Полипептид тромбопоэтин (тро), днк, кодирующая полипептид тро (варианты), способ получения полипептида (варианты), фармацевтическая композиция, способ лечения (варианты), антитело к полипептиду тро

Полипептид тромбопоэтин (тро), днк, кодирующая полипептид тро (варианты), способ получения полипептида (варианты), фармацевтическая композиция, способ лечения (варианты), антитело к полипептиду тро

Реферат

 

Изобретение касается генной инженерии. Полипептид тромбопоэтин (ТРО) имеет биологическую активность специфического стимулирования или увеличения образования тромбоцитов. Аминокислотная последовательность приведена в описании. ДНК, кодирующая полипептид ТРО с аминокислотной последовательностью, приведенной в описании. Полипептид ТРО получают экспрессией его в подходящем хозяине и последующим выделением. Фармкомпозиция для лечения связанных с тромбоцитами нарушений включает эффективное количество полипептида ТРО и приемлемый носитель. Фармкомпозицию вводят субъекту в эффективном количестве для лечения нарушений, связанных с тромбоцитами, например, тромбоцитопении. Проводят иммунизацию животного полипептидом ТРО и выделяют антитело к этому полипептиду. Изобретение позволяет осуществлять эффективное лечение нарушений, связанных с тромбоцитами. 12 с. и 22 з.п. ф-лы, 34 ил., 19 табл.

Эта заявка является частичным продолжением U.S. Patent Application Serial (неизвестен), поданной 31 января 1995, ожидающей решения, которая является частичным продолжением U.S. Patent Application Serial 08/361811, поданной 22 декабря 1994, ожидающей решения, которая является частичным продолжением U. S. Patent Application Serial N 08/320300, поданной 11 октября 1994, ожидающей решения, которая является частичным продолжением U.S. Patent Application Serial 08/278083, поданной 20 июля 1994, ожидающей решения, которая является частичным продолжением U. S. Patent Application Serial 08/221020, поданной 1 апреля 1994, отозванной, которая является частичным продолжением U. S. Patent Application Serial 08/212164, поданной 14 марта 1994, в настоящее время отозванной.

Область изобретения Данное изобретение касается нового белка, имеющего активность специфического стимулирования или увеличения образования тромбоцитов in vivo или усиления пролиферации и дифференциации клеток-предшественников мегакариоцитов, последовательности ДНК, кодирующей этот белок, и способа его получения.

Предпосылки изобретения Мегакариоциты представляют собой большие богатые цитоплазмой многоядерные клетки, которые продуцируют тромбоциты и могут быть обнаружены в основном в костном мозгу. Мегакариоциты происходят из плюрипотентных гемопоэтических (кроветворных) стволовых клеток в костном мозгу. Примитивная плюрипотентная стволовая клетка дифференцируется до некоторой степени в клетки-предшественники мегакариоцитов, которые дают начало ряду поколений мегакариоцитов. Клетки-предшественники мегакариоцитов размножаются и дифференцируются в мегакариоциты. Затем мегакариоциты подвергаются полиплоидизации и цитоплазматическому созреванию и в конце концов выделяют их безъядерные цитоплазматические фрагменты, а именно, тромбоциты, в кровообращение. В среднем из одного зрелого мегакариоцита образуются 2-4 тысячи тромбоцитов. Хотя механизм образования тромбоцитов во многих отношениях пока неясен, считают, что мегакариоциты обычно локализованы на белковой поверхности эндотелия синуса в костном мозгу и производят цитоплазматические отростки, распространяющиеся в синусоид, где происходит фрагментация тромбоцитов.

Имеется много неясных моментов относительно механизма образования тромбоцитов, хотя возможно, что мегакариоциты присутствуют локально в дермальном слое оболочки венозного синуса костного мозга и что цитоплазма проходит через дермальную оболочку, образуя струноподобный выступ на внутренней стенке венозного синуса, в результате чего происходит выбрасывание тромбоцитов.

Высказывалось предположение, что имеется специфическая функция для образования и регулирования образования тромбоцитов в гемопоэзе мегакариоцитов. В здоровых людях и животных сохраняется количество эффективных тромбоцитов, хотя известно, что при введении антител к тромбоцитам здоровым животным, например, количество тромбоцитов резко уменьшается, затем их количество временно увеличивается до уровня, более высокого, чем обычный уровень, и наконец они возвращаются к нормальному уровню. Также в области клиники известно, что уменьшение в числе тромбоцитов (тромбоцитопения) или увеличение в числе тромбоцитов (тромбоцитоз) наблюдаются даже при нормальных количествах эритроцитов и лейкоцитов.

Иногда наиболее важной функцией тромбоцита является образование тромба в гемостатическом (кровоостанавливающем) механизме. Если гемостатический механизм не функционирует должным образом вследствие уменьшения числа тромбоцитов, образуется тенденция в направлении возникновения гемостаза.

Было высказано предположение о наличии специфического регуляторного механизма мегакариоцитопоэза и тромбопоэза. Тромбоциты поддерживаются в эффективных количествах в здоровых людях и нормальных животных. Однако известно, что при введении антител к тромбоцитам нормальному животному количество тромбоцитов резко уменьшается в течение короткого периода времени, после этого начинает увеличиваться и временно превышает нормальный уровень, однако в конце концов возвращается к нормальному уровню. Известно, что в клинической области, уменьшение в числе тромбоцитов (тромбоцитопения) или увеличение в их числе (тромбоцитоз) происходят даже при нормальных количествах эритроцитов и лейкоцитов. Однако до настоящего времени не было сообщений об успехе в выделении и идентификации специфического регуляторного фактора, участвующего в образовании тромбоцитов (например, подобного эритропоэтину в образовании эритроцитов).

Наиболее важной функцией тромбоцитов является образование сгустка крови в гемостатическом (кровоостанавливающем) механизме. Склонность к кровотечению имеет место, когда нормальная функция гемостатического механизма нарушена тромбоцитопенией. В области лучевой терапии и химиотерапии раковых опухолей тромбоцитопения, вызванная угнетением костного мозга, является летальным осложнением, и для предотвращения склонности к кровотечению таким больным делают трансфузию тромбоцитов. Трансфузию тромбоцитов применяют также после пересадки костного мозга или гипопластической анемии.

Тромбоциты для применения в такой трансфузии готовят тромбоцитофорезом из крови здоровых доноров крови, однако такие тромбоциты для применения в трансфузии имеют короткий срок хранения и могут быть загрязнены бактериальной инфекцией. Трансфузия тромбоцитов представляет собой возможную опасность попадания в больных опасных вирусов, таких как вирус иммунодефицита человека (Н IV) или различные вирусы гепатита, опасность образования антител, специфических для антигена главного комплекса гистосовместимости (Н L А) переливаемых тромбоцитов или возникновения реакции "трансплантат против хозяина" (GVHD), обусловленной примесью лимфоцитов в тромбоцитах, применяемых для трансфузии.

Вследствие этого будет очень полезно, если в больных тромбоцитопенией можно будет стимулировать внутреннее образование тромбоцитов и в то же время можно будет снизить их зависимость от трансфузии тромбоцитов. Кроме того, если тромбоцитопению в раковых больных можно будет корректировать или предотвращать, такие обработки могут проводиться более безопасно, интенсивность лечения может быть повышена и можно будет ожидать дальнейшего улучшения противоракового действия.

В силу этих причин проводился ряд интенсивных исследований по выделению и идентификации специфических регуляторных факторов, участвующих в регуляции образования мегакариоцитов и тромбоцитов. Согласно исследованиям in vitro, регуляторные факторы, управляющие мегакариоцитопоэзом, грубо разделены на следующие два фактора (см. Williams et al., J, Cell Physiol., vol. 110, pp. 101-104, 1982). Колониестимулирующий фактор мегакариоцитов (Мeg-CSF) является регуляторным фактором, стимулирующим пролиферацию и дифференцировку CFU-MК с образованием колоний мегакариоцитов в полутвердой культуральной среде. Другой регуляторный фактор, называемый фактором потенциирования мегакариоцитов (Meg-Pot), фактором стимуляции мегакариоцитов, фактором стимуляции тромбоцитопоэза или т.п., действует главным образом на незрелые или зрелые мегакариоциты, усиливая их дифференцировку и созревание. Мeg-Pot обнаруживают в комбинации с Мeg-CSF - активностью в некоторых случаях. Кроме того, поскольку количества тромбоцитов увеличивались при введении сыворотки или плазмы, взятой из экспериментально индуцированных животных с тромбоцитопенией, другим нормальным животным, было сделано предположение, что существует гуморальный фактор, названный тромбоэтином (ТРО), способный усиливать образование тромбоцитов in vivo.

В последние годы некоторые цитокины, гены которых были клонированы, испытывались на их способность стимулировать мегакариоцитопоэз и тромбоцитопоэз. Человеческий IL-3 стимулировал образование колоний мегакариоцитов человека (Bruno et al., Exp. Hematol., vol.16, pp.371-377, 1988) и, по меньшей мере в обезьянах, увеличивая число тромбоцитов (Donahue et al., Science, vol. 241, p. 1820, 1988). Однако, поскольку IL-3 является фактором, действующим на пролиферацию и дифференцировку всех гематопоэтических клеток, его следует отличать от специфических регуляторных факторов, регулирующих мегакариоцитопоэз и образование тромбоцитов. Человеческий IL-6 не обнаружил Мeg-CSF активности, но действовал на незрелые мегакариоциты и затем усиливал их дифференцировку в зрелые мегакариоциты (Williams et al., Exp. Hematol., vol 18, p.69, 1990). Введение in vivo IL-6 индуцировало образование тромбоцитов и усиливало созревание и вызывало сдвиг в сторону более высокой плоидности мегакариоцитов костного мозга в приматах, но также вызвало побочные действия, такие как снижение массы тела, индукция белка острой фазы (Asano et al. , Blood, vol. 78, pp. 1467-1475, 1991). IL-11 человека не обнаружил Мeg-CSF активности, но проявлял Meg-Pot активность и усиливал образование тромбоцитов в мышах (Neben et al., Blood, vol. 81, pp. 901-908, 1993). Кроме того, LIF (ингибитор миграции лимфоцитов) человека значительно увеличивал количества тромбоцитов в приматах (Мауеr et al., Blood, vol. 81, pp.3226-3233, 1993), однако его действие in vitro на мегакариоциты было слабым (Burstein et al., J, Cell. Physiol., vol. 153, pp. 305-312, 1992).

Хотя можно ожидать клинического применения этих цитокинов в качестве факторов увеличения тромбоцитов, их функции не являются специфическими для ряда поколений мегакариоцитов и они вызывают побочные действия. Поэтому требовалось нахождение увеличивающего количество тромбоцитов фактора, который является специфическим для системы мегакариоцит-тромбоцит и вызывает меньшие побочные эффекты, для клинического применения.

Meg-CSF, Meg-Pot или ТРО активность была обнаружена в сыворотке, плазме или моче больных тромбоцитопенией или животных или в культуральном супернатанте некоторых культивируемых линий клеток человека. Однако в настоящее время неизвестно, обусловлены эти активности присутствием одного фактора или комбинацией нескольких факторов и отличаются ли они от известных цитокинов.

Hoffman et al. обнаружили, что сыворотки больных с гипопластической анемией и амегакариоцитной тромбоцитопенической пурпурой содержали Meg-CSF активность, которая значительно увеличивала образование колоний мегакариоцитов человека (Hoffman et al., N. Eng. J. Med., vol. 305, pp. 533-538, 1981). После этого Mazur et аl. сообщили, что Мeg-CSF активность присутствует в сыворотке больных с апластической анемией и она отличается как от IL-3, так и от GМ-CSF (Мazur et al., Blood, vol.76, pp.290-297, 1990). Сходная Мeg-CSF активность была найдена в сыворотках раковых больных, получивших интенсивную цитотоксическую химиотерапию, и больных с пересадкой костного мозга (Mazur et al. , Exp. Hematol., vol.12, pp.624-628, 1984; de Alarcon and Schmieder, Prog. Clin. Bio. Res., vol.215, pp.335-340, 1986).

Hoffman et al. сообщили, что Meg-CSF со средней мол. массой 46000 был очищен из плазмы больных с гипомегакариоцитной тромбоцитопенией (Hoffman et al. J. Clin. Invest.,vol 75, pp. 1174-1182, 1985), но дальнейшие исследования показали, что этот материал не был такого уровня чистоты, который позволил бы точное аминокислотное секвенирование (Hoffman, Blood, vol. 74, pp. 1196-1212, 1989). Вещество, имеющее ТРО-подобную активность, которое усиливало включение ⁷⁵Se-селенометионина во вновь образующиеся тромбоциты в мышах, было частично очищено из плазмы тромбоцитопенических больных или мочи больных идиопатической тромбоцитопенической пурпурой (неясного происхождения) (1ТР). Средняя мол. масса полученного из плазмы фактора была 40000 (Grossi et al., Hematologica, vol. 72, pp. 291-295, 1987; Vannucchi et al., Leukemia, vol.2, pp. 236-240, 1988).

Meg-CSF и ТРО-подобная активности были обнаружены также в пробах мочи больных с апластической анемией и тяжелой ITP (Kawakita et al., Br. J. Haematol. , vol. 48, pp. 609-615, 1981; Kawakita et al., Blood, vol. 556-560, 1983). Kawakita et al. сообщили также, что Meg-CSF активность, обнаруженная в экстракте мочи больных с апластической анемией, обнаружила среднюю мол. массу 45000, определенную гель-фильтрацией при диссоциирующих условиях (Kawakita et al. , Br. J. Haematol., vol.62, pp.715-722, 1986). Erikson-Miller et al. также сообщили об очистке Meg-CSF из подобных проб мочи, однако не дали информации о его структуре (Erikson-Miller et al., "Blood Cell Growth Factors: their present and future use in hematology and oncology" ed. by Murphy, AlphaMed Press, Dayton, Ohio, pp.204-220, 1992). Turner et al. очистили фактор стимуляции мегакариоцитов (MSF), имеющий Meg-CSF активность, из мочи больных с пересаженным костным мозгом и клонировали его ген (Turner et al., Blood, vol.78, p.1106, 279a, 1991, (abstr., Suppl.1)). Этот MSF имеет мол. массу 28000-35000. Идентичность этого фактора с Meg-CSF, обнаруженного до сих пор в пробах сыворотки и плазмы тромбоцитопенических больных, и его активность в увеличении числа тромбоцитов еще должны быть выяснены.

Вещество, имеющее ТРО-подобную активность с мол. массой 32000, было очищено из культурального супернатанта линии эмбриональных почечных клеток человека (НЕК клетки) и его биологические и биохимические свойства интенсивно исследовались, однако его структура пока неизвестна (McDonald et al., J. Lab. Clin. Hed. , vol. 106, pp. 162-174, 1985; McDonald, Int. J. Cell Cloning, vol. 7, pp. 139-155, 1989). Другие исследователи, напротив, сообщали, что основная активность в кондиционированной среде НЕК клеток, которая усиливает созревание мегакариоцитов in vitro, обусловлена известными цитокинами, а именно, IL-6 и ЕРО (withy et аl., J., Cell. Physiol., vol. 15, pp. 362-372, 1992).

Что касается полученных из животных факторов, Evatt et al. сообщали, что ТРО-подобная активность, усиливающая включение ⁷⁵Se-селенометионина во вновь образующиеся тромбоциты в кроликах и мышах, была обнаружена в плазме тромоцитопенических кроликов, индуцированных инъекцией сыворотки против тромбоцитов (Evatt et al., J. Lab. Clin. Med., vol. 83, pp. 364-371, 1974). В дополнение к этому, ряд подобных исследований были опубликованы с 60-х по 70-е годы (например, Оdell et al., Proc. Soc. Biol. Med., vol. 108, pp. 428-431, 1961; Evatt and Levin, J. Clin. Invest., vol. 48, pp. 1615-1626; Harker, Am. J. Physiol., vol. 218, pp. 1376-1380, 1970; Shreiner and Levin. J. Clin, Invest, vol.49, pp.1709-1713, 1970; and Penington, Br. Med. J. vol. 1, pp.606-608, 1970). Evatt et аl., и Hill и Levin провели частичную очистку ТРО-подобной активности из плазмы тромбоцитопенических кроликов (Evatt et al., Blood, vol.54, pp.377-388, 1979; Hill and Levin, Exp. Hematol., vol.14, pp.752-759, 1986).

После этого очистка этого фактора была продолжена, была проверена активность в усилении дифференцировки и созревания мегакариоцитов in vitro, a именно, Meg-Pot активность, было обнаружено, что средняя мол. масса была 40000-46000, определенная гель-фильтрацией (Kеllеr et al., Exp. Hematol., vol. 16, pp.262-267, 1988; Hill et al., Exp. Hematol., vol.20, pp. 354-360, 1992). Поскольку IL-6 активность не обнаруживалась в плазме кроликов с тяжелой острой тромбоцитопенией, индуцированной введением антисыворотки против тромбоцитов, было высказано предположение, что эта ТРО-подобная активность обусловлена фактором, иным, чем IL-6 (Hill et аl., Вlооd, vol. 80, pp. 346-351, 1992).

Tayrien Rosenberg также очистили фактор, имеющий среднюю мол. массу 15000, из плазмы тромбоцитопенических кроликов и культурального супернатанта НЕК клеток, который стимулирует образование фактора 4 тромбоцитов в линии мегакариоцитных клеток крыс, однако не сообщили информации о его структуре (Tayrien and Rosenberg, J. Biol., vol.262, pp. 3262-3268, 1987).

Кроме того, Nakeff обнаружил Мeg-CSF активность в сыворотке тромбоцитопенических мышей, индуцированных введением антисыворотки против тромбоцитов (Nakeff, "Experimental Неmаtology Today" ed. by Baum and Ledney, Springer-Verlag, NY, pp. 111-123, 1977). С другой стороны, сыворотки из тромбоцитопенических кроликов усиливали созревание мегакариоцитов (Keller et al., Exp. hematol., vol.16, pp.262-267, 1988; Hill et al., Exp. Hematol., vol.17, pp.903-907, 1989) и стимулировали морфологическое изменение мегакариоцитов в тромбоциты (Leven and Yee, Blood, vol.69, pp. 1046-1052, 1989), но не имели детектируемой Meg-CSF активности.

Miura et al. обнаружили Meg-CSF активность в плазме крыс, ставших тромбоцитопеническими под влиянием сублетального облучения всего тела (Miura et al. , Blood, vol. 63, pp. 1060-1066, 1984), и предположили, что индукция Мeg-CSF активности in vivo связана с уменьшением мегакариоцитов, но не с уменьшением тромбоцитов, поскольку эта активность не изменялась при трансфузии тромбоцитов (Мiura et al. , Exp.Hematol vol. 16, pp. 139-144, 1988), Mazur и South обнаружили Мef-CSF активность в сыворотке облученных сублетально собак и сообщили, что этот фактор имеет среднюю мол. массу 175000 при измерении гель-фильтрацией (Мazur and South, Exp.Hematol., vol. 13, pp. 1164-1172, 1985). В дополнение к вышеизложенному, факторы, полученные из сыворотки, плазмы и мочи, сообщались другими исследователями, например, Straneva et al. , (Straneva et al., Exp. Hematol., vol.15, pp. 657-663, 1987).

Таким образом, как описано выше, различные активности, стимулирующие мегакариоцитопоэз и тромбоцитопоэз, были обнаружены в биологических пробах, полученных из тромбоцитопенических больных и животных, но выделение этих факторов, их биохимическая и биологическая идентификация и определение их свойств не были достигнуты вследствие их чрезвычайно малых количеств в природных источниках, таких как кровь и моча.

Краткое изложение существа изобретения Целями данного изобретения являются выделение белка ТРО из природных источников и его идентификация, причем белок ТРО обладает активностью стимулирования или увеличения образования тромбоцитов in vivo и/или усиления пролиферации и дифференцировки клеток-предшественников мегакариоцитов (далее называемой "ТРО активностью"), и выделение гена, кодирующего белок ТРО, и обеспечение способа получения этого белка в гомогенном виде и в большом количестве технологией рекомбинантных ДНК. Успех в достижении этих целей приведет к замене или снижению частоты применяемой в настоящее время трансфузии тромбоцитов, и такой новый белок будет также применен для лечения и диагностики нарушений, связанных с тромбоцитами.

Таким образом, данное изобретение касается (i) очищенной и выделенной последовательности ДНК, кодирующей белок с ТРО активностью, выбранной из группы, состоящей из: (а) последовательностей ДНК, показанных в SEQ ID 194, 195 и 196, или их комплементарных цепей, и (b) последовательностей ДНК, гибридизующихся при строгих условиях с последовательностями ДНК п.(а), или их фрагментов, и (с) последовательностей ДНК, которые гибридизовались бы с последовательностями ДНК пунктов (а) и (в), если бы не вырожденность генетического кода, (ii) способа получения белка с ТРО активностью, предусматривающего стадии: выращивание при подходящих условиях питания прокариотических или эукариотических клеток хозяина, трансформированных для трансфицированных указанной последовательностью ДНК таким образом, чтобы была возможна экспрессия данного белка, и выделение целевого белкового продукта, полученного экспрессией указанной последовательности ДНК, и (iii) белкового продукта, полученного экспрессией в прокариотической или эукариотической клетке хозяина указанной последовательности ДНК.

Кроме того, данное изобретение касается фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество белка с ТРО активностью, и способа лечения связанных с тромбоцитами нарушений, в частности, тромбоцитопении, предусматривающего введение указанного белка больным с такими нарушениями.

Краткое описание чертежей Фиг. 1 показывает Sephacryl S-200HR гель-фильтрационную хроматографию на Phenyl Sepharose 6 FF/LS F2, полученной из XRP.

Фиг.2 показывает Capcell Pak C1 хроматографию с обращенной фазой УМС-pack CN-AP ТРО-активной фракции, полученной из пробы низкомолекулярного ТРО (Sephacryl S-200HR F3) XRP.

Фиг. 3 показывает анализ в ПААГ-ДСН (SDS-PAGE) Capcell Раk C1 ТРО-активной фракции (PA) из пробы низкомолекулярного ТРО XRP.

Фиг.4 показывает пептидные карты на C18 HPLC с обращенной фазой крысиного ТРО, выделенного электрофорезом в ПААГ-ДСН (SDS-PAGE). Пептидные фрагменты были получены систематическим гидролизом с применением трех протеаз.

Фиг. 5 показывает ТРО активность, полученную из XRP в крысиной тест-системе CFU-MK.

Фиг.6 показывает конструирование экспрессирующего вектора pEF18S.

Фиг. 7 показывает ТРО активность в культуральном супернатанте COSI клеток, в которые был введен pEF18S-A2, в крысиной тест-системе CFU-MK.

Фиг. 8 показывает ТРО активность в культуральном супернатанте COS1 клеток, в которые был введен pEF18S-HL34, в крысиной тест-системе CFU-MK.

Фиг. 9 показывает ТРО активность в культуральном супернатанте COS1 клеток, в которые был введен pHT1-231, в крысиной тест-системе CFU-MK.

Фиг.10а показывает ТРО активность в культуральном супернатанте COS1 клеток, в которые был введен pHTF1 в крысиной тест-системе CFU-MK.

Фиг.10b показывает ТРО активность в культуральном супернатанте COS1 клеток, в которые был введен pHTF1, в тест-системе M-07е.

Фиг. 11 показывает рестрикционную карту клона НGT1 и конструкцию pHGT1 pEFHGTE.

(E:EcoR1, H: Hind 111, S; Sal1) Фиг.12а показывает ТРО активность в культуральном супернатанте COS1 клеток, в которые был введен pEFHGTE, в крысиной тест-системе CFU-MK.

Фиг.12b показывает ТРО активность в культуральном супернатанте COS1 клеток, в которые был введен pEFHFTE, в тест-системе М-07е.

Фиг.13а показывает ТРО активность в культуральном супернатанте COS1 клеток, в которые был введен pHT1-211 1, pHT1-191 1 или pHT1-171 2, в крысиной тест-системе CFU-МК.

Фиг.13b показывает ТРО активность в культуральном супернатанте COS1 клеток, в которые был введен pHT1-163 2, в крысиной тест-системе CFU-МK.

Фиг. 14 показывает ТРО активность в культуральном супернатанте COS1 клеток, в которые был введен pHT1-211 1, pHT1-191 1, pHT1-171 2 или pHT1-163 2, в тест-системе М-07е.

Фиг. 15 является хроматограммой, полученной хроматографией с обращенной фазой (колонка Vydac), для очистки человеческого ТРО из культурального супернатанта СНО клеток, в которые был введен вектор pDEF202-hTPO-P1, экспрессировавший ТРО.

Фиг. 16 является фотографией, показывающей разделение в SDS-PAGE (ПААГ-ДСН) человеческого ТРО, очищенного из культурального супернатанта СНО клеток, в которые вводили pDEF2020 hTPO-P1 и давали экспрессироваться ТРО.

Фиг. 17 является хроматограммой, полученной хроматографией с обращенной фазой для очистки человеческого ТРО из E.coli, в которую вводили pCFM536/h 6T(1-163) для экспрессии ТРО.

Фиг. 18 является фотографией, показывающей разделение в SDS-PAGE (ПААГ-ДСН) варианта человеческого ТРО (1-163), выделенного очищенного из Е.соli, в которую вводили рСFМ536/h6Т (1-163) и позволяли экспрессироваться ТРО.

Фиг. 19 показывает рисунок элюции hТРO163 на колонке Superdex 75 рg в связи с очисткой hTРО 163 из культурального супернатанта в качестве исходного материала, полученного трансфекцией экспрессирующей человеческий ТРО плазмиды pDEF202 hTРO163 в СНО клетки. Количество белка определяли при 220 нм.

Фиг.20 показывает анализ SDS-PAGE стандартного рТРО163, элюированного из колонки Superdex 75 pg, при очистке hТРO163 из культурального супернатанта в качестве исходного материала, полученного трансфекцией экспрессирующей человеческий ТРО плазмиды pDEF202-hTPO163 в СНО клетки. Белок hTPO163 окрашивали серебром на геле.

Фиг.21 показывает структуру экспрессирующего вектора pSMT201.

Фиг. 22 показывает график, изображающий ТРО активность, определенную тестом М-07е, в культуральном супернатанте COS7 клеток, в которые вводили GL-TPO, 3/ТРО или 09/ТРО и затем в них происходила экспрессия.

Фиг. 23 является графиком, изображающим ТРО активность, определенную тестом М-07e, в супернатанте культур COS7 клеток, в которые вводили производное с инсерцией или делецией человеческого ТРО, после чего проводили экспрессию.

Фиг.24 показывает увеличенное число тромбоцитов в мышах, которым вводили ТРО при помощи внутривенной и подкожной инъекций.

Фиг.25 показывает зависимое от дозы увеличение числа тромбоцитов в мышах после подкожной инъекции ТРО.

Фиг. 26 показывает индуцированное ТРО увеличение числа тромбоцитов после обработки мышей 5-FU для индуцирования тромбоцитопении.

Фиг. 27 показывает индуцированное ТРО увеличение числа тромбоцитов после обработки мышей гидрохлоридом нимустина для индуцирования тромбоцитопении.

Фиг. 28 показывает индуцированное ТРО увеличение числа тромбоцитов после пересадки костного мозга.

Фиг. 29 показывает индуцированное ТРО увеличение числа тромбоцитов после облучения рентгеновскими лучами мышей для индуцирования тромбоцитопении.

Фиг. 30 показывает зависимое от дозы увеличение числа тромбоцитов после введения укороченного ТРО (аминокислоты 1-163 в SEQ 1D 6).

Фиг. 31 показывает увеличение числа тромбоцитов после введения укороченного ТРО (аминокислоты 1-63 в SEQ 1D 6) после введения гидрохлорида нимустина для индуцирования тромбоцитопении.

Фиг.32 показывает, что увеличение концентраций Мр1-Х, добавленного к системе культуры человеческих мегакариоцитов, приводит к увеличивающемуся блокированию развития мегакариоцитов.

Фиг. 33 представляет ТРО активность, определенную в тесте М-07е, производных ТРО [Met^-2, Lys^-1, Ala¹, Val³, Arg¹³³]- TPO(1-163), [Met^-2, Lys^-1, Ala¹, Val³, Pro¹⁴⁸] TPO(1-163) [Met^-2, Lys^-1, Ala¹, Val³, Arg¹¹⁵] TPO(1-163), экспрессированных в E.coli.

Фиг.34 описывает ТРО активность, определенную в тесте M-07e, производных ТРО [Met^-2, Lys^-1, Ala¹, Val³, Arg¹²⁹]- TPO(1-163), [Met^-2, Lys^-1, Ala¹, Val³, Arg¹⁴³] TPO(1-163), [Met^-2, Lys^-1, Ala¹, Val³, Leu⁸²] TPO(1-163), [Met^-2, Lys^-1, Ala¹, Val³, Leu¹⁴⁶] TPO(1-163) [Met^-2, Lys^-1, Ala¹, Val³, Arg⁵⁹] TPO(1-163), экспрессированных в E.coli.

Детальное описание изобретения Данное изобретение специфически обеспечило полипептиды тромбопоэтина (ТРО), имеющие биологическую активность специфического стимулирования или увеличения образования тромбоцитов и содержащие аминокислотную последовательность 1-332 SEQ 1D 6, или их производные. Приводимые в качестве иллюстрации полипептиды включают полипептиды, которые состоят из аминокислотных последовательностей 1-163 SEQ 1D 6, 1-232 SEQ 1D 6, 1-151 SEQ 1D 6, зрелую последовательность аминокислот SEQ 1D 2, 4 и 6, в том числе полипептиды, имеющие делетированные 1-6 аминокислот NН₂-конца. Дополнительные приводимые для иллюстрации полипептиды данного изобретения включают [Thr³³, Thr³³³, Ser³³⁴, Ile³³⁵, Gly³³⁶, Tyr³³⁷, Pro³³⁸, Tyr³³⁹, Asp³⁴⁰, Val³⁴¹, Pro³⁴², Asp³⁴³, Tyr²⁴⁴, Ala³⁴⁵, Gly³⁴⁶, Val³⁴⁷, His³⁴⁸, His³⁴⁹, His³⁵⁰, His³⁵¹, His³⁵², His³⁵³, ] TPO, [Asn²⁵, Lys²³¹, Thr³³³, Ser³³⁴, Ile³³⁵, Gly³³⁶, Tyr³³⁷, Pro³³⁸, Tyr³³⁹, Asp³⁴⁰, Val³⁴¹, Pro³⁴², Asp³⁴³, Tyr³⁴⁴, Ala³⁴⁵, Gly³⁴⁶, Val³⁴⁷, His³⁴⁸, His³⁴⁹, His³⁵⁰, His³⁵¹, His³⁵², His³⁵³] TPO, [Asn²⁵] TPO [Thr³³] TPO. Другие полипептиды этого изобретения включают производные TPO полипептиды [His³³] TPO(1-163), [Аrg¹¹⁷] ТРO(1-163), [Gly^116] TPO (1-163), [His³³, Thr³³', Рrо³⁴] TPO(1-163), [His³³, Ala³³', Pro³⁴] TPO(1-163), His³³, Gly³³', Pro³⁴, Ser³⁸] TPO(1-163), [Gly¹¹⁶, Asn¹¹⁶', Arg¹⁷⁷] TPO(1-163), [Gly¹¹⁶, Ala¹¹⁶', Arg¹⁷⁷] TPO(1-163), [Gly¹¹⁶, Gly¹¹⁶', Arg¹¹⁷] -TPO(1-163), [Ala¹, Val³, Arg¹²⁹] TPO(1-163), [Ala¹, Val³, Arg¹³³] -TPO(1-163), [Ala¹, Val³, Arg¹⁴³] TPO(1-163), [Ala¹, Val³, Leu⁸²] -TPO(1-163), [Ala¹, Val³, Leu¹⁴⁶] TPO(1-163), [Ala¹, Val³, Pro¹⁴⁸] -TPO(1-163), [Ala¹, Val³, Аrg⁵⁹] ТРО(1-163) и [Ala¹, Val³, Arg¹¹⁵] -TPO(1-163).

TPO полипептиды этого изобретения также включают такие полипептиды, которые ковалентно связаны с полимером, предпочтительно полиэтиленгликолем. Кроме того, TPO полипептиды изобретения могут включать аминокислоты [Met^-2-Lys^-1] , [Met^-1] или [Gly^-1]. Изобретение обеспечивает ДНК, которые кодируют TPO полипептид и описанные выше производные, причем эти ДНК обеспечены в виде кДНК, геномной ДНК и синтетических ДНК.

Изобретение также обеспечивает способы получения TPO полипептида, описанного выше, предусматривающего стадии экспрессии полипептида, кодируемого ДНК данного изобретения в подходящем хозяине, и выделение этого TPO полипептида. Если экспрессируемый TPO полипептид является Мet^-2-Lys^-1-пoлипептидом, то эти способы предусматривают стадию отщепления Мet^-1-Lys^-1 от выделенного TPO полипептида.

Изобретение обеспечивает также способы получения ТРО полипептидов, таких как полипептиды, слитые с глутатион-S-трансферазой (GST). ДНК, кодирующую амино-концевой GST полипептид, пептид, узнающий тромбин, и ТРО полипептид вводят в подходящего хозяина, выделяют слитый полипептид и GST-часть удаляют обработкой тромбином. Полученные ТРО полипептиды имеют [Gly^-1]-структуру.

Дополнительно обеспечены прокариотические и эукариотические хозяйские клетки, трансформированные или трансфицированные последовательностью ДНК согласно изобретению таким образом, что клетки хозяина способны экспрессировать полипептид, имеющий биологическую активность стимулирования или увеличения образования тромбоцитов.

Фармацевтические композиции этого изобретения содержат эффективное количество ТРО полипептида или его производного в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем и допустимы для применения в лечении связанных с тромбоцитами нарушений, в частности, для лечения тромбоцитопении, например, вызванной химиотерапией, лучевой терапией или трансплантацией костного мозга. Изобретение обеспечивает соответствующие способы лечения.

Наконец, данное изобретение обеспечивает антитела, специфически иммунореагирующие с ТРО полипептидами и их производными, описанными выше. Такие антитела применимы в способах выделения и определения количества ТРО полипептидов изобретения.

Согласно данному изобретению, обеспечена новая последовательность ДНК, кодирующая белок, имеющий ТРО активность (называемая далее последовательностью ДНК данного изобретения). Последовательность ДНК данного изобретения содержит последовательность ДНК, которая кодирует аминокислотную последовательность ДНК, которая кодирует аминокислотную последовательность, показанную в SEQ 1D 2, 4 или 6 прилагаемого списка последовательностей.

Также последовательностью ДНК данного изобретения называют последовательность ДНК, кодирующую частично модифицированную (заменой, делецией, инсерцией или добавлением) версию вышеупомянутой аминокислотной последовательности, показанной в SEQ 1D 2, 4 или 6, при условии, что такие модификации не нарушают ТРО активность. Т.е. последовательности ДНК, кодирующие производные ТРО, также включены в данное изобретение.

Другими словами, последовательность ДНК данного изобретения включает последовательности ДНК, кодирующие белковые молекулы, аминокислотные последовательности которых по существу являются аминокислотными последовательностями, показанными в SEQ 1D 2, 4 или 6. Фраза "аминокислотные последовательности являются по существу аминокислотными последовательностями, показанными в SEQ 1D 2, 4 или 6" в применении здесь означает, что эти аминокислотные последовательности включают последовательности, представленные SEQ 1D 2, 4 или 6, а также последовательности, представленные SEQ 1D 2, 4 или 6, которые имеют частичную модификацию, такую как замена, делеция, инсерция, добавление и т.п., при условии, что такие модификации на нарушают ТРО активность.

Далее, последовательность ДНК данного изобретения состоит по существу из последовательности ДНК, кодирующей белок с ТРО активностью.

Выражение "последовательность ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность" включает в себя все последовательности ДНК, которые могут иметь вырожденность в нуклеотидных последовательностях.

Последовательность ДНК данного изобретения включает также следующие последовательности: (а) последовательности ДНК, представленные SEQ 1D 7, 194, 195 и 196, или комплементарные им цепи, (в) последовательности ДНК, гибридизующиеся при строгих условиях с последовательностями ДНК, определенными в (а), или их фрагментами, или (с) последовательности ДНК, которые гибридизовались бы с последовательностями ДНК (а) и (в), если бы не вырожденность генетического кода.

Другими словами, последовательность ДНК данного изобретения также включает следующие последовательности: (а) последовательность ДНК, которая интегрирована в вектор pEF18S-A2 (депозитный FERM BP-4565), включаемый в штамм DH5 E.coli., вектор pHT1-231 (депозитный FERМ ВР-4564), включенный в штамм DH5 E.coli. вектор pHTGI (депозитный FERМ ВР-4617), включенный в штамм DH5 E.coli. вектор рНGT1 (депозитный FERM ВР-4616), включенный в штамм DH5 E.coli., и кодирует аминокислотную последовательность белка, имеющего ТРО активность, или (в) последовательности ДНК, которые гибридизуются (при строгих условиях) с последовательностями ДНК, описанными в (а), или их фрагментами, и кодируют аминокислотную последовательность белка, имеющего ТРО активность.

В применении здесь, репрезентативные "строгие" условия гибридизации представляют собой такие условия, которые применены в примерах по PCR амплификации ДНК этого изобретения при помощи вырожденных и/или уникальных олиногуклеотидных праймеров (зондов). См. также, например, главы 11 и 14 Molecular Cloning (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) Unit 2.10 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. Current Protocols, USA, 1993).

Также последовательностью данного изобретения является последовательность ДНК, которая кодирует белок с ТРО активностью и содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую положения 1-163 аминокислотной последовательности, представленной SEQ 1D N 6.

Такие последовательности ДНК могут содержать также сайт расщепления рестриктазой и/или дополнительную последовательность ДНК при сайте инициации, терминации или промежуточном сайте, которые облегчают конструирование легко экспрессируемых векторов. При использовании хозяина, не являющегося млекопитающим, может быть включен предпочтительный кодон для экспрессии гена в этом хозяине.

Примером последовательности ДНК данного изобретения является молекула кДНК, полученная выделением мРНК из клеток млекопитающих, в том числе человека, с последующим скринингом этой кДНК обычным путем из библиотеки кДНК, полученной известным способом. Источниками мРНК в этом случае могут быть клетки полученной из гепатоцитов крысы клеточной линии McA-R Н8994, НТС клетки, Н411-Е клетки, печень крысы, почки, мозг и тонкая кишка крысы, печень человека и т.п.

Другим примером последовательности ДНК данного изобретения является молекула геномной ДНК, которую получают скринингом ее обычным путем из геномной библиотеки, полученной известным способом из клеток млекопитающих, в том числе человека. Источниками геномной ДНК в этом случае могут быть препараты хромосомной ДНК, полученные из человека, крысы, мыши и т.п.

Последовательность ДНК, кодирующая производное TРО, может быть получена из полученной описанным образом последовательности кДНК, кодирующей белок с ТРО активностью, путем модификации этой кДНК с применением сайт-направленного мутагенеза, с частичной модификацией тем самым соответствующей аминокислотной последовательности.

После выяснения аминокислотной последовательности или последовательности ДНК белка, имеющего ТРО активность, в данном изобретении, последовательность ДНК, кодирующая частично модифицированную аминокислотную последовательность, может быть легко получена химическим синтезом.

Последовательность ДНК данного изобретения является ценным материалом для широкомасштабного получения белка, имеющего TPО активность, при помощи различных способов рекомбинантных ДНК.

Последовательность ДНК данного изобретения применима также в качестве меченого зонда для выделения гена, кодирующего родственный ТРО белок, а также кДНК и геномной ДНК, кодирующих ТРО других видов млекопитающих. Она применима также в генной терапии человека и других видов млекопитающих. Кроме того, последовательность ДНК данного изобретения применима для развития трансгенных видов мелкопитающих, которые могут использоваться в качестве эукариотического хозяина для широкомасштабного получения ТРО (Palmiter et al., Science, vol. 222, pp. 809-814, 1983).

Данное