Способ получения металлсодержащих производных бактериохлорофилла, новые металлированные производные бактериохлорофилла, фармацевтическая композиция

Способ получения металлсодержащих производных бактериохлорофилла, новые металлированные производные бактериохлорофилла, фармацевтическая композиция

Реферат

 

Новые способы получения металлированных производных [M]-бактериохлорофилла общей формулы I, где R₁ представляет собой С₁-С₂₅ углеводородный остаток; R₂ представляет собой Н, ОН или COOR₅, где R₅ представляет собой С₁-С₁₂ алкил или С₃-С₁₂ циклоалкил; R₃ представляет собой Н, ОН или С₁-С₁₂ алкил или алкокоси; каждый R₄ является независимо выбранным из группы, включающей винил, этил, ацетил, 1-гидроксиэтил и их простые и сложные эфиры; М представляет собой металл с ионным радиусом, меньшим, чем имеющийся у Cd (r95 пм), причем указанный металл выбран из группы, состоящей из двухвалентного металла, выбранного из группы, включающей Pd, Co, Ni, Cu, Zn и Mn, новые металлированные производные [M]-бактериохлорофилла и фармацевтическая композиция, их содержащая. Металлированные производные бактериохлорофилла могут применяться в методах фотодинамической терапии и фотодинамического уничтожения вирусов и микроорганизмов. 5 с. и 9 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 ил.

Изобретение относится к новому методу получения металлированных производных бактериохлорофилла для применения в методах фотодинамической терапии (PDT) и диагностики in vivo и фотодинамического уничтожения вирусов и микроорганизмов in vitro, а также к некоторым новым металлозамещенным производным бактериохлорофилла.

Определения и сокращения BChl = бактериохлорофилл-а (Мg-содержащий 7,8,17,18-тетрагидропорфирин формулы I, в которой и далее М представляет собой Мg, R₁ является фитилом или геранилгеранилом, R₂ представляет собой СООСН₃, R₃ представляет собой Н, R₄ в положении 3 является ацетилом, а в положении 8 - этилом).

BChl производное = производное BChl с модификациями в макроцикле, центрального атома металла и/или на периферии, включая производные формул I, II, III и I', II', III', приводимых ниже.

BPhe = бактериофеофитин-а (BChl, в котором центральный Мg замещен двумя атомами Н).

Chl = хлорофилл (Мg-содержащее производное 17,18-дигидропорфирина, состоящее из макроцикла, включающего 4 пиррольных кольца, и одного изоциклического кольца, которые конъюгированы друг с другом и связаны с атомом Мg). Хлорофилл а имеет формулу I, приводимую ниже, где R₁ представляет собой фитил, R₂ представляет собой СООСН₃, R₃ представляет собой Н, R₄ в положении 3 представляет винил, а в положении 8 - этил.

[M]-BChl = производное BChl, в котором центральный атом Мg замещен металлом М, как определено ниже.

PDT = фотодинамическая терапия.

Phe = феофитин а (Chl, в котором центральный Мg замещен двумя атомами Н).

Обоснование изобретения Мg-содержащие (бактерио)хлорофиллы ((В)Chl) и их свободные основания, (бактерио)феофитины ((В)Phe) незаменимы для фотосинтеза. Они выполняют роль антенны или редокс-пигментов, способных под действием света к разделению заряда в реакционном центре. Пигменты также способны потенциально служить как фотосенсибилизаторы, например, применяться в фотодинамической терапии опухолей.

Показано, что порфирины аккумулируются в опухолевой ткани и при облучении опухолевой ткани поглощают свет in situ, служа средством выявления опухолей по локализации флуоресценции. Неочищенное производное гаматопорфирина, известное как гематопорфириновое производное или HPD, предложено для применения с целью как выявления, так и фотодинамической терапии опухолей. Форма HPD, считающаяся более эффективной, включает часть HPD, имеющую агрегатный вес выше 10 кДа, и является предметом патента США 4649151. HPD или его активные компоненты описаны в патенте США 4753958 для местного лечения кожных болезней и в работе Matthews, J.L. et al., 1988, Transfusion, pp. 81-83, для стерилизации биологических образцов, содержащих инфекционные организмы, такие как бактерии и вирусы.

С целью оптимизации характеристик порфириновых лекарств для терапии и диагностики предложено несколько порфириновых производных, в которых, например, центральный атом металла образует комплекс с четырьмя пиррольными кольцами и/или модифицированы периферические заместители пиррольных колец, и/или макроцикл дигидрогенирован до Chl производных (хлоринов) или тетрагидрогенирован до BChl производных (бактериохлоринов).

Комплексы циклических тетрапирролов с металлами, отличными от Мg, исследовали в рядах порфиринов и 17,18-дигидропорфиринов для выяснения их спектроскопических и окислительно-восстановительных свойств (Hynninen P.H., in: Scheer, 1991, pp. 145-209). Бактериохлорофиллы имеют потенциальные преимущества по сравнению с хлорофиллами, поскольку они демонстрируют интенсивные полосы в области, близкой к инфракрасной, то есть при значительно больших длинах волн по сравнению с производными хлорофилла. Однако в настоящее время имеется мало информации относительно бактериохлорофиллов с центрально расположенными атомами металла, отличными от Мg.

РСТ Международная заявка, Публикация WO 90/12573 Dougherty описывает производные бактериохлорофилла-а или -b или соответствующие бактериохлорины, лишенные центрального атома металла, или в которых центральный атом металла может быть непарамагнитным металлом, выбранным из Mg²⁺, Sn²⁺ и Zn²⁺, и С-17³-карбоксильная группа этерифицирована насыщенным или ненасыщенным углеводородным остатком из 8-25С, для получения композиции, применяемой для разрушения или повреждения нежелательных биологических объектов-мишеней, который включает фотосенсибилизацию названного объекта эффективным количеством указанного производного с последующим облучением объекта-мишени с помощью излучения в области длин волн, соответствующей полосе поглощения названным производным в течение периода времени, достаточного для повреждения или разрушения объекта. Кроме того, названные соединения применимы для фотодинамической терапии и диагностики. Следует отметить, что хотя Sn²⁺ и Zn²⁺ комплексы бактериохлорофилла-а или -b были заявлены в описании заявки WO 90/12573, эти металлопроизводные не описываются в примерах и не описан ни один метод их получения.

Losev et al. , 1990, Opt. Spektrosk., vol. 69, pp. 97-101 описывает комплексы [Pd]-BChl и [Cu]-BChl, полученные, как отмечено, прямым введением металла BPhe с помощью Pd бензонитрила в бензоле в потоке азота или с помощью концентрированного раствора CuCl₂ в метаноле соответственно. Однако в этой публикации отсутствуют детали метода получения и характеристики металлокомплексов. Более того мы не смогли повторить получение [Pd]-BChl комплекса по Losev'y.

При нормальных условиях доставки, то есть в присутствии кислорода, при комнатной температуре и в условиях нормальной освещенности соединения группы BChl лабильны и имеют несколько меньшие квантовые выходы образования триплетного состояния по сравнению, например, с гематопорфириновым производным (HPD). Тем не менее их возможная роль в запуске биологических окислительно-восстановительных реакций, подходящие спектральные характеристики и легкое разрушение in vivo дают бактериохлорофиллам потенциальное преимущество перед другими соединениями, например, порфиринами и хлорофиллами, применительно к PDT терапии и диагностике и к уничтожению клеток, вирусов и бактерий в образцах и в живой ткани. Можно ожидать, что химическая модификация бактериохлорофиллов приведет к дальнейшему улучшению их свойств, однако подобные попытки были крайне ограниченны из-за отсутствия подходящих методов получения таких модифицированных бактериохлорофиллов (Hynninen, 1991).

Европейская патентная заявка, опубликованная за 0584552, того же заявителя, что и настоящая заявка, описывает новые конъюгаты Chl и BChl с аминокислотами, пептидами и белками для применения в PDT терапии и диагностике. Аминокислотный, пептидный или белковый остаток присоединяется непосредственно или через спейсер к С-17³-карбоксильной группе молекулы Chl или BChl. Эти конъюгаты получаются методами, достаточно мягкими для сохранения кислото-лабильного центрального атома Мg. Там же описаны комплексы метилового эфира хлорофилла a-l7³-cepина с Zn и Сu, но там не описаны ни металлопроизводные бактериохлорофилла, ни метод их получения.

Патентная заявка Германии DE 4121876 описывает производные бактериохлорофилла, в которых модифицированные эфиры в положениях С-13² и С-17³ получаются в мягких условиях быстрой щелочной переэтерификации, допускающей последующие изменения в изоциклическом кольце при сохранении центрального Mg, благодаря которому поглощение пигментом смещается в область ниже 800 нм. В заявке также упоминаются металлокомплексы указанных производных BChl с Zn или Ni, однако там эти комплексы не представлены в примерах, а методы их получения не описаны.

Было бы желательно получить новые металлокомплексы BChl для применения в PDT с целью сохранения и даже улучшения благоприятных оптических и физиологических свойств BChls, оптимизируя при этом их фотосенсибилизирующий потенциал, а также улучшая их химическую стабильность и оптимизируя их физиологические периоды жизни. Замена металла (трансметаллирование) приводит к заметным изменениям в химической реакционной способности и стабильности BChls, являющихся существенными для новых модификаций макроцикла и периферических заместителей, и в особенности для оптимизации их транспорта, направленности действия и биологического периода жизни, а также сведения к минимуму их побочного токсического действия. Замена металла (трансметаллирование) приводит также к заметным изменениям в свойствах возбужденного состояния, включая выход и период жизни триплета, доступность более высоких уровней состояния возбуждения и возникновение цитотоксических производных кислорода.

Известно несколько методов замены центрального атома металла в порфиринах (см. Buchler, J.W., 1975, "Static coordination chemistry of metalloporphyrins", in Porphyrins and Metalloporphyrins, Smith, K.M., ed., pp. 157-232, Elsevier, New York). Порфирины легкодоступны и химически стабильны, хотя их спектральные и физиологические свойства неблагоприятны.

Известно несколько методов прямого и непрямого введения металла в хлорофиллы. Strell, M., Urumow, Т., 1977, Liebigs Ann. Chem., pp. 970-974 описывают комплексы [Cr]-Chl и [Mn]-Chl, получаемые заменой металла в комплексе [Cd]-Chl (получаемом в реакции лишенного металла производного Chl с ацетатом кадмия в метаноле или пиридине) в реакции с ацетатом Сr⁺⁺ или Мn⁺⁺ в метаноле в атмосфере N₂. Сообщается, что этот метод замены металла пригоден также для комплексов производных хлорофилла с Сu, Zn, Со и Рb, но не с Fe³⁺, Ni и Мg. Однако, поскольку комплексы Сu, Zn, Со и Рb могут быть получены прямым введением металла в Phe, этот метод полезен лишь для Сr и Мn. Авторы описывают также получение комплекса [Mg]-Chl прямым введением металла в Phe в ацетоне с использованием ацетата Мg в диметилсульфоксиде.

В настоящее время имеется мало сведений о бактериохлорофиллах с центральными атомами металла, отличными от Мg. Введение металла в бактериохлорофиллы, как известно, является более затрудненным по сравнению с хлорофиллами из-за их сниженной реактивности к введению металла и повышенной реакционноспособности к побочным реакциям. Описан специфический метод введения Мg в бактериофеофитин-а (Wasielewsky, M.R., 1977, "A mild method for the introduction of Magnesium into bacteriopheophytin-a", Tetrahedron Letters, pp. 1373-76). Заявители настоящего изобретения пытались воспроизвести процедуры, описанные Strell и Urumow, для прямого введения металла и его замены в производных хлорофилла, применительно к получению металлокомплексов производных бактериохлорофилла, но все попытки были неудачными. Прямое введение металла в производные бактериофеофитина не удавалось с любым из использованных металлов, за исключением Сu и Zn, и, напротив, приводило к обнаружению в смеси непрореагировавшего бактериофеофитина и замещенных металлом продуктов окисления 3-ацетил-хлорофилла а типа.

Краткое содержание изобретения В соответствии с настоящим изобретением теперь обнаружено, что металлокомплексы производных бактериохлорофилла могут быть получены модификацией процесса трансметаллирования (замены металла) для введения металла в производные хлорофилла, опубликованного Strell и Urumow, с помощью подходящих солей металла и растворителей.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к новому способу получения синтетических замещенных металлом производных бактериохлорофилла формулы: [M]-BChl, где BChl представляет собой остаток (деметаллированного) лишенного металла природного или синтетического производного бактериохлорофилла, имеющего в положении 17³ группу -COOR₁, где R₁ представляет собой C₁-C₂₅ гидрокарбильный остаток и М представляет собой металл с ионным радиусом менее чем у Сd (r95 пм), упомянутый металл выбирается из группы, состоящей из двухвалентного металла, выбираемого из группы, состоящей из Pd, Co, Ni, Сu, Zn и Мn, трехвалентного металла, выбираемого из группы, состоящей из Fe, Mn и Сr, и четырехвалентного металла, выбираемого из группы, состоящей из Sn и Pt, этот процесс включает: (i) реакцию подходящего производного бактериофеофитина, имеющего в положении 17³ группу -COOR₁, как определено выше, растворенного в диметилформамиде, с безводным ацетатом Сd в атмосфере Аr и отделения [Cd]-BChl комплекса из реакционной смеси хроматографией в условиях восстановления; (ii) растворение полученного таким образом комплекса [Cd]-BChl, растворенного в безводном ацетоне, с соответствующей безводной солью металла М, выбранной из хлорида, ацетата и адетилацетоната металла М, в атмосфере Аr; и (iii) выделение целевого замещенного металлом производного [М]-ВСhl из реакционной смеси.

В одном из воплощений способ изобретения применяется для получения замещенных металлом производных BChl формулы I, II или III; где R₁ представляет собой C₁-C₂₅ углеводородный остаток; R₂ представляет собой Н, ОН или COOR₅, где R₅ представляет собой C₁-C₁₂ алкил или С₃-С₁₂ циклоалкил; R₃ представляет собой Н, ОН или C₁-C₁₂ алкил или алкокси; каждый R₄ является независимо выбранным из группы, состоящей из винила, этила, ацетила, 1-гидроксиэтила и их простых и сложных эфиров; и М представляет собой металл с ионным радиусом, меньшим чем имеющийся у Сd (r95 пм), причем указанный металл М выбирается из группы, состоящей из двухвалентного металла, выбираемого из группы, состоящей из Pd, Co, Ni, Сu, Zn и Мn, трехвалентного металла, выбираемого из группы, состоящей из Fe, Mn и Сr, и четырехвалентного металла, выбираемого из группы, состоящей из Sn и Pt.

Из отмеченных выше производных [М]-BChl формул I, II и III могут быть получены дополнительные производные путем переэтерификации в положении 17³ и, таким образом, в другом варианте изобретение относится к способу получения соединений формул I', II' и III' где R₁' выбирается из группы, состоящей из: (i) C₁-C₂₅ углеводородного остатка, по желанию замещенного галогеном, оксо (= 0), ОН, СНО, СООН или NН₂, или этот остаток прерывается одним или более гетероатомами, выбранными из О, S и NH, или фенильным кольцом; (ii) остатка аминокислоты или пептида, содержащего гидроксильную группу, или их производного, выбранного из группы, состоящей из эфиров и N-защищенных производных, в которых названная гидроксилированная аминокислота или ее производное присоединены к СОО-остатку через гидроксильную группу; (iii) остатка пептида, как указано в (ii), присоединенного к СОО-остатку через спейсер, как указано в (i), где названный С₁-С₂₅, насыщенный или ненасыщенный углеводородный остаток необязательно замещен галогеном, оксо, ОН, СНО, СООН или NH₂, или такой остаток прерывается одним или более гетероатомами, выбранными из О, S и NH, или фенильным кольцом, и этот остаток также замещен концевой функциональной группой, выбранной из ОН, СООН или NH₂, и (iv) остатка, специфичного для клетки лиганда, выбранного из пептида и белка, прямо или через спейсер присоединенного к СОО-остатку, как указано в (i), где названный C₁-C₂₅, насыщенный или ненасыщенный углеводородный остаток необязательно замещается галогеном, оксо, ОН, СНО, СООН или NН₂, или прерывается одним или более гетероатомами, выбранными из О, S и NH, или фенильным кольцом, и этот остаток также замещен концевой функциональной группой, выбранной из ОН, СООН или NН₂; R₂ представляет собой Н, ОН или COOR₅, где R₅ представляет собой C₁-C₁₂ алкил или С₃-C₁₂ циклоалкил; R₃ представляет собой Н, ОН или C₁-C₁₂ алкил или алкокси; каждый R₄ является независимо выбранным из группы, состоящей из винила, этила, ацетила, 1-гидроксиэтила и их простых и сложных эфиров; и М представляет собой металл с ионным радиусом, меньшим чем имеющийся у Cd (r95 пм), указанный металл выбирается из группы, состоящей из двухвалентного металла, выбираемого из группы, состоящей из Pd, Co, Ni, Cu, Zn и Мn, трехвалентного металла, выбираемого из группы, состоящей из Fe, Mn и Сr, и четырехвалентного металла, выбираемого из группы, состоящей из Sn и Pt, причем этот способ включает: (i) реакцию подходящего бактериофеофитина, полученного из производного бактериохлорофилла формулы I, II или III, имеющего в положении 17³ группу -COOR₁, где R₁ представляет C₁-C₂₅ углеводородный остаток, растворенного в диметилформамиде, с безводным ацетатом Cd в атмосфере Аr и выделения соответствующего [Cd]-BChl комплекса из реакционной смеси хроматографией при восстанавливающих условиях; (ii) реакцию полученного таким образом комплекса [Cd]-BChl, растворенного в безводном ацетоне, с соответствующей безводной солью металла М, выбранной из хлорида, ацетата и ацетилацетоната металла М, в атмосфере Аr; и (iii) реакцию полученного металлированного производного [M]-BChl, выделенного из реакционной смеси, с соединением формулы R₁'-ОН в условиях переэтерификации для получения соединения формулы I', II', или III', где R₁' как описано выше.

В предпочтительном воплощении изобретения производное [M]-BChl представляет собой такое производное [M]-BChl, в котором R₁ представляет собой фитил или геранилгеранил, R₂ представляет собой СООСН₃, R₃ представляет собой Н, R₄ в положении 3 является ацетилом, а в положении 8 представляет собой этил, и металл М является Pd, Cu, Ni, Co, Zn и Мn. В другом предпочтительном воплощении изобретения соль металла М, используемая на стадии ii), представляет собой хлорид металла.

В еще одном варианте воплощения изобретения стадии i) и ii) могут объединяться в одну стадию, то есть производное бактериофеофитина реагирует с избытком соответствующей безводной соли металла М, например с хлоридом металла, в присутствии каталитических количеств безводной соли Cd, например ацетата Cd, в диметилформамиде или ацетоне.

В другом варианте настоящее изобретение относится к новым замещенным металлом производным бактериохлорофилла, формул I', II' и III', как указано выше, но исключаются компоненты формулы I, в которых R₂ представляет собой СООСН₃, R₃ представляет собой Н, R₄ в положении 3 является ацетилом, а в положении 8 представляет собой этил, R₁ представляет собой фитил или этил, и металл М является Pd, или R₁ представляет собой фитил, а М представляет собой Сu.

Новые производные металлобактериохлорофилла изобретения формул I', II' и III', как указано выше, применяются как фотосенсибилизаторы в качестве терапевтических и диагностических агентов и для уничтожения клеток, вирусов и бактерий в образцах и живых тканях, как хорошо известно в этой области для HPD и других фотосенсибилизаторов.

На фиг. 1 показана фототоксичность метилового эфира [Рd]-ВСhl-17³-серила ([Pd] -BChl-Ser) и метилового эфира BChl-17³-серила (BChl-Ser) в отношении бактериальных суспензий S. aureus.

На фиг. 2 показана фототоксичность [Pd]-BChl-Ser в отношении M2R клеток меланомы в культуре по включению [³H]тимидина.

Подробное описание изобретения В отличие от порфиринов и хлорофиллов, прямое введение металла в бактериохлорофиллы затруднено. Способ настоящего изобретения позволяет получить замещенные металлом (металлированные) производные бактериохлорофилла путем замены металла соответствующих производных [Cd]-BChl, имеющих улучшенные свойства в отношении их применения в качестве фотосенсибилизаторов.

В соответствии с настоящим изобретением в комплексах [Cd]-BChl, которые легко получить ацетат/диметилформамидным методом, металл может быть заменен другим металлом в мягких условиях с прекрасным выходом других металлокомплексов. Легкость замены металла при применении [Cd]-BChl в качестве предшественника удивительна и, вероятно, частично обусловлена большим ионным радиусом (r_м) Cd^2- (95 пм) по сравнению с Мg²⁺ (r_м=72 пм). Вторым фактором является растворитель (ацетон) в сочетании с противоионами металла (хлоридами), применяемый в реакции. При трансметаллировании образуются CdCl₂ и [М]-BChl в равновесии с исходными веществами, а очень низкая растворимость CdCl₂ в ацетоне сдвигает равновесие в сторону образования продуктов.

В одном из воплощений настоящего изобретения R₁ представляет собой прямой или разветвленный, насыщенный или ненасыщенный, включая ароматический, углеводородный радикал, предпочтительно состоящий из 1-25 атомов углерода, такой как алкил, алкенил, фенил, предпочтительно низший алкил из C₁-C₄ атомов, наиболее предпочтительно этил, или радикал, образованный из природных BChl соединений, например, геранилгеранил (2,6-диметил-2,6-октадиенил) или фитил (2,6,10,14-тетраметилгексадек-14-ен-16-ил); и R₁' имеет значения или указанные для R₁, или представляет собой такую углеводородную цепь, замещенную атомом галогена, выбранного из F, Br, C1 и I, или ОН, оксо, СНО, СООН или NH₂, или такую по желанию замещенную углеводородную цепь, прерванную О, S или NH, предпочтительно О, например, R₁' представляет собой остаток олигооксиэтиленгликоля от 4 до 10 углеродных атомов, предпочтительно пентаоксиэтиленгликоль. Когда R₁' служит в качестве спейсера для пептида или белка, как здесь указано, он обычно содержит концевую функциональную группу, выбранную из ОН, СООН и NH₂, посредством которой концевая функциональная группа пептида или белка присоединяется эфирной или амидной связью.

В другом воплощении изобретения R₁' представляет собой остаток аминокислоты или пептида, содержащий гидроксильную группу, такой как серин, треонин и тирозин или содержащие их пептиды, или производное указанной аминокислоты или пептида, выбранное из эфиров, например алкильных эфиров, и N-защищенные производные, в которых N-защитная группа представляет собой, например, третичный бутокси, карбобензокси или тритил, и указанная гидроксилированная аминокислота или пептид, или их производное присоединена к СОО-группе через гидроксильную группу. Примерами таких аминокислотных производных служат метиловый эфир серина, метиловый эфир N-тритилсерина, метиловый эфир тирозина и метиловый эфир N-третбутокси-тирозина, и примером такого пептида служит метиловый эфир N-карбобензокси-серилсерина; все они получены, как описано в ЕР 0584552. В наиболее предпочтительном воплощении изобретения производное [М] -BChl представляет собой [Pd]-BChl, этерифицированный метиловым эфиром L-серина.

В другом воплощении изобретения R₁' представляет остаток специфичного для клетки лиганда, выбираемого из пептидов и белков, примерами которых служат, но не исчерпывают их, гормональные пептиды, например меланоцитстимулирующие гормоны (меланотропины), и антитела, например иммуноглобулины, и антитела, специфичные для опухолей.

Производные [М] -BChl изобретения формулы I', где М представляет Zn или Сu, могут быть получены также прямым введением металла в лишенное металла (деметаллированное) производное BChl, как описано ниже в примерах с 1 по 4.

Некоторые из металлокомплексов бактериохлорофиллов очень стабильны и, таким образом, могут быть использованы для дальнейших модификаций на периферии тетрапиррольной кольцевой системы, которые включают жесткие условия, такие как применение уксусной кислоты или сильной минеральной кислоты типа соляной или серной кислоты. Так, сложные эфиры, например, необязательно замещенные алкильные или арильные эфиры, могут быть получены реакцией гидроксильных групп, например, в положении 31 или 132, с соответствующими алифатическими или ароматическими кислотами, хлоридами кислот или аминокислотами, а простые эфиры в тех же положениях получаются реакцией с соответствующими алифатическими или ароматическими спиртами. Соединения, имеющие гидроксильную группу в положении 31, например производные 3-гидроксиэтил-BChl, или в положении 132, например производные 132-OH-BChl, могут быть получены стандартными методами (см. Struck, A. et al., 1992, Bacteriochlorophylls modified at position C-3. Long-range intramolecular interaction with position C-13.2, Biochim. Biophys. Acta, 1101; 321-328 и Hynninen, 1991). Кроме того, природные фитиловые и геранилгераниловые эфиры могут быть переэтерифицированы в положении 17³ с помощью кислотного катализа в другие эфиры, например в этиловый эфир, путем реакции с соответствующим спиртом. Другие заместители могут быть введены в кольцо макроцикла путем реакции Витига природных СО групп, таких как 3-ацетил в BChl а, или введены химически такие заместители, как кетоспирты, этерифицированные по С-17³ а также путем окислительного присоединения ОН групп с формированием эфирных связей в положении С-13², или путем кислотно-катализируемой этерификации ОН групп, например, в положении С-3¹, С-13¹, С-13², с карбоновыми кислотами.

В альтернативном варианте модификации на периферии тетрапиррольной кольцевой системы проводятся в природном производном Мg-содержащем BChl перед удалением металла (деметаллированием).

Производные BChl формул II и III в данном случае могут быть получены из соответствующих природных производных BChl формулы 1, как описано ранее (Struck, A., 1990, "Chemisch modifizierte Bakteriochlorophylle und phaeophytinc in den Bindungsstellen В_A,B und H_a,b von photosynthetischen Reaktionszentren aus Rhodobacter sphaeroides R26: Pigmentsynthese, Pigmentaustausch und Spektroskopie", Ph. D. Thesis, University of Munich, Germany).

Соединения изобретения, в которых R₁' представляет собой остаток аминокислоты, пептид или белок, например антитело, получают после процедуры замены металла настоящего изобретения путем ферментативной переэтерификации с помощью фермента хлорофиллазы или путем каталитической конденсации соответствующего бактериохлорофиллида (свободная кислота BCh-17³-COOH) с гидроксилированной аминокислотой, пептидом или белком с использованием дициклогексилкарбодиимида (DCC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) или 4-диметиламинопиридина (DMAP), как описано в ЕР 0584552, или путем кислотно-катализируемых реакций неустойчивых Мg комплексов, таких как природный BChl.

Новые производные металлобактериохлорофилла изобретения предназначены для применения в качестве фотосенсибилизаторов как терапевтические и диагностические средства и для уничтожения клеток, вирусов и бактерий в образцах и живых тканях, как хорошо известно для HPD и других фотосенсибилизаторов. Эти соединения применимы, например, для сенсибилизации неопластических клеток или другой аномальной ткани к разрушению под действием облучения, либо in vivo или ex vivo при использовании света соответствующей длины волны. Считается, что энергия фотоактивации передается эндогенному кислороду, превращая его в синглетный (атомарный) кислород, который, как полагают, ответственен за цитотоксический эффект. Кроме того, фотоактивированные формы бактериохлорофиллов флуоресцируют, и эта флуоресценция может помочь в установлении локализации опухолей или других мест, в которые вводятся металлозамещенные бактериохлорофиллы.

Примеры известных в науке случаев, при которых может быть показано лечение новыми производными металлобактериохлорофилла по изобретению, включают разрушение опухолевой ткани в твердых опухолях, растворение бляшек в кровеносных сосудах (смотри, например, патент США 4,512,762); лечение местных нарушений, таких как акне, эпидермофития стопы, бородавки, папиллома и псориаз, обработку биологических продуктов (таких, как кровь для переливания) в отношении инфекционных агентов.

Производные металлобактериохлорофилла настоящего изобретения формируются в готовые фармацевтические композиции для введения больному или наносятся на объект in vitro с применением способов, хорошо известных в этой области, например суммированных в Remington's Farmaceutical Sciences, Marck Publishing Co; Easton, Penna; последнее издание. Композиции могут вводиться системно, в частности, путем инъекции или могут применяться местно.

Для диагностики производные металлобактериохлорофилла могут применяться как таковые или могут быть помечены радиоизотопом или другими средствами обнаружения, известными в науке.

Количество вводимого производного металлобактериохлорофилла должно определяться в соответствии с опытом, накопленным в отношении других порфиринов, применяемых в PDT, например, оно должно варьировать в зависимости от выбора производного, применяемого в качестве активного ингредиента, нарушения, подлежащего лечению, способа введения, возраста и состояния больного и заключения врача.

Длина волны облучающего света преимущественно подбирается в соответствии с максимумом поглощения металлобактериохлорофилльного фотосенсибилизатора. Подходящая длина волны для любого из соединений может быть легко определена по его спектру поглощения.

В дополнение к применению in vivo производные металлобактериохлорофилла изобретения могут быть применены для обработки материалов in vitro для уничтожения вредных вирусов или инфекционных агентов, таких как вредные бактерии. Например, кровь и плазма крови, подлежащие последующему переливанию, могут быть обработаны соединением изобретения и облучены для достижения стерилизации.

Таким образом, изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим производные металлобактериохлорофилла указанных здесь формул I', II' и III' для фотодинамической терапии и диагностики злокачественных опухолей и для фотодинамического уничтожения клеток, бактерий и вирусов.

Для этих целей композиции должны быть получены и введены традиционными методами, например, как описано в патентах США 4649151, 4753958, 5256840 и 5238940, Заявке на Европейский Патент 0584552 и Заявке РСТ WO 90/12573, каждая из которых включена здесь в качестве ссылки.

Изобретение теперь будет иллюстрировано следующими примерами, не ограничивающими изобретение.

ПРИМЕРЫ В примерах и таблице будут идентифицированы исходные соединения и полученные металлокомплексы следующими номерами: la-BPhe 1b-BPhe-13²-OH 2a-[Pd]-BChl 2b-[Pd]-BChl-13²-OH 3a-[Co]-BChl 3b-[Co]-BChl-13²-OH 4a-[Ni]-BChl 4b-[Ni]-BChl-13²-OH 5a-[Cu]-BChl 5b-[Cu]-BChl-13²-OH 6a-[Zn]-BChl 6b-[Zn]-BChl-13²-OH 7a-BChl 7b-BChl-13²-OH 8a-[Cd]-BChl 8b-[Cd]-BChl-13²-OH 9a-[Mn]-BChl 9b-[Mn]-BChl-13²-OH Материалы и методы (i) Выделение BChl. BChl [соединение 7а] выделяли из фотосинтезирующей бактерии, подобной Rhodobacter (Rb) sphaeroides или Rhodospirilium rubrum в соответствии с Scherz, A., Parson, W.W., 1984, Biochim. Biophys. Acta, vol. 766, pp. 653-55; Struck et al., 1992 или Svec, W.A., 1991, "The distribution and extraction of the Chlorophylls", in: Scheer, 1991, pp. 89-102. Очистку проводили на DEAE-Сефарозе согласно Omata, Т., Murata, N., 1983, "Preparation of Chlorophyll a, Chlorophyll b and Bacteriochlorophyll a by column chromatography with DEAE-Sepharose C1-6B and Sepharose C1-6B", Plant Cell Physiol., vol. 24, pp. 1093-1100.

(ii) Получение 13²-гидроксибактериохлорофилла a [BChl-13²-OH]. BChl-13²-OR [соединение 7b] , соединение формулы I, где R₁ представляет собой фитил, R₂ представляет собой СООСН₃, R₃ представляет собой ОН, R₄ в положении 3 представляет ацетил, а в положении 8 - этил, получали гидроксилированием BChl [7a] в положении С-13² путем хранения 7 а в метаноле в течение 5-7 дней в темноте при 4^oС (Struck, A. and Scheer, H., 1990, "Modified reaction centers from Rhodqbacter sphaeroides R26. 1. Exchange of monomeric bacteriochlorophyll with 13-hydroxy-bacteriochlorophyir, FEBS Lett. 261, pp. 385-388). В другом варианте применяли LiBr-процедуру согласно Schaber, P.M., J.E.Hunt, R.Fries and J.J.Katz, 1984, J. Chromatogr. 316, 25-41, что приводило к образованию меньшего количества побочных продуктов. В каждом случае очистку проводили на препаративных (20 х 20 см²) пластинах силикагеля (Silica gel 60 H, Merck) или колонках с применением смеси толуол/ацетон (9: 1, объем/объем) как элюента. Зеленовато-голубую полосу, содержащую продукт, названный в заголовке (R_f0,4), механически отделяли и непрореагировавший BChl экстрагировали из Si0₂ ацетоном.

(iii) Удаление металла (деметаллирование) из BChl и BChl-13-OH. BPhe [соединение 1а] и BPhe-13²-OH [соединение 1b] получали удалением металла из BChl [7а] и BChl-13²-OH [7b], согласно Rosenbach-Belkin, V., 1988, "The primary reactants in bacterial photosynthesis modelling by in vitro preparation". Ph. D. Thesis, Weizmann Institute of Science, Israel, 1988, с небольшим количеством уксусной кислоты (только для растворения пигмента). После удаления металла, происходящего немедленно, уксусную кислоту выпаривали под током N₂ и BPhe и BPhe-13²-OH выделяли в виде твердых продуктов.

(iv) Хлорофиллаза (Хлаза). Ацетоновый порошок Хлазы получали из Melia azedarach L. листьев китайского дерева, как описано в ЕР 0584552.

(v) Культура клеток. M2R клетки меланомы мыши культивировали в виде монослойной культуры в среде Игла/F12, модифицированной по Дюльбекко, содержащей 25 мМ HEPES рН 7,4, 10% плодной сыворотки коров, глутамин 2 мМ, пенициллин 0,06 мг/мл и стрептомицин 0,1 мг/мл при 37^oС в увлажненной атмосфере 8% СO₂, как описано ранее (Gerst, J.E., J.Sole, J.P.Mather and Y.Salomon, 1986, Mol. Cell. Endocrinol., vol. 46, pp. 137-47).

(vi) Исследования клеточной фотоцитотоксичности. M2R клетки меланомы мыши (1 х 10⁵ клеток на лунку) культивировали в 24-луночных микропланшетах и выращивали в течение 24 ч до приблизительно 2 х 10⁵ клеток на лунку, приблизительно 70-80% от конфлюентности. Производное [М] -BChl растворяют в культуральной среде и диспергируют звуком. Photosan-3 (коммерчески доступный HPD) разводят до его конечной концентрации в культуральной среде. Среду заменяют свободной от сыворотки средой, и клетки инкубируют в темноте с желаемой концентрацией фотосенсибилизаторов. После 2 ч инкубации клетки облучают при комнатной температуре в течение 5 мин со стороны дна планшеты. Среду заменяют средой, содержащей сыворотку, и планшеты с культурой вновь помещают в инкубатор на 24 ч. Цитотоксическую эффективность в культуре клеток определяют с помощью: (i) микроскопического исследования клеточной морфологии, (ii) флуоресцентной микроскопии клеток с последующей обработкой прижизненным красителем (пропидия иодидом [PID] [2,7-диамино-9-фенил-10-(диэтиламинопропил)-фенантридиния иодида метиодид] ), который избирательно накапливается в ядрах поврежденных клеток, и (iii) включения [³H]тимидина, как описано ниже. Контрольные эксперименты включают: (1) необработанные клетки, хранившиеся в темноте, (2) освещавшиеся необработанные клетки и (3) клетки, обработанные препаратом, но хранившиеся в темноте.

(vii) Источник света. Источник света для облучения представляет собой бытовую 250 Вт галогеновую лампу, фокусируемую через 10 см водный фильтр на стеклянной подложке и подогнанную жидкостным фильтром (хлорофилл а о.п.= 10,00 при 660 нм).

Интенсивность света доводят до 45 мВт/см² во всех случаях.

(viii) Включение [³Н]тимидина. Двадцать четыре часа спустя после PDT к клеточным культурам одномоментно добавляют 1 мкКи/мл [³Н]тимидина на два часа при 37^oC. Культуры затем промывают дважды забуференным фосфатным солевым раствором, обрабатывают 7,5% холодной трихлоруксусной кислотой в течение 30 мин при 4^oС и промывают дважды этанолом. Добавляют гидроокись натрия (1N, 300 мкл на лунку), и планшеты хранили в течение 10 мин при 37^oС. Образцы в 100 мкл переносят в сцинтилляционные флаконы, нейтрализуют 100 мкл 1N НСl и измеряют радиоактивность в жидкостном сцинтилляционном счетчике в 4 мл (20:8 [объем/объем] ) ксилольной сцинтилляционной lumax смеси согласно Chen, L., Могу, Y., Zilberstein A., Revel, М., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 85, pp. 8037-41.

Пример 1. Получение [Zn]-BChl и [Zn]-BChl-13²-OH прямым введением металла [Zn] -BChl [соединение 6а] и [Zn]-BChl-13²-OH [соединение 6b] получали прямым введением металла в BPhe [la] и BPhe-13²-ОН [lb] соответственно методом с применением ацетата/уксусной кислоты или ацетата/диметилформамида.

1а. Метод с применением ацетата/диметилформамида (DMF) [Zn] -BChl и [Zn]-BChl-13²-OH [6а, 6b] получали нагреван