Рецептор фолликулостимулирующего гормона (fsh) человека, днк, вектор, способ получения, фармацевтическая композиция

Рецептор фолликулостимулирующего гормона (fsh) человека, днк, вектор, способ получения, фармацевтическая композиция

Реферат

 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетической инженерии и может быть использовано в фармацевтической промышленности, а также в медицинской практике с целью снижения эндогенной активности фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). Путем скрининга кДНК-библиотеки определена полная нуклеотидная последовательность, кодирующая рецептор ФСГ человека. Включение этой последовательности в экспрессионный вектор и трансфекция полученным вектором клеток-хозяев позволили осуществить выделение и очистку функционально активной рекомбинантной формы рецептора. Наряду с полноразмерным полипептидом ФСГ-рецептора человека методом рекомбинантных ДНК получены укороченные с С-конца фрагменты, сохраняющие способность к связыванию ФСГ. Предложена фармкомпозиция для снижения эндогенной активности ФСГ, включающая в качестве активного начала рекомбинантный рецептор ФСГ человека или его активный фрагмент. 5 с.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл.

Предлагаемая заявка является частичным продолжением заявки США рег. 07/670085, поданной 15 марта 1991 г., по которой испрашивается приоритет.

Предшествующий уровень техники Изобретение относится к рецептору фолликулостимулирующего гормона человека и его синтезу с использованием техники рекомбинантных ДНК.

Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) представляет собой гетеродимерный гликопротеиновый гормон, вырабатываемый гипофизом и имеющий структуру, сходную со структурой лютеинизирующего гормона (ЛГ), тиреотропного гормона (ТТГ), оба из которых также секретируются гипофизом, и хорионического гонадотропина (ХГ), который продуцируется в плаценте. Эти гормоны являются относительно крупными (28-38 кДа) и состоят из нековалентно связанной -субъединицы, которая является одинаковой для всех указанных гормонов, и -субъединицы, которая у всех гормонов является разной, и которая ответственна за специфичность связывания с рецептором.

Известно, что клеточные рецепторы для этих гормонов принадлежит к классу белок G-связанных мембранных рецепторов, которые при активации способны стимулировать увеличение активности аденилинциклазы. Это приводит к повышению уровня вторичного посредника - аденозин 3', 5' - монофосфата (цАМР), который в свою очередь способствует увеличению уровня синтеза и секреции стероидов. Диаграммы гигроскопичности аминокислотных последовательностей указанных рецепторов выявили три главных области: 1) гидрофильную аминоконцевую область, называемую амино-концевым внеклеточным доменом; 2) семь гидрофобных сегментов с длиной, составляющем ширину мембраны, называемых трансмембранным доменом; и 3) карбокси-концевую область, содержащую потенциальные сайты фосфорилирования (сериновый, треониновый и тирозиновый остатки), и называемую карбокси-концевым внутриклеточным или цитоплазматическим доменом. Это семейство рецепторов гликопротеиновых гормонов отличается от других белок G-связанных рецепторов (таких, как ² - адренэргический, родопсиновый рецептор и рецептор субстанции К) большими размерами своих гидрофильных амино-концевых доменов, которые участвуют в связывании гормонов.

Рецептор ФСI экспрессировали на клетках Сертоли яичка и зернистых клетках яичника. Хотя необходимость получения, в основном, чистого рецептора ФСI человека совершенно очевидна; однако, очистка природных препаратов является практически невыгодной процедурой, и к тому же маловероятно, что такая очистка окажется достаточной для определения аминокислотной последовательности. Недавно, одной группой исследователей была клонирована кДНК, кодирующая рецептор крысиного ФСГ; выведена аминокислотная последовательность этого рецептора, который был экспрессирован в клетках млекопитающего (Sprengel, Mol. Endocrunol. 4: 525, 1990). Другой группой исследователей, предпринимавших попытки клонировать ФСI-рецептор, была также, по-видимому, клонирована и идентифицирована часть трансмембранной области рецептора чел. ФСГ (Parmentier, Science 246:1620, 1389).

Краткое описание изобретения Изобретение относится к, в основном, чистому рецептору человеческого ФСГ, или его фрагменту, или мутанту, способному связывать ФСГ, а также кДНК, кодирующей указанный рецептор, его фрагмент, или мутант; к векторам экспрессии, содержащим указанную ДНК, к клеткам, трансфецированным указанными векторами экспрессии; и к способам продуцирования указанного рецептора, его фрагмента или мутанта путем культивирования указанных трансфецированных клеток. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим указанный рецептор, его фрагмент, или мутант, и к способам лечения пациентов с использованием таких композиций в целях снижения биоактивности эндогенного ФСГ. В предлагаемой заявке также раскрывается улучшенный анализ чел. ФСГ с использованием рецептора, его фрагмента или мутанта изобретения.

Краткое описание чертежей На фиг. 1 представлена карта клонов кДНК для рецептора ФСI человека. На фигуре показана частичная карта рестрикции, которая была построена путем объединения данных о ДНК-последовательностях, полученных от частей каждого из пяти клонов. На карте отмечено увеличение в размере на каждые 0,2 тысяч пар оснований (кв). Области, которым соответствуют клоны, показаны сплошными линиями ниже рестрикционной карты. Обозначения и приблизительные размеры клонов (в кв) указаны слева и справа от каждой сплошной линии соответственно. Пунктирными стрелками, выше рестрикционной карты, показано приблизительное расположение амино-концевого внутриклеточного домена, трансмембранного домена, и карбокси-концевого внутриклеточного домена кодированного белка. Положение инсерции (вероятно, интрон или часть интрона) в клоне 5-10 показано рамкой.

На фиг. 2А и 2В показана стратегия, использованная для конструирования кДНК "полного" ФСГ-рецептора человека в целях экспрессии кодированного белка в клеточной линии млекопитающего.

На фиг. 3 представлена диаграмма плазмидного вектора экспрессии, использованного для получения клеточных линии СНО -ДИКХ, стабильно трансфецированных чел. ФCI-рецептором.

На фиг.4 представлена диаграмма плазмидного вектора экспрессии, использованного для получения клеточных линии Y1, стабильно трансфецированных чел. ФСI-рецептором.

На фиг. 5 проиллюстрированы уровни внутриклеточного цАМР, измеренные в СНО-DUKX - клеточной линии GHOHГ ЕР 40-13, после обработки различными дозами либо ФСГ (кружки), либо ЛГ (треугольники). Каждая точка представляет среднее значение. Стандартные ошибки показаны вертикальными черточками.

На фиг.6 проиллюстрированы уровни прогестерона, измеренные в культуральной среде Y1 - клеточной линии Y1HFSHR4-38, после обработки различными дозами ФСI. Вертикальными черточками обозначены стандартные погрешности (ср. кв.ош.) при измерениях прогестерона для каждой дозы ФСI.

Подробное описание изобретения Рассматриваемые в описании рецептор чел. ФСI, и его ФСI-связывающие фрагменты или мутанты представляют собой полипептиды, обладающие способностью распознавать и селективно связываться с чел. ФСГ, а также продуцировать незначительный иммунологический ответ у человека. Таким образом, изобретение относится к рецептору чел. ФСI, имеющему аминокислотную последовательность, изображенную в SEQ ID 2, а также к его ФСГ-связывающим фрагментам или мутантам, сохраняющим высокую степень гомологии (по крайней мере, 95% идентичности) с указанной аминокислотной последовательностью или, по крайней мере, ее внеклеточной частью. Объем изобретения включает в себя такие фрагменты чел. ФСI-рецептора, которые остаются после делении цитоплазматического и/или трансмембранного доменов из полного полипептида. Особенно предпочтительным фрагментом изобретения является аминоконцевая внеклеточная часть, содержащая приблизительно аминокислоты I-349 аминокислотной последовательности чел. ФСI- рецептора, показанной в SEQ ID 2. Некоторые из петлевых фрагментов, которые простираются по всей ширине трансмембранных областей (указаны в SEQ-ID 2, в разделе "отличительные особенности") являются также внеклеточными, и они могут быть сшиты (посредством соответствующих спейсерных молекул) с фрагментом, содержащим амино-концовую внеклеточную область, для улучшения связывания. Этот полипептид может быть гликосилирован, как и в природном рецепторе, либо он может быть частично или полностью дегликосилирован.

Кроме того, предполагается, что из вышеописанной амино-концевой внеклеточной области лишь ее часть может быть эффективно использована для ФСI-связывания, поскольку вероятность того, что для этой цели не требуется полный внеклеточный домен, очень велика. Таким образом, фрагмент, который является короче, чем 349 аминокислот полного внеклеточного домена, может быть легко продуцирован и проанализирован на эффективное связывание с ФСГ. Поскольку область ФСI-связывания внеклеточного домена целиком сохраняется, то полная длина используемого фрагмента не является критической величиной. По этой причине можно также ожидать, что либо к концу внеклеточного домена, либо к его ФСГ-связывающему фрагменту могут быть также добавлены аминокислоты, не оказывающие неблагоприятного воздействия на способность полипептида к связыванию. В соответствии с этим изобретение относится к фрагменту чел. ФСI-рецептора, который включает в себя, в основном, часть внеклеточного домена, и который, в основном, сохраняет такую же способность к ФСI-связыванию, что и полный внеклеточный домен.

Объем изобретения также включает в себя мутантные формы вышеописанного рецептора и его фрагментов. Такие мутанты могут быть получены с помощью консервативных замещений в 1-10 аминокислотных остатках; причем локализацию и природу этих замещений выбирают таким образом, чтобы они не оказывали неблагоприятного воздействия на ФСI-связывающие свойства модифицируемого рецептора или его фрагмента.

В основном, чистый чел. ФСI-рецептор, или его фрагмент, или мутант получают путем выделения и клонироваиия ДНК, кодирующие указанный рецептор, его фрагмент, или мутант, из кДНК или геномной библиотеки, с последующим лигированием этой ДНК в вектор, трансфецированием клеток-хозяев этим вектором, культивированием трансфецированных хозяйских клеток в условиях, благоприятствующих экспрессии рецептора, фрагмента или мутанта, и выделением рецептора, фрагмента или мутанта из культуры.

ДНК, используемая для получения векторов экспрессии, может быть геномнои ДНК или кДНК, кодирующей редептор чел. ФСГ, и может содержать области, которые способствуют усилению экспрессии, такие как интроны, промоторы, энхансеры, и т.п. Эта ДНК может быть легко модифицирована путем замещения, делеции или инсерции нуклеотидов (например, путем сайт-специфического мутагенеза) таким образом, чтобы эти мутации не оказывали неблагоприятного воздействия на биологическую активность или способность к ФСГ-связыванию экспрессированного белка. Например, консервативные замещения (мутации), которые вносят изменения в 1-10 аминокислотах, могут быть осуществлены без неблагоприятного воздействия на полную структуру и активность экспрессируемого белка (мутеина). Кроме того, некоторые части ДНК, например части, которые кодируют цитоплазматический и/или трансмембранный домены, могут быть делетированы таким образом, чтобы экспрессировался лишь один фрагмент белка, такой как растворимый внеклеточный домен. Рецептор чел. ФСГ или ФСГ-связывающий его фрагмент или мутант могут быть также экспрессированы в виде гибридного белка. Один из таких гибридных белков может содержать полипептид в карбокси-конце, который обладает свойствами, облегчающими очистку белка, или иммобилизацию очищенного белка на твердом субстрате в целях его использования в анализах ФСГ или в процедурах очистки ФСГ. Другой такой гибридный белок может содержать отщепляемый полипептид у амино-конца, который будет способствовать облегчению экспрессии.

Рецептор чел. ФСГ, продуцированный в соответствии с изобретением, является, в основном, чистым, а это означает, что он, в основном, не содержит нежелательных биологических включений, обычно ассоциирующихся с ФСI-рецептором, экстрагированным из натуральных источников, таких как бактерии, вирусы и другие белки. Указанный рецептор может быть включен в фармацевтическую композицию путем смешивания с подходящими фармацевтическими приемлемыми носителями, хорошо известными специалистам.

Вообще говоря, фармацевтические композиции могут быть составлены для перорального, парентерального (подкожно, внутримышечно и внутривенно), вагинального, ректального, буккального (например, подъязычно), трансдермального или внутриносового введения. Композиции для парентерального введения обычно изготавливают в виде жидкого раствора, дисперсии или эмульсии, предпочтительно в виде изотонического раствора; для вагинального или ректального введения - в виде кремов или суппозиториев, для перорального или буккального введения - в виде таблеток или капсул; и для внутриносового введения - в виде порошка, капель для пускания в нос, или аэрозолей. При этом могут быть использованы лекарственные фермы с пролонгированным высвобождением, например имплантат, или инъецируемые формы. Активный компонент может быть тaкже введен в полимерные матрицы, липосомы и микросферы в целях регулирования доставки лекарственного средства к нужным тканям или органам.

Эти композиции могут быть введены в виде разовых лекарственных форм, которые могут быть получены в соответствии с традиционной фармацевтической техникой. Композиции для парентерального введения могут содержать в качестве наполнителей стерильную воду или солевой раствор; алкиленгликоли, такие как пропиленгликоль; полиалкиленгликоли, такие как полиэтиленгликоль; масла растительного происхождения; гидрогенизированные нафталины и т.п. Композиции для вагинального или ректального введения, например суппозитории, могут содержать в качестве наполнителей, например полиалкиленгликоли, вазелин, какао-масло и т.п. Композиции для введения через нос, изготовленные в виде порошков, могут в качестве наполнителей содержать лактозу или декстран; либо они могут быть изготовлены в виде водных или масляных растворов и введены через нос в виде капель или дозируемого распыляемого раствора. Для транс-букального введения стандартными растворителями являются сахар, стеарат кальция, крахмал, набухающий в холодной воде, и т.п. К раствору или порошкообразной композиции могут быть добавлены кислоты или соли поверхностно-активных веществ. Подходящими фармацевтическими приемлемыми солями поверхностно-активных веществ (ПАВ) являются такие соли, которые сохраняют способность к повышенной абсорбции пептида, и свойства ПАВ, а также не оказывают нежелательного воздействия на композицию, и не имеют других нежелательных свойств.

Дозы вводимых активных ингредиентов, а также способ и режим введения зависят от конкретных данных пациента, его состояния и нужного терапевтического эффекта, и могут быть определены лечащим врачом.

Фармацевтические композиции, содержащие рецептор чел. ФСГ, либо его ФСГ-связывающие фрагменты или мутанты, могут быть введены пациенту в дозах, являющихся терапевтически эффективными для связывания с эндогенным пиркулирующим в организме пациента фолликулостимулирующим гормоном (ФСГ), в целях регулирования приемлемого уровня биоактивиого ФСГ. Так, например, фармацевтические композиции изобретения могут быть эффективно использованы для снижения эндогенной ФСГ-биоактивности. Например, женщинам может быть назначено лечение с использованием вышеуказанных композиций в целях предупреждения роста и созревания фолликулов, и тем самым предупреждения беременности. Мужчинам такое лечение может быть назначено для предупреждения сперматогенеза. Особенно предпочтительная фармацевтическая композиция, которая может быть использована в вышеуказанных целях, включает в себя фрагмент рецептора человеческого ФСГ, содержащий амино-концевой внеклеточный домен или его значительную часть, и обладающий, в основном, такой же способностью к ФСГ-связыванию, что и полные рецептор.

В основном, чистый рецептор чел. ФСГ может быть также с успехом использован в стандартном анализе для ФСГ, который, например, описан Reichert в Endocrinology 94: 483, 1974. Замещения в чистом рецепторе изобретения, или в его фрагменте, способном к ФСГ-связыванию, позволит значительно усовершенствовать проведение указанных анализов. Фрагмент, содержащий амино-концевой внеклеточный домен или его ФСГ-связывающую часть и/или гибрид может быть также аффинно связан с колонкой в целях выделения ФСГ из жидкостей, экстрактов и т.п.

Указанный рецептор может быть введен в стабильную клеточную линию, предпочтительно линию эукариотических клеток, а наиболее предпочтительно линию клеток млекопитающего, которая способна продуцировать обнаружимый биологический ответ при стимулировании рецептора. Измерение клеточного ответа в присутствии ФСГ при проведении анализа (например, в сыворотке, плазме, культуральной среде, тканевых гомогенатов) будет служить указанием на биоактивность, и тем самым на значительную ценность диагностического анализа. Указанная клеточная линия может быть также использована для скрининга химических библиотек в целях оценки веществ, которые могут взаимодействовать с ФСГ-рецептором, или испытуемых пептидов, или небольших белков на их способность связываться с ФСГ-рецептором в скринирующей системе с высокой продуктивностью. Примером такой высокопродуктивной скринирующей системы является система, в которой связывание лиганда с рекомбинантным ФСГ-рецептором способствует продуцированию или блокированию образования оцениваемого продукта, такого как цАМР или прогестерона. Кроме того, указанная система может быть усилена путем соответствующего связывания легко обнаружимого маркера, например биолюминесцирующего агента (напр., ген люциферазы), с сигнал-трансдуцирующим участком рецептора (например, с использованием элемента цАМР-ответа).

В основном, чистый рецептор чел. ФСГ или его ФСР-связывающие фрагменты или мутанты могут быть также использованы в кристаллографическом рентгеновском анализе для разработки молекулярных моделей. Такие модели могут быть использованы при определении третичной структуры гормон-связывающих доменов чел. ФСI-рецептора. Полученная таким образом информация внесла бы значительный вклад в изучение структуры важных областей, осуществляющих взаимодействие между ФСГ и его рецептором, что позволило бы конструировать пептиды, обладающие ФСГ-агонистической или ФСГ-антагонистической активностью.

Рекомбинантная техника, используемая для продуцирования белков и ДНК изобретения и включающая в себя способы идентификации соответствующих мутаций, векторы, хозяйские клетки, условия культивирования и т.п., является хорошо известной специалистам, и адекватно описана, например, в патенте США 4761371 и WO 88/09819, раскрытие которых вводится в предлагаемое описание посредством ссылки. Экспериментальные схемы, бактериальные и бактериофаговые культуральные среды и химические растворы, используемые в приведенных ниже примерах (если это не оговорено особо), подробно описаны Sambrook в "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". 2-ое изд., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

Пример 1. Выделение и характеризация кДНК-клонов рецептора чел. ФСГ Скрининг библиотеки кДНК-клон рецептора крысиного ФСГ, аналогичный описанному Sprengel в "Моl. Endocrinol". 4: 525, 1990, получили от Dr.William Moyle University of Medicine and Dentistry of New Jersey-Robert Wood Johnson Medical School. Этот кДНК - клон инсертировали в поздний экспрессирующий вектор р SVI SV40 (Pharmacia LKB, номер продукта: 27-4509-01) и полученный вектор обозначали р SVLFSUR. 2,1 - кb - фрагмент ДНК, содержащий область, соответствующую области, кодирующей полный рецептор крысиного ФСГ, вырезали из плазмиды с использованием сайтов рестрикции эндонуклеаз ХbаI и BamHI. Переваренную ДНК фракционировали по размерам с помощью гель-электрофореза, и 2,1 кb - фрагмент рецептора крысиного ФСГ очищали с помощью электроэлюции с геля. Этот очищенный ДНК - фрагмент использовали в качестве пробы для скрининга библиотеки в целях идентификации кДНК-клонов рецептора чел. ФСГ.

кДНК - библиотеку лямбда - gtII, сконструированную из PНK, экстрагированной из яичка человека, получали из Clontech, Palo AltO, CA (кат.номер HL 101Оb), и до ее использования амплифицировали. 20 аликвот амплифицированной библиотеки, что соответствует приблизительно 7,510⁴ бляшкообразующих единиц (БОЕ), были адсорбированы, примерно в 0,5 мл суспензии для культивирования штамма YI088 Е. соli. Эту суспензию получали путем культивирования ночной культуры YI088 при 37^oС в NZYМ или LВ-среде, дополненной 0,2% мальтозой и 10 мМ МgSO₄, и осаждения клеток с последующим их ресуспендированием в 10 мМ MgSO₄ до 0, П₆₀₀=0,5. Затем к каждом суспензии фага/клетки добавляли около 6,5 мл расплавленной верхней NZYМ - агарозы (0,7%) при температуре 48^oС, и полученную смесь выливали в одну из 20 чашек (150 мм) с NZYМ - агаром, предварительно нагретым до 42^oС. Общее число фага, пассированного для первичного скрининга, составляло около 1,510⁶. После 4-часового инкубирования при 42^oC с последующим охлаждением при 4^oС в течение нескольких часов, для каждой чашки генерировали слои бляшек на дубликатных нитроцеллюлозных фильтрах (Millipore) в соответствии с процедурами, описанными Benton и Davies (Science 196: 180, 1977). С помощью процедуры праймирования с использованием олигонуклеотида, описанной Feinberg и Vogelstein (Anal. Biochem. 137: 266, 1983), из фрагмента - матрицы ДНК рецептора крысиного ФСГ, описанного в предыдущем параграфе, генерировали ³²Р - меченную пробу со специфической активностью 1-210⁹ им. в мин. /микрограмм (мкг). Предгибридизацию фаговых слоев на нитроцеллюлозных фильтрах проводили в буфере, содержащем 50% формамида, 5SSС [ISSC=0,15 М хлорида натрия, 0,015 М цитрат натрия], 20 мМ фосфатно-натриевого буфера (pH 7,2), 10 реагента Денхардта (50реагент Денхардта = 1% Фиколл, 1% полифинилпирролидон, и 1% альбумин бычьей сыворотки), и 100 мкг/мл тРНК при 37^oС, примерно в течение 6 часов. Гибридизацию фильтров осуществляли в том же буфере, за исключением того, что пробу ДНК крысиного ФСГ-рецептора добавляли при концентрации около 310⁶ им/мин на мл буфера. После гибридизации при 37^oC в течение 16-24 часов избыток пробы промывали с фильтром в 2SSС, 0,1% ДCН при комнатной температуре в течение 30 минут, а затем в 0,2SSС, 0,1% ДСН при 37^oС в течение 60 минут. Затем фильтры экспонировали с рентгеновской пленксй (ХАR Коdак) в течение ночи при -70^oС. 6 дубликатных позитивов идентифицировали, исходя из первичного скрининга библиотеки. Широким концом пастеровской пипетки бляшкосодержащие агаровые слои удаляли из 150 мм - чашек в тех местах, где располагались позитивные клоны. Фаг элюировали путем погружения этих слоев в SM. Суспендированный фаг затем снова засевали на 150 мм - чашки с NZYМ - агаром, как описано выше для первичного скрининга. Чашки, содержащие около 500 БОЕ/ чашка, отбирали для вторичного скрининга. Процедуры, используемые для получения фильтров и их гибридизации для вторичного скрининга, были аналогичны процедурам, описанным выше для первичного скрининга.

После вторичного скрининга 5 предполагаемых чел. ФСГ-рецептор-позитивных клонов идентифицировали и выделяли в виде очищенных клонов бактериофага gtII. Эти клоны обозначали: 1-5, 5-10, 11-11, 13-9 и 15-6.

Определение ДНК-последовательностей предполагаемых кДНК-клонов рецептора чел. ФСГ Фаговую ДНК получали от каждого изолята кДНК gtII с использованием метода лизиса в чашках, описанного Sambrook в "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, "2-ое изд. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, стр.2.118. Фаговую ДНК переваривали рестриктирующей эндонуклеазой EcoRI, а затем факционировали по размерам в агарозном геле для очистки инсерционных фрагментов кДНК. Очищенные кДНК-вставки субклонировали в ЕсоRI - caйт рUС18 в целях облегчения последующих манипуляций по клонированию и секвенированию. Двухцепочечную плазмидвую ДНК считали из 5 мл культуры штамма-хозяина E.coli MC1066 с использованием метода мелкомасштабного щелочного лизиса (Sambrook, там же, см. выше, стр.1,25), а затем очищали путем пропускания через Elutip-d-колонки (Schleicher, & Schuell Keene, NH) в соответствии с инструкцией изготовителей. После этого половину плазмидной дНК, полученной от каждого препарата, денатурировали в 0,2 н. NaOH, 0,2 мМ EDТА в объеме 20 мкл, при комнатной температуре, в течение 10 минут. Денатурированную плазмидную ДНК нейтрализовали и осаждали этанолом путем добавления 7,5 мкл 7,5 М ацетата аммония и 110 мкл 100% этанола, после чего смесь охлаждали в жидком азоте. ДНК-преципитат осаждали в течение 10 минут на микроцентрифугe. ДНК-осадок промывали в 70% этаноле и осушали. Реакции секвенирования осуществляли с использованием ДНК-полимеразы Т7(United States Biochemical) в соответствии с инструкцией изготовителем. Предварительные реакции секвенирования осуществляли с использованием прямого и обратного сeквенирующих праймеров (Pharmacia LКВ) для полилинкерной области рUС18. Данные, полученные в результате предварительного секвенирования, использовали для конструирования чел. ФСГ - рецептор-специфических секвенирующих праймеров. Эти праймеры либо синтезировали на ДНК-синтезаторе модели 391 Арplied Biosystem, либо заказывали в National Biosciences Ihc, Hamel, MN. Некоторые данные о ДНК-последовательности были получены путем субклонирования более мелких рестрикционных фрагментов исходных клонов в рUС18 и повторного секвенирования с использованием прямого и обратного праймеров.

Предварительные данные секвенирования показали, что ни один из пяти кДНК-изолятов не представляет область, кодирующую полный чел. ФСI - рецептор, однако объединенные данные секвенирования по пяти клонам могут быть использованы для вывода полной последовательности белка. Схематическая диаграмма относительного расположения каждого из пяти клонов по отношению к полной кДНК-последовательности, кодирующей чел. ФСГ-рецептор, представлена (см. ниже) на фиг.1. кДНК-последовательность полного чел. ФСI - рецептора, полученная путем объединения данных секвенирования, проводимого в соответствии с компьютерной программой сборки фрагментов (Genetic Computer Group) (GCG), изображена в SEQ ID 1, а выведенная аминокислотная последовательность изображена в SEQ ID 2. Анализ ДНК-последовательности чел. ФСI - рецептора позволил идентифицировать длинную открытую рамку считывания из 2085 нуклеотидов, которая кодирует белок в 695 аминокислот. Рецептор человеческого ФСГ на 3 аминокислоты длиннее рецептора крысиного ФСГ. Полный % сходства между ДНК крысиного и человеческого ФСГ и белковыми последовательностями, который был определен с использованием программы GGG Веstfit, составлял 87% и 90% соответственно. По проведенным оценкам внеклеточная амино-концевая гидрофильная часть рецептора чел. ФСГ составляет в длину 349 аминокислот и имеет 87% сходства с соответствующем областью крысиного ФСГ. Семь трансмембранных областей этих двух видов, которые связаны мостиковой связью тремя внеклеточными и тремя внутриклеточными петлями, имеют идентичность 95%, а карбокси-концевые внутриклеточные области имеют лишь 81% идентичности. Частичная аминокислотная последовательность, опубликованная Parmentier, Science 246:1620-1622, 1989, соответствует аминокислотам 399-525 в SEQ ID 2.

Клон 5-10 был мутантным и имел инсерцию 0,25 кb после нуклеотида Т в положении 446 в SEQ ID 1. ДНК-последовательность инсерции не имеет сходства с какой-либо частью ДНК - последовательности крысного ФСГ - или человеческого ФСГ-рецептора, а также не похожа на какую-либо известную последовательность в Банке генов или базах данных ДНК-последовательностей в EMBL. Соответствующая область в клоне 11-11 не содержит указанной инсерции. кДНК-клоны рецептора LH, выделенные из кДНК-библиотеки щетовидной железы человека, содержат аналогичные мутации (Frazier, Mol.Endocrinol. 4:1264-1276, 1990). Эти мутации, очевидно, происходят в результате неполного и/или аберрантного сплайсинга РНК-молекул. Это объяснение подтверждается присутствием 3' - сплайсируемого консенсуса (САG'G) в 3' - области соединения инсерции 5-10.

Плазмиды рUС18, содержащие кДНК-вставки: 10-11 (обозначенная pHFSHR 11-11), 15-6 (обозначенная рНFSHR 15-6), и 5-10 (обозначенная рНFSHR 5-10), были депонированы Американской коллекцией типовых культур (АТСС, Роквилл, МД), 1 марра 1991, и имеют следующие номера допуска: АТСС68538, АТСС68500 и АТСС68539 соответственно. Указанное депонирование было осуществлено в соответствии со всеми требованиями Будапештского соглашения.

Пример 2. Конструирование векторов для экспрессии полного рецептора чел. ФСГ в клетках млекопитающего Стратегия конструирования ДНК, кодирующей рецептор чел. ФСГ, для экспрессии в клетках млекопитающих показана на фиг.2А и 2В. На фиг. 2А, NSiI-ВamHI - фрагмент из 5'-691 пар оснований (п.о.), содержащий старт АТС, выделяли из рНFS НR II-II и субклонировали в рUС18, переваренную PstI и ВаmНI. Полученную плазмиду, рНFSHR II-IInb, линеаризовали с помощью SphI. Концы затупляли путем обработки фрагментом Кленова ДНК - полимеразы I (New England Biolobs, Beverly, MA). После лигирования Хhol - линкеров (New England Biolabs, Beverly, MA) с тупыми концами плазмиды, смесь переваривали ХhoI и BamHI и 5'-фрагмент рецептора чел. ФСГ, составляющий приблизительно 700 п.о., очищали. Фрагмент из срединной области кДНК чел. ФСГ-рецептора выделяли из рНFSHR II-II путем переваривания BamHI и Sрhl и проводили гель-очистку фрагмента прибл. в 734 п. о. 3' - фрагмент чел. ФСГ-рецептора, содержащий стоп-кодон ТАА, выделяли из pHFSHR15-6 сначала путем переваривания плазмиды ферментом DraIII, а затем затупления концов в реакции с ДНК-полимеразой Т4, ХhoI - лигировали в тупые концы, полученную смесь переваривали SphI и XhoI, а 3' - SphI-XhoI - фрагмент приблизительно 690 п.о.

На фиг. 2В, 5'-700 п.о. - ХhoI - BamНI - и срединный 734. п.о. BamHI -SphI - фрагменты кДНК чел. рецептора ФСГ субклонировали в pUCI8 - XhoI (созданного в лаборатории путем превращения Smal-сайта в полилинкере pUC18 в XhоI-сайт с использованием XhoI-линкеров), переваренного ХhoI и SрhI. Полученную плазмиду (pHFSHR 1.4XS) переваривали ХhoI и SphI. Переваренную ДНК фракционировали по размерам с помощью электрофореза в 5-6% полиакриламидном геле, и фрагмент (примерно 1400 п.о.), содержащий 5' - и срединную области кДНК чел. ФСI-рецептора, вырезали и очищали путем электроэлюирования. 3-SphI-XhoI-фрагмент, содержащий стоп-кодон ТАА, субклонировали в pUC18-XhoI, переваренный SphI и XhoI. Полученную плазмиду переваривали SphI и EcoRI. Переваренную ДНК фракционировали в 5-6% полиакриламидном геле, и кусок приблизительно 700 п.о. вырезали и очищали путем электроэлюирования. Затем осуществляли сборку области, кодирующей полный чел. ФСГ-рецептор, объединяя 5'-1400 п. о. - XhoI-SphI-фрагмент с 3'-700 п.о. -SphI-EcoRI-фрагментом при лигировании с рUC18-ХhoI, переваренным ХhoI и ЕcоRI. Правильность сборки конструкции, обозначенной рНFSHRX, проверяли путем переваривания рестриктирующими эндонуклеазами и ДНК-секвенирования. Полностью сконструированный 2,1 кb-XhoI-фрагмент чел. ФСГ - рецептора который содержит приблизительно 18 п. о. 5'-некодирующей последовательности и 12 п.о. 3'-некодирующей последовательности в дополнение к области, кодирующей полный чел. ФСГ-рецептор, вырезали из pHFSHRX путем ХhoI-переваривания. Переваренную ДНК фракционировали по размерам с помощью электрофореза в 0,7% агарозном геле. 2,1 кb - фрагмент вырезали из геля, очищали путем электроэлюирования в Little ВlueTank^тм(ISCO) с использованием процедуры, рекомендованной изготовителями, и вставляли в XhoI-сайты клонирования плазмидного вектора для экспрессии в клетке млекопитающего. Плазмиды, содержащие вставку в соответствующей ориентации для транскрипции мРНК чел. ФСГ-рецептора, отбирали путем рестрикционного анализа. Перед введением в клетки млекопитающих плазмидную ДНК вектора экспрессии очищали либо с помощью двух последовательных процедур высокоскоростного центрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия, либо с помощью плазмидного набора maxi-kit (Qiagen, Chatsworth, CA) в соответствии с инструкцией изготовителя.

Для экспрессии чел. ФМГ - рецептора может быть использован любой подходящий экспрессирующий вектор клетки млекопитающего. Плазмидный вектор имеет следующие необходимые компоненты: эукариотический промотор, такой как промотор мышиного металлотионеина I (ММT-I), промотор вируса саркомы Рауса, либо ранний или поздний промотор обезьяньего вируса SV40, для запуска транскрипции мРНК чел. ФСГ-рецептора; маркерный ген, такой как ген резистентности к неомицину (neo), ген дигидрофолактедуктазы (DНFR), или ген, кодирующий множественную лекарственную устойчивость (МDR), для селекции трансфецированных клеток, сигнал полиаденилирования (поли А), такой как ранний участок полиаденилирования SV40 для 3'-процессинга РНК - транскрипта рецептора; и бактериальную область репликации и гена устойчивости к антибиотику, такую как ori pBP322 и ген резистентности к ампициллину; присутствие этих компонентов необходимо для роста и размножения плазмидного вектора в соответствующем штамме E.coli. Для некоторых клеточных линий может оказаться необходимым введение нитрона в область, которая транскрибируется в мРНК, кодирующую чел. ФСГ-рецептор. Этот интрон предпочтительно поместить между промотором и кДНК-вставкой чел. ФСГ-рецептора, что соответствует его локализации в 5'-нетраслированной области РНК-транскрипта чел. ФСГ-рецептора. В этих целях может быть использован любой подходящий интрон. В данных экспериментах в качестве интрона была использована XbaI-PstI- часть (2 кв) интрона А в гене -субъединицы человеческого гликопротеина (Fiddes, J. Mol. Appl. Genet. 1: 13, 1931). В векторах экспрессии эту часть интрона вставляли между областью протомора ММT-I и кДНК-фрагментом чел. ФСГ- рецептора. Усеченный интрон сохранял акцептор эндогенного сплайсированного фрагмента, но донор сплайсированного фрагмента поставлялся синтетическим олигонуклеотидом.

Диаграмма экспрессирующего вектора чел. ФСГ-рецептора, используемого для трансфекции CНО- клеток, а именно рDHFSHRX (чел. ФСГ-рецептор в СLH3AXSV2DHFRh IVS ), показана на фиг.3, а диаграмма экспрессирующего вектора чел. ФСГ-рецептора, используемого для стабильной трансфекции Y1-клеток, а именно pNHFSHRX (чел. ФСГ-рецептор в CLН3АХSV2 NEOh IVS), показана на фиг. 4. Последовательности ММT-1-гена (нуклеотиды 4542-7514 на фиг.3, и нуклеотиды 5192-8164 на фиг.4), включающие в себя промоторную область, аналогичны последовательностям, показанным "вверх по течению" от ХhoI-сайта в конструкции CLH3X (Reddy, ДНК, 6: 461, 1987) Фрагмент интрона А гена -субъединицы чел. гликопротеина, описанный в предыдущем абзаце, расположен между нуклеотидами 7514 и 9514 на фиг. 3 и между нуклеотидами 8164-10164 на фиг. 4. "Вниз по течению" от Хh01-сайта, ММT-1-интроны и последовательности сигнала полиаденилирования удаляли и заменяли ранним участком полиаденилирования SV40 (нуклеотиды 11614-11857 на фиг.3 и нуклеотиды 12264-12508 на фиг. 4) рML область (Lusky, Nature 293:79, 1981) содержит бактериальный сайт инициации репликации и ген резистентности к ампициллину от рВН 322 (нуклеотиды 1925-4542 на фиг.3, и нуклеотиды 2575-5192 на фиг.4). Транскриптон гена DHFR (нуклеотиды 1-1925 на фиг.3), который включает в себя кДНК мышиной DHFR и область раннего промотора SV40, небольшой Т-интрон, и последовательностей ранней области полиаденилирования, соответствует РvuII-BamHI-фрагменту в рSV2DHFR (Subramani, Mol, Cell, Biol., 1:854, 1981). PvuII-сайт превращали в BamHI-сайт перед введением этого фрагмента в плазмидный вектор экспрессии. Транскриптон гена neo (нуклеотиды 1-2575 на фиг.4) синтезировали путем замены кДНК DHFR (нуклеотиды 342-1077 на фиг.3) HindIII-SmaI-фрагментом (1385 п.о.), происходящим от pSV2-neo (Southern, J. NoI, Appl. Genet, 1:327, 1982). SmaI-сайт - превращали в ВаmHI-сайт перед введением этого фрагмента в экспрессирующий плазмидный вектор.

Для трансфекции большинства стабильных клеточных линий млекопитающих может быть использована плазмида pN