Вирус козьего артрита-энцефалита, обеспечивающий иммунную защиту от инфекции вич-1

Вирус козьего артрита-энцефалита, обеспечивающий иммунную защиту от инфекции вич-1

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и предлагает вакцину, содержащую иммуноген вируса козьего артрита-энцефалита (CAEV) и фармацевтически приемлемый носитель. Изобретение также предлагает способ стимулирования у индивидуума иммунной реакции на инфекцию вируса иммунодефицита человека-1 или на инфекцию CAEV введением терапевтически эффективного количества иммуногена CAEV индивидууму. Изобретение далее предлагает способ стимулирования иммунной реакции in vitro контактированием лимфоцита с терапевтически эффективным количеством иммуногена CAEV, а также включает способы, лежащие в основе диагностики инфекции CAEV у человека, и выделенный CAEV человека, имеющий нуклеотидную последовательность с дивергенцией от эталонного CAEV-Со. Преимущество изобретения заключается в создании вакцины, содержащей иммуноген CAEV, стимулирующий иммуную реакцию на инфекцию ВИЧ-1 человека. 8 с. и 16 з. п. ф-лы, 4 табл., 5 ил.

Изобретение относится в широком смысле к области иммунологии и медицины и, более конкретно, к способам обеспечения иммунной защиты от инфекции ВИЧ-1.

Число заболеваний синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД) достигло уровня эпидемии, особенно в странах третьего мира - в Африке, Азии и Карибском бассейне. Несмотря на миллиарды долларов, расходуемые на исследования с целью найти средство для лечения этого заболевания, достигнут лишь небольшой прогресс в области лекарств, которые могут замедлить развитие заболевания.

Возбудителем СПИД'а является вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1). ВИЧ-1 инфицирует особый тип клеток иммунной системы, Т-клетки. Попадая в Т-клетку, геномная ДНК ВИЧ-1 встраивается в геном Т-клетки, где она направляет синтез вирусных белков. Из инфицированной Т-клетки секретируются новые копии, которые далее инфицируют новые Т-клетки. В конечном счете инфицированные Т-клетки умирают и иммунная система инфицированного ВИЧ-1 человека ослабляется и не может противостоять последующим инфекциям. В результате жертвы СПИД'а, как правило, умирают от инфекций, которые обычно у здорового индивидуума вызвали бы, в худшем случае, легкое недомогание.

Первоначально лечение СПИД'а сводилось к способам лечения инфекций, возникавших в результате ослабления иммунного ответа. Позднее было найдено, что такие лекарственные препараты, как AZT (азидотимидин) и ddI, которые известны как аналоги нуклеозидов, могут препятствовать репликации ДНК ВИЧ-1. Эти препараты, особенно в комбинации, могут продлевать жизнь больных СПИД'ом. Еще позднее сообщалось, что класс лекарственных препаратов, называемых ингибиторами протеаз, является более эффективным для ингибирования репликации ВИЧ-1. Предполагали, что ингибиторы протеаз, возможно, в сочетании с нуклеозидными аналогами, сделают жизнь больного СПИД'ом еще более продолжительной и даже вылечат его.

Так как применение препаратов, как описано выше, приводит к уничтожению вируса у инфицированных ВИЧ-1, такие лекарства применимы только тогда, когда человек уже инфицирован; они не оказывают действия на активацию иммунной системы. Ясно, что более предпочтительным подходом к прекращению эпидемии СПИД'а прежде всего было бы предотвращение ВИЧ-1 инфекции. Логическим выбором в качестве средства для предотвращения ВИЧ-1 инфекции являются вакцины, которые стимулируют иммунный ответ человека на действующее вещество вакцины. Например, применялись вакцины для предотвращения или уменьшения тяжести различных вирусных заболеваний, включая полиомелит, корь, оспу и грипп. Кроме того, вакцина может стимулировать иммунную систему человека, уже инфицированного вирусом.

Применялись многочисленные способы усовершенствования вакцины, которая повысила бы сопротивляемость инфицированию вирусом СПИД'а. Однако, хотя были созданы и испытаны в клинических условиях различные ВИЧ-1 вакцины, каждая из них имеет серьезные ограничения. Например, вакцины подгруппы, созданной из частей белка ВИЧ-1, дают только временную или малоэффективную защиту. Одним из препятствий, мешающих улучшению вакцины является то, что ВИЧ-1 при репродукции претерпевает быструю мутацию. В результате стимулированный иммунный ответ на конкретный белок ВИЧ-1 или штамм ВИЧ-1 является малоэффективным по отношению к измененной форме вируса. Более того, антитела к участку поверхности ВИЧ-1, которые должны быть самыми активными в вакцине, на самом деле стимулируют ВИЧ-1-инфекцию.

Также предлагались ослабленные вакцины, которые содержат живые, но дефектные по репродукции вирусы. Однако введение такого вируса ВИЧ-1 человеку, особенно здоровому в других отношениях, должно быть оправданным. Таким образом, существует необходимость в вакцине, которая обеспечивает универсальный иммунный ответ на ВИЧ-1, но без сопутствующего риска и ограничений, связанных с применением ВИЧ-1 в качестве реагента для вакцинации. Данное изобретение удовлетворяет этому требованию и дает дополнительные преимущества.

Вирус козьего артрита-энцефалита (CAEV) представляет собой ретровирус, который сходен с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-1), который вызывает СПИД у людей. Известно, что CAEV поражает коз, вызывает у них различные патологии, включая артрит и энцефалит. Инфекция CAEV встречается во всем мире и может привести к дорогостоящим потерям в животноводстве, связанном с разведением коз.

Во многих частях земного шара обычно потребляют козье молоко и, особенно в малоразвитых странах, оно представляет собой важный источник пищи. Однако в этих странах козье молоко редко пастеризуют перед потреблением его человеком. Также потребление сырого козьего молока увеличивается в Соединенных Штатах вследствие спроса на здоровую пищу.

В соответствии с настоящим изобретением в настоящее время признано, что CAEV-подобные вирусные формы могут инфицировать людей (h-CAEV), особенно тех, кто по роду своей работы контактирует с козами, или тех, кто потребляет сырое козье молоко. Хотя еще не доказано, вызывает ли CAEV патологические состояния у людей, близость CAEV и ВИЧ-1 предполагает, что лучше всего было бы свести к минимуму присутствие CAEV-инфекции у людей.

Хотя в молочном скотоводстве делались попытки предотвратить распространение CAEV у коз, заражение людей формами, адаптированными к человеку, до сих пор не было известно. Следовательно, необходим способ (метод) диагностики человека. Такой метод диагностирования CAEV-инфицированных индивидуумов был бы полезен для идентификации запасов крови, зараженной CAEV. В частности, важно иметь способ обнаружения CAEV-инфекции в запасах крови, так как энцефалит, связанный с CAEV-инфекцией, может встречаться только у детей раннего возраста, получающих инфицированную кровь при внутривенном вливании. К сожалению, ни один удобный метод не пригоден для идентификации наличия CAEV-инфекции у людей. Таким образом, необходим простой и недорогой способ диагностирования наличия CAEV-инфекции. Настоящее изобретение удовлетворяет этому требованию и дает дополнительные преимущества.

Данное изобретение предлагает вакцину, содержащую иммуноген вируса козьего артрита-энцефалита (CAEV), предпочтительно CAEV человека, и фармацевтически приемлемый носитель. Вакцина по данному изобретению применима, например, для стимуляции иммунозащитной реакции на CAEV-перекрестную защитную иммунную реакцию на вирус-1 иммунодефицита человека (ВИЧ-1) у индивидуума и для вакцинации человека или другого млекопитающего (кроме коз) от инфекции CAEV.

Данное изобретение также предлагает способ стимулирования иммунной реакции у индивидуума на CAEV или ВИЧ-1 введением ему CAEV-иммуногена. Такой способ применим, например, для повышения сопротивляемости заражению (инфекции) ВИЧ-1 или CAEV у человека, ранее не зараженного ВИЧ-1 или CAEV соответственно, или облегчить состояние, вызванное ВИЧ-1 у больного, инфицированного ВИЧ-1, или CAEV у больного, инфицированного CAEV. Далее, данное изобретение предлагает способ стимуляции иммунной реакции in vitro путем контакта лимфоцита с CAEV-иммуногеном.

Данное изобретение также предлагает способы диагностирования заражения вирусом козьего артрита-энцефалита (CAEV) у субъектов, подозреваемых в том, что они инфицированы CAEV. Например, данное изобретение предлагает способ твердофазного иммуносорбентного анализа (ELISA), отличающийся тем, что gp135 CAEV прикреплен к твердой подложке (носителю), и тем, что при контакте gp135 CAEV с образцом, например с образцом иммунной сыворотки, взятой у индивидуума, предпочтительно зараженного CAEV, определение (обнаружение) в сыворотке антитела, которое связывается с gp135 CAEV, и представляет собой то, что лежит в основе диагностики инфекции CAEV у этого индивидуума. Другие способы включают тесты на основе PCR. Данное изобретение также предлагает набор для осуществления такого диагностического подхода, как ELISA или теста на основе нуклеиновой кислоты.

На фиг. 1 изображено диагностическое древо, сравнивающее gag-последовательности CAEV с gag-последовательностями других лентивирусов. PCR (полимеразную цепную реакцию) и RT-PCR (полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией) и клонирование и секвенирование продуктов PCR осуществляли, как описано в Примере I.D. Различные последовательности анализировали, и их порядковые номера такие, как описано в Примере I.D. Все относящиеся к CAEV последовательности заключены в рамку на фиг. 1. Все другие последовательности являются лентивирусными за исключением JSR (ретровирус овцы Яагзикте (Jaagsiekte)), который служит в качестве анцестральной (родовой) распознаваемой последовательности на фиг. 1. Для анализа 173 упорядоченных (выравненных) gag-сайтов, из которых 157 изменялись на фиг. 1, а 65 изменялись на фиг. 2, применяли оптимизированный (parsimony) алгоритм PAUL 3.1.1. Две из применявшихся опций представляли собой рандомизацию входа последовательности и MULPARS. Оптимизацию (parsimony) с обратным множителем применяли на фиг. 1, как описано в Примере I.D., получая длины ветвей, непропорциональные изменениям одиночного нуклеотида, но обеспечивающие наибольшие относительные расстояния для включенных последовательностей с высокой дивергенцией. Одно древо с наивысшей оптимизацией (most parsimonious) было обнаружено на фиг. 1 и порядок его разветвления был в дальнейшем подтвержден анализом "ближайших соседей" и анализом древа с использованием фрагментов гена полимеразы.

На фиг. 2 дан анализ филогенетического древа, сравнивающий gag-последовательности CAEV с gag-последовательностями друг с другом, как описано в Примере I. D. Обычная оптимизация показана на фиг. 2 (так как все эти последовательности тесно связаны) и, соответственно, длины ветвей выражены в единицах минимальных нуклеотидных изменений. Последовательность является распознаваемой (опозновательной) анцестральной (родовой) последовательностью. На фиг. 2 были получены два равно оптимизированных (parsimonious) древа, которые по существу не отличались.

На фиг. 3 сравнивается нуклеотидная последовательность PCR-амплифицированных образованных из Hmc4 клонов gag CAEV человека с соответствующей областью инфицирующего CAEV козы, как описано в Примере I.I. Анализируемые клоны представляли собой геномные клоны Hmc4 g-30, g-39, g-40, g-46 и g-50; плазматические клоны Hmc4 p-254 и р-256; клоны из эксперимента по заражению (инфицированию) i-238 и i-239. "i"-клоны были получены из цитоплазмы инфицированных культур. Клоны "р" были получены из плазмы инфицированных пациентов.

На фиг. 4 сравнивается нуклеотидная последовательность PCR-амплифицированных полученных из клонов полимеразы Hmc4 CAEV человека с соответствующей областью с двумя CAEV инфицированных коз, как описано в Примере I.I.

На фиг. 5 непосредственно сравнивается последовательность полученных из коз штаммов CAEV CAEV-CO и gWa19 (т.е. CAEV-79-63) и h-CAEV штаммов человека Hmc1 и Hmc4.

Данное изобретение предлагает вакцину, содержащую иммуноген вируса козьего артрита-энцефалита (CAEV), предпочтительно адаптированного к человеку штамма CAEV, и фармацевтически приемлемый носитель. Как раскрывается ниже, вакцина по данному изобретению применима для стимуляции иммунозащитной реакции на ВИЧ-1 у человека. Кроме того, вакцина по данному изобретению применима для вакцинации человека или другого млекопитающего (кроме коз) от заражения CAEV.

Употребляемый ниже термин "иммуноген CAEV", означает CAEV-вирусную частицу, которая может быть живым, ослабленным или убитым CAEV, или иммуногенный участок CAEV-вирусной частицы, или пептидный фрагмент CAEV-белка, например пептидный фрагмент гликопротеина gp135 оболочки (см. Таблица 1; env). CAEV-иммуноген характеризуется тем, что он может стимулировать иммунную реакцию как in vivo, так и ex vivo. В частности, CAEV-иммуноген может стимулировать иммунную реакцию на CAEV при введении индивидууму и может стимулировать перекрестно-реактивный иммунный ответ на ВИЧ-1. Перекрестно-реактивный иммунный ответ на ВИЧ-1, который вызывается инфекцией CAEV, напоминает перекрестно-реактивный иммунный ответ на вирус оспы, который вызывается инфекцией коровьей оспы.

Пептидный фрагмент белка 70К, присутствующий в комплексе рибонуклеопротеида U1, который гомологичен аминокислотной последовательности ВИЧ-1, может вести себя как суррогатный иммуноген, который стимулирует иммунную реакцию, перекрестную с ВИЧ-1 (Douvas and Takehana. AIDS Res. Hum. Retrovir. 10: 253-262 (1994). Как раскрывается ниже, различные пептидные фрагменты белков CAEV гомологичны последовательностям 70К и ВИЧ-1 и, следовательно, могут применяться в качестве CAEV-иммуногенов для стимулирования иммунной реакции, перекрестной с ВИЧ-1, у человека.

Примеры пептидных фрагментов CAEV, гомологичные аминокислотным последовательностям 70К и ВИЧ-1, даны в Таблице 1. Другие примеры пептидных фрагментов CAEV, рассматриваемые ниже с соответствующими структурными особенностями в ВИЧ-1 (ВИЧ-1 --> CAEV), включают, например: 220-FAILKS-->200-FAILKS (шарнир); 99-DMVEQM-->415-DMVEHM (-спираль 1); 129-LKCTDL-->203-LKCTKW (консервативный поворот); 300-NNNTRT-->480-NNNTIT (консервативный поворот) и т. п. Другие такие петиды CAEV могут быть идентифицированы с помощью исследования ДНК- или аминокислотной последовательности CAEV с целью идентификации CAEV-пептидов, гомологичных иммунологически гомологичным последовательностям 70К и ВИЧ-1 (Douvas and Takehana, supra, 1994). Далее, ниже раскрываются способы обнаружения того, какие CAEV-пептиды, гомологичные пептидам 70К и ВИЧ-1, применимы в качестве CAEV-иммуногенов, включая такие способы, как ELISA или вестерн-блоттинг или реакция нейтрализации вируса (Пример I), или другие, известные в технике (см, например, Harlow and Lane, Antibodies: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988).

Употребляемый ниже термин "вакцина" означает композицию, содержащую иммуноген, который при введении индивидууму, представляющему собой обычно млекопитающее (кроме козы), например человеку и т. п., стимулирует в индивидууме иммунную реакцию (иммунный ответ). В частности, вакцина по данному изобретению содержит CAEV-иммуноген, который можно вводить, например, человеку. отличающийся тем, что он стимулирует иммунный ответ на CAEV, перекрестно-реактивный с ВИЧ-1. Таким образом, CAEV-иммуноген применим в качестве суррогатного иммуногена для стимулирования иммунного ответа на ВИЧ-1. Особенно предпочтительной вакциной является ослабленная ч-CAEV, например, такая, как таковые, представленные на фиг. 3 и 4.

Хотя ниже рассматривается с целью применения любой инфекционный CAEV, наиболее предпочтительными CAEV для применения ниже являются новые адаптированные к человеку штаммы CAEV, называемые ниже "CAEV человека, ч-CAEV", например, штаммы больных Hmc1 и Hmc4, описанные в Примере II, частичная геномная последовательность которых представлена на фиг. 3 и 4. Было найдено, что CAEV человека отличаются от CAEV, способных инфицировать коз. Например, в геномной области, соответствующей нуклеотидному фрагменту 173, амплифицированному праймерами, изображенными SEQ ID No 16 и 17, было найдено, что эта конкретная область вируса CAEV человека содержит, по меньшей мере, две мутации, присущие исключительно человеку (встречающиеся лишь у человека). Эти мутации соответствуют гуанину в положении 56 и цитозину в положении 77 внутри продукта амплификации gag-области 173.

Таким образом, в соответствии с другим вариантом данного изобретения, предложены новые изолированные CAEV человека. CAEV человека по данному изобретению можно выделить методами, описанными в Примере III, или используя методы, хорошо известные в технике.

Признано, что вакцину по данному изобретению можно вводить индивидууму, который не инфицирован ВИЧ-1, в этом случае вакцина стимулирует иммунный ответ, который может защитить индивидуума от инфекции вследствие контакта с ВИЧ-1, или можно вводить ВИЧ-1-инфицированному человеку, и в этом случае вакцина может стимулировать иммунный ответ так, чтобы противостоять иммунопатологии ВИЧ-1 (см. , например, Cease and Berzofsky, Ann. Rev. Immunol. 12:923-989 (1994)). Таким образом вакцину по данному изобретению можно применять для повышения сопротивляемости человека ВИЧ-1-инфекции или для облегчения тяжести патологии, вызванной ВИЧ-1 у ВИЧ-1-инфицированного индивидуума.

До данного открытия не было известно, что CAEV может инфицировать людей. Как обнаружено ниже, однако, CAEV-инфекция у людей распространена, особенно в популяциях, у которых потребление сырого козьего молока является общепринятым или где представители населения каким-либо другим образом контактируют с козами (см. Пример I.C.). Хотя еще не установлено, вызывает ли инфекция CAEV патологию, например, артрит или энцефалит у человека, как это происходит у коз, если такая, вызванная CAEV, патология существует, тогда важно вакцинировать людей, работающих в животноводстве и связанных с козами, от заражения CAEV. Вакцина по данному изобретению может применяться для этой цели. Кроме того, метод диагностики ELISA, как ниже показано, может применяться для обнаружения зараженных CAEV и может быть особенно полезен, например, для скрининга (исследования) системы кровоснабжения с целью идентификации крови, зараженной CAEV, что, таким образом, предотвращает распространение инфекции CAEV при введении крови, содержащей CAEV.

Так как сейчас найдено, что CAEV инфицирует людей, признается вероятность того, что CAEV также может инфицировать других млекопитающих (не коз), включая, например, нечеловекообразных приматов (например, обезьян и тому подобное), коров, лошадей, овец, собак, кошек и других млекопитающих. Таким образом ELISA по данному изобретению может применяться для диагностирования инфекции CAEV у любого такого млекопитающего ("не козы"). Далее, если найдено, что CAEV инфицирует других таких млекопитающих, вакцину по данному изобретению можно применять для предотвращения или ограничения распространения инфекции CAEV у этих млекопитающих ("не коз").

Как раскрывается ниже, контакт индивидуума с CAEV также может стимулировать иммунный ответ на CAEV, перекрестно-реактивный с ВИЧ-1 (Пример I.E.). CAEV представляет собой ретровирус, подтип лентивирусов, который близок вирусу-1 иммунодефицита человека (ВИЧ-1). CAEV инфицирует коз и вызывает артрит и отклонения (ненормальности) в иммунной системе инфицированных животных (см. , например, Banks et al., Arthrit. Rheum. 30:1046-1053 (1987); Crawford et al., Science 207:997-999 (1980)).

Вирус висны/мэди (VMV) представляет собой другой лентивирус, который тесно связан с CAEV и ВИЧ-1 и вызывает у овец заболевание, близкое к таковому, вызываемому CAEV у коз. Таким образом, ниже рассматривается то, что VMV или иммуногенный фрагмент VMV может быть заменен на CAEV или, если нужно, может применяться в сочетании с CAEV-иммуногеном в вакцине по данному изобретению. Вакцина, содержащая иммуноген VMV, применяется для стимуляции иммунного ответа у человека, который перекрестно реагирует на ВИЧ-1.

CAEV вызывает устойчивую инфекцию у коз и ассоциируется с тремя болезненными синдромами, включая артрит, который возникает у 20-30% инфицированных животных; лейкоэнцефалит, поражающий молодых животных; и единичные неврологические заболевания взрослых коз. Как обнаружено, инфекция CAEV широко распространена в мире и выявлена как причина артрита и энцефалита коз в 1980 г. В 1985 и 1986 г.г. описано сходство между нуклеотидными и аминокислотными последовательностями CAEV и ВИЧ-1 (затем названный HTLV-III). CAEV и ВИЧ-1 очень сходны филогенетически и имеют высокую степень гомологии, включая, например, между их РНК-зависимыми полимеразами ДНК (роl) и между gp120/41 в ВИЧ-1 и gp135/38 в CAEV (см., например, Gonda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. . USA 83:4007-4111 (1986); Gonda et al., Retroviridae 3:83-109 (1994); Garry et al., Retroviridae 4:491-603 (1995).

CAEV передается среди коз через зараженное молоко, особенно через молозиво, и инфекция распространяется благодаря практике в сельском хозяйстве объединять запасы молозива для кормления молодых животных. CAEV размножается в клетках моноцитарно/макрофагальной линии и в клеточной линии фибробластов, но не инфицирует Т-клетки. Макрофаги, экспрессирующие CAEV, распределяются в синовии, легких, центральной нервной системе, лимфатических узлах, селезенке, желудочно-кишечном тракте и молочных железах инфицированных коз.

До настоящего открытия не было известно, что CAEV инфицирует человека. Однако обнаружение сероконверсии с помощью ELISA и вестерн-блоттинга на образцах крови человека (Пример I.C.), и провирусной ДНК, соответствующей gag и pol генам CAEV, анализом геномной ДНК больного MCTD с помощью полимеразной цепной реакции (PCR) (Пример I.D.) дает наглядное доказательство того, что CAEV инфицирует людей. Внедрение последовательностей вирусной ДНК в ДНК клетки-хозяина есть признак заражения лентивирусами, включая CAEV и ВИЧ-1.

Исходя из представленных ниже результатов CAEV, по-видимому, заражена половина населения Мексики и Центральной Америки, в особенности те, кто потребляет сырое козье молоко, что распространено в этих местах, или как-либо иначе соприкасаются с козами (см. Пример I.C.). Хотя нет доказательства, что CAEV вызывает патологическое состояние у человека, важно, тем не менее, определить размер распространения CAEV-инфекции в человеческой популяции, чтобы идентифицировать, коррелируется ли патология неизвестной этиологии с инфекцией CAEV. Анализ ELISA, приведенный ниже, позволяет проводить рутинный скрининг CAEV-инфекции у людей и дает дополнительное преимущество, так как применим для скрининга других млекопитающих, кроме козы, с целью определения CAEV-инфекции.

Также проводился анализ PCR геномной ДНК, полученной от трех групп коз из разных географических районов и от инфицированных CAEV индивидуумов (см. Пример I. D. ). PCR-анализ геномной ДНК человека и козы идентифицировал, по меньшей мере, два потенциальных штамма CAEV, которые отличаются от последовательности ДНК эталонного штамма CAEV (последовательность ДНК эталонного CAEV имеет в каталоге GenBank (Генбанка) N М33677). Следует заметить, что иммунные ответы, вызванные в двух или трех группах коз, инфицированных CAEV, и у нескольких инфицированных CAEV индивидуумов, были перекрестно-реактивными в отношении ВИЧ-1, что указывает, что любой из этих штаммов может быть использован в качестве источника иммунного CAEV для вакцины по данному изобретению.

Инфицированные CAEV козы использовали в качестве животных моделей для ревматоидного артрита человека, который является наиболее известным и широко распространенным синдромом в группе артритных/аутоиммунных расстройств, системных ревматических расстройств. Системные ревматические расстройства у женщин встречаются примерно в три раза чаще, чем у мужчин.

Смешанная соединительнотканная болезнь (MCTD) представляет собой еще одно системное ревматическое заболевание. Для MCTD характерны аутоантитела к комплексу сплайсинга U1 snRNP. Считают, что MCTD является общим синдромом, который охватывает клинические и серологические особенности, общие для трех других системных ревматических расстройств системного волчьего эритематоза (SLE), склеродермы и полимиозита. Клинический профиль MCTD включает артрит, лимфаденопатию, васкулит, миозит, синдром Шегрена (лимфоцитарная инфильтрация слюнных и слезных желез) и нарушение регуляции иммунной системы.

Клинический профиль, очевидный в MCTD-индивидуумах, также проявляется у индивидуумов, инфицированных ВИЧ-1. Однако эти клинические проявления имеют более тяжелое течение и менее поддаются лечению у ВИЧ-1-инфицированных индивидуумов. Например, синдром Шегрена у MCTD-индивидуумов характеризуется локализованной лимфоцитарной инфильтрацией, тогда как обширная гландулярная инфильтрация, называемая синдромом диффузного инфильтрационного лимфоцитоза, встречается при соответствующем ВИЧ-1-ассоциированном синдроме.

Тяжелый, вызывающий некроз васкулит, сопровождаемый невропатией, воспалительной полимиопатией, не связанной с лекарственной терапией, и другие формы сосудистого и нервно-мышечного заболевания, ассоциированного с ревматическими нарушениями (расстройствами), также возникают у ВИЧ-1-инфицированных индивидуумов. Вызывающая некроз лимфаденопатия, приводящая к серьезнейшему разрушению структуры лимфатического узла, происходит при заражении MCTD, SLE и ВИЧ-1. Два классических ревматических расстройства, псориатический артрит и синдром Рейтера, являются самыми ранними проявлениями заражения ВИЧ-1 и наименее поддающимися действию химиотерапевтических агентов, когда они связаны (ассоциированы) с ВИЧ-1-инфекцией.

Клиническое сходство инфекции ВИЧ-1 и системных ревматических расстройств, например MCTD, подтверждает, что ВИЧ-1 может вызывать ревматические патологии или что филогенетически родственный (близкий) более клинически неопасный лентивирус представляет собой этиологический фактор при ревматических нарушениях (расстройствах). Серологически MCTD характеризуется наличием антител RNP (рибонуклеопротеид), специфических к частице U1 snRNP, которая располагается на 5'-конце интронов во время сплайсинга ядерной РНК. Антитела против RNP также присутствуют у некоторых больных SLE и склеродермией. Частицы U1 snRNP состоят из центральной части U1 РНК и кластера РНК-связывающих белков, включая более 70К, А и С. Антитела против RNP ингибируют сплайсинг РНК, связывая U1 snRNP.

Хотя реакция гуморально анти-RNP-аутоантитела является патогномоничной в MCTD, белок 70К, например, содержит эпитопы как Т-клеток, так и В-клеток и гуморальные и клеточные аутоиммунные манифестации зависят друг от друга. Были выделены клоны Т-клеток, отвечающие на эпитопы 70К, и они включают CD8⁺ Т-клетки, обладающие цитотоксической Т-лимфоцитарной активностью, и CD4⁺ Т-клетки, проявляющие активность Т-хелперов. Некоторые из эпитопов Т-клеток 70К гомологичны эпитопам Т-клеток ВИЧ-1 (см. Douvas and Takehana, supra, 1994). Как раскрывается ниже, белки CAEV, включая CAEV gp135, также содержат эпитопы, которые гомологичны эпитопам Т-клеток 70К и ВИЧ-1 (см. Таблица 1). Таким образом, иммуноген CAEV, содержащий такой эпитоп, может вызывать универсальный перекрестно-реактивный иммунный ответ на ВИЧ-1.

Ввиду клинического сходства ВИЧ-1-инфекции и MCTD и идентификации CAEV-инфекции у индивидуумов с MCTD или в других отношениях здоровых индивидуумов, важно было выяснить, развивается ли у индивидуумов, инфицированных CAEV, иммунный ответ, перекрестно-реактивный с ВИЧ-1. Степень иммунитета по отношению к белку ВИЧ-1, gp120, в крови, взятой у инфицированных CAEV индивидуумов, изучали анализом ELISA и вестерн-блоттингом (см. Пример I.E.). Кроме исследования сходства между CAEV-инфекцией и роста иммунной реакции на ВИЧ-1, исследовали сходство между CAEV-инфекцией и MCTD. Так как некоторые больные MCTD из Мексики или Центральной Америки имеют антитела, которые реагируют на gp120 ВИЧ-1 и ингибируют инвазионную способность in vitro, остается установить, появляется ли также у CAEV-инфицированных индивидуумов, не имеющих MCTD, иммунитет против ВИЧ-1.

Как раскрывается в данном описании, инфекция CAEV у людей, страдающих ли MCTD, или в других отношениях здоровых, стимулировала гуморальную иммунную реакцию, перекрестно-реактивную в отношении вирусного антигена gp120 или р24 ВИЧ-1 (см. Пример I.E.). Следует заметить, что ни один из исследованных индивидуумов не был ВИЧ-1-инфицирован, что определяли, применяя официальные клинические анализы. Эти результаты показывают, что иммунизация индивидуума иммуногеном CAEV может вызвать перекрестно-реактивный иммунитет против ВИЧ-1-инфекции, таким образом повышая сопротивляемость ВИЧ-1-инфекции у неинфицированных индивидуумов или облегчая тяжесть патологии вследствие ВИЧ-1 у ВИЧ-1-инфицированных индивидуумов. Далее, наличие общего (системного) ревматического расстройства, например MCTD, у CAEV-инфицированного больного значительно повышало степень ВИЧ-1 перекрестной реактивной способности (Пример. I.E.). Таким образом, введение иммуногена CAEV, предпочтительно, в сочетании с аутоантигеном, связанным с MCTD, например, иммуногена 70К, который вызывает перекрестно-реактивный иммунный ответ на ВИЧ-1 (Douvas and Takehana, supra, 1994), может быть особенно эффективным для стимулирования иммунного ответа перекрестно реагирующего на ВИЧ-1 у человека.

Иммуноген CAEV может быть иммуногенным сам по себе или может быть соединен с молекулой носителя, например с альбумином телячьей сыворотки, или инертным носителем, так чтобы комплекс иммуноген-носитель мог стимулировать иммунный ответ (см., например, Harlow and Lane, supra, 1988). Например, если вакцина содержит целый вирус CAEV, вирус является иммуногенным и может стимулировать иммунную реакцию у вакцинированного. CAEV легко доступен в Американской Коллекции Культур Клеток (ФТСС VR-905).

Вакцина по данному изобретению также может содержать участок пептида белка CAEV, например, gp135 (см. Таблица 1, supra). Выяснено, что каждый из пептидов, приведенных в Таблице 1 или иначе примененных в данном изобретении, может сам по себе не быть иммуногенным. Однако хорошо известно, что такие гаптены могут соединяться с молекулой носителя так, что становятся иммуногенными (см. , например, Harlow and Lane, supra, 1988). Иммунная реакция может стимулироваться in vivo и ex vivo. Например, иммунные клетки, включая Т-клетки и В-клетки, можно взять у субъекта и поместить в культуральную среду ткани. Затем клетки могут контактировать с иммуногеном CAEV, который может стимулировать иммунные клетки и индуцировать иммунную реакцию Т-хелпера и цитоксической Т-клетки.

Вакцина по данному изобретению содержит, помимо иммуногена CAEV, фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны в технике и включают водные растворы, например физиологически забуференный солевой раствор, или другие растворители или носители, такие как гликоли (диолы), глицерин, масла, например оливкое масло, или пригодные для инъекций сложные органические эфиры. Адъюванты, например, квасцы и полный или неполный адъювант Фрейнда или другие подходящие адъюванты известны в технике и промышленно доступны (Ribi Immunochem Research, Inc.; Hamilton MT). Добавление адъюванта обычно снижает количество иммуногена CAEV, требуемого для стимуляции иммунной реакции.

Фармацевтически приемлемый носитель также может содержать физиологически подходящее соединение, которое реагирует, например, стабилизируя иммуноген CAEV или повышая его адсорбцию. Физиологически подходящее соединение включает, например, углеводы, такие как глюкоза, сахароза или декстрины; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или глутатион; хелатирующие агенты; низкомолекулярные белки; или другие стабилизаторы или наполнители. Специалист в данной области знает, что выбор фармацевтически приемлемого носителя, включая физиологически подходящее соединение, зависит, например, от способа введения вакцины и, в особенности, от физико-химических характеристик иммуногена CAEV. В технике известны различные способы введения вакцины для стимуляции иммунной реакции; они включают, например, внутривенную, внутрикожную и подкожную инъекции, оральное и трансдермальное введение.

Если необходимо, вакцина по данному изобретению может также содержать иммуноген 70К или его пептидный фрагмент, который является суррогатным иммуногеном (иммуногеном-заместителем), стимулирующим иммунный ответ, перекрестно-реактивный в отношении ВИЧ-1 (Douvas and Takehana, supra, 1994). Полезно добавлять в вакцину иммуноген 70К, так как он является аутоиммунным белком, который обогащен последовательностями, которые могут стимулировать ранние общие клоны, представляющие собой латентные Т-клетки и В-клетки анти-70К, которые могут легко активироваться для реакции с ВИЧ-1 или могут продуцировать антитела, перекрестно реагирующие на gp120/41, нейтрализующие ВИЧ-1. Добавление иммуногена 70К полезно также потому, что он способствует коамплификации или синергетической амплификации общих клонов с gp120/41. Кроме того, можно отобрать иммуногенные фрагменты 70К, не содержащие аминокислотных последовательностей, которые стимулируют антитела, опосредующие (разрушительное) вредное воздействие, ассоциированное с ВИЧ-1-инфекцией (Douvas and Takehana, supra, 1994).

Иммуноген CAEV может быть получен различными способами, включая, например, технику рекомбинантной ДНК или с помощью методов органического синтеза. Например, если нужен белок CAEV или его пептидный фрагмент, белок или его пептидный фрагмент можно получить клонированием кодирующей последовательности соответствующего CAEV в экспрессирующий вектор, например вектор бакуловируса, и белок или пептид могут экспрессироваться соответствующей клеткой-хозяином и изолироваться от нее. Последовательность нуклеиновой кислоты CAEV можно получить в GenBank, No. M33677 (см. также Saltarelli et al., Virology 179:347-364 (1990); Knowles et al., J. Virol. 65:5744-5750 (1991). Кроме того, желательно (получить) продуцировать рекомбинантный белок или пептид в клетке млекопитающего, которая может осуществить заданную пост-трансляционную модификацию. Соответствующие векторы экспрессии и клетки-хозяева хорошо известны в технике и промышленно доступны, и специалисты в данной области знают, как выбрать соответствующую систему вектор/клетка-хозяин, исходя из конкретных нужд.

Если выбранный иммуноген CAEV является пептидным иммуногеном, как например, иммуногены CAEV, представленные в Таблице 1, пептид можно синтезировать, используя хорошо известный способ химического синтеза, включая, например, автоматизированные твердофазные методы. Химический синтез иммуногена CAEV может быть особено желателен, так как он дает возможность вводить аминокислотные аналоги в пептид. Например, нужно синтезировть иммуноген CAEV, содержащий одну или несколько замен (D)-аминокислот вместо соответствующих природных (L)-аминокислот. Внедрение (D)-аминокислоты может придать иммуногену CAEV желательные свойства, включая, например, повышенную устойчивость пептида, что может быть особенно полезным для приготовления вакцины, которая распространяется в регионах мира, где охлаждение (рефрижирация) не всегда доступно или надежно. Кроме того, пептид CAEV может быть синтезирован и, если нужно, может содержать дополнительный цистеиновый остаток, который может облегчить специфическое соединение пептида с матрицей или молекулой носителя, например, как "ключ-замок" гемоцианина блюдечка, применяя соответствующие условия окисления.

Данное изобретение также предлагает способ стимулирования иммунного ответа индивидуума на CAEV или стимулирование перекрестно-реактивного иммунного ответа на ВИЧ-1 введением терапевтически эффективного количества иммуногена CAEV субъекту. Если требуется, иммуноген CAEV можно заменить на ВМВ (VMV) или иммуногенный фрагмент ВМВ. Далее, может оказаться полезным вводить индивидууму иммуноген 70К, или в сочетании с иммуногеном CAEV или VMV, или самостоятельно.

Хотя ниже говорится о введении иммуногена CAEV индивидууму или применении для вакцинации индивидуума, обнаружено, что иммунный ответ на ВИЧ-1 можно стимулировать in vivo или ex vivo. Каждый из этих способов (охватывается) входит в объем данного изобретения. Например, может оказаться нужным стимулировать иммунный ответ на ВИЧ-1 ех vivo, если индивидуум, подлежащий лечению, болен СПИД'ом. В этом случае у индивидуума должны быть взяты лимфоциты и иммунизированы в культуре. В то же самое время популяция лимфоцитов может быть увеличена. Стимулированные, подращенные иммунные клетки затем снова вливают индивидууму, таким образом обеспечивая индивидууму лечебный эффект. Далее, если даже способ по данному изобретению, например, иммунизация и реинфузия (повторное, обратное вливание) ех vivo, не оказывает лечебного воздействия, такая терапия может быть паллиативной и, следовательно, может улучшить (качество) жизнь индивидуума, страдающего СПИД'ом.

Как показано ниже, вакцинация индивидуума иммуногеном CAEV стимулирует перекрестно-реактивный иммунный ответ на ВИЧ-1. Вакцинация против ВИЧ-1 иммуногеном CAEV, либо одним, либо в соч