Соединение сахара

Соединение сахара

Реферат

 

Изобретение относится к химической и биотехнологической промышленности. Соединение сахара получено путем воздействия на фукоидан эндофукоиданлиазы. Данное соединение обладает биологической активностью и его применение позволяет анализировать структуру фукоидана. 9 з.п. ф-лы, 42 ил., 2 табл.

Изобретение относится к соединениям сахара, полезным в области исследований углеводов, полисахаридлиазе, применяемой при производстве этих соединений сахара, и к микроорганизмам, принадлежащим к роду Fucoidanobacter, полезным при производстве соединений сахара.

Предпосылки изобретения Сообщалось о том, что фукоидан, который представляет собой сульфатированный полисахарид, содержащийся в бурых водорослях (Phaeophyta), обладает различными биологическими активностями, включая антикоагуляционное действие, снижение количества липидов в крови, противоопухолевое, ингибирующее образование раковых метастазов действие, а также противодействие вирусной инфекции СПИД. Таким образом, фукоидан является важным компонентом в качестве лекарственного средства.

Однако в случае применения фукоидана как такового в качестве лекарственного средства возникают проблемы антигенности, однородности, антикоагуляционной активности и т.д., так как фукоидан представляет сульфатированный полисахарид с очень большим молекулярным весом. Соответственно, часто возникает необходимость до некоторой степени разрушить фукоидан.

Поэтому необходимо определить структуру фукоидана и выявить ее связь с его биологической активностью. Фукоидан представляет собой высокомолекулярное соединение, содержащее множество боковых цепей и различные составляющие сахара. Более того, его сульфатные группы находятся в различных положениях. Эти особенности делают чрезвычайно затруднительным анализ структуры фукоидана. Для того чтобы проанализировать структуру полисахарида, известен способ, включающий обработку полисахарида ферментом, способным его расщеплять, и проведение анализа структур образующихся при этом олигосахаридов. Однако до сих пор не было коммерчески доступных ни фукоидан расщепляющих ферментов, которые давали бы продукты с известной структурой сахарной цепи, ни чего-либо, что могло бы служить стандартом фукоиданового олигосахарида, среди до сих пор известных.

Вот почему были необходимы соединения сахара с известными структурами, фермент, расщепляющий полисахарид и использующийся в получении этих соединений сахара, и микроорганизм, пригодный для продуцирования соединений сахара.

Целью настоящего изобретения является создание соединений сахара, которые можно было бы использовать при анализе структуры фукоидана, идентифицируя продукты энзиматического разложения фукоидана и определяя их биологические активности, новая эндо-фукоидан-лиаза, полезная при исследовании фукоидана, например, при получении олигосахаридов фукоидана, и новый микроорганизм, пригодный для продуцирования соединений сахара.

Первой целью настоящего изобретения являются соединения сахара, представленные следующей общей формулой (1) или (2), в которых, по крайней мере, одна спиртовая гидроксильная группа была сульфатирована, или их соли (см. в конце описания), где X представляет водород или группу, представленную формулой (3) (см. в конце описания), У представляет водород или группу, представленную формулой 4 или 5 (см. в конце описания), при условии, что Х и У не представляют водород одновременно; и Z представляет водород, или группу, представленную формулой (6) (см. в конце описания).

Примеры соединений, представленных приведенными ранее формулами (1) или (2), приведены далее в виде формул (7)-(15) (см. в конце описания).

Второй целью настоящего изобретения является эндо-фукоидан-лиаза, отличающаяся следующими физикохимическими свойствами: I) Функция: действует на фукоидан, и при этом высвобождает, по крайней мере, соединения, представленные ранее формулами (7) и (8).

II) Оптимальные значения рН: в интервале рН от 6 до 10.

III) Оптимальная температура: в интервале от 30 до 40^oС.

Третьей целью настоящего изобретения является бактерия, принадлежащая к роду Fucoidanobacter, которая является новым микроорганизмом, который используют в производстве соединений сахара в соответствии с первым разделом настоящего изобретения, содержащих менахинон в цепи передачи электронов и содержащих 60% GC.

В формулах (1), (2), (4)-(15) и (17)-(25), здесь представленных, знак "~ " означает, что как манноза, так и галактоза существуют в виде - и -аномеров.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что соединения сахара настоящего изобретения можно получить, обрабатывая фукоидан ферментом, который составляет вторую цель настоящего изобретения, или клеточным экстрактом или надосадочной жидкостью культуры бактерий в соответствии с третьей целью настоящего изобретения, в результате чего осуществляется настоящее изобретение.

Краткое описание чертежей Фиг.1 представляет картину элюирования соединения сахара (а), представляющего пиридил-(2)-аминированный (РА-а), которое элюируется из L-колонки.

Фиг.2 представляет картину элюирования соединения сахара (b), представляющего пиридил-(2)-аминированный (РА-b), которое элюируется из L-колонки.

Фиг.3 представляет картину элюирования соединения сахара (с), представляющего пиридил - (2)-аминированный (РА-с), которое элюируется из L-колонки.

Фиг.4 представляет картину элюирования соединения сахара (d), представляющего пиридил-(2)-аминированный (PA-d), которое элюируется из L-колонки.

Фиг.5 представляет картину элюирования соединения сахара (е), представляющего пиридил-(2)-аминированный (РА-e), которое элюируется из L-колонки.

Фиг.6 представляет картину элюирования соединения сахара (f), представляющего пиридил-(2)аминированный (РА-f), которое элюируется из L-колонки.

Фиг.7 представляет картину элюирования соединения сахара (g), представляющего пиридил-(2)-аминированный (РА-g), которое элюируется из L-колонки.

Фиг.8 представляет картину элюирования соединения сахара (h), представляющего пиридил-(2)-аминированный (РА-h), которое элюируется из L-колонки.

Фиг.9 представляет картину элюирования соединения сахара (i), представляющего пиридил-(2)-аминированный (PA-i), которое элюируется из L-колонки.

Фиг.10 представляет масс-спектр (отрицательное измерение) соединения сахара (а).

Фиг.11 представляет масс-спектр (отрицательное измерение) соединения сахара (b).

Фиг.12 представляет масс-спектр (отрицательное измерение) соединения сахара (с).

Фиг.13 представляет масс-спектр (отрицательное измерение) соединения сахара (d).

Фиг.14 представляет масс-спектр (отрицательное измерение) соединения сахара (е).

Фиг.15 представляет масс-спектр (отрицательное измерение) соединения сахара (f).

Фиг.16 представляет масс-спектр (отрицательное измерение) соединения сахара (g).

Фиг.17 представляет масс-спектр (отрицательное измерение) соединения сахара (h).

Фиг.18 представляет масс-спектр (отрицательное измерение) соединения сахара (i).

Фиг. 19 представляет масс-масс-спектр (отрицательное измерение) соединения сахара (а).

Фиг. 20 представляет масс-масс-спектр (отрицательное измерение) соединения сахара (b).

Фиг.21 представляет масс-масс-спектр соединения сахара (с) (отрицательные измерения).

Фиг.22 представляет масс-масс-спектр соединения сахара (d) (отрицательные измерения).

Фиг.23 представляет масс-масс-спектр соединения сахара (е) (отрицательные измерения).

Фиг.24 представляет масс-масс-спектр соединения сахара (f) (отрицательные измерения).

Фиг.25 представляет масс-масс-спектр соединения сахара (g) (отрицательные измерения).

Фиг.26 представляет масс-масс-спектр соединения сахара (h), (отрицательные измерения).

Фиг.27 представляет масс-масс-спектр соединения сахара (i) (отрицательные измерения).

Фиг.28 представляет ¹H ЯМР спектр соединения сахара (a).

Фиг.29 представляет ¹Н-ЯМР спектр соединения сахара (b).

Фиг.30 представляет ¹H-ЯМР спектр соединения сахара (c).

Фиг.31 представляет ¹Н-ЯМР спектр соединения сахара (d).

Фиг.32 представляет ¹Н-ЯМР спектр соединения сахара (e).

Фиг.33 представляет ¹Н-ЯМР спектр соединения сахара (f).

Фиг.34 представляет ¹H-ЯМР спектр соединения сахара (g).

Фиг.35 представляет ¹H-ЯМР спектр соединения сахара (h).

Фиг.36 представляет ¹H-ЯМР спектр соединения сахара (i).

Фиг. 37 представляет график зависимости относительной активности (%) фермента в соответствии со второй целью изобретения от величины рН.

Фиг. 38 представляет график зависимости относительной активности (%) фермента в соответствии со второй целью изобретения от температуры (^oC).

Фиг. 39 представляет график зависимости остаточной активности фермента (%) в соответствии со второй целью изобретения от величины рН при обработке.

Фиг. 40 представляет график зависимости остаточной активности (%) фермента в соответствии со второй целью настоящего изобретения от температуры (^oС) при обработке.

Фиг.41 представляет картину элюирования соединений сахара (а)-(i), выделенных за счет DEAE - Sepharose FF.

Фиг.42 представляет картины элюирования соединений сахара (h) и (i), выделенных за счет DEAE-Sepharose FF.

Далее настоящее изобретение будет раскрыто более подробно.

Штамм, который следует использовать в соответствии со вторым разделом настоящего изобретения, может быть произвольным, если только он принадлежит к роду Flavobacterium и способен продуцировать эндо-фукоидан-лиазу настоящего изобретения. В качестве конкретного примера штамма, способного продуцировать эндо-фукоидан-лиазу, можно указать Flavobacterium sp. SA-0082 штамм. Соединения сахара первой цели настоящего изобретения можно получить, обрабатывая фукоидан эндо-фукоидан-лиазой, полученной из этого штамма.

Этот штамм, который был обнаружен впервые авторами настоящего изобретения из морской воды в Aomori, обладает следующими микологическими свойствами.

1. Flavobacterium sp. SA-0082 штамм а. Морфологические свойства 1) короткая палочка; ширина: 0,8-1,0 мкм, длина: 1,0-1,2 мкм 2) Споры: нет 3) Окрашивание по Граму: - b. Физиологические свойства 1) Температурный интервал роста: способен расти при 37^oС или ниже, подходящая температура для роста в интервале от 15 до 28^oС.

2) Отношение к кислороду: аэробный 3) Каталаза: + 4) Оксидаза: + 5) Уреаза: слабый + 6) Образование кислоты D-глюкоза: + лактоза: + мальтоза: + D - маннит: + сахароза: - трегалоза: - 7) Гидролиз крахмал: - желатин: + казеин: - эскулин: + 8) Восстановление нитрата: - 9) Образование индола: - 10) Образование сероводорода: - 11) Отверждение молока: - 12) Потребность в натрии: + 13) Потребности в солях Рост в среде без NaCl: - Рост в среде с 1% NaCl: - Рост в морской воде: + 14) Хинон: менахинон 6 15) GC содержание во внутриклеточной ДНК: 32% 16) OF-тест: О 17) Цвет колоний: желтый 18) Подвижность: нет 19) Скольжение: нет Можно утверждать, что этот штамм является штаммом бактерии, аналогичной Flavobacterium aguatile u Flavobacterium meningosepticum, описанной в Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol.1(1984) и в Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Vol. 9(1994). Однако этот штамм отличается от первого тем, что не способен образовывать кислоту за счет метаболизма сахарозы, не способен разлагать кезиин, способен разлагать эскулин, способен ожижать желатин и позитивен по отношению к уреазе, а от последнего отличается тем, что не способен разлагать казеин и медленно растет при 37^oС. Соответственно, этот штамм определен как штамм бактерии, принадлежащей к роду Flavobacterium и назван Flavobacterium sp. SA-0082.

Вышеуказанный штамм обозначен как Flavobacterium sp. SA-0082 и депонирован в National Institute of Bioscien-ce and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (адрес: 1-3, Higashi 1-chome,Tsaukuba, Ibaragi, 305 JAPAN) под регистрационным номером FERM P-14872 с марта 29, 1995 и депонирован в National Institute of Bioscience and Human Technology, как указано выше, под регистрационным номером FERM BP-5402 (перенос в международный депозитарий зарегистрирован 15 февраля 1996 г.).

Что касается питательных веществ, которые необходимо добавлять в среду для инкубирования штамма, который используют в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения, то они могут быть любыми, если только используемый штамм может потреблять их с тем, чтобы продуцировать эндо-фукоидан-лиазу второго аспекта изобретения. Подходящие примеры источников углерода включают фукоидан, порошок морских водорослей, альгининовую кислоту, фукозу, маннит, глицерин сахарозу, мальтозу, лактозу и крахмал, тогда как соответствующие примеры источников азота включают дрожжевой экстракт, пептон, казаминовую кислоту, жидкость от замачивания кукурузы, мясной экстракт, обезжиренную сою, сульфат аммония и хлорид аммония. Кроме того, среда может содержать неорганические вещества и такие соли металлов, как соли натрия, фосфаты, соли калия, соли магния и соли цинка.

Этот штамм хорошо растет также в морской воде или в искусственной морской воде, содержащей вышеуказанные питательные вещества.

При инкубировании штамма, продуцирующего эндо-фукоидан-лиазу в соответствии со второй целью настоящего изобретения, выход фермента варьируется в зависимости от условий инкубирования. Обычно предпочтительно, чтобы температура в процессе инкубирования менялась от 15 до 30^oС, а величина рН среды была от 5 до 9. Выход эндо-фукоидан-лиазы достигает максимума при инкубированими штамма в условиях аэрации и при перемешивании в течение 5-72 часов. На самом деле, условия инкубирования выбирают в соответствии с используемым штаммом, составом среды и т.д., с тем чтобы достичь максимального выхода.

Эндо-фукоидан-лиаза в соответствии со второй целью настоящего изобретения содержится как в клетках, так и в надосадочной жидкости.

Вышеуказанный Flavobacterium sp. SA-0082 инкубируют в подходящей среде, и клетки собирают и разрушают способами, которые обычно используют для разрушения клеток, например, ультразвуком. Таким образом получают не содержащий клеток экстракт.

Затем этот экстракт очищают способами, которые обычно используют специалисты, получая в результате очищенный препарат фермента. Так, например, такую очистку можно осуществить за счет высаливания, с помощью ионообменной хроматографии, хроматографически с гидрофобно связывающей колонкой, за счет гель-фильтрации или т.п., получая в результате эндо-фукоидан-лиазу второго раздела настоящего изобретения, не содержащую каких-либо других разрушающих фукоидан ферментов.

Надосадочная жидкость культуральной среды, полученная после удаления клеток из вышеуказанной культуральной среды, также содержит большое количество фермента (внеклеточный фермент), который можно очистить таким же способом, что и тот, который используют для очистки внутриклеточного фермента.

Эндо-фукоидан-лиаза в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения обладает следующими химическими и физикохимическими свойствами. Внеклеточный фермент идентичен внутриклеточному по своим свойствам, кроме молекулярного веса.

I) Функции: действует на фукоидан таким образом, что вызывает высвобождение, по крайней мере, соединений сахара, представленных вышеуказанными формулами (7) и (8).

II) Оптимальные значения рН: в интервале от рН 6 до рН 10 (фиг.37), а именно, фиг.37 представляет график зависимости относительной активности этого фермента от величины рН, где по оси ординат отложена относительная активность (%), а по оси абсцисс - величина рН.

III) Оптимальная температура: в интервале от 30 до 40^oС (фиг.38), а именно, фиг. 38 представляет график зависимости относительной активности фермента от температуры, где по оси ординат отложена относительная активность (%), тогда как по оси абсцисс отложена температура (^oС).

IV) Стабильность рН: стабилен в интервале значений рН от 6 до 11,5 (фиг. 39), а именно, фиг.39 представляет график зависимости остаточной активности этого фермента от величины рН при обработке, где по оси ординат отложена остаточная активность (%), тогда как по оси абсцисс отложена величина рН.

V) Температурная стабильность: стабилен в интервале температур около 30^oС или менее (фиг.40), а именно, фиг.40 представляет график зависимости остаточной активности этого фермента от температуры при обработке, где по оси ординат отложена остаточная активность (%), а по оси абсцисс отложена температура (^oС).

VI) Молекулярный вес: молекулярный вес этого фермента по данным гельфильтрации, измеренный на Sephacryl S-200 (модиф. Pharmacia) составляет около 70000 в случае внеклеточного фермента штамма Flavobacterium Sp. SA-0082 или около 460000 в случае внутриклеточного фермента этого штамма.

VII) Способ определения энзиматической активности.

Активность эндо-фукоидан-лиазы в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения определяют следующим образом.

50 мкл 2,5% раствора фукоидана, полученного из Kjell-maniella crassifolia, 10 мкл эндо-фукоидан-лиазы второго раздела настоящего изобретения и 60 мкл 83 мМ фосфатного буфера (рН 7,5), содержащего 667 мМ хлорида натрия, смешивают вместе и подвергают взаимодействию при 37^oС в течение 3 часов. Затем 105 мкл реакционной смеси смешивают с 2 мл воды при перемешивании и измеряют поглощение (AT) на длине волны 230 нм. В качестве контролей используют реакционную смесь, полученную таким же способом, но заменяя эндо-фукоидан-лиазу второго раздела настоящего изобретения одним только вышеуказанным буфером, который использовали для растворения фермента, и другую реакционную смесь, полученную таким же способом, но с заменой фукоиданового раствора одной только водой, и также измеряя их поглощение (АВ1 и АВ2).

Количество фермента, за счет которого происходит расщепление гликозидной связи между маннозой и уроновой кислотой (1 мкмоль) в течение одной минуты принимают за единицу (U). Расщепленную таким образом связь определяют, принимая миллимолярный молекулярный коэффициент экстинкции ненасыщенной уроновой кислоты, образующейся в реакции элиминирования, за 5,5. Активность фермента определяют в соответствии со следующим уравнением: Активность (U/мл)=(АТ-АВ1-АВ2)(2,105120/(5,51050,01180); 2,105: объем (мл) образца, поглощение которого предстоит измерить; 120: объем (мкл) ферментной реакционной смеси; 5,5: миллимолярный молекулярный коэффициент экстинкции (коэффициент (мМ) ненасыщенной уроновой кислоты на 230 нм; 105: объем (мкл) реакционной смеси, используемой для разбавления; 0,01: объем (мл) фермента; и 180: время реакции (мин).

Количество протеина определяют, измеряя поглощение ферментного раствора на 280 нм, и рассчитывают, принимая поглощение 1 мг/мл раствора протеина за 1,0.

В настоящем изобретении определили механизм действия эндо-фукоидан-лиазы второго аспекта настоящего изобретения следующим образом.

1) Получение Kjellmaniella crassifolia фукоидана Сухую Kjellmaniella crassifolia измельчают с помощью мельницы модель М-2 (произв. Nara Kikai Seisakusho) и обрабатывают 10 кратным объемом 85% метанола при 70^oС в течение 2 часов. Затем фильтруют, а остаток обрабатывают далее в 10 кратном объеме метанола при 70^oС в течение 2 часов. После фильтрования добавляют 20 кратный объем воды к остатку. Затем смесь обрабатывают при 100^oС в течение 3 часов и фильтруют, в результате чего получают экстракт. Концентрацию солей в экстракте доводят до уровня, соответствующего 400 мМ раствору хлорида натрия. К этому добавляют цетилпиридинийхлорид до тех пор, пока уже больше не образуется осадка. После центрифугирования осадок тщательно промывают этанолом, полностью удаляя тем самым цетилпиридинийхлорид. Затем все это обессоливают и удаляют низкомолекулярные вещества, используя ультрафильтр (ультрафильтрационная мембрана с исключением по молекулярному весу: 100000 произв. Amicon). Полученный при этом осадок удаляют центрифугированием. Надосадочную жидкость высушивают замораживанием, получая очищенный Kjellmaniella crassifolia фукоидан. Выход продукта составляет около 4% в расчете на вес сухого порошка Kjellmaniella crassifolia.

2) Расщепление фукоидана эндо-фукоидан-лиазой и выделение продуктов расщепления.

Очищенный фукоидан, полученный из Kjellmaniella crassifolia, обрабатывают эндо-фукоидан-лиазой настоящего изобретения, в результате чего получают в большом количестве продукты расщепления.

А именно, 600 мл 5% раствора фукоидана, полученного из Kjellmaniella crassifolia, 750 мл 100 мл фосфатного буфера (рН 8,0), 150 мл 4 М хлорида натрия и 3,43 мл 1750 мU/мл раствора эндо-фукоидан-лиазы настоящего изобретения смешивают вместе и оставляют реагировать при 25^oС в течение 144 часов. Затем реакционную смесь подвергают диализу, используя мембрану для диализа с размером пор 3500, и отбирают фракцию с молекулярным весом 3500 или менее. После обессоливания с помощью Micro Acilyzer G3 (изг. Asahi Chemical Industry Co, Ltd). Эту фракцию разделяют на девять фракций (а), (b), (с), (d), (е), (f), (g), (h), (i) с помощью DEAE-Sepharose FF. Фиг.41 представляет картину элюирования этих фракций, где по оси абсцисс отложен номер фракции; ось ординат слева и черные кружки относятся к содержанию сахара в образце, определенному по методу с использованием фенола-серной кислоты и представленному как поглощение на 480 нм; ордината справа и пустые кружки относятся к содержанию ненасыщенной глюкуроновой кислоты в образце, представленному как поглощение при 235 нм, а еще правее ордината и пунктирная линия относятся к концентрации ацетата аммония (М) в элюате. Номера фракций и соответствующие фракции следующие: а) от 42 до 43; (b) от 84 до 91; (с) от 51 до 52; (d) 79; (с) от 102 до 103; (f) от 62 до 63; (д) 45; (h) 75 и (i) 77.

Что касается фракции (h) и (i), то вышеуказанные фракции 64-78 объединяют и повторно очищают с помощью DEAE-Sepharose FF. Фиг.42 представляет картину элюирования этих фракций, где по оси абсцисс отложен номер фракции, ордината слева и черный кружок относятся к содержанию сахара в образце, определенному методом с использованием фенола-серной кислоты, выражненному как поглощение на 480 нм, ордината справа и пустые кружки относятся к содержанию ненасыщенной глюкуроновой кислоты в образце, выраженному как поглощение при 235 нм, а еще правее ордината и пунктирная линия представляют концентрацию ацетата аммония (М) в элюате. Номера фракций для этих фракций соответственно следующие: (h) от 92 до 96 и (i) от 99 до 103.

3) Анализ структуры продукта ферментной реакции Подтверждение однородности каждой фракции Часть каждой из вышеуказанных девяти фракций (а), (b), (с), (d), (е), (f), (g), (h) и (i) пиридил-(2)-аминируют (РА) по восстанавливающему концу, используя Gly-coTAG и GlycoTAG набор реагентов /произв. Takara Shuzo Co., Ltd. / до получения таким образом РА сахаридов (РА-а), (РА-b), (РА-с), (PA-d), (РА-е), (PA-f), (PA-g), (РА-h) и (РА-i), которые затем анализируют с помощью ВЭЖХ. Таким образом подтверждается, что каждый из (РА-а), (РА-b), (РА-с), (PA-d), (PA-e), (PA-f), (PA-g), (PA-h) и (PA-i) представляет однородное вещество.

Условия осуществления анализа с помощью ВЭЖХ: Прибор: Model L-6200(Hitachi, Ltd.).

Колонка: L-колонка (4,6х250 мм) (Kagaku Yakuhin Kensa Kyokai (Foundation)).

Элюент: 50 мМ уксусная кислота-триэтиламин (рН 5,5) для веществ вышеуказанных формул (7), (8) и (9) /т.е. (РА-а), (РА-b) и (РА-с)/; 100 мМ уксусная кислота-триэтиламин (рН 5) для веществ вышеуказанных формул (10), (12), (13) и (15) /т.е. (PA-d), (PA-f), (PA-g) и (PA-i)/; 200 мМ уксусная кислота-триэтиламин (рН 3,8) от 0 до 10 минут и 200 мМ смесь уксусной кислоты - триэтиламина (рН 3,8), содержащая 0,5% тетрагидрофурана, от 10 до 60 минут при линейном изменении отношения первого к последнему от 100:0 до 20:80 для вещества формулы (11) /т.е. (РА-е)/; и 200 мМ уксусная кислота-триэтиламин (рН 3,8) и 200 мМ уксусная кислота-триэтиламин (рН 3,8), содержащая 0,5% тетрагидрофурана от 0 до 60 минут при линейном изменении отношения первого к последнему с 80:20 до 50:50 для вещества формулы (14) /т.е. (PA-h)/.

Детектирование: Флуорометрический детектор F-1150 (Hitachi, Ltd), длина волны возбуждения: 320 нм, флуоресцентная длина волны 400 нм.

Скорость потока: 1 мл/мин.

Температура колонки: 40^oС.

Анализ восстанавливающего конца сахара и нейтральная сахарная композиция продукта ферментной реакции РА - сахара (РА-а), (РА-b), (Ра-с), (Pa-d), (РА-е), (PA-f), (Ра-g), (РА-h) и (Pa-i) каждый гидролизуют, обрабатывая 4Н соляной кислотой при 100^oС в течение 3 часов, и восстанавливающий конец сахара исследуют с помощью ВЭЖХ.

Затем восстанавливающие концы этих гидролизатов пиридил-(2)-аминируют (РА), используя GlycoTAG и GlycoTAG реагентный набор /каждый изгот. Takara Shuzo Co., Ltd./ и нейтральные сахарные композиции анализируют с помощью ВЭЖХ. Условия проведения ВЭЖХ: Прибор: Model L-6200 (Hitachi, Ltd).

Колонка: PALPAK Type A (4,6 мм х 150 мм, Takara Shuzo, Co, Ltd.) Элюент: 700 мМ боратный буфер (рН 9,0): ацетонитрил = 9:1.

Детектирование: Флуорометрический детектор F-1150 /Hitachi, Ltd. /, возбуждение на длине волны 310 нм, флуоресценция на 380 нм; Скорость потока: 0,3 мл/мин и Температура колонки: 65^oС.

В результате было обнаружено, что (РА-а), (РА-b), (РА-с), (РА-d), (РА-е), (PA-f) и (PA-i) все имеют маннозу в качестве восстанавливающего конца сахара. Что касается нейтральной сахарной композиции, то (РА-а), (РА-b), (РА-с), (РА-е), (РА-f) и (PA-i) содержат маннозу и фукозу в эквимолярных количествах, тогда как (РА-d) содержит маннозу и фукозу в отношении 2:1.

(РА-g) и (Pa-h) каждый содержат галактозу в качестве восстанавливающего конца сахара. Что касается нейтральной сахарной композиции, то (РА-g) содержит галактозу и фукозу в отношении 1:2, тогда как (РА-h) содержит галактозу и фукозу в отношении 2:1.

Далее конфигурацию маннозы, которая является одной из составляющих сахаров, исследуют следующим образом: используя F наборы глюкоза/фруктоза и фосфоманнозоизомеразу (все Boehringer Mannheim - Yamanouchi), создают реакционную систему, с помощью которой можно определить одну D-маннозу, в соответствии с рекомендациями изготовителей. Отдельно, по 100 мкг соединений сахара (а), (b), (с), (d), (е), (f) и (i) гидролизуют 2 н. соляной кислотой при 100^oС в течение 3 часов и после нейтрализации осуществляют определение в этой реакционной системе. В результате, D -маннозу детектируют во всех соединениях сахара (а), (b), (с), (d), (е), (f) и (i). Таким образом доказано, что соединения сахара (а), (b), (с), (d), (е), (f) и (i) все содержат D-маннозу в качестве составляющего сахара.

Далее конфигурацию галактозы, которая является одной из составляющих сахаров (g) и (h), исследуют, используя F набор лактоза/галактоза (Boehringer Mannheim-Yamanouchi), с помощью которого можно детектировать одну D-галактозу. А именно, порции по 100 мкг (g) и (h) каждую гидролизуют 2 н. соляной кислотой при 100^oС в течение 3 часов и после нейтрализации осуществляют детектирование в этой реакционной системе. В результате галактозу детектируют в (g) и (h). Таким образом, доказано, что (g) и (h) оба содержат D-галактозу в качестве составляющей сахара.

Далее, конфигурацию фукозы, которая является следующим составляющим сахаром, исследуют следующим образом. В соответствии с методом, описанным в Clinical Chemistry 36, 474-476 (1990), порции по 100 мкг соединений (а), (b), (с), (d), (e), (f), (g), (h) и (i) гидролизуют 2 н. соляной кислотой при 100^oС в течение 3 часов и после нейтрализации осуществляют детектирование в этой реакционной системе, с помощью которой можно определить одну только L-фукозу. В результате оказывается, что L-фукоза детектируется в соединениях сахара (а): (b), (с), (d), (e), (f), (g), (h) и (i).

Анализ молекулярного веса продуктов ферментной реакции.

Далее соединения сахара (а), (b), (с), (d), (e), (f), (g), (h) и (i) исследуют с помощью масс-спектрометрии, используя API-111 масс-спектрограф (Perkin-Elmer Science). Так, было обнаружено, что эти вещества имеют молекулярный вес 564, 724, 1128, 1062, 1448, 644, 632, 1358 и 1288 соответственно. В (b) и (с) основные сигналы дают двухвалентные анионы. Одновалентный ион, одновалентный ион с присоединенным к нему натрием и двухвалентный ион определены для (d). Двухвалентный ион с присоединенными к нему четырьмя ионами натрия, трехвалентный ион с присоединенными к нему тремя ионами натрия и четырехвалентный ион с присоединенным к нему ионом натрия и т.д. определены для (е). Одновалентный ион с присоединенными к нему двумя ионами натрия определен для (f). Одновалентный ион, одновалентный ион с присоединенным к нему ионом натрия и двухвалентный ион определены для (g). Одновалентный, двухвалентный, трехвалентный и четырехвалентный ионы соответственно с четырьмя, тремя, двумя и одним ионом натрия соответственно и т.д. детектированы для (h). Одновалентный ион, из которого были элиминированы две сульфатные группы и к которому присоединен ион натрия, и двухвалентный ион, из которого были элиминированы две сульфатные группы, был детектирован для (i).

С помощью масс-масс /МС/МС/ спектрометрии с отрицательными ионами было определено для (а) одновалентный сульфатный ион (молекулярный вес 97), одновалентный ион (молекулярный вес 157), в котором молекула воды и ион водорода были элиминированы из ненасыщенной гексуроновой кислоты, одновалентный ион (молекулярный вес 175), в котором ион водорода был элиминирован из ненасыщенной гексуроновой кислоты, одновалентный ион (молекулярный вес 225), в котором были элиминированы молекула воды и ион водорода из сульфатированной фукозы, одновалентный ион (молекулярный вес 243), в котором из сульфатированной фукозы был элиминирован ион водорода, одновалентный ион (молекулярный вес 319), в котором были элиминированы молекула воды и ион водорода из ненасыщенной гексуроновой кислоты, связанной с маннозой, и одновалентный ион (молекулярный вес 405), в котором был элиминирован ион водорода из сульфатированной фукозы, связанной с маннозой.

С помощью МС/МС спектрометрии с использованием отрицательных ионов проводилось детектирование для (b) аналогичным образом: получены: одновалентный сульфатный ион (молекулярный вес 97), одновалентный ион (молекулярный вес 175), в котором был элиминирован ион водорода из ненасыщенной гексуроновой кислоты, одновалентный ион (молекулярный вес 243), в котором водородный ион был элиминирован из сульфатированной фукозы, двухвалентный ион (молекулярный вес 321), в котором два иона водорода были элиминированы из ненасыщенной гексуроновой кислоты и сульфатированной фукозы, связанной с сульфатированной маннозой, одновалентный ион (молекулярный вес 405), в котором ион водорода был элиминирован из сульфатированной фукозы, связанной с маннозой, или фукозы, связанной с сульфатированной маннозой, и одновалентный ион (молекулярный вес 417), в котором водородный ион был элиминирован из ненасыщенной гексуроновой кислоты, связанной с сульфатированной маннозой.

С помощью МС/МС спектрометрии с использованием отрицательных ионов проводилось детектирование для (с) и определены: одновалентный сульфатный ион (молекулярный вес 97), одновалентный ион (молекулярный вес 175), в котором ион водорода был элиминирован из ненасыщенной гексуроновой кислоты, одновалентный ион (молекулярный вес 225), в котором молекула воды и ион водорода были исключены из сульфатированной фукозы, одновалентный ион (молекулярный вес 243), в котором ион водорода был исключен из сульфатированной фукозы, двухвалентный ион (молекулярный вес 371), в котором два иона водорода были элиминированы из сульфатированной фукозы, связанной с маннозой, связанной с гексуроновой кислотой, связанной с маннозой, одновалентный ион (молекулярный вес 405), в котором водородный ион был элиминирован из сульфатированной фукозы, связанной с маннозой, и одновалентный ион (молекулярный вес 721), в котором вода и ион водорода был элиминирован из сульфатированной фукозы и ненасыщенной гексуроновой кислоты, связанной маннозой, связанной с гексуроновой кислотой.

С помощью МС/МС спектрометрии с использованием отрицательных ионов проводилось детектирование двухвалентных ионов (d) и определены: одновалентный сульфатный ион (молекулярный вес 97) одновалентный ион (молекулярный вес 175), в котором ион водорода был элиминирован из ненасыщенной гексуроновой кислоты, одновалентный ион (молекулярный вес 225), в котором молекула воды и ион водорода были элиминированы из сульфатированной фукозы, одновалентный ион (молекулярный вес 243), когда ион водорода был элиминирован из сульфатированной фукозы, одновалентный ион (молекулярный вес 405), образовавшийся за счет элиминирования атома водорода из сульфатированной фукозы, связанной с маннозой, двухвалентный ион (молекулярный вес 450), в котором две сульфатные группы и два атома водорода были элиминированы из (d), двухвалентный ион (молекулярный вес 490), образовавшийся за счет элиминирования сульфатной группы и двух ионов водорода из (d).

С помощью МС/МС спектрометрии с использованием отрицательных ионов проводилось детектирование (е) и получены: одновалентный сульфатный ион (молекулярный вес 97), одновалентный ион (молекулярный вес 225), полученный за счет элиминирования молекулы воды и водородного иона из сульфатированной фукозы, одновалентный ион (молекулярный вес 243), полученный за счет элиминирования иона водорода из сульфатированной фукозы, одновалентный ион (молекулярный вес 345), в котором два иона водорода были элиминированы, был присоединен и ион натрия к дисульфатированной фукозе, трехвалентный ион (молекулярный вес 450), полученный за счет элиминирования двух сульфатных групп, присоединения трех натриевых ионов и элиминирования шести ионов водорода из (е), трехвалентный ион (молекулярный вес 476), полученный за счет элиминирования сульфатной группы и шести водородных ионов из (е), и присоединения трех натриевых ионов, одновалентный ион (молекулярный вес 563), полученный за счет элиминирования иона водорода из ненасыщенной гексуроновой кислоты и сульфатированной фукозы, связанной с маннозой, и одновалентный ион (молекулярный вес 705), полученный за счет элиминирования молекулы воды и иона водорода из ненасыщенной гексуроновой кислоты и дисульфатированной фукозы, связанной с сульфатированной маннозой.

С помощью МС/МС спектрометрии с использованием отрицательных ионов проводилось детектирование (f), получены: одновалентный сульфатный ион (молекулярный вес 97), одновалентный ион (молекулярный вес 243), полученный за счет элиминирования иона водорода из сульфатированной фукозы, одновалентный ион (молекулярный вес 421), в котором вода и два иона водорода были элиминированы и присоединен ион натрия к ненасыщенной гексуроновой кислоте, связанной с сульфатированной маннозой.

С помощью МС/МС спектрометрии с использованием отрицательных ионов проводилось детектирование (g); получены: одновалентный ион (молекулярный вес 405) полученный за счет элиминирования водородного иона из сульфатированной фукозы, связанной с галактозой, и одновалентный ион (молекулярный вес 551), полученный за счет элиминирования водородного иона из сульфатированной фукозы, связанной с фукозой, связанной с галактозой, или фукозы, связанной с сульфатированной фукозой, связанной с галактозой.

С помощью МС/МС спектрометрии с использованием отрицательных ионов проводилось детектирование вещества, в котором три натриевых иона были присоединены к (h), и пять водородных ионов были элиминированы из него, одновалентный сульфатный ион (молекулярный вес 97), одновалентный ион (молекулярный вес 225), в котором молекула воды и ион водорода были элиминированы из сульфатированной фукозы, и одновалентный ион (молекулярный вес 1197), в котором ион водорода и две сульфатные группы были элиминированы из (h).

С помощью МС/МС спектрометрии с использованием отрицательных ионов проводилось детектирование двухвалентного иона, полученного за счет элиминирования двух сульфатных групп и двух водородных ионов из (i); получен одновалентный сульфатный ион (молекулярный вес 97), одновалентный ион (молекулярный вес 345), полученный за счет элиминирования двух водородных ионов из присоединения натриевого иона к дисульфатированной фукозе.

Анализ композиции сахара в продукте ферментной реакции Как свидетельствуют приведенные результаты масс-спектрометрии, существует большая вероятность того, что соединения сахара (а), (b), (с), (d), (е), (f) и (i) каждое может содержать в своей молекуле ненасыщенную гексуроновую кислоту.

Поэтому проводят следующий эксперимент для доказательства того, что в результате этих ферментных реакций получают продукты, каждый из которых содержит гексуроновую кислоту, содержащую в своей молекуле ненасыщенную связь. Известно, что высокое поглощение в интервале 230-240 нм объясняется наличием в молекуле ненасыщенной связи. Поэтому измеряют поглощение водных растворов каждого из очищенных олигосахаридов (а), (b), (с), (d), (е), (f), (