Пептидные иммуногены для вакцинации и лечения аллергии

Пептидные иммуногены для вакцинации и лечения аллергии

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины. Сущность изобретения составляют иммуногенные молекулы, включающие по крайней мере один фрагмент пептида, имитирующего естественный эпитоп на поверхности человеческого IgE, распознаваемый моноклональным антителом ВSW17 к человеческому IgE, и фрагмент, способный вызвать иммунный ответ на этот пептид. Они пригодны для включения в фармацевтические композиции или для изготовления фармацевтических композиций, в частности предназначенных для лечения опосредуемых IgE заболеваний, таких, как аллергии и атопический дерматит, например, для изготовления вакцин против аллергии. Технический результат - расширение арсенала иммуногенных средств для вакцинации. 2 с. и 5 з.п.ф-лы, 15 ил., 5 табл.

Настоящее изобретение относится к пептидным иммуногенам и касается ингибирования взаимодействий, которые обычно вызывают стимуляцию тучных клеток и базофилов, индуцированную связыванием с клеткой аллергена, сшитого с IgE, что приводит к выделению фармакологически активных медиаторов, а также к синтезу de novo цитокинов, вовлеченных в регуляцию аллергических и воспалительных реакций. Оно относится к иммуногенным молекулам, включающим фрагмент BSW17-мимеотопного пептида, и к их применению.

Аллергические симптомы вызываются выделением из клеток в окружающую ткань и в сосудистые структуры фармакологически активных медиаторов, таких, как гистамин, лейкотриены и ферменты. Эти медиаторы в норме запасаются или синтезируются de novo в специализированных клетках, называемых тучными клетками и базофильными гранулоцитами. Тучные клетки распределены в ткани животного, а базофилы циркулируют в сосудистой системе. Эти клетки синтезируют и накапливают медиаторы внутри клетки до тех пор, пока не происходит определенная последовательность событий, стимулирующая их выделение.

Роль антител в виде иммуноглобулина Е (IgE) в опосредовании аллергических реакций хорошо известна. IgE представляет собой сложную, состоящую из полипептидных цепей структуру, которая так же, как и у других иммуноглобулинов, состоит из двух легких и двух тяжелых цепей, сшитых вместе дисульфидными связями в виде Y-образной конфигурации. Каждая легкая цепь имеет две области, при этом одна область - вариабельная (V_L) - сшита с областью, которая имеет относительно постоянную аминокислотную последовательность и которая называется константной областью (С_L). В отличие от этого тяжелые цепи имеют одну вариабельную область (V_H), а в случае IgE - четыре константных области (C_H1, С_H2, С_H3, С_H4, также известные как С1, С2, С3, С4). Два "плеча" антитела, ответственные за связывание антигена, имеют области с вариабельной полипептидной структурой, и их называют Fab'-фрагментами или F(ab')₂, которые представляют собой два Fab'-антигенсвязывающих плеча, сшитых вместе дисульфидными связями. "Хвост", или центральная ось антитела, содержит фиксированную или постоянную последовательность пептидов, и его называют Fc-фрагментом. Fc-фрагмент содержит интерактивные сайты, которые дают возможность антителу взаимодействовать с другими молекулами или клетками иммунной системы, связывая его с их Fc-рецепторами.

Fc-рецепторы представляют собой молекулы, которые специфически связываются с активными молекулярными сайтами внутри Fc-областей иммуноглобулина. Fc-рецепторы могут существовать в виде связанных с мембраной протеинов в наружной плазматической мембране клетки или могут существовать в виде свободных "растворимых" молекул, которые свободно циркулируют в плазме крови или в других жидкостях тела. В организме человека высокоаффинное связывание IgE с рецептором FcRI происходит в результате сложного взаимодействия протеин-протеин, в котором участвуют различные части домена третьей константной области тяжелой цепи (С3) IgE и ближайший к мембране иммуноглобулинподобный домен (2) субъединицы FcRI.

Хотя было установлено, что остатки внутри С3-домена константной области тяжелой цепи IgE и областей, принадлежащих к 2-домену рецептора FcRI, имеют большое значение для связывания, детальный механизм процесса связывания пока остается неясным. Экспериментальные данные, полученные с помощью измерений переноса флуоресцентной энергии, а также с помощью рассеивания рентгеновских лучей и нейтронов, показали, что человеческий IgE принимает изогнутую форму, которая, как предполагается, придает исключительно высокую аффинность IgE к FcRI (К_d~10^-10M). Кроме того, считается, что эта изогнутая форма также ответственна за образование эквимолярного комплекса между IgE и связанным с клеткой или растворимым FcRI, хотя на молекуле IgE могут образовываться идентичные эпитопы на двух С3-доменах, ответственных за связывание с рецептором. Эта моновалентность является функционально необходимой, если требуется избежать стимуляции рецептора в отсутствии аллергена (фиг. 1). Интерактивные сайты в зависимости от их функции могут уже быть доступными и, следовательно, способны связываться с клеточными рецепторами. Альтернативно этому они могут быть скрыты до момента связывания антитела с антигеном, после чего антитело может изменить строение, и вследствие этого будут доступными другие активные сайты, которые далее могут стимулировать специфическую иммунную активность. Основываясь на данных о спектре кругового дихроизма, было сделано предположение о том, что конформационное преобразование, оказывающее воздействие на связывание С3 с рецептором, является причиной стехиометрического соотношения 1:1 комплекса Fc/FcRI на поверхности клетки.

Для аллергического (иммунологического) выделения гистамина в организм из тучных клеток и базофилов молекула IgE должна присоединиться или прикрепиться с помощью своего Fc-фрагмента к сайту клеточного Fc-рецептора, прикрепляя, таким образом, молекулу IgE к тучной клетке или базофилу. Fab'-фрагменты связанных с клеткой молекул IgE должны быть перекрестно сшиты с определенным совместимым антигеном (аллергеном). Когда происходит такое взаимодействие, в тучной клетке или в базофиле автоматически стимулируется выделение гистамина в локальную окружающую среду, вызывая известные симптомы аллергии. В последней фазе реакции происходят другие биохимические процессы, которые приводят к синтезу de novo и выделению цитокинов и других медиаторов [J.V. Ravetch и J.P. Kinet, Ann. Rev. Immunol. 9 (1991)457-492].

Общепринятые подходы к лечению аллергии включают системную терапию с использованием антигистаминных или стероидных препаратов или десенсибилизацию пациентов; эти подходы не направлены на вмешательство в основное взаимодействие IgE - тучная клетка/базофил. Другие подходы основаны на получении полипептидных цепей, способных блокировать связывание антитела в виде IgE с Fc- рецепторами на поверхностях клеток, и на вытеснении IgE из сайтов связывания, с которыми IgE уже связан. Кроме того, были проведены исследования с целью выяснения природы предполагаемого "эффекторного" сайта внутри Fc-области IgE, который, вероятно, создает иммунологический сигнал, стимулирующий выделение медиатора тучными клетками/базофилами.

Также были сделаны попытки применения рекомбинантных IgE-фрагментов в качестве иммуногенов для получения защитной анти-IgE вакцины, и они оказались эффективными. Основной аргумент против такой вакцины обусловлен опасением того, что использование для иммунизации больших фрагментов IgE может инициировать не только производство ингибиторных антител, но также приводить к поперечному связыванию и тем самым продуцировать анафилактогенные антитела у пациентов (фиг.2).

Целью стратегии, позволяющей преодолеть эту проблему, является выявление наименьших возможных IgE-фрагментов, которые в идеальном случае состоят только из сайта связывания рецептора и которые после связывания оказываются скрытыми внутри комплекса IgE/FcRI и тем самым более не доступны для поперечного связывания при генерируемом вакциной иммунном ответе. Маловероятно, чтобы попытки реконструировать такую сложную молекулярную структуру оказались успешными, учитывая пространственное удаление различных областей С3, вовлеченных во взаимодействие IgE/FcRI.

В настоящее время установлено, что проблемы, присущие "классическому" подходу, основанному на применении вакцин, преодолеваются в результате использования для активной иммунизации BSW17-мимеотопов либо в виде синтезированных химическим путем пептидов, сшитых с соответствующими носителями, либо в виде рекомбинатных слитых конструкций (например, с овальбумином, IgG и т.д.).

BSW17 представляет собой моноклональное антитело, которое распознает конформационный эпитоп на Fc, по крайней мере ту его часть, которая находится в С3. Линия клеток гибридомы, продуцирующая моноклональное антитело BSW17, депонирована 19 декабря 1996 г. в соответствии с Будапештским договором о депонировании микроорганизмов в Европейской коллекции культивируемых клеток животных (ЕСАСС) под регистрационным номером 96121916. Это антитело обладает представляющим интерес профилем биологических активностей, что обобщенно представлено на фиг. 3. BSW17 или BSW17-подобные антитела, циркулирующие в сосудистой системе, защищают от аллергических реакций путем а) ингибирования стимуляции тучных клеток и базофилов с помощью конкурентного ингибирования взаимодействия IgE/IgERI и б) снижения концентраций IgE в сыворотке с помощью понижающей регуляции синтеза IgE на уровне В-клеток.

В настоящее время с помощью скрининга случайной доступной библиотеки фаговых пептидов были выявлены BSW17-"мимеотопные" пептиды, т.е. пептиды, которые имитируют по крайней мере часть сложного конформационного эпитопа на молекуле IgE. Синтезированные химическим путем мимеотопные пептиды, сшитые с иммуногенным носителем-протеином, могут использоваться, например, в качестве вакцин для специфической генерации антител в хозяине-аллергике, которые ингибируют стимуляцию тучных клеток/базофилов путем блокирования связывания IgE/FcRI и/или синтеза IgE. В качестве мимеотопов антител к IgE они индуцируют иммунный ответ, приводящий к продуцированию ВSW17-подобных антител в хозяине. Поскольку установлено, что BSW17 являются неанафилактогенными и ингибируют связывание IgE/PcRI и синтез IgE на поверхности В-клеток, эти антитела, секретируемые в ответ на введение вакцин на основе ВSW17-мимеотопа, обладают аналогичными защитными свойствами. Иммунный ответ является очень специфичным, поскольку в отличие от "классического подхода, основанного на применении вакцин", в этом случае отсутствуют происходящие из IgE протеиновые фрагменты, которые могут генерировать поперечное связывание антител у иммунизированных пациентов (фиг.4).

Таким образом, изобретение относится к иммуногенным молекулам, включающим (а) по крайней мере один фрагмент BSW17-мимеотопного пептида и (б) фрагмент, способный вызвать иммунный ответ на этот пептид, далее кратко называемым в контексте настоящего описания "иммуногенами по изобретению".

Компонент (а) предпочтительно состоит максимум из пяти, предпочтительно из одного или двух, особенно предпочтительно из одного фрагмента BSW17-мимеотопного пептида. Компонент (б) предпочтительно является обычным иммунногенным носителем, представленным далее в настоящем описании, предпочтительно БСА или гемоцианином лимфы улитки (KLH).

BSW17-мимеотопный пептид в компоненте (а) предпочтительно в целом включает примерно до 15 аминокислот, и он представлен, например, одной из приведенных ниже последовательностей (А)-(С) (SEQ ID NO: 1-17). Однако при необходимости он может включать дополнительные компоненты для связывания гаптена с носителем, например, для облегчения сшивания с компонентом (б) или дальнейшего процессинга. Так, в частности, в том случае, когда BSW17-мимеотопный пептид является циклическим, два конца могут, например, соединяться вместе с помощью двух дополнительных остатков цистеина, образующих дисульфидный мостик, или концы могут быть химически поперечно сшиты, например, с помощью лизина; или, когда BSW17-мимеотопный пептид является линейным, С-концевая аминокислота может быть блокирована общепринятым способом путем амидирования, и/или N-концевая аминокислота может быть блокирована общепринятым способом путем ацетилирования. Кроме того, фрагменты BSW17-мимеотопного пептида в компоненте (а), например, представленные ниже предпочтительные фрагменты (А) - (С), могут быть фланкированы в иммуногенах по изобретению несколькими, предпочтительно одной или двумя дополнительными вспомогательными группами, такими, как ацетил, цистеин или лизин, и/или дополнительной сшивающей группой, такой, как DC или BSS, как это, например, описано для конкретных иммуногенов по изобретению, приведенных далее в примере 8 в виде конъюгатов (2)-(4), (6)-(11), (13) и (14).

Антитела, секретируемые в ответ на иммуногены по изобретению, в отличие от антител, продуцируемых гибридомой BSW17, должны быть эндогенными, и, следовательно, они могут использоваться для профилактического лечения больных людей. Они могут быть получены путем соответствующего сшивания компонентов (а) и (б), как описано выше.

Иммуногены по изобретению представлены, например, в форме полимерного пептида или рекомбинантного слитого протеина, причем мономерный компонент полимерного пептида или одна составляющая слитого протеина представляет собой фрагмент BSW17-мимеотопного пептида (а), а другая часть полимерного пептида или слитого протеина представляет собой фрагмент (б), способный вызвать иммунный ответ.

Предпочтительно они находятся в форме конъюгата, состоящего по крайней мере из одного фрагмента BSW17-мимеотопного пептида (а) и фрагмента иммуногенного носителя (б).

Предпочтительные фрагменты ВSW17-мимеотопного пептида, т.е. компонент (а), иммуногенов по изобретению в основном состоят из аминокислот или имеют аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей: Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (A) (SEQ ID NO:1), Arg-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (Б) (SEQ ID NO:2), Arg-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Tyr-Trp-Leu-Trp (B) (SEQ ID NO:3), Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (Г) (SEQ ID NO:4), Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (Д) (SEQ ID NO:5), Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (E) (SEQ ID NO:6), Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (Ж) (SEQ ID NO:7), Val-Asn-Arg-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (З) (SEQ ID NO:8), Val-Lys-Leu-Pro-Trp-Arg-Phe-Tyr-Gln-Val (И) (SEQ ID NO:9), Val-Trp-Thr-Ala-Cys-Gly-Tyr-Gly-Arg-Met (K) (SEQ ID NO:10), Gly-Thr-Val-Ser-Thr-Leu-Ser (Л) (SEQ ID NO:11), Leu-Leu-Asp-Ser-Arg-Tyr-Trp (M) (SEQ ID NO:12), GIn-Pro-Ala-His-Ser-Leu-Gly (H) (SEQ ID NO:13), Leu-Trp-Gly-Met-Gln-Gly-Arg (О) (SEQ ID NO:14), Leu-Thr-Leu-Ser-His-Pro-His-Trp-Val-Leu-Asn-His-Phe-Val-Ser (П) (SEQ ID NO:15), Ser-Met-Gly-Pro-Asp-Gln-Thr-Leu-Arg (P) (SEQ ID NO:16) или Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser (С) (SEQ ID NO:17).

Более предпочтительными являются представленные выше последовательности (А), (Г) и (Ж), прежде всего (А) и (Г).

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, в частности вакцинам, содержащим иммуногенные молекулы, как они определены выше, и адъювант.

Изобретение также относится к лигандам, т.е. к антителам к BSW17-мимеотопным пептидам или происходящим из них фрагментам, применяемым для "пассивной иммунизации" (см. ниже), причем антитело или его фрагмент также распознает натуральный эпитоп для BSW17 на человеческом IgE, a именно, изобретение относится к лигандам, включающим домен антитела, специфический по отношению к фрагменту BSW17-мимеотопного пептида, как он определен выше, причем домен антитела является реактивным по отношению к последовательности аминокислот тяжелой цепи IgE, которая включает натуральный эпитоп, распознаваемый BSW17. Такие лиганды могут быть получены у млекопитающих в виде поли- или моноклональных антител; предпочтительно они находятся в форме моноклональных антител, предпочтительно в форме их Fab'-фрагмента или F(аb')₂-фрагмента, Изобретение также относится к способу получения иммуногена по изобретению, включающему ковалентное сшивание (а) по крайней мере одного фрагмента BSW17-мимеотопного пептида с (б) фрагментом, способным вызвать иммунный ответ на этот пептид.

Изобретение далее относится к иммуногенным молекулам, как они определены выше, предназначенным для использования в качестве фармацевтических препаратов, например, при лечении опосредованных IgE заболеваний, таких, как аллергия и атопический дерматит. Кроме того, изобретение относится к применению иммуногенных молекул, как они определены выше, при изготовлении фармацевтических композиций, в частности вакцин, предназначенных для лечения опосредованных IgE заболеваний, в частности аллергии и атопического дерматита.

Далее, изобретение относится к способу профилактической или лечебной иммунизации против опосредованных IgE заболеваний, таких, как аллергии и атопический дерматит, включающему введение терапевтически эффективного количества иммуногенных молекул, как они определены выше, пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

Иммуногены по изобретению, будучи практически неспособными вызывать нецитолитическое выделение гистамина, способны вызывать появление антител, обладающих сильной серологической перекрестной реактивностью по отношению к аминокислотным последовательностям-мишеням Fc-фрагмента IgE. Таким образом, они пригодны для включения в вакцины или для применения в качестве вакцин.

Начальную дозу иммуногена (например, от приблизительно 0,2 мг до приблизительно 5 мг, предпочтительно приблизительно 1 мг) вводят, например, внутримышечно, после чего через 14-28 дней вводят повторные (бустерные) дозы этого же препарата. Дозировка, как очевидно, должна зависеть в определенной степени от возраста, веса и общего состояния здоровья пациента. Иммунизация может быть "активной" или "пассивной".

При "активной" иммунизации пациент получает иммуноген по изобретению, и при этом анти-h IgE -ответ активно индуцируется иммунной системой пациента.

"Пассивную" иммунизацию получают при введении пациенту, страдающему опосредованным IgE заболеванием, предпочтительно путем инъекции либо поликлональных, либо моноклональных антител к BSW17-мимеотопу.

Поликлональные антитела к BSW17-мимеотопу могут быть получены путем введения иммуногена по изобретению, предпочтительно с использованием адъюванта, животному из класса млекопитающих и отбора образовавшейся в результате иммунной сыворотки. Улучшенные титры могут быть получены при повторных инъекциях через определенный промежуток времени. Не существует особых ограничений в отношении видов млекопитающих, которые могут быть использованы для получения антител; обычно предпочтительно использовать кроликов или морских свинок, однако также могут использоваться лошади, кошки, собаки, козы, свиньи, крысы, коровы, овцы и т.д. Для получения антител определенное количество иммуногена по изобретению разбавляют до требуемой концентрации, например, физиологическим раствором и полученный разбавленный раствор смешивают с полным адъювантом Фрейнда с получением суспензии. Суспензию вводят млекопитающим, например, внутрибрюшинно, например, кролику, используя на одно введение от приблизительно 50 мкг до приблизительно 2500 мкг иммуногена по изобретению. Для иммунизации суспензию предпочтительно вводят приблизительно каждые две недели в течение примерно 2-3 месяцев, предпочтительно примерно в течение 1 месяца. Антитело получают, беря кровь иммунизированного животного по истечении 1-2 недель после последней обработки, центрифугируя кровь и выделяя сыворотку из крови.

Моноклональные антитела к BSW17-мимеотопу могут быть, например, человеческими или мышиными. Предпочтительно пациента следует лечить препаратом, содержащим Fab'-фрагмент мышиного моноклонального антитела или химерного человеческого-мышиного антитела (которое содержит человеческую Fc-область и мышиную Fab'-область), с целью минимизации любой вредной реакции на чужеродный животный иммуноглобулин. Мышиные моноклональные антитела могут быть получены согласно методу Khler и Milstein (Khler G. и Milstein С., Nature 256 [1975] 495), например, путем слияния клеток селезенки гипериммунизированных мышей с пригодной линией клеток миеломы мыши. Для получения человеческих моноклональных антител могут использоваться многочисленные методы, включая получение с использованием: (1) трансформированных вирусом Эпштейна-Барра (EBV) B-клеток; (2) линии клеток для гибридизации В-лимфоцитов; (3) человеческих-мышиных гибридом; (4) человеческих-человеческих гибридом; (5) человеческих человеческих-мышиных гетерогибридом; и (6) репертуарного клонирования (в доступном фаге).

Наиболее предпочтительными являются человеческие человеческие-мышиные гетерогибридомы, и они включают объединенные предпочтительные характеристики обоих человеческих и мышиных родительских типов клеток. Линии клеток человеческой-мышиной гетерогибридомы считаются пригодными для В-клеточного слияния (Teng N.N.M. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 [1983] 7308).

С целью иммунизации антитело может вводиться хозяину в основном с помощью внутримышечной инъекции. Может применяться любой общепринятый жидкий или твердый носитель, который является приемлемым для хозяина и не оказывает вредных побочных воздействий на хозяина и не оказывает отрицательных воздействий на вакцину. В качестве носителя может использоваться забуференный фосфатом физиологический раствор (ЗФР) с физиологическим значением рН, например со значением рН приблизительно 6,8-7,2, предпочтительно приблизительно 7,0, индивидуально либо с приемлемым адъювантом, таким, как адъювант на основе гидроксида алюминия. Концентрация иммуногенного антигена может варьироваться от приблизительно 50 мкг до приблизительно 500 мкг, предпочтительно от приблизительно 200 мкг до приблизительно 300 мкг на инъекцию, в объеме растворителя, обычно составляющем от приблизительно 0,25 мл до приблизительно 1 мл, предпочтительно 0,5 мл. После первоначальной инъекции могут потребоваться многократные инъекции, и они могут быть сделаны, например, с ежегодными интервалами.

Касательно "активной" иммунизации следует отметить, что ее предпочтительно применять для человека, однако другие виды млекопитающих, например собаки, могут быть обработаны аналогичным образом с использованием аналогичных мимеотопов, соответствующих IgE данного вида. Понятие "иммуногенный носитель" в контексте настоящего описания включает такие материалы, которые обладают способностью независимо вызывать иммуногенный ответ у животного-хозяина и которые могут быть ковалентно сшиты с полипептидом либо непосредственно путем образования пептидных или сложноэфирных связей между свободной карбоксильной, амино- или гидроксильными группами в полипептиде и соответствующими группами на материале иммуногенного носителя, либо в альтернативном варианте путем связи через обычные бифункциональные сшивающие группы, либо в виде слитого протеина.

Примеры таких носителей включают: альбумины, такие, как БСА; глобулины; тироглобулины; гемоглобулины; гемоцианины (в частности гемоцианин лимфы улитки [KLH] ); протеины, экстрагируемые из аскарид, например, экстракты аскарид, описанные в J. Immun. III [1973] 260-268, J. Immun. 122 [1979] 302-308, J. Immun. 98 [1967] 893-900 и в Am. J. Physiol. 199 [1960] 575-578, или их очищенные продукты; полилизин; полиглутаминовую кислоту; сополимеры лизина и глутаминовой кислоты; сополимеры, содержащие лизин или орнитин, и т.д. В настоящее время вакцины производятся с использованием в качестве материала иммуногенного носителя токсоида двукрылых или столбнячного токсина (Lepow M.L. и др., J. of Infectious Diseases 150 [1984] 402-406; Coen Beuvery E. и др., Infection and Immunity 40 [1983] 39-45), и эти токсоидные материалы также могут применяться в настоящем изобретении. Очищенное протеиновое производное туберкулина (PPD) является особенно предпочтительным для использования в схеме "активной" иммунизации, поскольку (1) оно не индуцирует сам Т-клеточный ответ (т.е. оно является в действительности "Т-клеточным гаптеном"), но еще ведет себя как полностью процессированный антиген и поэтому распознается Т-клеткой; (2) известно, что оно является одним из наиболее сильных гаптеновых "носителей" с точки зрения механизма распознавания; и (3) оно может применяться для человека без дополнительного тестирования.

В качестве агентов, связывающих гаптен-носитель, могут использоваться также обычно применяемые в препаратах антигены, например, описанные выше или приведенные далее в примерах.

Процесс по изобретению ковалентного сшивания компонента (а) с фрагментом (б) может быть осуществлен известным способом. Так, например, для непосредственного ковалентного сшивания предпочтительно использовать в качестве сшивающего агента производные бис-N-сукцинимидила, более предпочтительно бис(сульфосукцинимидил)суберат (БСС). Глутаровый альдегид или карбодиимид, более предпочтительно дициклогексилкарбодиимид (ДК) или 1 -этил-3 -(3-диметиламинопропил)карбодиимид также могут использоваться для ковалентного сшивания пептида (а) с материалом иммуногенного носителя (б).

Количество гаптена и агента, связывающего гаптен-носитель [т.е. компонента (а)], и носителя [т.е. компонента (б) ] может быть легко оценено общепринятым способом. Предпочтительно, чтобы применяемое соотношение по массе между носителем и гаптеном составляло от приблизительно 1 до приблизительно 6, предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 5, а соотношение молярных эквивалентов агента, связывающего гаптен-носитель, и гаптена составляло от приблизительно 5 до приблизительно 10. После взаимодействия носитель связывают с гаптеном с помощью агента, связывающего гаптен-носитель, получая требуемую композицию антигена в виде комплекса пептид-носитель. Полученный иммуноген по изобретению может быть легко выделен общепринятыми методами, например, диализом, гель-фильтрацией, фракционированием методом осаждения и т.д.

Получение исходных материалов может осуществляться обычным способом. Пептиды, пригодные для использования в качестве компонента (а), могут, например, быть выделены путем скрининга случайных доступных библиотек фаговых пептидов и легко синтезированы, например, с помощью обычных методов с использованием твердых фаз, например, для циклических пептидов с помощью метода твердых фаз с использованием хорошо известного способа "F-mос", или в альтернативном варианте могут быть выявлены с использованием пептидомиметической стратегии путем скрининга случайным образом синтезированных пептидов.

Фиг. 1. Взаимодействие между IgE и рецептором IgERI, обладающим высокой аффинностью к нему.

Фиг.2. "Классической" подход, основанный на применении анти-IgE-вакцины.

Фиг.3. Профиль биологической активности BSW17.

Фиг.4. Иммунотерапия, основанная на применении BSW17-мимеотопа.

Фиг.5. Специфичное распознавание BSW17 BSW17-мимеотопами фага.

Фиг.6. Ингибирование связывания IgE/BSW17 BSW17-мимеотопами фага.

Фиг. 7. Связывание синтезированного химическим путем BSW17-мимеотопного пептида с BSW17.

Фиг. 8а. Распознавание BSW17 конъюгата циклический BSW17-мимеотоп GEFCINHRGYWVCGDPA-KLH (БСС) (SDS 236) и конъюгата Fc (500-509)-KLH (БСС) (SDS 237).

Фиг.8б. Распознавание BSW17 различных конъюгатов BSW17-мимеотопа.

Фиг. 9а. Специфическое распознавание BSW17 конъюгатов BSW17-мимеотопа [БСА (ДК)] и конъюгата Fc (500-509) [KLH (глутаральдегид)] Фиг. 9б. Специфическое распознавание BSW17 конъюгатов BSW17-мимеотопа [KLH (ДК); Lys].

Фиг. 10а. Иммунный ответ на человеческий IgE, индуцированный у кроликов после иммунизации конъюгатами BSW17-мимеотопа (1).

Фиг. 10б. Иммунный ответ на человеческий IgE, индуцированный у кроликов после иммунизации конъюгатами BSW17-мимеотопа (2).

Фиг. 11. Титры антител к BSW17-мимеотопу, вырабатываемых в сыворотке у кроликов после иммунизации.

Фиг.12. Изотипическая специфичность иммунного ответа на человеческий IgE у кроликов, иммунизированных BSW17-мимеотопом.

Фиг.13. Конкуренция за связывание IgE между сывороткой к BSW17-мимеотопу и BSW17.

Фиг. 14. Связывание с hIgE очищенных с помощью аффинной хроматографии антител к BSW17-мимеотопу.

Фиг. 15. Исследование анафилактогенности в отношении клеток крови человека иммунной сыворотки кролика к BSW17-мимеотопу и очищенных с помощью аффинной хроматографии антител к BSW17-мимеотопу: - R2/0, R4/0: предиммунная сыворотка кроликов R2 и R4 до вакцинации BSWn-мимеотопом; - R2/SDS214, R4/SDS213: сыворотка кроликов R2 и R4 через 65 дней после первичной иммунизации BSW17; - антиSDS213, антиSDS214: очищенные с помощью аффинной хроматографии антитела к BSW17-мимеотопу; - R2/0 PC, R4/0 PC: положительная контрольная стимуляция (PC) в присутствии сыворотки кролика.

Концентрации образцов: А = 0,1 мкг антител к ВSW17-мимеотопу (или эквивалентов в полной сыворотке кролика) на 1 мл, В = 1,0 мкг антител к BSW17-мимеотопу (или эквивалентов в полной сыворотке кролика) на 1 мл, С = 5,0 мкг антител к BSW17-мимеотопу (или эквивалентов в полной сыворотке кролика) на 1 мл.

Сокращения Ас - ацетил; СА - сульфат аммония; БСА - бычий сывороточный альбумин; БСС - бис(сульфосукцинимидил)суберат; BSW17 - моноклональное антитело в виде IgG к СН₃- эпитопу нативного IgE (J. Knutti-Mller и др., Allergy 41 [1986] 457-465; S. Miescher и др., Int. Arch. Allergy Immunol. 105 [1994] 75); BSW17-мимеотопный пептид - пептид, имитирующий природный эпитоп человеческого IgE, распознаваемый моноклональным антителом BSW17 к человеческому IgE; КОЕ - колониеобразующие единицы; (DK) - дигексилкарбодиимид; EBV - вирус Эпштейна-Барра; ELISA - твердофазный иммуноферментный анализ; FcRI - рецептор I, обладающий высокой аффинностью к константной области IgE; ФТС - фетальная телячья сыворотка; gam - козий антимышиный; gar - козий антикроличий; h - человеческий; HEPES - N-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота; HRP - пероксидаза из хрена (= РОХ); HSA - человеческий сывороточный альбумин; IgE - иммуноглобулин Е; ИПТГ - изопропил--D-тиогалактозид; KLH - гемоцианин лимфы улитки; Le27 - моноклональное антитело к человеческому IgE (Allergy [1986], см. выше; Int. Arch. Allergy Immunol. [1994], см. выше; LB-планшеты - планшеты со средой Луриа-Бертани; мимеотопный пептид - пептид, который имитирует по крайней мере часть конформационного эпитопа молекулы антитела; ЗФР - забуференный фосфатом физиологический раствор; ПЭГ - полиэтиленгликоль; РОХ - пероксидаза из хрена (= HRP); PPD - очищенное протеиновое производное туберкулина; rhIL-3 - рекомбинантный человеческий интерлейкин-3; РИА-планшеты - планшеты для радиоиммунного анализа; RPMI1640 - стандартная среда для культуры клеток (фирма Sigma, St. Louis, США); SB-среда - натрийсодержащая среда Бакто (фирма Pharmacia, Uppsala, Швеция); SLt - растворимый лейкотриен; ЗТФР - забуференный трис физиологический раствор; VCS - фаг-хелпер VCS M13 (фирма Stratagen, США).

5. Примеры В следующих примерах, которые иллюстрируют настоящее изобретение, но не ограничивают его объем, температура указана в градусах Цельсия (^oС).

Пример 1. Антиаллергический потенциал моноклонального антитела BSW17 к hIgE В качестве модели для тестирования антиаллергической способности BSW17 и BSW17-пoдoбныx антител, вырабатывающихся у больных людей при активной иммунизации BSW17-мимеотопными пептидами, показано воздействие BSW17 на выделение гистамина базофилподобными клетками человека, полученными из клеток костного мозга, культивируемых вместе с rhIL-3.

Одноядерные клетки получают из костного мозга пациентов, нуждающихся в замене головки бедренной кости, с помощью осаждения в градиенте плотности в растворе Ficoll-Hypaque (1,077 г/мл; 400 г). 510⁵ клеток/мл культивируют в среде RPMI1640, содержащей 15% ФТС и 2 нг/мл человеческого rhIL-3. После 6-дневного культивирования при 37^o С в 5% СО₂ добавляют равный объем среды, содержащей rhIL-3. На 12-й день клетки собирают и используют для пассивной сенсибилизации и определяют выделение гистамина. Приблизительно 510⁵ культивируемых клеток костного мозга инкубируют в НА-буфере (20мМ HEPES; рН = 7,4; 0,3 мг/мл HSA) с добавлением 500 нг/мл человеческого IgE в общем объеме 1 мл в присутствии 50-кратного избытка моноклонального антитела к IgE или без него. После инкубации в течение 2 ч при 37^o С клеточные супернатанты используют для измерения содержания гистамина в процессе пассивной сенсибилизации. Для стимуляции выделения гистамина используют клеточные дебрисы. Для определения степени непосредственного выделения гистамина пассивно сенсибилизированные клетки костного мозга ресуспендируют в 0,3 мл НСМ-буфера (НА-буфер, содержащий 0,6М СаСl₂ и 1мМ MgCl₂) и инкубируют с 0,1 мкг/мл анафилактогенного моноклонального антитела Le27 к IgE. Количество гистамина в супернатанте и в осажденных клетках измеряют с помощью анализатора типа Technicon Autoanalyzer II (фирма Technicon, Tarrytown, New York, США). Подсчитывают процент выделения гистамина [по следующей формуле: выделение гистамина (%) = (количество гистамина в супернатанте)/(количество гистамина в супернатанте + количество гистамина в клеточном дебрисе) 100]. Подсчитывают процент выделения гистамина в процессе пассивной сенсибилизации [по следующей формуле: выделение гистамина (%) = (количество гистамина в супернатанте (после пассивной сенсибилизации))/(количество гистамина в супернатанте (после стимуляции) + количество гистамина в супернатанте (после сенсибилизации) + количество гистамина в клеточном дебрисе)} 100]. Оценивают воздействие антитела к IgE на специфическое выделение гистамина [по следующей формуле: специфическое выделение гистамина (%) = % общего выделения гистамина минус % спонтанного выделения гистамина].

Результаты трех независимых экспериментов обобщены в табл. 1.

Из данных, приведенных в таблице 1, очевидно, что в клетках костного мозга, инкубированных с IgE и BSW17, в процессе сенсибилизации не происходит выделения гистамина, но происходит ингибирование стимуляции при использовании Le27. Клетки костного мозга, инкубированные с IgE и Le27, стимулируются уже в процессе пассивной сенсибилизации до такой степени, что уже более не может происходить выделение гистамина в процессе вторичной инкубации с использованием этого анафилактогенного моноклонального антитела. В клетках костного мозга, пассивно сенсибилизированных без какого-либо моноклонального антитела к IgE, происходит эффективное выделение гистамина после последующей стимуляции с использованием Le27.

Отсюда может быть сделано заключение о том, что a) BSW17 само по себе является неанафилактогенным и б) BSW17 предотвращает выделение человеческими базофилами гистамина, индуцируемое стимулирующими агентами. Таким образом, можно ожидать, что продуцирование BSW17- подобных антител у страдающих аллергией пациентов путем активной иммунизации с использованием BSWn-мимеотопных пептидов должно защищать иммунизированных хозяев от развития аллергических реакций.

Пример 2. Скрининг доступной библиотеки случайных фаговых пептидов и отбор позитивных клонов Бактериофаговые частицы, специфически распознаваемые BSW17, идентифицируют с помощью биопэннинга библиотек фагов, дающих линейные или кольцевые случайные пептиды длиной 6-15 аминокислотных остатков, слитые с фаговыми пептидами р11 и pVIII соответственно. Для амплификации библиотек фагов 2 мл жидкой культуры штамма E.coli XL-1-голубой, выращенной в SB-среде до оптической плотности ОП₆₀₀, равной 1,0,инкубируют с 10 фагов в течение 15 мин при комнатной температуре. Добавляют 10 мл SB-среды, содержащей 10 мг/мл тетрациклина и 20 мкг/мл карбенициллина, и 10 мкл, 1 мкл и 0,1 мкл соответственно высевают на LB-планшеты, содержащие 100 мкг/мл карбенициллина. Культуры инкубируют при 37