Синтетические аналоги il-10

Синтетические аналоги il-10

Реферат

 

Изобретение относится к полипептидам, включающим следующую последовательность: Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆, где X₄ и Х₅ - независимо выбраны из группы, состоящей из Met, Ile, Leu и Val, и Х₆ выбран из группы, состоящей из Asn, Asp, Gln и Glu. Соединения по изобретению обладают IL-10 - подобной активностью и могут использоваться в качестве агонистов или антагонистов IL-10. Описаны также фармацевтическая композиция, содержащая указанный полипептид, а также способ его получения. 3 с. и 20 з.п.ф-лы, 14 ил., 10 табл.

Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к фармацевтическому использованию веществ, которыми являются агонисты интерлейкина 10 (IL-10). В частности, настоящее изобретение относится к использованию вещества настоящего изобретения для получения фармацевтической композиции, предназначенной для снижения продуцирования TNF, и/или для профилактики или лечения панкреатита, уратного артрита (подагры), аллергий кожи, аллергических реакций на коже, повреждений ткани в результате гипоксии/ишемии (инфаркта, реперфузии), воспалительных реакций, вызываемых вирусными инфекциями; и/или для изготовления противозачаточного средства.

Известный уровень техники Фармацевтические композиции, содержащие человеческий IL-10 (hIL-10) или вирусный IL-10 (vIL-10), а также использование hIL-10 или vIL-10 для изготовления фармацевтической композиции для лечения различных состояний были описаны, например, в WO 93/02693 и WO 94/04180, а некоторые агонисты IL-10 были описаны в WO 96/01318.

Краткое описание сущности изобретения Настоящее изобретение относится к использованию вещества или полипептида формулы X₁-X₂-X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (SEQ ID No: 22) где X₁ представляет Ala или Gly, Х₂ представляет Тyr или Phe, Х₃, X₄ и X₅ независимо выбирают из группы, состоящей из Met, Ile, Leu, и Val; и Х₆ выбирают из группы, состоящей из Asn, Asp, Gin и Glu; при этом необязательно по крайней мере, один из X₁, Х₂, Х₃, Х₄, X₅ и Х₆ независимо замещен не встречающимися в природе или редкими аминокислотами; и/или пептид является циклизованным; и/или пептид является стабилизированным, и/или амино-концевой аминокислотный остаток является ацилированным, и/или карбокси-концевой аминокислотный остаток является амидированным; а псевдопептиды смоделированы на основе вышеуказанной формулы в целях получения фармацевтической композиции, предназначенной для снижения уровня продуцирования TNF, и/или для профилактики или лечения панкреатита.

Кроме того, настоящее изобретение относится к веществу или полипептиду формулы X₁-X₂-X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (SEQ ID No: 22) где X₁ представляет Ala или Gly, Х₂ представляет Тyr или Phe, Х₃, X₄ и X₅ независимо выбирают из группы, состоящей из Met, Ile, Leu, и Val; и Х₆ выбирают из группы, состоящей из Asn, Asp, Gin и Glu; где, по крайней мере, один из X₁, Х₂, Х₃, Х₄, X₅ и Х₆ независимо замещен не встречающимися в природе или редкими аминокислотами; и/или пептид является циклизованным; и/или пептид является стабилизированным, и/или амино-концевой аминокислотный остаток является ацилированным, и/или карбокси-концевой аминокислотный остаток является амидированным; а псевдопептиды смоделированы на основе вышеуказанной формулы; причем указанное вещество или полипептид обладает, по крайней мере, одним из нижеследующих свойств: a) индуцирует ингибирование спонтанного продуцирования IL-8 моноцитами человека; b) индуцирует ингибирование IL-l-индуцированного продуцирования IL-8 мононуклеарными клетками периферической крови человека (РВМС); c) индуцирует продуцирование белка, являющегося антагонистом рецептора интерлейкина-1(IRAP), моноцитами человека; d) индуцирует хемотаксическую миграцию СD⁸⁺-Т-лимфоцитов человека in vitro, e) десенсибилизирует CD⁸⁺-Т-клетки человека, что приводит к их невосприимчивости по отношению к rhIL-10, f) супрессирует хемотаксический ответ CD⁴⁺-T-лимфoцитoв человека по отношению к IL-8; д) супрессирует хемотаксический ответ моноцитов человека по отношению к MCAF/MCP-1; h) ингибирует экспрессию молекулы МНС (главного комплекса гистосовместимости) класса II на моноцитах человека, стимулированных IFN-; i) индуцирует продуцирование IL-4 культивированными нормальными CD⁴⁺-T-клeткaми человека; j) снижает продуцирование TNF в реакции смешанной культуры лейкоцитов человека; k) осуществляет негативную регуляцию продуцирования TNF и IL-8 в кроличьей модели острого панкреатита, индуцированного желчной кислотой, а также способствует снижению нейтрофильной инфильтрации в легких обработанных кроликов.

Считается (как подробно изложено в нижеследующем описании иммунологических механизмов), что механизм действия указанного пептида опосредован блокированием действия медиаторов иммунной системы, а в частности цитокинов, таких как монокины, лимфокины, хемокины и антагонисты рецептора монокинов, то есть предполагается, что вещество настоящего изобретения блокирует/супрессирует продуцирование и/или действие некоторых цитокинов и тем самым ингибирует патологические процессы, приводящие к повреждению тканей, и что вещество настоящего изобретения индуцирует продуцирование природных антагонистов рецептора монокинов, что приводит к блокированию/супрессии действия некоторых цитокинов, таких как, TNF или IL-1 и тем самым к ингибированию патологических процессов, вызывающих повреждение ткани.

Таким образом, в важном варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента вещество настоящего изобретения.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к использованию вещества настоящего изобретения для изготовления фармацевтической композиции, предназначенной в основном для ингибирования цитокин-ассоциированного биологического эффекта, т.е. к использованию вещества настоящего изобретения в качестве белка/пептида, лимфокина, монокина, интерлейкина, интерферона, хемокина или колониестимулирующего фактора, являющихся антагонистами рецептора IL-1. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к использованию вещества настоящего изобретения для изготовления фармацевтической композиции, предназначенной для профилактики или лечения состояния, связанного с нарушением системы цитокинов, т.е. системы белков/пептидов, лимфокинов, монокинов, интерлейкинов, интерферонов, хемокинов или колониестимулирующих факторов, которые являются антагонистами IL-1. В другом своем аспекте настоящее изобретение также относится к способу лечения состояний у человека, связанных с нарушением в системе цитокинов, где указанный способ предусматривает введение индивидууму эффективного количества вещества настоящего изобретения.

Клеточная иммунная система принимает участие в развитии таких нарушений, как инфекции, воспаления и опухолевые заболевания. Иммунокомпетентные клетки и их продукты могут играть важную роль в инициации, прогрессировании и, возможно, в природе развития хронических воспалительных состояний. Эти нарушения имеют часто неясную этиологию и представляют собой широко распространенные заболевания, такие как сахарный диабет, ревматоидный артрит, воспалительные заболевания желудочно-кишечного тракта и кожи. Однако помимо указанных примеров клеточно-опосредованный иммунитет или провоспалительные медиаторы вносят свой вклад во многие другие воспалительные и пролиферативные заболевания (см. табл.1).

Действие IL-10 на продуцирование цитокинов hIL-10 ингибирует продуцирование ряда цитокинов, включая интерферон- (IFM-), фактор некроза опухоли-. (TNF-), колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF), IL-l, IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 и моноцитарный хемотаксический полипептид-1 (MCP-1/MCAF), моноцитами/макрофагами и/или Т-лимфоцитами [4, 5]. IL-10 также ингибирует способность моноцитов мигрировать в ответ на хемокин MCP-1/MCAF [75] . Кроме того, hIL-10 индуцирует продуцирование эндогенного природного антагониста рецептора интерлейкина-1 (IRAP) [6], который ингибирует IL-l и IL-l, путем конкурирования за связывание с рецептором. Поскольку IL-8 является в высокой степени IL-l, IL-l, индуцибельным, то часть действия IL-10, ингибирующего продуцирование IL-8, обусловлено стимуляцией продуцирования антагониста рецептора IL-1, IRAP. Этот механизм имеет большое значение для настоящего изобретения, описанного и проиллюстрированого ниже. IRAP обладает противовоспалительной активностью [9], и предполагается что он оказывает терапевтическое действие при ревматоидном артрите [10]. В своих исследованиях Fischer et а1. наблюдали успешное выживание через 28 дней после обработки IRAP (р=0,015) [11], что свидетельствовало о том, что IRAP оказывает эффективное и дозозависимое действие при лечении септического синдрома. Часть противовоспалительного действия IRAP может быть обусловлена ингибированием продуцирования хемокинов, таких как IL-8.

Экспрессия IL-10 и антигена IL-10 ингибирует экспрессию МНС класса II на моноцитах человека [8]. hIL-10 ингибирует конститутивно индуцированную и IL-4- или IFN--индуцированную экспрессию HLA-DR/DP и DQ [12] . Кроме того, моноциты, предварительно инкубированные с IL-10, не реагируют на последующее индуцирование экспрессии МНС класса II цитокинами IL-4 или IFM-. IL-10 ингибирует экспрессию МНС класса II моноцитами человека после LPS-активации [12, 76]. Введение мышам BALB/c 1-10 мг IL-10 одновременно с летальной дозой LPS обеспечивало защиту этих мышей от гибели [6].

IL-10 ингибирует азотсодержащие промежуточные соединения и супероксид-анионы. IL-10 также ингибирует реакционноспособное азот-содержащее промежуточное соединение (NO), а также реакционноспособные кислородсодержащие промежуточные соединения (H₂O₂), продуцируемые макрофагами после IFN-активации [13].

IL-10 и Т-клеточная активность IL-10 обладает также модулирующим действием на Т-клеточные функции/активность. Так, например, hIL-10 представляет собой хемотаксический фактор для СD⁸⁺-Т-лимфоцитов, тогда как по отношению к CD⁴⁺-T-клeткaм он не обнаруживает хемотаксического действия [14] . Кроме того, IL-10 подавляет способность CD⁴⁺-T-клeтoк реагировать на хемотаксические сигналы -хемокина RANTES, а также -хемокина IL-8. hIL-10 также непосредственно ингибирует пролиферацию Т-клеток периферической крови человека и клоны CD⁴⁺-T-клeтoк [14].

Обсуждение терапевтических свойств Эти in vivo-результаты/данные и другие данные, систематизированные, например, в WO 96/01318, дают серьезные основания предположить о гомеостатической роли IL-10 в регуляции клеточно опосредованного и амплифицированного монокинами иммуновоспалительного ответа и указывают на возможность широкого терапевтического применения IL-10 или лекарственного средства с IL-10-подобной активностью для лечения заболеваний, обусловленных повышенным/недостаточным продуцированием и/или активностью IL-10.

В табл. 1 и 2 перечислены некоторые заболевания, где иммуномодулятор, аналогичный IL-10, или иммуномодулятор с IL-10-подобной активностью имеет, как предполагается, важное терапевтическое значение: Подробное описание изобретения Получение IL-10-гомологичного нонапептида с IL-10-подобной активностью Неполные последовательности hIL-10, имеющие длину 9 аминокислот, были выбраны исходя из тех соображений, что последовательности vIL-10 и hIL-10 должны обладать высокой гомологией, но, по возможности, низкой гомологией по отношению к mlL-10. Было обнаружено, что синтетический нонапептид IT9302 обладает некоторой иммуносупрессорной активностью, которая имитирует активность hIL-10, как будет более подробно описано в нижеследующих примерах. IT9302 соответствует нонапептидной последовательности от С-конца hIL-10, имеющего следующую аминокислотную последовательность NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn-COOH (SEQ ID No: 1) Нонапептид IT9302 обладает сильным действием, ингибирующим различные функции, и является очень стабильным, и, кроме того, предполагается, что он не способен неспецифически связываться с рецепторами. Нонапептид был выбран потому, что в основном 9-аминокислотная полипептидная последовательность является уникальной для белка. Однако следует отметить, что наиболее важными являются, очевидно, 6 аминокислот у самого конца hIL-10. Таким образом, в объем настоящего изобретения входит вещество или полипептид, содержащий подпоследовательность аминокислотной последовательности Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn (SEQ ID No: l).

Предполагается также, что некоторые аминокислотные замены не будут оказывать неблагоприятного действия на агонистическую активность hIL-10, как показано в настоящем описании, при условии, что будут присутствовать треонин, лизин и аргинин и что между ними будет находиться одна аминокислота.

Настоящее изобретение, в частности, относится к использованию вещества или полипептида формулы X₁-X₂-X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (SEQ ID No: 22) где X₁ представляет Ala или Gly, X₂ представляет Тyr или Phe, Х₃, Х₄ и X₅ независимо выбирают из группы, состоящей из Met, Ilе, Leu, и Val; и Х₆ выбирают из группы, состоящей из Asn, Asp, Gin и Glu; при этом необязательно по крайней мере, один из X₁, X₂, Х₃, Х₄, X₅ и Х₆ независимо замещен не встречающимися в природе или редкими аминокислотами; и/или пептид является циклизованным; и/или пептид является стабилизированным; и/или амино-концевой аминокислотный остаток является ацилированным; и/или карбокси-концевой аминокислотный остаток является амидированным; а псевдопептиды смоделированы на основании вышеуказанной формулы в целях получения фармацевтической композиции, предназначенной для снижения IL-1-индуцированного продуцирования TNF, вероятно, посредством IRAP-блокирования рецептора IL-1, и/или для профилактики или лечения панкреатита.

Примерами конкретных полипептидов, которые, как предполагается, могут быть использованы для снижения уровня продуцирования TNF и/или для профилактики или лечения панкреатита, являются следующие полипептиды: 4. NH₂-Gly-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO:5) 5. NH₂-Ala-Phe-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO:6) 6. NH₂-Ala-Tyr-Ile-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO:7) 7. NH₂-Ala-Tyr-Leu-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO:8) 8. NH₂-Ala-Tyr-Val-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO:9) 9. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO:10) 10. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Leu-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO: 11) 11. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Val-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO: 12) 12. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO: 13) 13. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Met-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO: 14) 14. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO: 15) 15. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Gln-COOH (SEQ ID NO: 16) 16. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Glu-COOH (SEQ ID NO: 17) Настоящее изобретение, в частности, относится к полипептиду, имеющему формулу Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (SEQ ID No: 19) полипептиду, имеющему формулу X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (SEQ ID No: 20) полипептиду, имеющему формулу X₂-X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (SEQ ID No: 21) и к полипептиду, имеющему формулу X₁-X₂-X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (SEQ ID No: 22), где X₁ представляет Ala или Gly, Х₂ представляет Тyr или Phe, Х₃, Х₄ и X₅ независимо выбирают из группы, состоящей из Met, Ile, Leu, и Val; и Х₆ выбирают из группы, состоящей из Asn, Asp, Gin и Glu; где одна или несколько аминокислот замещены не встречающимися в природе или редкими аминокислотами; и/или пептид является циклизованным; и/или амино-концевой аминокислотный остаток является ацилированным, и/или карбокси-концевой аминокислотный остаток является амидированным; а псевдопептиды смоделированы исходя из вышеуказанной формулы; причем указанные аналоги обладают, по крайней мере, одним из нижеследующих свойств: a) индуцируют ингибирование спонтанного продуцирования IL-8 моноцитами человека; b) индуцируют ингибирование IL-l-индуцированного продуцирования IL-8 мононуклеарными клетками периферической крови человека (РВМС); c) индуцируют продуцирование белка, являющегося антагонистом рецептора интерлейкина-1(IRAP), моноцитами человека; d) индуцируют хемотаксическую миграцию СD⁸⁺-Т-лимфоцитов человека in vitro, е) десенсибилизируют CD⁸⁺-T-клетки человека, что приводит к их невосприимчивости по отношению к rhIL-10; f) супрессируют хемотаксический ответ CD⁴⁺-T-лимфoцитoв человека по отношению IL-8; g) супрессируют хемотаксический ответ моноцитов человека по отношению MCAF/MCP-1; h) ингибируют экспрессию молекулы МНС (главного комплекса гистосовместимости) класса II на моноцитах человека, стимулированных IFN-; i) индуцируют продуцирование IL-4 культивированными нормальными СD⁴⁺-Т-клетками, j) снижают продуцирование TNF в реакции смешанной культуры лейкоцитов человека; k) осуществляют негативную регуляцию продуцирования IL-8 и TNF в кроличьей модели острого панкреатита, индуцированного желчной кислотой, а также способствуют снижению уровня нейтрофильной инфильтрации в легких обработанных кроликов.

Используемый в настоящем описании термин "по крайней мере, одна биологическая активность IT9302" означает, что IT9302 имеет, по крайней мере, одно из вышеуказанный свойств.

Любой из пептидов, рассматриваемых в настоящем изобретении, может иметь амино-концевой аминокислотный остаток, который является ацилированным, такой как ацетилированный или бензоилированный аминокислотный остаток. Любой из рассматриваемых пептидов может также иметь карбокси-концевой аминокислотный остаток, который является амидированным.

Кроме того, в настоящем изобретении рассматриваются аналоги пептидов, образованные другими консервативными аминокислотными заменами, отличающимися от тех, которые были указаны выше; заменами редкими или не встречающимися в природе аминокислотами; стабилизацией пептидов; циклизацией пептидов; и псевдопептидами, смоделированными на основе идентифицированных пептидов, являющихся агонистами IL-10.

Принцип "консервативных аминокислотных замен" основан на том, что некоторые пары аминокислот имеют совместимые боковые цепи, такие, что при замене одной аминокислоты другой аминокислотой третичная структура белка и его аффинность связывания имеют лишь минимальные изменения. Правила, которым следует руководствоваться при осуществлении консервативных замен, описаны в [78].

Используемый в настоящем описании термин "консервативный" означает, что (i) изменения являются, по возможности, конформационно нейтральными, то есть влекут за собой минимальные изменения третичной структуры мутантных полипептидов по сравнению с нативным белком: и (ii) изменения являются, по возможности, антигенно нейтральными, то есть влекут за собой минимальные изменения в антигенных детерминантах мутантных полипептидов по сравнению с нативным белком. Конформационная нейтральность желательна для сохранения биологической активности, а антигенная нейтральность желательна для предупреждения стимуляции иммуногенного ответа у пациентов или животных, которым были введены вещества настоящего изобретения. Хотя достаточно трудно с абсолютной уверенностью выбрать, который из альтернативных вариантов будет конформационно и антигенно нейтральным, однако существуют правила, которыми каждый специалист может руководствоваться для осуществления замен, которые с высокой степенью вероятности можно считать конформационно и антигенно нейтральными, см., например, [77 и 78]. Некоторые из наиболее важных правил основаны на том, что: (1) замена гидрофобных остатков с меньшей долей вероятности будет приводить к изменению антигенности, поскольку они, очевидно, расположены внутри белка, см., например, Berzovsky (цитированный выше) и Bowie et al. (цитированные выше); (2) замена подобных по своим физико-химическим свойствам, то есть синонимичных остатков с меньшей долей вероятности будет приводить к конформационным изменениям, поскольку заменяющая кислота может играть ту же самую структурную роль, что и заменяемая кислота; и (3) замена эволюционно консервативных последовательностей будет, очевидно, приводить к неблагоприятным конформационным эффектам, поскольку предполагается, что эволюционная консервативность последовательностей может играть важную функциональную роль. Помимо этих основных правил, которыми следует руководствоваться при выборе последовательностей мутеина, имеются анализы, способные подтвердить биологическую активность и конформацию сконструированных молекул. Изменения в конформации могут быть протестированы, по крайней мере, с использованием двух хорошо известных анализов: метод фиксации микрокомплемента, например, [79 и 80], широко используемый в эволюционных исследованиях третичных структур белков; и анализ на аффинность для установления конформационно-специфических моноклональных антител, например, [81]. Более полно биологические анализы для веществ настоящего изобретения описаны в нижеследующих примерах.

Ингибирование спонтанного продуцирования IL-8 моноцитами человека тестировали, как показано в Примере 1, с использованием синтезированного вещества или пептида вместо IT9302. Если продуцирование IL-8 супрессируется не более чем на 50% при использовании 1 нг/мл вещества или пептида, то это вещество или пептид входит в объем настоящего изобретения.

Ингибирование IL-l-индуцированнго продуцирования IL-8 мононуклеарными клетками периферической крови человека (РВМС) тестировали, как показано в Примере 2, с использованием синтезированного вещества или пептида вместо IT9302. Если процент ингибирования продуцирования IL-8 составляет, по крайней мере, 50% при использовании 1 нг/мл вещества или пептида, то это вещество или пептид входит в объем настоящего изобретения.

Продуцирование белка, обладающего антагонистической активностью по отношению к рецептору интерлейкина-1 (IRAP), моноцитами человека, тестировали, как показано в Примере 3, с использованием синтезированного вещества или пептида вместо IT9302. Если индуцирование IRAP составляет, по крайней мере, 30 нг/мл при использовании 10 нг/мл вещества или пептида, то это вещество или пептид входит в объем настоящего изобретения.

Индуцирование хемотаксической миграции СD⁸⁺-Т-лимфоцитов человека in vitro тестировали, как показано в Примере 4, с использованием синтезированного вещества или пептида вместо IT9302. Если при используемой концентрации 10 нг/мл данное вещество или пептид является эффективным, то есть дает значение 2 или более, то это вещество или пептид входит в объем настоящего изобретения.

Десенсибилизацию СD⁸⁺-Т-клеток человека, приводящую к их невосприимчивости в отношении к rhIL-10, тестировали, как показано в Примере 5, с использованием синтезированного вещества или пептида вместо IT9302. Если предварительное инкубирование клеток с данным веществом или пептидом приводит, в основном, к полной супрессии восприимчивости СD⁸⁺-клеток по отношению к rhIL-10, то есть дает значение около 1, такое как 0,8-1,2, при концентрации вещества или пептида 10 нг/мл, то это вещество или пептид входит в объем настоящего изобретения.

Супрессию хемотаксического ответа CD⁴⁺-T-лимфoцитoв человека по отношению к IL-8 тестировали, как показано в Примере 6, с использованием синтезированного вещества или пептида вместо IT9302. Если добавление вещества или пептида к суспензии СD⁴⁺-Т-лимфоцитов человека приводит, в основном, к полному ингибированию ответа СD⁴⁺-клеток по отношению к IL-8, то есть дает величину около 1, такую как 0,8-1,2 при концентрации вещества или пептида 10 нг/мл, то это вещество или пептид входит в объем настоящего изобретения.

Супрессию хемотаксического ответа моноцитов человека по отношению к MCAF/MCP-1 тестировали, как показано в Примере 1, с использованием синтезированного вещества или пептида вместо IT9302. Если добавление вещества или пептида к суспензии моноцитов человека приводит, в основном, к полному ингибированию хемотаксического ответа моноцитов по отношению к MCAF/MCP-1, то есть дает величину около 1, такую как 0,8-1,2 при концентрации вещества или пептида 10 нг/мл, то это вещество или пептид входит в объем настоящего изобретения.

Ингибирование экспрессии молекул МНС класса II на IFN-стимулированных моноцитах человека тестировали, как показано в Примере 8, с использованием вещества или пептида вместо IT9302. IFN осуществляет позитивную регуляцию экспресии антигена МНС класса II в клеточной популяции на уровне от 36,8 до 58,4%, и эта стимуляция блокирует или осуществляет негативную регуляцию до уровня 25,2% при концентрации 10 нг/мл rhIL-10 и до уровня 31,2% при концентрации 1 нг/мл IT9302. Если данное вещество или пептид блокирует или осуществляет негативную регуляцию экспрессии МНС класса II на моноцитах до нестимулируемого уровня при добавлении этого вещества в количестве 1-10 нг/мл, то указанное вещество или пептид входит в объем настоящего изобретения.

Если добавление данного вещества или пептида приводит к блокированию эффекта стимуляции IFN при концентрации этого вещества или пептида 10 нг/мл, то указанное вещество или пептид входит в объем настоящего изобретения.

Индуцирование продуцирования IL-4 культивированными нормальными CD⁴⁺-T-клeткaми человека тестировали, как показано в Примере 9, с использованием синтезированного вещества или пептида вместо IT9302. Если добавление данного вещества или пептида индуцирует продуцирование IL-4 в CD⁴⁺-T-лимфoцитax при концентрации вещества или пептида 10 нг/мл, то это вещество или пептид входит в объем настоящего изобретения.

Снижение продуцировния TNF в реакции смешанной культуры лейкоцитов тестировали, как описано в Примере 10, с использованием синтезированного вещества или пептида вместо IT9302. Если добавление данного вещества или пептида приводит к значительному снижению продуцировния TNF в реакции смешанной культуры лейкоцитов в течение 24 часов при концентрации вещества или пептида 10 нг/мл, то это вещество или пептид входит в объем настоящего изобретения.

Негативную регуляцию продуцирования TNF и IL-8 в кроличьей модели острого панкреатита, индуцированного желчной кислотой, и снижение уровня нейтрофильной инфильтрации в легких обработанных кроликов тестировали, как описано в Примере 14, с использованием синтезированного вещества или пептида вместо IT9302. Если добавление данного вещества или пептида при концентрации 100 мкг/кг приводит к значительному снижению смертности испытуемых животных, то это вещество или пептид входит в объем настоящего изобретения.

Таким образом, в одном из важных вариантов своего осуществления настоящее изобретение относится к полипептиду, в котором, по крайней мере, один аминокислотный остаток заменен другим аминокислотным остатком, и/или в котором, по крайней мере, один аминокислотный остаток был делегирован или добавлен так, чтобы полученный в результате этого полипептид содержал аминокислотную последовательность или подпоследовательность, включающую указанную аминокислотную последовательность, определенную ниже, и при этом чтобы он в основном обладал hIL-10-агонистической активностью, определенной выше.

Аналоги синтетических пептидов могут быть также получены путем замены отдельных остатков синтетическими или редкими аминокислотами. Последовательности биологически активных пептидов происходят от белков, которые состоят из двадцати природных L-аминокислотных остатков. Однако способ химического синтеза, используемый для конструирования синтетических пептидов, предусматривает замену альтернативными остатками, включая D-аминокислоты, -аминокислоты, N-замещенные аминокислоты, редко встречающиеся природные аминокислоты, или не встречающиеся в природе синтетические аналоги аминокислот [93] . Неограничивающими примерами аминокислот, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются следующие аминокислоты: Aad 2-Аминоадипиновая кислота bAad 3-Аминоадипиновая кислота bAla бета-Аланин, бета-аминопропионовая кислота Abu 2-Аминомасляная кислота 4Abu 4-Аминомасляная кислота, пиперидиновая кислота Аср 6-Аминокапроновая кислота Ahe 2-Аминогептановая кислота Aib 2-Аминоизомасляная кислота bAib 2-Аминоизомасляная кислота Аpm 2-Аминопимелиновая кислота Dbu 2,4-Диаминомасляная кислота Des Десмозин Dpm 2,2'-Диаминопимелиновая кислота Dpr 2,3-Диаминопропионовая кислота EtGly N-Этилглицин EtAsn N-Этиласпарагин Hyl Гидроксилизин aHyl алло-Гидроксилизин 3Нyр 3-Гидроксипролин 4Hyp 4-Гидроксипролин Ide Изодесмозин alle алло-Изолейцин MeGly N-Метилглицин, саркозин Melle N-Метилизолейцин MeLys 6-N-Mетиллизин MeVal N-Метилвалин Nva Норвалин Nle Норлейцин Orn Орнитин Другие и неограничивающие примеры редко встречающихся и не встречающихся в природе аминокислот или сконструированных блоков перечислены в следующих работах: Novabiochem 1994/95 Catalog (Calbiochem-Novabiochem AG, Weidenmattweg 4, CH-4448 /Switzerland), pp. 65-125; Bachem Feinkemikalien AG 1995 Catalog (Bachem Feinkemikalien AG, Haupstrasse 144, CH-4416 Budendorf/Switzerland), pp. 753-831; Neosystem Laboratoire Catalogue 1997/98 (Neosystem Laboratoire, 7 rue de Boulogne, 67100 Strasbourg, France) pp. 131-176.

Вышеописанные альтернативные остатки могут быть использованы (а) для замены химически реакционноспособных остатков и повышения стабильности синтетического пептида в отношении, например, ферментативной и протеолитической деградации; (b) для включения аналитической метки, используемой при детекции синтетического пептида; и (с) для модуляции биологической активности синтетического пептида путем повышения или снижения аффиности связывания пептида с рецептором IL-10, например, путем введения конформационных затруднений, которые ограничивают свободу вращения для специфических химических связей.

В объем настоящего изобретения также входят вещества, в которых один или несколько остатков Thr, Lys или Arg в вышеуказанной формуле заменены не встречающимися в природе или редкими аминокислотами, перечисленными выше. Если это не оговорено особо, то все полипептидные последовательности, упомянутые в настоящем описании и в формуле изобретения, считываются от N-конца к С-концу в стандартном формате.

Для синтеза пептидов и их аналогов был выбран метод твердофазного пептидного синтеза (ТФПС). Этот метод был предложен Merrifield (100) в 1963 г., и с использованием этой техники было синтезировано множество пептидов. Прекрасный обзор современных методов химического синтеза пептидов и белков представлен в работе S.B.H. Kent [101].

На практике синтез пептидов проводят постадийно методом ТФПС. С-концевую аминокислоту в N-альфа-защищенной форме (если необходимо получить защищенное по боковой цепи реакционноспособное производное) ковалентно связывают либо непосредственно, либо посредством подходящего линкера с твердым носителем, например полимерной смолой, которая набухает в органическом растворителе. Затем N-альфа-защитную группу удаляют и постадийно присоединяют последующие защищенные аминокислоты в соответствии с нужной последовательностью.

После синтеза полной пептидной цепи защитные группы для боковой цепи удаляют и пептид отщепляют от смолы, что может быть сделано одновременно или отдельными стадиями.

Из нескольких различных стратегий синтеза, разрабатывавшихся в течение многих лет, в настоящее время в основном применяются два способа, которые основаны на использовании различных N-альфа-защитных групп и соответствующих защитных групп для боковых цепей. Merrifield использовал в качестве N-альфа-защитной группы трет-бутилоксикарбонил (Воc), a Caprino и Han [102] вводили 9-флуоренилметоксикарбонил (Fmoc). Практическое применение этих двух методик, включая выбор твердых носителей, защитных групп для боковых цепей, процедуры активации, процедуры отщепления, оборудование, а также аналитическую технику и мониторинг, описано в нескольких монографиях, из которых могут быть упомянуты следующие: Stewart & Young [103], Atherton & Sheppard [104], и Pennington & Dunn [105]. Пептиды настоящего изобретения и их аналоги с редкими или не встречающимися в природе аминокислотами были в основном синтезированы в соответствии с вышеуказанными схемами синтеза.

Аналоги синтетических линейных пептидов могут быть получены путем химической трансформации структур в циклическую форму. Циклизация линейных пептидов может способствовать модуляции биологической активности путем усиления или снижения аффинности связывания пептида с белком-мишенью [94]. Линейные пептиды очень пластичны и способны принимать множество различных конформаций в растворе. Циклизация приводит к ограничению ряда имеющихся конформаций и тем самым благоприятствует более активным или неактивным структурам пептида. Иммуногенность синтетических пептидов коррелирует с экспериментально наблюдаемыми конформационными предпочтениями в растворе [95]. Различия в иммуногенности могут указывать на различия в аффинности связывания специфических антител для циклических пептидов.

Циклизацию линейных пептидов осуществляют либо путем образования пептидной связи между свободными N- и С-концами (гомодетные циклопептиды) или путем образования новой ковалентной связи между аминокислотным остовом и/или боковыми группами (гетеродетные циклопептиды) [93]. Последний способ циклизации предусматривает использование альтернативных химических стратегий для образования ковалентных связей, например дисульфидов, лактонов (оба они также присутствуют в природных пептидах), эфиров или тиоэфиров. Линейные пептиды, состоящие из более чем пяти остатков, могут быть циклизованы относительно легко. Способность пептида к образованию бета-конформации в центральных четырех остатках облегчает образование как гомо-, так и гетеродетных циклопептидов. Присутствие пролиновых или глициновых остатков у N- или С-концов также облегчает образование циклопептидов, особенно из линейных пептидов, которые имеют длину менее чем 6 остатков.

Примеры способов образования дисульфидных связей и проведения других реакций циклизации пептидов приводятся в работе Pennington & Dunn [105], в главе 7 и 11.

Технология конструирования псевдопептидов была разработана для получения молекулярных имитаторов пептидов. Возможность успешного конструирования таких молекул зависит от знания свойств линейной пептидной последовательности и конформации, в которой она презентируется рецептору IL-10. Благодаря синтезу имитаторов можно получить вещества, обладающие лучшей биологической активностью, повышенной растворимостью и стабильностью [96].

В качестве примера могут служить нижеследующие псевдопептиды, которые были получены на основе -спиральных матриц в имитаторах С-концевого пептида цитокинов, описанных в патенте США 5446128 [97], с учетом того известного факта, что С-конец IL-10 существует в форме x-спирали [98].

При присоединении этой небольшой молекулы у N-конца пептида -спиральная структура синтетического пептида стабилизируется, и этот пептид становится более устойчивым к протеолитическому расщеплению. Другие псевдопептиды могут быть получены исходя из описания, приведенного в патенте США 5445128. Такие вещества, где были сделаны замены в других остатках, а не в X₁ и/или были сделаны замены молекулами, отличающимися от N-концевой молекулы, показанной в вышеуказанной формуле, входят в объем настоящего изобретен