Арилалкиламины, активные по отношению к рецепторам кальция

Арилалкиламины, активные по отношению к рецепторам кальция

Реферат

 

Настоящее изобретение относится к молекулам общей формулы (I) или (II), которые могут модулировать активность рецепторов по отношению к ионам кальция. Предпочтительное использование таких молекул заключается в лечении заболеваний или нарушений путем модулирования активности рецептора кальция. Предложенные молекулы более эффективны. 4 c. и. 13 з.п. ф-лы, 90 ил.

Изобретение относится к конструированию, разработке, композициям и применению новых молекул, способных изменять активность рецептора неорганических ионов.

Некоторые клетки организма реагируют не только на химические сигналы, но также на ионы, такие как внеклеточные ионы кальция (Са²⁺). Изменение концентрации внеклеточного Са²⁺ (обозначаемой далее как "[Са²⁺]") изменяет фукциональную восприимчивость этих клеток. Одной из таких специализированных клеток является клетка паращитовидной железы, секретирующая паратгормон. Паратгормон является основным эндокринным фактором, регулирующим гомеостаз в крови и внеклеточных жидкостях.

Паратгормон, действуя на костные клетки и клетки почек, повышает уровень Са²⁺ в крови. Повышение [Са²⁺] действует далее как отрицательный сигнал обратной связи, подавляя секрецию паратгормона. Взаимосвязь между [Са²⁺] и секрецией паратгормона образует необходимый механизм поддержания гомеостаза Са²⁺.

Внеклеточный Са²⁺ действует непосредственно на клетки паращитовидной железы, регулируя секрецию паратгормона. Подтверждено существование белка поверхности клеток паращитовидной железы, обнаруживающего изменение [Са²⁺], Brown et al., 366 Nature 574, 1993. В клетках паращитовидной железы этот белок действует как рецептор внеклеточного Са²⁺ (рецептор кальция), обнаруживает изменение [Са²⁺] и инициирует функциональный отклик клетки - секрецию паратгормона.

Внеклеточный Са²⁺ может проявлять влияние на различные клеточные функции, см. обозрение Nemeth et al., 11 Cell Calcium 319, 1990. Роль внеклеточного Са²⁺ в парафолликулярных (С-клетках) и клетках паращитовидной железы обсуждается в публикации Nemeth, 11 Cell Calcium 323, 1990. Было показано, что эти клетки экспрессируют подобные Са²⁺ рецепторы. Brown et al., 366 Nature 574, 1993, Mithal et al., 9 Suppl. 1, J.Bone and Mineral Res. s.282, 1994; Rogers et al., 9 Suppl. 1, J.Bone and Mineral Res. s.409, 1994; Garett et al., 9 Suppl. 1, J.Bone and Mineral Res. s.409, 1994. Действие внеклеточного Са²⁺ на костные остеокласты обсуждается Zaidi 10 Bioscience Reports 493, 1990. Кератиноциты, юкстагломерулярные клетки, трофобласты, панкретические бета-клетки и жировые клетки - все реагируют на рост внеклеточного кальция, что, вероятно, отражает активацию рецепторов кальция этих клеток.

Способность различных соединений имитировать внеклеточный Са²⁺ in vitro рассматривалась в книге Nemeth et al., "Calcium-Binding Proteins in Health and Disease" (роль белков, связывающих кальций, в обеспечении здоровья и лечении заболеваний), 1987, Academic Press Jnc., р.р. 33-35 (спермин и спермидин); Brown et al. , 128 Endocrinology 3047, 1991 (например, неомицин); Chen et al. , 5, J.Bone and Mineral Res. 581, 1990 (дилтиазем и его аналог ТА-3090); и Zaidi et al. , 167 Biochem Biophys. Res. Commun, 807, 1990 (верапамил). Nemeth et al. РСТ/ US 93/01642, WO 94/18959 и Nemeth et al. РСТ/US 92/07175, WO 93/04373, описывает различные соединения, которые могут изменять влияние неорганического иона на клетки с рецепторами неорганического иона, предпочтительно кальция, на рецепторы кальция.

Настоящее изобретение предлагает молекулы, которые могут модулировать активность рецептора неорганических ионов, предпочтительно молекулы могут имитировать или блокировать влияние внеклеточного Са²⁺ на рецептор кальция. Предпочтительно такие молекулы применяют для лечения заболеваний или нарушений, изменяя активность рецептора неорганических ионов, предпочтительно активность рецептора кальция.

Внеклеточный Са²⁺ находится под сильным контролем гомеостаза и регулирует различные процессы, такие как свертывание крови, возбудимость нервов и мышц и правильное образование костей. Белковые рецепторы кальция позволяют некоторым специализированным клеткам реагировать на изменение концентрации внеклеточного Са²⁺. Например, внеклеточный Са²⁺ ингибирует секрецию паратгормона клетками паращитовидной железы, ингибирует рассасывание кости остеокластами и стимулирует секрецию кальцитонина С-клетками.

Соединения, модулирующие активность рецепторов неорганических ионов, можно использовать для лечения заболеваний и нарушений, на которые влияют активность или активности рецептора неорганического иона, приводящие к благоприятному влиянию на пациента. Например, остеопороз является возрастным заболеванием, характеризующимся потерей костной массы и увеличением риска растрескивания костей. Соединения, блокирующие рассасывание кости остеокластами непосредственно (например, ионмиметиками остеокластов) или косвенно посредством увеличения эндогенных уровней кальцитонина (например, ионмиметиками С-клеток) и/или посредством снижения уровней паратгормона (например, ионмиметиками клеток паращитовидной железы), могут замедлять костные потери и, следовательно, приводить к благоприятному влиянию на пациента, страдающего остеопорозом.

В дополнение известно, что прерывистая низкая дозировка паратгормона анаболически влияет на костную массу и соответственно на реконструкцию костей. Следовательно, соединения и способ дозировки, приводящие к временному увеличению паратгормона, могут повышать костную массу пациентов, страдающих остеопорозом.

Также настоящее изобретение позволяет лечить заболевания или нарушения, связанные с недостатком одной или нескольких активностей рецептора неорганических ионов. Например, некоторые формы начального гиперпаратиреоза характеризуются аномально высоким уровнем паратгормона и снижают восприимчивость паращитовидной железы к циркулирующему кальцию. Средства, изменяющие рецепторы кальция, можно использовать для изменения восприимчивости клеток паращитовидной железы к кальцию.

Предпочтительно соединения изменяют активность рецептора кальция и используются для лечения заболеваний или нарушений, на которые может влиять изменение одной или нескольких активностей рецептора кальция. В основном эти заболевания характеризуются атипичным костным и минеральным гомеостазом, особенно гомеостазом кальция.

Аномальный гомеостаз кальция характеризуется одним или несколькими следующими признаками: (1) аномальным увеличением или уменьшением кальция в сыворотке; (2) аномальным увеличением или уменьшением в мочевыделении кальция; (3) аномальным увеличением или уменьшением костных уровней кальция, например определенными измерениями плотности костного минерала; (4) аномальным усвоением кальция из пищи; и (5) аномальным увеличением или уменьшением выработки и/или выделения циркулирующих посредников или гормонов, влияющих на гомеостаз кальция, таких как паратгормон и кальцитонин. Аномальное увеличение или уменьшение гомеостаза кальция в этих различных аспектах соотносится с гомеостазом у населения в целом и обычно связано с заболеванием или нарушением.

Обычно молекула, которая изменяет активность рецептора неорганического иона, полезна для лечения заболеваний, характеризуемых атипичным гомеостазом неорганического иона. Предпочтительно, молекула изменяет один или несколько эффектов рецептора неорганического иона. Средства, изменяющие рецептор неорганического иона, включают ионмиметики, ионолитики, кальцимиметики и кальцилитики.

Ионмиметики - это молекулы, которые имитируют эффекты повышенной концентраци иона у рецептора неорганического иона. Предпочтительно, молекула влияет на одну или несколько активностей рецептора кальция. Кальцимиметики - это ионмиметики, которые влияют на одну или несколько активностей рецептора кальция и, предпочтительно, связаны с рецептором кальция.

Ионолитики - это молекулы, которые уменьшают или блокируют одну или несколько активностей, оказываемых неорганическим ионом на рецептор неорганического иона. Предпочтительно, молекула ингибирует одну или несколько активностей рецептора кальция. Кальцилитики - это ионолитики, которые ингибируют одну или несколько активностей рецептора кальция, вызываемых внеклеточным кальцием, и, предпочтительно, связаны с рецептором кальция.

Средства, модулирующие рецептор неорганического иона, могут быть изготовлены в форме фамакологических средств или композиций, чтобы облегчить их введение больному. Фармакологические средства или композиции являются средствами и композициями в форме, пригодной для введения млекопитающим, предпочтительно людям. Аспекты, касающиеся форм введения, известны и включают токсические эффекты, растворимость, способ введения и поддерживающую активность.

Следовательно, первый аспект изобретения относится к средству, изменяющему рецептор неорганического иона и содержащему молекулу, которая вызывает одну или несколько активностей рецептора неорганического иона, обусловленных внеклеточным неорганическим ионом. Молекула имеет формулу: где каждый Х независимо выбран из группы, состоящей из изопропила, СН₃О, СН₃S, CF₃О, алифатического кольца и присоединенного или конденсированного ароматического кольца; и каждый m находится независимо между 0 и 5 включительно.

Предпочтительно ароматические и алифатические кольца имеют 5-7 членов. Более предпочтительно, ароматические и алифатические кольца содержат только атомы углерода (например, кольцо не является гетероциклическим кольцом).

Предпочтительно молекула вызывает одну или несколько активностей рецептора кальция или блокирует одну или несколько активностей рецептора кальция, вызванных внеклеточным кальцием.

Другой аспект настоящего изобретения относится к средству, изменяющему рецептор неорганического иона, формулы: где каждый Х независимо выбирают из группы, состоящей из Н, СН₃, СН₃О, СН₃СН₂О, метилендиоксигруппы, Br, Cl, F, CF₃, CHF₂, CH₂F, CF₃O, CH₃S, OH, CH₂OH, CONH₂, CN, NO₂, CH₃CH₂, пропила, изопропила, бутила, изобутила, трет-бутила, ацетоксигруппы, алифатического кольца, ароматического кольца или конденсированного ароматического кольца; каждый R независимо выбирают из группы, состоящей из водорода, метила, этила, пропила, изопропила, бутила, аллила, изобутила, трет-бутила, циклопентила, циклогексила, циклогептила, циклооктила, инденила, инданила, дигидроиндолила, тиодигидроиндолила и 2-, 3- или 4-пиперид(ин)ила; и кажды m находится независимо между 0 и 5 включительно.

Молекула либо вызывает одну или несколько активностей рецептора неорганического иона, либо блокирует одну или несколько активностей рецептора неорганического иона, обусловленных внеклеточным кальцием.

В предпочтительном варианте изобретения R - либо Н, СН₃, этил, либо изопропил, и каждый Х - независимо выбран из группы, состоящей из изопропила, СН₃О, СН₃S, СF₃О, алифатического кольца и ароматического кольца. Предпочтительно алифатические кольца, ароматические и конденсированные ароматические кольца имеют 5-7 членов. Более предпочтительно ароматические и алифатические кольца содержат только атомы углерода.

Другой аспект настоящего изобретения относится к средству, изменяющему активность рецептора неорганических ионов и содержащему молекулу, выбранную из группы, состоящей из соединения 4L, соединения 8J, соединения 8U, соединения 9R, соединения 11Х, соединения 12U, соединения 12V, соединения 12Z, соединения 14U, соединения 16М и соединения 16Р.

Другие аспекты настоящего изобретения относятся к способам использования средств, описанных здесь, для лечения заболеваний или нарушений изменением активности рецептора неорганических ионов. Больных, нуждающихся в таком лечении, можно выявить обычными методами медицины, такими как обычный анализ крови. Например, этим методом можно выявить недостаток белка, на выработку или секрецию которого влияют изменения концентраций неорганических ионов, или выявить аномальные уровни неорганических ионов или гормонов, которые влияют на гомеостаз неорганических ионов.

Терапевтические методы включают введение больному терапевтически эффективного количества средства, изменяющего рецептор неорганического иона. В предпочтительных вариантах эти методы используют для лечения заболеваний или нарушений, характеризуемых аномальным гомеостазом неорганического иона, более предпочтительно заболеваний или нарушений, характеризуемых аномальным гомеостазом кальция. Заболевания и нарушения, характеризуемые аномальным гомеостазом кальция, включают гиперпаратиреоз, остеопороз и другие костные и минеральные нарушения и т.д. (как описано, например, в обычном учебнике, таком как "Harrison's Principles of Jnternal Medicine"). Такие заболевания и нарушения лечат средствами, изменяющими рецепторы кальция, которые имитируют или блокируют одно или несколько влияний Са²⁺ и, следовательно, прямо или косвенно влияют на уровень белков или других молекул в организме больного.

Под "терапевтически эффективным количеством" понимают количество средства, которое облегчает до некоторой степени один или несколько симптомов заболевания или нарушения у больного, или возвращает к нормальному состоянию, частично или полностью, один или несколько физиологических или биохимических параметров, связанных или служащих причиной заболевания или нарушения.

В предпочтительном варианте больной имеет заболевание или нарушение, характеризуемое аномальным уровнем компонентов, регулируемых одним или несколькими рецепторами кальция, и молекула активна по отношению к рецепторам кальция клеток, выбранных из группы, состоящей из клетки паращитовидной железы, остеокласта кости, юкстагломерулярной клетки почки, проксимальной трубочковой клетки почки, дистальное трубочковой клетки почки, клетки центральной нервной системы, клетки периферической нервной системы, клетки толстой восходящей ветви петли Генле и/или собирающего протока, кератиноцита эпидермиса, парафолликулярной клетки щитовидной железы (С-клетки), кишечной клетки, трофобласта плаценты, тромбоцита, клетки гладкой мышцы сосудов, клетки предсердия, гастрин-секритирующей клетки, глюкагон-секретирующей клетки, клетки мезангия почки, клетки молочной железы, бета-клетки, жировой клетки, иммунной клетки и клетки желудочно-кишечного тракта.

Более предпочтительно клетка является клеткой паращитовидной железы, и молекула снижает уровень паратгормона в сыворотке больного, даже более предпочтительно уровень снижается до степени, достаточной, чтобы вызвать уменьшение Са²⁺ в плазме, наиболее предпочтительно уровень паратгормона снижается до уровня у нормального индивидуума.

Следовательно, настоящее изобретение относится к средствам и способам, пригодным для лечения заболеваний и нарушений изменением активности рецепторов неорганических ионов. Например, молекулы настоящего изобретения можно использовать, чтобы сориентировать рецепторы кальция на различные типы клеток, обнаруживающих и реагирующих на изменение внеклеточного кальция. Например, молекулы, имитирующие внеклеточный кальций можно использовать для селективного подавления секреции паратгормона клетками паращитовидной железы, или подавляют ресорбцию кости остеокластами, или стимулируют секрецию кальцитонина С-клетками. Такие молеклуы можно использовать для лечения заболеваний или нарушений, характеризуемых атипичным гомеостазом кальция, таких как гиперпаратиреоидизм и остеоопороз.

Другие признаки и преимущества изобретения будут очевидны из последующего описания предпочтительных вариантов и формулы изобретения.

Краткое описание чертежей Фиг. 1А-Е, 2A-D, 3A-E, 4A-E, 5A-D, 6A-E, 7A-E, 8A-E, 9A-F, 10A-D, 11A-E, 12A-D, 13A-D, 14A-D, 15A-D, 16A-D, 17A-D, 18A-E, 19A-D и 20A-D показывают химические структуры молекул, производных дифенилпропил--фенэтиламина, демонстрируя семейство молекул, которые были получены и подвергнуты скриннингу, чтобы найти молекулы, пригодные для изобретения.

Настоящее изобретение описывает средства, модулирующие рецепторы неорганических ионов и способные имитировать или блокировать влияние неорганического иона у рецепторов неорганического иона. Предпочтительным использованием средств, изменяющих рецепторы неорганических ионов, является лечение заболеваний или нарушений изменением активности рецепторов неорганических ионов. Предпочтительно молекулы используют для лечения заболеваний или нарушений, характеризуемых атипичным гомеостазом ионов, более предпочтительно атипичным гоместазом кальция. Известно также другое использование средств, изменяющих рецепторы неорганических ионов, например, в диагностике (РСТ/US 93/01642, WO 94/18959).

1. Рецепторы кальция Рецепторы кальция и нуклеиновые кислоты, кодирующие рецепторы кальция, описаны в РСТ/US 93/01642, WO 94/18959. Рецепторы кальция присутствуют в различных клетках, таких как клетки паращитовидной железы, остеокласта кости, юкстагломерулярной клетки почки, проксимальной трубочковой клетки почки, дистальной трубочковой клетки почки, клетки центральной нервной системы, клетки периферической нервной системы, клетки толстой восходящей ветви петли Генле и/или собирающего протока, кератиноцита эпидермиса, парафолликулярной клетки щитовидной железы (С-клетки), кишечной клетки, трофобласта плаценты, тромбоцита, клетки гладкой мышцы сосудов, клетки предсердия, гастрин-секретирующей клетки, глюкагон-секретирующей клетки, клетки мезангия почки, клетки молочной железы, бета-клетки, жировой клетки, иммунной клетки и клетки желудочно-кишечного тракта. Рецепторы кальция этих клеток могут быть различными. Возможно также, что клетка может иметь более, чем один тип рецептора кальция.

Сравнение активностей рецепторов кальция и аминокислот различных клеток указывает, что существуют различные типа рецепторов кальция. Например, рецепторы кальция могут реагировать на различные двух- и трехвалентные катионы. Паратиреоидные рецепторы кальция реагируют на кальций и Gd³⁺, тогда как остеокласты реагируют на двухвалентные катионы, такие как кальций, и не реагируют на Gd³⁺. Следовательно, паратиреоидные рецепторы кальция отличны от рецепторов остеокластов.

С другой стороны, нуклеиновые кислоты, кодирующие рецепторы кальция паратиреоидных и С-клеток, свидетельствуют, что эти рецепторы имеют весьма похожую структуру аминокислот. Тем не менее, кальцимиметики имеют различную фармакологию и регулируют различные активности паратиреоидных клеток и С-клеток. Следовательно, фармакологические свойства рецепторов кальция могут значительно изменяться в зависимости от типа клетки или органа, в котором они проявляются, даже если рецепторы кальция имеют близкие структуры.

Рецепторы кальция, в целом, имеют низкое сродство к внеклеточному Са²⁺ (кажущаяся K_d обычно больше, чем 0,5 мМ). Рецепторы кальция могут включать свободный или связанный эффекторный механизм в соответствии с описанным в публикации Cooper, Bloom and Roth, "Biochemical Basis of Neuropharmacology", глава 4, и, следовательно, отличаются от внутриклеточных рецепторов кальция, например калмодулина и тропонинов.

Рецепторы кальция реагируют на изменения уровней внеклеточного кальция. Точные изменения зависят от отдельных рецепторов и вида клеток, содержащих рецептор. Например, влияние кальция in vitro на рецептор кальция в клетке паращитовидной железы состоит в следующем: 1. Увеличении концентрации внутреннего кальция. Увеличение обусловлено притоком внешнего кальция и/или созданием подвижности внутреннего кальция. Характеристики повышения внутреннего кальция включают следующее: (а) Быстрое (максимальное повышение в пределах менее 5 с) и временное увеличение [Са²⁺] , которое невосприимчиво к ингибированию 1 мкМ La³⁺ или 1 мкМ Gd³⁺ и устраняется предварительным введением иономицина (при отсутствии внеклеточного Са²⁺); (б) Увеличение не ингибируется дигидропиридинами; (в) Временное увеличение устраняется предварительной обработкой 10 мМ фторидом натрия в течение 10 минут; (г) Временное увеличение снижается предварительной обработкой активатором протеинкиназы С, таким как миристатацетат форбола, мезереин или (-)-индолактам У. Полное влияние активатора протеинкиназы С заключается в сдвиге кривой концентрация кальция - реакция вправо без влияния на максимальную реакцию; и (д) Обработка токсином коклюша (100 нг/мл в течение больше 4 часов) не влияет на это увеличение.

2. Быстрое (менее 30 секунд) увеличение образования инозит-1,4,5-трифосфата или диацилглицерина. Обработка токсином коклюша (100 нг/мл в течение больше 4 часов) не влияет на это увеличение; 3. Ингибирование образования циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), стимулируемого допамином и изопротеренолом. Это влияние блокируется предварительной обработкой токсином коклюша (100 нг/мл в течение больше 4 часов); 4. Ингибирование секреции паратгормона. Обработка токсином коклюша (100 нг/мл в течение больше 4 часов) не влияет на ингибирование секреции паратгормона.

Используя известные методы можно легко определить влияние кальция на другие рецепторы кальция в различных клетках. такие влияния могут быть похожи на увеличение внутреннего кальция, наблюдаемые в клетках паращитовидной железы. Однако, ожидается, что влияние отличается в других аспектах, таких как вызывание или ингибирование выделения гормона, отличного от паратгормона.

Средства, изменяющие рецептор неорганического иона, либо вызывают одну или несколько активностей рецептора неорганического иона, либо блокируют одну или несколько активностей рецептора неорганического иона, вызванных внеклеточным неорганическим ионом. Средства, изменяющие рецептор кальция могут имитировать или блокировать влияние внеклеточного Са²⁺ на рецептор кальция. Предпочтительными средствами, изменяющими рецептор кальция, являются кальцимиметики и кальцилитики. Общие и специфические структуры средств, изменяющих рецептор неорганического иона, приведены в реферате ранее на фиг. 1.

Средства, изменяющие рецептор неорганического иона, можно идентифицировать скриннингом молекул, моделирующих молекулу, показывающую определенную активность (т.е. ключевую молекулу) (РСТ/US 93/01642, WO 94/18959).

Предпочтительные средства, изменяющие рецептор неорганического иона и описанные в настоящем изобретении, - это соединения 8J, 8U, 9R, 11Х, 12U, 12V, 12Z, 14U, 16М и 16Р. Все эти соединения имеют величину ЭК₅₀ меньше, чем 5 мкМ.

ЭК₅₀ - это концентрация молекулы, вызывающая полумаксимальный эффект. ИК₅₀ - это концентрация, вызывающая полумаксимальный блокирующий эффект. ЭК₅₀ и ИК₅₀ можно определить анализом одной или нескольких активностей неорганического иона у рецептора неорганического иона. Предпочтительно такие анализы специфичны для определенного рецептора кальция. Например, предпочтительными являются анализы, которые измеряют гормоны, выработка или секреция которых изменяется определенным рецептором неорганического иона.

Увеличение [Са²⁺] можно обнаружить стандартными методами, такими как использование флуориметрических индикаторов или измерением роста тока Cl^- в овоците Xenopus, вводимым с нуклеиновой кислотой, кодирующей рецептор кальция (РСТ/US 93/01642, WO 94/18959). Например, поли(А)⁺ мРНК можно получить из клеток, экспрессирующих рецептор кальция, таких как клетка паращитовидной железы, остеокласт кости, юкстагломерулярная клетка почки, проксимальная трубочковая клетка почки, дистальная трубочковая клетка почки, клетка центральной нервной системы, клетка периферической нервной системы, клетка толстой восходящей ветви петли Генле и/или собирающего протока, кератиноцит эпидермиса, парафолликулярная клетка щитовидной железы (С-клетка), кишечная клетка, трофобласт плаценты, тромбоцит, клетка гладкой мышцы сосудов, клетка предсердия, гастрин-секретирующая клетка, глюкагон-секретирующая клетка, клетка мезангия почки, клетка молочной железы, бета-клетка, жировая клетка, иммунная клетка и клетка желудочно-кишечного тракта. Предпочтительно нуклеиновая кислота является нуклеиновой кислотой клетки паращитовидной железы, С-клетки или остеокласта. Более предпочтительно нуклеиновая кислота кодирует рецептор кальция и присутствует на плазмиде или векторе.

Предпочтильно молекула является кальцимиметиком или кальцилитиком с ЭК₅₀ или ИК₅₀ у рецептора кальция меньше чем или равной 5 мкМ и даже более предпочтительно меньше чем или равной 1 мкМ, 100 нМ, 10 нМ или 1 нМ. Такие низкие ЭК₅₀ или ИК₅₀ предпочтительны, так как позволяют использовать более низкие концентрации молекул in vivo или in vitro в терапии или диагностике. Открытие молекул с такими низкими ЭК₅₀ или ИК₅₀ позволяет придумывать и синтезировать другие молекулы с подобной активностью и эффективностью.

В предпочтительных вариантах средством, изменяющим рецептор кальция, является кальцимиметик, ингибирующий секрецию паратгормона клеткой паращитовидной железы in vitro и уменьшающий секрецию паратгормона in vivo; стимулирующий секрецию кальцитонина С-клеткой in vitro и повышающий уровни кальцитонина in vivo; или блокирующий ресорбцию кости in vitro и ингибирующий ресорбцию кости in vivo.

В другом предпочтительном варианте средством, изменяющим рецептор кальция, является кальцилитик, который вызывает секрецию паратгормона клетками пращитовижной железы in vitro и повышает уровень паратгормона in vivo.

Предпочтительно средство селективно нацелено на активность рецептора неорганического иона, более предпочтительно активность рецептора кальция, в специфической клетке. Под "селективно" понимают, что молекула осуществляет большее влияние на активность рецептора неорганического иона одного типа клеток, чем другого типа клеток при заданной концентрации средства. Предпочтительно влияние различается в 10 и больше раз. Предпочтительно концентрация относится к концентрации в плазме крови, и измеряемый эффект производится внеклеточными посредниками, такими как кальцитонин плазмы, паратгормон или кальций плазмы. Например, в предпочтительном варианте средство нацелено на секрецию паратгормона больше, чем на секрецию кальцитонина.

В другом предпочтительном варианте, молекула имеет ЭК₅₀ или ИК₅₀ меньше чем или равные 5 мкМ у одной или нескольких, но не всех клетках, выбранных из группы, состоящей из клетки паращитовидной железы, остеокласта кости, юкстагломерулярной клетки почки, проксимальной трубочковой клетки почки, дистальной трубочковой клетки почки, клетки центральной нервной системы, клетки периферической нервной системы, клетки толстой восходящей ветви петли Генле и/или собирающего протока, кератиноцита эпидермиса, парафолликулярной клетки щитовидной железы (С-клетки), кишечной клетки, тофобласта плаценты, тромбоцита, клетки гладкой мышцы сосудов, клетки предсердия, гастрин-секретирующей клетки, глюкагон-секретирующей клетки, клетки мезангия почки, клетки молочной железы, бета-клетки, жировой клетки, иммунной клетки и клетки желудочно-кишечного тракта.

Предпочтительно, средства, модулирующие рецептор неорганического иона, имитируют или блокируют все влияния внеклеточного иона на клетки, содержащие рецептор неорганического иона. Например, средства, изменяющие рецептор кальция, предпочтительно имитируют или блокируют все влияния внеклаточного иона на клетки, содержащие рецептор кальция. Кальцимиметики не обладают всеми активностями внеклеточного Са²⁺, скорее имитируют, по меньшей мере, одну активность. Подобно этому кальцилитики не уменьшают или не устраняют все активности, вызванные внеклеточным кальцием. Дополнительно различные кальцимиметики и различные кальцилитики не связываются с одним и тем же местом на рецепторе кальция, как это делает внеклеточный Са²⁺ при проявлении своей активности.

А. Кальцимиметики Способность молекул имитировать или блокировать активность Са²⁺ или рецепторов кальция можно определять, используя методики, приведенные в РСТ/US 93/01642 и WO 94/18959). Например, кальцимиметики обладают одной или несколькими, а предпочтительно всеми приведенными далее активностями при испытании на клетках паращитовидной железы: 1. Быстрое (максимальное повышение в пределах менее 5 с) и временное увеличение [Са²⁺]_i, которое невосприимчиво к ингибированию 1 мкМ La³⁺ или 1 мкМ Gd³⁺, рост [Са²⁺]_i продолжает существовать в отсутствие внеклеточного Са²⁺, но устраняется предварительной обработкой иономицина (при отсутствии внеклеточного Са²⁺); 2. Молекула способствует увеличению [Са²⁺]_i, вызванному субмаксимальной концентрацией внеклеточного Са²⁺; 3. Увеличение [Са²⁺] _i, вызванное внеклеточным Са²⁺, не ингибируется дигидропиридинами; 4. Временное увеличение [Са²⁺]_i, вызванное внеклеточным Са²⁺, устраняется предварительной обработкой 10 мМ фторидом натрия в течение 10 минут; 5. Временное увеличение [Са²⁺]_i, вызванное молекулой, снижается предварительной обработкой активатором протеинкиназы С, таким как миристатацетат форбола, мезереин или (-)-индолактам У. Полное влияние активатора протеинкиназы С заключается в сдвиге кривой концентрации кальция - реакция молекулы вправо без влияния на максимальную реакцию; 6. Молекула вызывает быстрое (менее 30 секунд) увеличение образования инозит-1,4,5-трифосфата и/или диацилглицерина; 7. Молекула ингибирует образование циклического аденозинмонофосфата, стимулируемого допамином или изопротеренолом; 8. Молекула ингибирует секрецию паратгормона; 9. Предварительная обработка токсином коклюша (100 нг/мл в течение больше 4 часов) блокирует ингибирующее влияние молекулы на циклический аденозинмонофосфат, но не влияет на рост [Са²⁺]_i, инозит-1,4,5-трифосфата или диацилглицерина и не увеличивает секрецию паратгормона; 10. Молекула вызывает рост тока Сl^- в овоцитах Xenopus, инъецируемых с поли(А)⁺-обогащенной мРНК из бычьих или человеческих клеток паращитовидной железы, но не влияет на овоциты Xenopus, инъецируемые с водой или мРНК мозга или печени крыс; и 11. Также, используя клонированный рецептор кальция клетки паращитовидной железы, молекула вызовет реакцию в овоцитах Xenopus, инъецируемых со специфическими цДНК и мРНК, кодирующими рецептор.

Различные активности кальция можно измерять доступными методами (РСТ/US 93/01642, WO 94/18959). Параллельные определения молекул, имитирующих активность Са²⁺ на других клетках, реагирующих на кальций, очевидны из примеров, приведенных здесь и в РСТ/US 93/01642, WO 94/18959.

Предпочтительно средство, по определению биоанализом, описанным здесь и в РСТ/US 93/01642 и WO 94/18959, имеет одну или больше, предпочтительно все следующие активности: вызывает временное увеличение внутреннего кальция длительностью меньше 30 секунд (предпочтительно мобилизуя внутренний кальций); вызывает быстрый рост [Са²⁺]_i, происходящий в пределах 30 секунд; вызывает длительное увеличение (больше тридцати секунд) [Са²⁺]_i, (предпочтительно вызываемое притоком внешнего кальция); вызывает увеличение уровней инозит-1,4,5-трифосфата или диацилглицерина, предпочтительно в пределах менее 60 секунд; и ингибирует образование циклического аденозинмонофосфата, стимулируемого допамином или изопротеренолом.

Временное увеличение [Са²⁺]_i предпочтительно устраняется предварительной обработкой клетки в течение 10 минут 10 мМ фторидом натрия, или временное увеличение снижается краткой предварительной обработкой (не больше 10 минут) клетки активатором протеинкиназы С, предпочтительно таким, как миристатацетат форбола, мезереин или (-)-индолактам V.

Б. Кальцилитики Способность молекулы блокировать активность внешнего кальция можно определять, используя стандартные методы (РСТ/US 93/01642, WO 94/18959). Например, молекулы, которые блокируют влияние внешнего кальция на клетки паращитовидной железы, обладают одной или больше, предпочтительно всеми следующими характеристиками при испытании на клетках паращитовидной железы in vitro: 1. Молекула блокирует, частично или полностью, способность повышенных концентраций внеклеточного Са²⁺: (а) увеличивать [Са²⁺]_i, (б) мобилизовывать внутриклеточный Са²⁺, (в) увеличивать образование инозит-1,4,5-трифосфата, (г) снижать образование циклического аденозинмонофосфата, стимулируемого допамином или изопротеренолом, (д) ингибировать секрецию паратгормона.

2. Молекула блокирует рост тока Сl^- в овоцитах Xenopus, инъецируемых с поли (А)⁺ мРНК из бычьих или человеческих клеток паращитовидной железы, вызываемый внеклеточным Са²⁺ или кальцимиметиками, но не в овоцитах Xenopus, инъецируемых с водой или мРНК печени; 3. Также, используя клонированный рецептор кальция клетки паращитовидной железы, молекула заблокирует реакцию, вызываемую внеклеточным Са²⁺ или кальцимиметиком, в овоцитах Xenopus, инъекцированных специфическими цДНК, мРНК или цРНК, кодирующими рецептор кальция.

Параллельные определения молекул, блокирующих активность Са²⁺ на других клетках, реагирующих на кальций, предпочтительно у рецептора кальция, очевидны из примеров, приведенных здесь и в РСТ/US 93/01642 и WO 94/18959.

Предпочтительное использование соединений настоящего изобретения состоит в лечении или предотвращении различных заболеваний или нарушений изменением активности рецептора неорганического иона. Средства настоящего изобретения, изменяющие рецептор неорганического иона, могут оказывать влияние на рецептор неорганического иона, вызывая один или несколько клеточных эффектов, в конце концов производят терапевтический эффект.

Различные заболевания и нарушения можно лечить соединениями настоящего изобретения, достигающими клетки с рецептором неорганического иона, таким как рецептор кальция. Например, первичный гиперпаратиреоз характеризуется гиперкальциемией и повышенными уровнями циркулирующего паратгормона. Дефект, связанный с основным типом гипертиреоза, заключается в пониженной чувствительностью клеток паращитовидной железы к негативному регулированию обратной связи внеклеточным кальцием. Следовательно, в ткани больного первичным гипертиреозом заданное значение внеклеточного Са²⁺ сдвигается вправо, так что требуемая для подавления секреции паратгормона концентрации внеклеточного Са²⁺ должна быть больше нормальной. Более того, при первичном гиперпаратиреозе даже высокие концентрации внеклеточного Са²⁺ часто подавляют секрецию паратгормона только частично. При вторичном (уремическом) гиперпаратиреозе наблюдается похожий рост заданного значения внеклеточного Са²⁺, хотя степень подавления секреции паратгормона кальцием Са²⁺ в норме. Изменения секреции паратгормона параллельны изменениям [Са²⁺]_i; заданное значение роста [Са²⁺] _i, вызванное внеклеточным Са²⁺, сдвигается вправо, а величина такого роста снижается.

Молекулы, которые имитируют действие внеклеточного Са²⁺, действуют благотворно при длительном лечении как первичного, так и вторичного гипертиреоза. Такие молекулы обеспечивают дополнительный стимул, требуемый для подавления секреции паратгормона, которое нельзя достичь одним гиперкальциемическим состоянием, и, тем самым, помогают облегчить гиперкальциемическое состояние. Молекулы, более эффективные, чем внеклеточный Са²⁺, могут преодолеть очевидный неподавляемый компонент секреции паратгормона, который доставляет особенное беспокойство в аденоматозной ткани. Альтернативно или дополнительно такие молекулы могут подавлять синтез паратгормона, как длительная гиперкальциемия подавляет, как показано, уровни препропаратгормона мРНК в аденоматозной ткани бычьей или человеческой паращитовидной железы. Длительная гиперкальциемия также подавляет разрастание клеток паращитовидной железы in vitro, так что кальцимиметики также могут быть эффективными в ограничении гиперплазии клеток паращитовидной железы, характерной для вторичного гиперпаратиреоза.

Клетки, отличные от клеток паращитовидной железы, могут реагировать непо