Поливалентные ассоциированные коклюшно-дифтерийно- столбнячно (акдс)-полиомиелитные вакцины

Поливалентные ассоциированные коклюшно-дифтерийно- столбнячно (акдс)-полиомиелитные вакцины

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины и касается поливалентной вакцинной композиции, содержащей бесклеточные компоненты коклюшной вакцины, дифтерийный токсоид, столбнячный токсоид и инактивированный полиовирус. Композиция может также содержать конъюгат капсульного полисахарида Haemophilus influenzae типа b и столбнячного или дифтерийного токсоида, который может быть реконструирован (воссоздан) из лиофилизированного состояния другими компонентами этой вакцины. Введение состоящей из многих компонентов вакцины не приводит к уменьшению иммуногенности любого компонента в результате взаимодействия с другими компонентами вакцины. Преимущество изобретения заключается в создании высокоимммуногенного препарата вакцины, включающего иммуногенные индивидуальные компоненты. 3 с. и 22 з.п.ф-лы, 11 табл., 1 ил.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ Изобретение относится к поливалентным вакцинам, в частности, для применения в педиатрии.

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ Эта заявка является частичным продолжением патентной заявки с серийным номером United States Patent Application No. 08/501743, поданной 12 июля 1995 в патентное ведомство США, которая сама является частичным продолжением патентной заявки США с серийным No. 08/433646, поданной 4 мая 1995.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ Коклюш представляет собой тяжелую очень заразную инфекцию верхних дыхательных путей, вызываемую Bordetella pertussis. Согласно оценке Всемирной организации здравоохранения имеется 60 миллионов случаев коклюша в год и 0,5-1 миллион связанных с коклюшем смертей (ссылка 1).( Во всей этой публикации даются многочисленные ссылки в скобках для более полного описания состояния данной области, к которой относится данное изобретение. Полная библиографическая информация для каждого цитирования находится в конце заявки, сразу же после формулы изобретения. Описания этих ссылок включены тем самым в качестве ссылки в данное описание). В невакцинированных популяциях наблюдали такой высокий коэффициент заболеваемости, как 80%, у детей в возрасте менее 5 лет (ссылка 2). Хотя коклюш считается детским заболеванием, имеются все увеличивающиеся доказательства клинического и бессимптомного заболевания у подростков и взрослых (ссылки 3, 4 и 5).

Введение цельноклеточных вакцин, состоящих их химически инактивированных и инактивированных нагреванием организмов В. pertussis, в 1940-х годах вызывало драматичное снижение частоты заболеваний коклюшем, вызываемых В. pertussis. Коэффициенты эффективности для цельноклеточных вакцин были оценены как 95% в зависимости от конкретного случая распознавания заболевания (ссылка 6). Хотя инфекция В. pertussis вызывает пожизненный иммунитет, появляется все больше доказательств уменьшения иммунитета после иммунизации цельноклеточными вакцинами (ссылка 3). Несколько сообщений, указывающих на взаимосвязь между цельноклеточной вакцинацией против коклюша, реактогенностью и серьезными побочными эффектами, привели к отказу от приема вакцин и, как следствие, возобновлению эпидемий. Относительно недавно были разработаны вакцины, состоящие из коклюшных компонентов.

Антигены для описанных коклюшных вакцин Были разработаны многочисленные бесклеточные коклюшные вакцины, включающие в себя антигены Bordetella pertussis, коклюшный токсин (РТ), нитевидный гемагглютинин (FHA), белок наружной мембраны 69 кДа (пертактин) и фимбриальные (жгутиковые) агглютиногены (см. таблицу 1. Таблицы помещены в конце описания).

Коклюшный токсин Коклюшный токсин является экзотоксином, который является членом семейства А/В бактериальных токсинов с АДФ-рибозилтрансферазной активностью (ссылка 8). А-часть этих токсинов проявляет АДФ-рибозилтрансферазную активность, а В-часть медиирует связывание токсина с рецепторами клеток-хозяина и транслокацию А к месту действия. РТ облегчает также прикрепление В. pertussis к реснитчатым эпителиальным клеткам (ссылка 9) и также играет роль в инвазии макрофагов В. pertussis (ссылка 10).

Все бесклеточные коклюшные вакцины включали в себя РТ, который считали основным фактором вирулентности и иммунным антигеном (ссылки 11, 12). Природная инфекция В. pertussis, генерирует как гуморальный, так и клеточно-опосредованный ответы на РТ (ссылки 13-17). Младенцы имеют антитела против РТ трансплацентарного происхождения (ссылки 16, 18), и молозиво человека, содержащее антитела против РТ, было эффективно в пассивном иммунитете мышей против аэрозольной инфекции (ссылка 19). Клеточно-опосредованный иммунный ответ (СМI) на субъединицы РТ, был продемонстрирован после иммунизации бесклеточной вакциной (ссылка 20), а ответ CMI на РТ был вызван после вакцинации цельноклеточными вакцинами (ссылка 13). Химически инактивированный РТ в цельноклеточных или компонентных вакцинах является иммунным в животных моделях и в людях (ссылка 21). Кроме того, моноклональные антитела, специфические для субъединицы 31, защищают против инфекции В. pertussis (ссылки 22 и 23).

Основные патофизиологические эффекты РТ обусловлены его АДФ-рибозилтрансферазной активностью. РТ катализирует перенос АДФ-рибозы от НАД к G₁-гуаниннуклеотидсвязывающему белку, разрушая тем самым клеточную аденилатциклазную регуляторную систему (ссылка 24). РТ также предотвращает миграцию макрофагов и лимфоцитов к местам воспаления и препятствует медиируемому нейтрофилами фагоцитозу и уничтожению бактерий (ссылка 25). Ряд тестов in vitro и in vivo использовали для оценки ферментативной активности 31 и/или РТ, в том числе ДДФ-рибозилирование бычьего трансдуцина (ссылка 26), тест образования кластеров клеток яичника Китайского хомячка (СНО) (ссылка 27), сенсибилизацию гистамином (ссылка 28), лейкоцитоз и НДД-гликогидролазу. При экспонировании с РТ клетки СНО развивают характерную кластерную морфологию. Этот феномен зависит от связывания РТ, последующей его транслокации и АДФ-рибозилтрансферазной активности S1 и поэтому тест образования кластеров СНО широко используется для тестирования целостности и токсичности голотоксинов РТ.

Нитевидный гемагглютинин Нитевидный гемагглютинин представляет собой большой (220 кДа) нетоксичный полипептид, который медиирует присоединение В. pertussis к реснитчатым клеткам верхних дыхательных путей во время бактериального заселения (ссылки 9, 29). Природная инфекция индуцирует антитела против FHA и клеточно-опосредованный иммунитет (ссылки 13, 15, 17, 30 и 31). Антитела против FHA находят в молозиве человека, и они также передаются трансплацентарно (ссылки 17, 18 и 19). Вакцинация цельноклеточными или бесклеточными коклюшными вакцинами генерирует антитела против FHA, а бесклеточные вакцины, содержащие FHA, также индуцируют CMI-ответ на FHA (ссылки 20, 32). FHA представляет собой иммунный антиген в мышиной модели респираторного заражения после активной или пассивной иммунизации (ссылки 33, 34). Однако один FHA не создает иммунитета в мышином тесте эффективности интрацеребрального заражения (ссылка 28).

Белок наружной мембраны 69 кДа (пертактин) Белок 69 кДа является белком наружной мембраны, который первоначально был идентифицирован из В. bronchiseptica (ссылка 35). Этот белок известен также как пертактин и Р.69. Было показано, что он является иммунным антигеном против В. bronchiseptica и он был впоследствии идентифицирован как в В. реrtussis, так и в В. parapertussis. Белок 69 кДа связывается непосредственно с эукариотическими клетками (ссылка 36), и природная инфекция B. pertussis индуцирует гуморальный ответ в виде антител против Р.69 (ссылка 14) и Р.69 индуцирует также клеточно-опосредованный иммунный ответ (ссылка 17, 37, 38). Вакцинация цельноклеточными или бесклеточными вакцинами индуцирует антитела против Р.69 (ссылки 32, 39), а бесклеточные вакцины индуцируют CMI на Р. 69 (ссылка 39). Пертактин защищает мышей против аэрозольного заражения В. pertussis (ссылка 40) и в сочетании с FHA защищает в тесте интрацеребрального заражения против В. pertussis (ссылка 41). Пассивный перенос поликлональных или моноклональных антител против Р.69 также защищает мышей против аэрозольного заражения (ссылка 42).

Агглютиногены Серотипы В. pertussis определяются их агглютинирующими фимбриями (жгутиками). Всемирная организация здравоохранения (WHO) рекомендует, чтобы цельноклеточные вакцины включали в себя типы 1, 2 и 3 агглютиногенов (Aggs), так как они не являются перекрестно-иммунными (ссылка 43). Agg 1 является нефимбриальным и обнаружен на всех штаммах В. pertussis, тогда как Agg серотипов 2 и 3 являются фимбриальными. Природная инфекция или иммунизация цельноклеточными или бесклеточными вакцинами индуцирует антитела против Agg (ссылки 15, 32). Специфический клеточно-опосредованный иммунный ответ может быть генерирован в мышах Agg 2 или Agg 3 после аэрозольной инфекции (ссылка 17). Аgg 2 и 3 являются иммунными в мышах против респираторного заражения, и молозиво человека, содержащее антиагглютиногены, будут также защищать в этом тесте (ссылки 19, 44, 45).

Бесклеточные коклюшные вакцины Первой разработанной бесклеточной коклюшной вакциной была двухкомпонентная РТ+FHA вакцина (JNIH 6) Sato et al. (ссылка 46). Эта вакцина была приготовлена совместной очисткой антигенов РТ и FHA из культурального супернатанта штамма В. pertussis Tohama с последующим превращением в токсоид (обезвреженный токсин) формалином. Бесклеточные вакцины от различных изготовителей и различные композиции использовали с успехом для иммунизации японских детей против коклюша с 1981 года, что привело к серьезному снижению частоты заболевания (ссылка 47). Вакцина JNIH 6 и монокомпонентная РТ-токсоидная вакцина (JNIH 7) были испытаны в большом клиническом испытании в Швеции в 1986 году. Первоначальные результаты показали более низкую эффективность, чем эффективность, сообщенная для цельноклеточной вакцины, но последующие исследования показали, что они были более эффективными против заболевания легкой тяжести, диагностируемого серологическими способами (ссылки 48, 49, 50, 51). Однако было обнаружено возвращение к токсичности инактивированного формалином РТ в этих вакцинах. Было также обнаружено, что эти вакцины защищают скорее от заболевания (защищают уже заболевшего), чем от инфекции.

В настоящее время оценивается ряд новых бесклеточных и компонентных коклюшных вакцин, которые включают в себя комбинации РТ, FHA, Р. 69 и/или агглютиногены, и которые представлены в таблице 1. Несколько способов химической детоксикации были использованы для РТ, в том числе инактивация формалином (ссылка 46), глутаровым альдегидом (ссылка 52), перекисью водорода (ссылка 53) и тетранитрометаном (ссылка 54).

Столбняк Столбняк представляет собой острую инфекцию, вызываемую Clostridium tetani. Это заболевание характеризуется тяжелыми болезненными мышечными сокращениями, сопровождающимися гиперчувствительностью (аллергией), гиперрефлексией и повышенной автономной стимуляцией пораженных частей тела. Легкие стимулы могут вызвать тяжелые непроизвольные мышечные спазмы. Может присутствовать лихорадочное состояние, вызываемое мышечным спазмом. Столбняк может быть генерализованным, включающим в себя лицо, шею, живот и туловище, или локализованным в конкретной части тела (месте поражения). Вовлечение в патологический процесс жевательной мышцы лица приводит к тризму или спазму жевательных мышц, приводящему к возникновению классического выражения лица, известного как "risus sardonicus" (сардоническая улыбка) (ссылка 78).

Clostridium tetani существует в виде непатогенного организма в кишечнике людей и животных. Этот организм обнаружен также в почве, загрязненной фекалиями, и может выживать в почве в течение нескольких лет в виде инфекционных спор (ссылка 79).

Столбняк возникает от анаэробного роста Clostridium tetani и образования нейротоксина в загрязненных тканях. Инфекция вызывается при введении веществ, загрязненных организмами или спорами, в ткань. Наиболее обычным сценарием является инфекция через проникающее повреждение. Однако во многих случаях неизвестна история повреждения. Присутствие некротической или ишемической ткани облегчает рост этой бациллы (ссылка 78).

Предотвращением инфекции является вакцинация и хороший уход за раной, включающий в себя тщательную очистку и хирургическую обработку мертвых тканей. Индивидуумы с загрязненными ранами и те, у кого не были завершены вакцинации, должны получить столбнячную вакцину и столбнячный иммуноглобулин.

Лечение этого синдрома является в основном поддерживающим и может включать в себя поддержку дыхания, введение столбнячного антитоксина и тщательную очистку инфицированных ран. Несмотря на современный медицинский уход, коэффициенты смертности все еще бывают такими высокими, как 30-90% (ссылка 79). Это, в частности, верно для людей пожилого возраста. Природная инфекция не всегда создает иммунитет против последующих инфекций.

Предупреждение инфекции вакцинацией является наиболее эффективным способом борьбы с этим заболеванием. Со времени введения всеобщей вакцинации столбняк стал чрезвычайно редким заболеванием в развитых странах. Случаи столбняка встречаются почти исключительно у индивидуумов, которые не завершили ряда вакцинаций или которые не получили соответствующих бустердоз (повторных доз). Индивидуумы должны получать бустер-дозу один раз каждые 10 лет.

Дифтерия Дифтерия является острой инфекцией, вызываемой бактерией Corynebacterium diphtheriae. Основное место инфекции находится в верхних дыхательных путях (нос, глотка, гортань и трахея) (ссылка 80). Характерным повреждением, результатом бактериального цитотоксина, являются бляшки сероватой псевдомембраны, окруженные воспалением. Это сопровождается цервикальной лимфоаденопатией, набуханием и отеком горла. В тяжелых случаях (набухание) может прогрессировать до обструкции (закупорки) (дифтерийный круп). Другие осложнения включают в себя миокардит, эффекты центральной нервной системы (краниальную невропатию, двигательную и сенсорную невропатии, такие как восходящий паралич) и тромбоцитопению. Другие слизистые оболочки могут быть менее часто поражены. Клиническое проявление может варьировать от бессимптомной инфекции до молниеносной, внезапно развивающейся мультисистемы и смерти (ссылка 79). Кожные и раневые инфекции с дифтерией являются обычными в тропиках. Единственным резервуаром инфекции для С. diphtheriae является человек (ссылка 79).

Предполагаемый диагноз может быть сделан на основании клинического наблюдения характерных повреждений, но он должен быть подтвержден бактериальным исследованием повреждений. Если имеется сильное клиническое подозрение на дифтерию, лечение должно быть начато немедленно антибиотиками (пенициллин или эритромицин) и дифтерийным антитоксином (нейтрализующим токсин антителом), даже если этот диагноз еще не подтвержден. Смертность увеличивается, чем дольше выжидают после появления клинических симптомов (ссылка 80). Коэффициент смертности находится в диапазоне от 5 до 10%, несмотря на современный медицинский уход (ссылка 79) и смертность встречается в основном в случае очень молодых пациентов и пожилых пациентов. Природная инфекция не всегда вызывает иммунитет от последующей инфекции (ссылка 80).

Передача инфекции происходит путем прямого контакта с секрециями или выделениями из инфицированных индивидуумов. Индивидуумы являются заразными до тех пор, пока в секрециях наблюдаются бактерии. Это может продолжаться до 4 недель после инфекции. Передача инфекции имеет также место с инфицированными предметами (ссылка 79). Рекомендуется строгая изоляция пациентов.

Изредка индивидуумы могут становиться носителями и распространяют организмы вплоть до 6 месяцев после инфекции. Неиммунизированные носители должны быть немедленно вакцинированы по полной схеме вакцинации. Лечение антибиотиками устраняет ношение возбудителя и инфекционность пациентов в течение 4 дней (ссылка 80).

Полиомиелит Как инактивированные (IPV), так и живые аттенуированные (OPV) полиовирусные вакцины были эффективными в борьбе с полиомиелитом во всем мире. Комбинированная DPT-IPV вакцина в настоящее время лицензирована в Европе и в Канаде, и было показано, что она была безопасной и эффективной для миллионов детей по всему миру.

Haemophilus influenzae типа b До того как стали доступны эффективные вакцины, Haemophilus influenzae типа b (Hib) был основным возбудителем инвазивных переносимых кровью инфекций менингита в первые 2 года жизни (ссылка 81). Приблизительно 10% жертв менингита, вызываемого Haemophilus influenzae, умирают несмотря на медицинский уход. Перманентные осложнения являются обычными у выживших. Иммунизация против Haemophilus influenzae началась в Канаде в 1987 году полисахаридной вакциной (полирибозорибитолфосфат [PRP] из Haemophilus influenzae типа b). Улучшенная иммуногенность была достигнута у детей в возрасте 18 месяцев и старше с введением в 1988 году вакцины, состоящей из PRP, конъюгированным с дифтерийным токсоидом (PRP-D). С 1992 года была возможна иммунизация младенцев лицензированными PRP-конъюгатными вакцинами, иммуногенными для младенцев в возрасте менее 1 года (PRP, конъюгированный со столбнячным токсоидом, или PRP-Т). Использование этих Haemophilus influenzae-конъюгатных вакцин было ассоциировано с серьезным уменьшением частоты заболевания инвазивной инфекцией Haemophilus influenzae в Канаде и других местах (ссылка 82). Два Канадских клинических исследования с участием почти 900 детей в Британской Колумбии и Альберте показали, что лиофилизированный PRP-T может быть реконституирован (воссоздан из порошка) при помощи DPT (COMBIPACK) (ссылка 83) или при помощи DPT-Polio-адсорбированной вакцины (PENTA^ТМ) (ссылка 84), кроме обычного солевого разбавителя. Клинические исследования с участием более 100000 детей по всему миру продемонстрировали эффективность лиофилизированного PRP-T (ActHib^ТМ). Свыше 90% достигаемых уровней антител против PRP считаются иммунными (больше или равно 0,15 мкг/мл) после 3 доз PRP-T (ActHib^ТМ), начинающихся при 2 месяцах, или после однократной дозы PRP-T, вводимой после 12-месячного возраста. Соотношение, достигающее уровней, указывающих на долгосрочный иммунитет (более 1,0 мкг/мл), варьирует от 70 до 100% в зависимости от исследования. Миллионы доз PRP-T были проданы в Канаде с 1992 года. Случаи инвазивной инфекции Haemophilus influenzae после вакцинации PRP-T являются редкими и могут быть связаны с такими заболеваниями, как иммунодефицит (ссылка 85).

Комбинированные вакцины Хотя имеется много фактических и потенциальных выгод вакцин, которые объединяют антигены для придания иммунитета против множественных патогенов, эти комбинации могут оказывать неблагоприятное действие на иммуногенность индивидуальных компонентов. Комбинации дифтерийного и столбнячного токсоидов с цельноклеточной противококлюшной вакциной (DTP) были доступны на протяжении 50 лет, и образование антител на эту комбинацию превосходило образование антител на индивидуальные компоненты, возможно, в результате адъювантного эффекта цельноклеточной противококлюшной вакцины. Комбинации DTP, которые также включают в себя инактивированную полиовирусную вакцину, лицензированы для многих случаев применения, хотя образование антител на антигены коклюша может быть уменьшено этой комбинацией (ссылки 69-71). Действие объединенных вакцин DTP с конъюгатными вакцинами Hib было вариабельным. Исследования с французским DTP и PRP-T показало такую же безопасность, но уменьшенное образование антител против PRP (ссылки 72-73), тогда как исследования с вакциной Канадского DTP и PRP-T не обнаружили влияния на ответ на PRP, но показали снижение коклюшных агглютиногенов и увеличенную болезненность места инъекции в группе комбинированной иммунизации (ссылки 74, 75).

В настоящее время становятся доступными данные о влиянии комбинирования APDT-вакцин с Hib-конъюгатной вакциной. У двух месячных младенцев, получивших три дозы бесклеточной коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакцины (APDT), комбинированной с Hib-конъюгатной вакциной (PRP-T), образование антител к PRP было значимо более низким, чем в группе, получавшей отдельные инъекции в тот же самый день (ссылка 76). Сходные результаты сообщались и другой бесклеточной коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакцине, комбинированной с PRP-T, предоставляемой в виде первых трех доз (ссылка 77).

В противоположность другим сообщенным исследованиям, дети, иммунизированные комбинированной вакциной, имели превосходящий титр антител к FHA, антигену дифтерии, и нескольким антигенам коклюша по сравнению с детьми, получавшими PRP в виде одновалентной вакцины. Существует несколько причин для эквивалентной или лучшей иммуногенности для этих вакцин, предоставляемых в виде комбинированной инъекции, иных, чем уменьшенная иммуногенность, сообщенная с другими продуктами. Все бесклеточные и компонентные коклюшные вакцины неодинаковы по их антигенному содержанию, способу токсоидирования, адъювантам или консервантам. Однако уменьшенная иммуногенность сообщалась бесклеточными коклюшными вакцинами, содержащими РТ, FHA и 69К и (ссылка 77) и содержащими РТ, FHA, 69K и фимбриальные агглютиногены (ссылка 76).

Было обнаружено, что пятикомпонентная вакцина APDT, исследованная в данном исследовании, имеет защитную эффективность 85% (пример 5), (95% CI 81/89) в фазе III клинического испытания, недавно завершенного в Швеции при содействии Национального Института Здоровья (ссылка 78).

Современные коммерчески доступные комбинированные вакцины могут не содержать подходящих форм подходящих антигенов в подходящих иммуногенных формах для достижения желательного уровня эффективности в восприимчивой к коклюшу популяции человека.

Было бы желательно обеспечение эффективных комбинированных вакцин, включающих в себя бесклеточные коклюшные компоненты, содержащие выбранные относительные количества выбранных антигенов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ Данное изобретение относится к комбинированным или поливалентным вакцинам, содержащим бесклеточные компоненты коклюшной вакцины, и способам их применения.

В соответствии с одним аспектом данного изобретения обеспечена поливалентная иммуногенная композиция для создания иммунитета у хозяина против заболевания, вызываемого инфекцией Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, полиовирусом и/или Haemophilus influenzae, содержащая: (a) коклюшный токсоид, нитевидный гемагглютинин, пертактин и агглютиногены в очищенном виде, (b) столбнячный токсоид, (c) дифтерийный токсоид, (d) инактивированный полиовирус и необязательно (e) конъюгат молекулы-носителя, выбранной из столбнячного токсоида и дифтерийного токсоида, и капсульного полисахарида Haemophilus influenzae типа b.

Эта иммуногенная композиция может быть приготовлена в виде вакцины для введения in vivo хозяину, причем индивидуальные компоненты этой композиции приготовлены таким образом, что иммуногенность индивидуальных компонентов не ухудшается другими индивидуальными компонентами композиции.

Эта иммуногенная композиция может дополнительно содержать адъювант, в частности гидроксид алюминия или фосфат алюминия.

Такая иммуногенная композиция может содержать приблизительно от 5 до приблизительно 30 мкг азота коклюшного токсоида, от примерно 5 до примерно 30 мкг азота нитевидного гемагглютинина, от примерно 3 до примерно 15 мкг азота пертактина и от примерно 1 до примерно 10 мкг азота агглютиногенов.

В одном конкретном варианте, иммуногенная композиция может содержать коклюшный токсоид, нитевидный гемагглютинин, белок 69 кДа и фимбриальные агглютиногены Bordetella pertussis в весовом соотношении примерно 20:20:5:3, обеспечиваемом примерно 20 мкг коклюшного токсоида, примерно 20 мкг нитевидного гемагглютинина, примерно 5 мкг фимбриальных агглютиногенов и примерно 3 мкг белка 69 кДа, в дозе для одного приема для человека. В другом специфическом варианте, вакцина может содержать коклюшный токсоид, нитевидный гемагглютинин, белок 69 кДа и фимбриальный агглютиноген Bordetella pertussis в весовом соотношении 10:5:5:3, обеспечиваемом примерно 10 мкг коклюшного токсоида, примерно 5 мкг нитевидного гемагглютинина, примерно 5 мкг фимбриального агглютиногена и примерно 3 мкг белка 69 кДа, в дозе для одного приема для человека. В одном варианте иммуногенной композиции, обеспеченной здесь, вакцина содержит примерно 15 Lf дифтерийного токсоида и примерно 5 Lf столбнячного токсоида.

Инактивированный полиовирус, применяемый в иммуногенной композиции данного изобретения, обычно включает в себя смесь инактивированных типов полиовируса 1, 2 и 3. Такая смесь инактивированных типов полиовируса 1, 2 и 3 может применяться в композициях: от примерно 20 до примерно 50 единиц антигена D полиовируса типа 1; от примерно 5 до примерно 10 единиц антигена D полиовируса типа 2; от примерно 20 до примерно 50 единиц антигена D полиовируса типа 3 в однократной дозе для человека. В одной композиции такие смеси инактивированных типов полиовируса могут содержать: примерно 40 единиц антигена D полиовируса типа 1; примерно 8 единиц антигена D полиовируса типа 2; примерно 32 единицы антигена D полиовируса типа 3 в разовой дозе для человека.

Компонент конъюгированной молекулы иммуногенной композиции может содержать конъюгат столбнячного токсоида или дифтерийного токсоида и полирибозорибитолфосфата (PRP) Haemophilus Influenzae типа b. Такая молекула-конъюгат может быть обеспечена в лиофилизированной форме, которая воссоздается (реконституируется) для введения путем комбинирования с другими компонентами. Эта иммуногенная композиция может содержать конъюгат в количестве от примерно 5 до примерно 15 мкг PRP, конъюгированного с от примерно 15 до примерно 35 мкг столбнячного токсоида, в разовой дозе для человека. В одной композиции этот конъюгат применяют в количестве примерно 10 мкг PRP, конъюгированного с примерно 20 мкг столбнячного токсоида.

В таких конкретных вариантах иммуногенные композиции обеспечивают профиль иммунного ответа на каждый из антигенов коклюша, содержащихся в них, и этот профиль ответа, обеспечиваемый бесклеточными компонентами, по существу, эквивалентен профилю, создаваемому цельноклеточной коклюшной вакциной.

В предпочтительном варианте данного изобретения обеспечена поливалентная вакцинная композиция, содержащая на дозу 0,5 мл 20 мкг коклюшного токсоида; 20 мкг нитевидного гемагглютинина; 5 мкг фимбриальных агглютиногенов 2 и 3; 3 мкг мембранного белка пертактина; 15 Lf дифтерийного токсоида; 5 Lf столбнячного токсоида; 40 единиц антигена D полиовируса 1; 8 единиц антигена D полиовируса типа 2; 1,5 мкг фосфата алюминия.

Такие композиции могут дополнительно содержать на дозу 0,5 мл 10 мкг очищенного капсульного полисахарида полирибозорибитолфосфата (PRP) Haemophilus influenzae типа b, ковалентно связанного с 20 мкг столбнячного токсоида. Кроме того, такие композиции могут содержать на дозу в 0,5 мл 0,6% 2-феноксиэтанол.

В дополнительном аспекте данного изобретения обеспечен способ иммунизации хозяина против многочисленных заболеваний, предусматривающий введение хозяину, которым может быть человек, иммуноэффективного количества иммуногенной композиции или вакцины, обеспеченной здесь.

Преимущества данного изобретения включают в себя поливалентную вакцину, которая может вызывать безопасным и эффективным образом иммунитет против ряда обычных педиатрических заболеваний. Способность обеспечивать одну вакцинацию против множества заболеваний без мешающих взаимодействий между иммуногенными ответами на различные иммуногены является важным преимуществом данного изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ Данное изобретение будет более хорошо понято из последующего подробного описания и примеров со ссылкой на сопутствующий чертеж, на котором дано схематическое изображение процедуры выделения препарата агглютиногена из штамма Bordetella.

СВЕДЕНИЯ,ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ Приготовление агглютиногена На чертеже показана схема способа получения препарата агглютиногена из штамма Bordetella. Как видно из чертежа, клеточную пасту Bordetella, содержащую агглютиногены, такую как клеточная паста В. pertussis, экстрагируют, например, содержащим мочевину буфером, таким как 10 мМ фосфат калия, 150 мМ NaCI и 4 М мочевина, для селективной экстракции агглютиногенов из клеточной пасты с получением первого супернатанта (sp1), содержащего агглютиногены, и первого оставшегося осадка (ppt1). Первый супернатант (sp1) отделяют от первого оставшегося осадка (ppt1), например, центрифугированием. Оставшийся осадок (ppt1) отбрасывают. Затем осветленный супернатант (sp1) может быть сконцентрирован и диафильтрован против, например, смеси 10 мМ фосфат калия/150 мМ NaCl/0,1% Тритон Х-100, с применением, например, мембранного фильтра NMWL 100-300 кДа.

Затем первый супернатант инкубируют при температуре и в течение времени, достаточных для получения осветленного супернатанта (sp2), содержащего агглютиногены, и второго отбрасываемого осадка (ppt2), содержащего примеси, не являющиеся агглютиногенами. Подходящие температуры находятся в пределах от приблизительно 50 до приблизительно 100^oС, в том числе от приблизительно 75 до приблизительно 85^oС, а подходящие периоды инкубации включают периоды времени от приблизительно 1 до приблизительно 60 минут. Затем осветленный супернатант концентрируют, например, добавлением полиэтиленгликоля с молекулярной массой приблизительно 8000 (ПЭГ 8000) до конечной концентрации приблизительно 4,50,2% и перемешивают осторожно в течение минимально приблизительно 30 минут с получением третьего осадка (ppt3), который может быть собран центрифугированием. Оставшийся супернатант sp3 отбрасывают.

Этот третий осадок (ppt3) экстрагируют, например, буфером, содержащим 10 мМ фосфат калия/150 мМ NaCl, с получением неочищенного фимбриального агглютиногенсодержащего раствора. К неочищенному фимбриальному раствору может быть добавлен 1 М фосфат калия, чтобы сделать его приблизительно 100 мМ относительно фосфата калия. Альтернативно осветленный супернатант обработанных нагреванием агглютиногенов может быть очищен без осаждения гель-фильтрационной хроматографией с применением геля, такого как Sepharose CL6B. Фимбриальные агглютиногены в неочищенном растворе очищают затем колоночной хроматографией, например пропусканием через колонку диоксида кремния PEI, с получением препарата фимбриального агглютиногена в прошедшей через колонку фракции.

Эта прошедшая через колонку фракция, содержащая фимбриальный агглютиноген, может быть дополнительно сконцентрирована и диафильтрована против, например, буфера, содержащего 10 мМ фосфат калия/150 мМ NaCl, с применением мембраны NMWL 100-300 кДа. Препарат агглютиногена может быть простерилизован фильтрованием через мембранный фильтр менее или равный 0,22 мкМ с получением конечного очищенного препарата фимбриального агглютиногена 2 и 3, по существу, не содержащего агглютиногена 1. Весовое отношение Аgg 2 к Аgg 3 может быть от примерно 1,5:1 до примерно 2:1. Вакцины могут содержать другие очищенные иммуногены Bordetella, в том числе нитевидный гемагглютинин, белок наружной мембраны 69 кДа и коклюшный токсин или его токсоид, в том числе генетически детоксифицированные аналоги РТ, описанные, например, в ссылке 68.

Другие иммуногены Bordetella, коклюшный токсин (в том числе его генетически обезвреженные аналоги, описанные, например, в Klein et al. Патент США No. 5085862, принадлежащем заявителю данной заявки и включенном здесь в качестве ссылки), FHA и белок 69 кДа могут быть получены в очищенном виде различными способами, такими как описанные ниже.

Очистка РТ РТ может быть выделен из культурального супернатанта штамма В. pertussis при помощи общепринятых способов. Например, может быть использован способ Sekura et al. (ссылка 55). РТ выделяют сначала абсорбцией культурального супернатанта на колонке, содержащей гелевый матрикс с красителем-лигандом, Affi-Gel Blue (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). РТ элюируют из этой колонки солевым раствором высокой концентрации, таким как 0,75 М хлорид магния, и после удаления соли пропускают через колонку аффинного матрикса fetuin-Sepharose, состоящего из фетуина, связанного с CNBr-активированной Сефарозой. РТ элюируют из фетуиновой колонки при помощи 4 М соли магния.

Альтернативно может быть использован способ Irons et al. (ссылка 56). Культуральный супернатант абсорбируют на колонке CNBr-активированной Сефарозы 4В, с которой сначала связывают гаптоглобин. РТ связывается с абсорбентом при рН 6,5 и элюируется из колонки буфером 0,1 М Трис/0,5 М NaCI ступенчатым изменением до рН 10.

Альтернативно может быть использован способ, описанный в Патенте США No. 4705686, выданном Scott et al. 10 ноября 1987 и включенном здесь в качестве ссылки. В этом способе культуральные супернатанты или клеточные экстракты В. pertussis пропускают через колонку анионообменной смолы достаточной емкости для адсорбции эндотоксина, но позволяющей антигенам Bordetella протекать через нее или отделяться от эндотоксина другим способом.

Альтернативно РТ может быть очищен при помощи хроматографии на перлите, как описано в Патенте ЕР No. 336736, принадлежащем заявителю данной заявки и включенном здесь в качестве ссылки.

Детоксикация РТ РТ обезвреживают для удаления нежелательных активностей, которые могли бы вызывать побочные реакции конечной вакцины. Могут быть использованы любые из разнообразных общепринятых способов химической детоксикации, такие как обработка фомальдегидом, перекисью водорода, тетранитрометаном или глутаровым альдегидом.

Например, РТ может быть обезврежен глутаровым альдегидом согласно модификации процедуры, описанной в Munoz et al. (ссылка 57). В этом способе детоксикации очищенный РТ инкубируют в растворе, содержащем 0,01 М забуференный фосфатом солевой раствор (ЗФР). Раствор готовят 0,05% в отношении глутарового альдегида и эту смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов и затем добавляют L-лизин до концентрации 0,02 М. Эту смесь инкубируют дополнительно в течение 2 часов при комнатной температуре и затем диализуют в течение 2 дней против 0,01 М ЗФР (PBS). В конкретном варианте можно использовать способ детоксикации ЕР Патента No. 336736. Вкратце, РТ может быть детоксифицирован глутаровым альдегидом следующим образом.

Очищенный РТ в 75 мМ фосфате калия при рН 8,0, содержащем 0,22 М хлорида натрия, разбавляют равным объемом глицерина до концентрации белка приблизительно 50-400 мкг/мл. Этот раствор нагревают до 37^oС и детоксифицируют добавлением глутарового альдегида до конечной концентрации 0,5% (в/об). Смесь выдерживают при 37^oС в течение 4 часов и затем добавляют аспарагиновую кислоту (1,5 М) до конечной концентрации 0,25 М. Эту смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа и затем диафильтруют с 10 объемами 10 мМ фосфата калия при рН 8,0, содержащего 0,15 М хлорид натрия и 5% глицерин, для снижения глицерина и удаления глутарового альдегида. Токсоид РТ стерильно фильтруют через мембрану 0,2 мкМ.

Если используют рекомбинантные способы для получения мутантной молекулы РТ, не обнаруживающей токсичности или имеющей низкую токсичность, для применения в качестве превращенной в токсоид молекулы, то химическая детоксикация не является необходимой.

Очистка FHA FHA может быть очищен из культурального супернатанта, как описано Cowell et al. (ссылка 58). Для увеличения выхода FHA в культуральных супернатантах могут быть использованы промоторы роста, такие как метилированные бета-циклодекстрины. Культуральный супернатант наносят на колонку гидроксилапатита. FHA адсорбируется на колонке, а РТ не адсорбируется. Колонку интенсивно промывают Тритоном Х-100 для удаления эндотоксина. Затем FHA элюируют при помощи 0,5 М NaCl в 0,1 М фосфате натрия и, если требуется, пропускают через колонку fetuin-Sepharose для удаления оставшегося РТ. Дополнительная очистка может включать в себя пропускание через колонку Sepharose CL-6B.

Альтернативно FHA может быть очищен при помощи моноклональных антител к этому антигену, причем антитела фиксируют на CNBr-активированной аффинной колонке (ссылка 59).

Альтернативно FHA может быть очищен при помощи хроматографии на перлите, как описано в вышеупомянутом ЕР 336736.

Очистка белка наружной мембраны 69 кДа (пертактина) Белок наружной мембраны 69 кДа (69К или пертактин) может быть извлечен из бактериальных клеток инактивацией сначала этих клеток бактериостатическим агентом, таким как тимеросал, как описано в опубликованном ЕР 484621, включенном здесь в качестве ссылки. Инактивированные клетки суспендируют в водной среде, такой как ЗФР (рН 7-8), и подвергают повторяемой экстракции при повышенной температуре (45-60^oС) с последующим охлаждением до комнатной температуры или до 4^oС. Экстракции высвобождают белок 69К из клеток. Материал, содержащий белок 69К, собирают осаждением и пропускаю