 6: 47 (1988)). Конкретные примеры включают такие плазмиды, как Bluescript (фирма Stratagene, La Jolla, CA), pFLAG (фирма International Biotechnolosies, Inc., New Haven, CT), pTrcHis (фирма Invitrogen, La Jolla, CA) и бакуловирусные векторы экспрессии, например, имеющие происхождение из генома вируса ядерного полиэдроза Autographica californica (AcMNPV). Предпочтительной системой бакуловирус/насекомое являются клетки pVI11392/Sf21 (фирма Invitrogen, La Jolla, CA).

Полученный рекомбинантным путем эукариотический фермент протокс пригоден для различных целей. Например, он может применяться для обеспечения ферментативной активности протокса in vitro. Он также может применяться в анализе in vitro для скрининга новых соединений с гербицидной активностью, мишень для которых ранее не была выявлена, с целью определения, могут ли они ингибировать протокс. Такой анализ in vitro также может быть применен в качестве более общего скрининга для идентификации химических соединений, ингибирующих активность протокса, и, следовательно, являющихся потенциальными гербицидами. В другом варианте полученный рекомбинантным путем фермент протокс может применяться для дальнейшей характеризации его связи с известными ингибиторами, чтобы рационально сконструировать новые ингибирующие гербициды, а также толерантные к гербицидам формы фермента.

Обычно ингибирующее действие в отношении протокса определяют путем измерения флуоресценции при длинах волн от приблизительно 622 до 635 нм после возбуждения длинами волн от приблизительно 395 до 410 нм (см., например, у Jacobs и Jacobs, Enzyme 28:206 (1982); Sherman и др., Plant Physiol. 97: 280 (1991)). Этот анализ основан на том факте, что протопорфирин IX представляет собой флуоресцирующий пигмент, а протопорфириноген IX является нефлуоресцирующим. Экстракты протеина получают из выбранных субклеточных фракций, например из этиопластов, митохондрий, микросом или плазматических мембран путем дифференциального центрифугирования (см., например. Lee и др., Plant Physiol. 102: 881 (1993); Prado и др., Plant Physiol. 65: 956 (1979); Jackson и Мооге в Plant Organelles, Reid ред., стр. 1-12; Jacobs и Jacobs, Plant Physiol., 101: 1181 (1993)). Протопорфириноген получают путем восстановления протопорфирина амальгамой натрия, как описано у Jacobs и Jacobs (1982). Реакционные смеси обычно состоят из 100 мМ HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота) (рН 7,5), 5 мМ ЭДТК, 2 мМ ДТТ (дитиотреитол), приблизительно 2 М протопорфириногена IX и приблизительно 1 мг/мл экстракта протеина. До начала ферментативной реакции к экстракту фермента добавляют растворы ингибитора в различных концентрациях, например в 1 мМ, 100 мкМ, 10 мкМ, 1 мкМ, 100 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 100 пМ. После добавления экстракта протеина в течение нескольких минут регистрируют флуоресценцию и в области линейного изменения вычисляют тангенс угла наклона кривой (скорость реакции). Значение IC₅₀ определяют путем сравнения тангенса угла наклона реакции в условиях ингибирования с таковым в контрольной реакции.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения включает применение протокса в анализе по выявлению устойчивых к ингибитору мутантов протокса. Типичный анализ включает следующие стадии: (а) инкубирование первого образца протокса и его субстрата, т.е. протопорфириногена IX, в присутствии второго образца, содержащего ингибитор протокса; (б) измерение ферментативной активности протокса из стадии (а); (в) инкубирование первого образца мутированного протокса и его субстрата в присутствии второго образца, содержащего тот же самый ингибитор протокса; (г) измерение ферментативной активности мутированного протокса из стадии (в) и (д) сравнение