Модифицированный c3 белок человека, фрагмент днк, конъюгат, фармацевтическая композиция, способ уменьшения количества белка

Модифицированный c3 белок человека, фрагмент днк, конъюгат, фармацевтическая композиция, способ уменьшения количества белка

Реферат

 

Изобретение относится к нативным белкам схемы комплемента, модифицированным таким образом, что белок способен образовывать стабильную С3 конвертазу. Предпочтительный модифицированный белок представляет модифицированный С3 белок человека. В аминокислотной последовательности С3 белки заменены Arg 1303 и/или Arg 1320, или аминокислотными остатками 752-754 и/или 758-780, или 1427, 1431 и/или 1433. Предложены также ДНК последовательности, кодирующие такие белки. Описаны конъюгаты, содержащие такие белки, связанные с антителом. Фармацевтическая композиция включает конъюгат и фармацевтически приемлемый носитель. При введении млекопитающему модифицированного белка или фармацевтической композиции происходит уменьшение количества белка системы комплемента. Изобретение позволяет повысить степень С3 конверсии. 5 с. и 12 з.п.ф-лы, 9 ил., 1 табл.

Изобретение относится к новым модифицированным белкам, способным образовывать стабильные С3 конвертазы, к ДНК последовательностям, кодирующим такие белки, и к их использованию в качестве терапевтических агентов, особенно для использования для снижения уровней белков схемы комплемента.

Функционирование системы комплемента в иммунных реакциях людей и других позвоночных играет основную роль в таких эффекторных функциях, как фагоцитоз, цитолиз и возбуждение клеток, которые индуцируют локальные воспалительные реакции [15]. Такие свойства необходимы для исключения таких заражающих патогенов, как бактерии, но вовсе нежелательны, когда их действие направлено против тканей организма-хозяина /например, при повреждении постишемической реперфузии [3]/ или против чужеродного терапевтического материала /например, гиперострое отторжение ксенотрансплантатов [7]/. Были предприняты попытки исключить эти нежелательные свойства за счет использования производных регуляторных протеинов комплемента, функция которых состоит в подавлении активации комплемента [10, 18].

Система комплемента включает протеины как на поверхности клеток /рецепторы и регуляторы/, так и в жидкой фазе /плазма крови и другое внеклеточное окружение/. Критической стадией для возбуждения реакции является протеолитическое превращение С3 во фрагменты C3b и С3а. Фрагмент С3а представляет анафилатоксин, который, подобно C5a, притягивает тучные клетки к очагу заражения, что приводит к локальному выделению гистамина, вазодиляции, и к другим воспалительным эффектам. Образующиеся С3b обладают способностью связываться с поверхностью вокруг очага их образования. Затем эти С3b фокусируют атаку за счет цитолитических компонентов комплемента /С5-С9/.

Связанные с поверхностью С3b и их продукты разложения также функционируют как лиганды для С3 рецепторов, участвуя, например, в фагоцитозе [15]. Существуют две различные схемы активации комплемента, причем обе они приводят к превращению С3 в С3b и к последующей реакции. Классическим путем является обычно возбуждение комплексов антитело - антиген, инициируя ряд ферментов, включающий белки С1q, С1r, C1s, С2 и С4. Альтернативная схема зависит от активационной петли, включающей сам С3 и требующей участия факторов В и Д.

Превращение С3 в С3b /или C3i / дает продукт, который может объединяться с фактором В, образуя С3bВ /или С3iВ/. Эти комплексы подвергаются воздействию фактора D с образованием С3bВb, что представляет собой С3 конвертазу, которая способна увеличить превращение С3 в С3b, что приводит к увеличению числа С3bBb, и еще более увеличивает конверсию С3. В определенных обстоятельствах комплекс С3bВb стабилизируется за счет ассоциации с позитивным регуляторным пропердином /Р/. Однако такая петля положительной обратной связи обычно бывает ограничена до медленных актов за счет регуляторных протеинов, особенно фактора Н и фактора I.

Фактор Н /и структурно родственные связанные с клетками молекулы/ /i/ удаляет В и Bb с С3b, и /ii/ действует как кофактор для фактора I, который расщепляет С3b до iC3b, тем самым предотвращая какую бы то ни было рекомбинацию с фактором В и образование большего количества конвертаз. Этот путь направлен на усиленное образование С3b на поверхности, например, клеточных стенок бактерий, которые связывают образующиеся С3b и мешают их регуляции за счет факторов Н и I. Образующиеся С3b способны также связываться с эндогенными клетками. Поэтому эндогенные клеточные поверхности, обычно доступные комплементу, оказываются дополнительно защищены за счет таких связанных с мембраной регуляторов, как МСР, DАF и CR1, действующих аналогично фактору Н.

Существует несколько редко встречающихся в природе условий, при которых не может происходить нормальная регуляция в жидкой фазе, и спонтанная С3 конверсия в конечном счете приводит к общему исключению С3 из циркуляции: /i/ генетический дефицит фактора Н или фактора I [13], /ii/ наличие антител /нефритные факторы/, которые связываются в С3bВb и препятствуют диссоциации [4] , и /iii/ контакт с протеином яда кобры, называемым фактором яда кобры /CVF/, который объединяется с фактором В и образует конвертазу, которая не содержит С3b, и не подвержена воздействию факторов Н и I [14]. Это иллюстрирует нормальную физиологическую важность регуляции в сторону уменьшения /даунрегуляции/ комплемента в отсутствие специфической активации.

Существуют также обстоятельства, при которых наблюдается специфическая активация, но оказывается нежелательной, особенно, если она направлена против тканей хозяина /например, повреждение тканей при ишемии или хирургическом вмешательстве/ или против чужеродного материала, преднамеренно используемого для терапевтических целей /такого, как ксенотрансплантаты, искусственные органы или мембраны для диализа/. Активация комплемента приводит к нежелательной атаке и дальнейшему поражению, так что в таких случаях желательно блокировать или ингибировать такую активацию и реакцию.

Существующие подходы для предотвращения повреждений за счет комплемента направлены на использование даун-регулирующих протеинов /СR1, МСР, DАF и факторов Н и I/ для ингибирования активации комплемента. Ингибиторы комплемента подобные фактору I, фактору Н и растворимым производным связанных с мембраной протеинов СR1, DAF MCP, подавляют петлю амплификации в жидкой фазе в альтернативной схеме. Поэтому были предприняты попытки использовать эти молекулы, в частности СR1 /который, по-видимому, является наиболее эффективным/ для уменьшения связанных с комплементом поражений в моделях физиологических ситуаций [10, 18].

Фактор Н эндогенно присутствует в плазме крови в высоких концентрациях /обычно 0,3-0,5 мг/мл [15]/, и хотя повышенные уровни ингибиторов ослабляют жидкофазные реакции, их эффективность мала, и поэтому приходится вводить ин виво большие количества очищенных протеинов /например, более 5 мг/кг веса тела растворимого CR1/. Кроме того, альтернативная схема активируется поверхностями, где влияние фактора Н уже ослаблено. Хотя это не обязательно попутно снижает активности других ингибиторов, предполагают, что те же факторы, по-видимому, не могут быть столь же полно или универсально эффективны.

Фактор яда кобры /CVF/ обладает свойством выработки стабильной С3 конвертазы, которую можно использовать экспериментально для снижения количества комплемента у животных ин виво и в других образцах /например, в плазме крови человека/ ин витро. CVF эффективен /например, 40 мкг/кг могут разрушить активность комплемента у мыши [16]/. Однако существуют недостатки, которые делают его неподходящим для терапевтического использования при лечении людей.

Во-первых, его получают из яда кобры /малодоступный источник и опасности при работе с препаратом/, что требует тщательной очистки от нейротоксинов яда. Существуют также очевидные трудности в получении материала. Эту проблему нельзя легко решить за счет клонирования и экспрессии гена ex vivo, так как существуют посттрансляционные модификации, которые наблюдаются у змей /специфический протеолитический процессинг/, которые могут оказаться трудно /или невозможно/ воспроизводимыми ин витро. Кроме того, ферменты и условия расщепления, необходимые для такого процессинга, в настоящее время неизвестны. Во-вторых, протеин является чужеродным /для человека/ и поэтому иммуногенным. Это делает невозможным его повторное использование для терапевтических целей, так как требует декомплементации пациента в течение многих недель /например, для обеспечения приживаемости ксенотрансплантатов/.

Хотя CVF имеет некоторую структурную и функциональную гомологичность с С3 человека [17], он также имеет существенные отличия в этих двух аспектах /например, в строении цепей, сайтах биосинтеза, нечувствительности к регуляторам комплемента, в образовании стабильной С3 конвертазы/. Он не получен из змеиного эквивалента /от кобры/ С3, который, как известно, был клонирован и секвенирован и который по структуре и функциям напоминает С3 человека более сильно, нежели CVF [8].

CVF представляет ядоспецифический продукт животного, находящегося на значительной эволюционной дистанции от гомо сапиенс. Именно поэтому нежелательно использовать генетические манипуляции для модификации этого протеина для получения продукта, который приемлем человеку для неиммуногенного использования.

Был разработан альтернативный подход, который основан на том, чтобы обойти физиологическую регуляцию, и вместо ингибирования активации комплемента вызывает суперактивацию системы. Это имеет два применения. Во-первых, это можно использовать ин виво для активации комплемента до тех пор, пока не израсходуется один или более из компонентов, что приводит к потере способности вызывать локальные реакции на любое последующее заражение /например, на ксенотрансплантаты/. Во-вторых, нерегулируемую суперактивацию можно преднамеренно локализовать на конкретной мишени /например, на вирус или инфицированную вирусом клетку/ для повышения чувствительности такой направленной, осуществляемой за счет комплемента деструктивной реакции.

Термин "регуляторы активации комплемента" используют здесь по отношению ко всем протеинам, которые действуют как ингибиторы амплификации С3 конверсии, и его значение не следует ограничивать теми протеинами, гены которых расположены в RCA генетическом локусе. Однако он не должен включать такие "ап-регуляторы" /усиливающие регуляторы/, как пропердин. Термин "С3 конверсия" определяют как конверсию С3 в C3b и С3а, если нет других указаний, а термин "С3 конвертаза" /или просто "конвертаза"/ определяют как фермент /обычно комплекс двух или более протеиновых компонентов; например, C3bBb, C3iBb, CVFBb или С4b2а/, который является катализатором этой реакции.

Таким образом, в первом аспекте в настоящем изобретении предложен протеин, действующий по схеме нативного комплемента, модифицированный таким образом, что этот протеин способен образовывать стабильную С3 конвертазу.

Под термином "нативный" подразумевают встречающийся в природе. Таким образом, это определение охватывает любые протеины, действующие по схеме нативного комплемента, модифицированные как указано ранее. Их не следует ограничивать протеинами специфических видов. Другими словами, модифицированный протеин человека можно использовать в качестве стабильной С3 конвертазы и в других видах млекопитающих. Обычно используют модифицированные протеины, действующие по схеме комплемента, из того же самого вида.

Модификации С3 ДНК кодирующей последовательности, например, за счет сайтнаправленного мутагенеза могут привести к получению такого варианта С3, который устойчив к регуляторным протеинам комплемента, сохраняя при этом позитивные функциональные свойства /расщепление до C3b за счет С3 конвертазы/ и характеристики структурной целостности /правильная структура цепи и наличие тиолэстерной связи/. Описываемое здесь изобретение относится к генетически модифицированным формам протеинов нативных комплементов, например к С3 человека, C3b фрагмент которого приобретает свойство устойчивости к физиологической комплементной регуляции. Благодаря такой устойчивости эти молекулы могут вырабатывать стабилизированные формы соответствующей С3 конвертазы, которые продуцируют усиленную конверсию С3 в C3b, и последующие продукты разложения в физиологических условиях /например, ин виво/.

В предпочтительном варианте в изобретении предложен модифицированный С3 протеин человека, который устойчив к расщеплению под действием фактора I.

Этого можно достичь модифицируя остатки протеина по протеолитическим сайтам.

Наиболее предпочтительный вариант изобретения относится к модифицированному протеину С3 человека, где протеин модифицирован за счет замены либо Arg-1303, Аrg-1320, либо их обоих, другой аминокислотой. Такой другой аминокислотой может быть тирозин, цистеин, триптофан, глутамин, глутаминовая кислота или глицин. Предпочтительно заменять Аrg-1303 на глутаминовую кислоту или глицин /менее предпочтительно на глутамин/. Предпочтительно Arg-1320 заменять на глутамин.

Другие подходы для получения подходящих модифицированных протеинов настоящего изобретения включают: i/ пониженную подверженность ингибирующему воздействию фактора Н и родственных протеинов /например, МСР, DAF, CR1/. Для примера в С3 человека остатки 767-776 и 1209-1271 вовлечены в связывание фактора Н [20, 24], и замена одного или более из этих остатков или других остатков, также связанных с действием этих протеинов, может уменьшить связывание одного или более из этих регуляторных протеинов.

ii/ Пониженную степень диссоциации C3bВb. Можно осуществить мутации, которые усилят взаимодействие между C3b и Вb. Это приведет как к снижению спонтанной декомпозиции энзима, так и уменьшит эффективность фактора Н /и родственных регуляторов/ в вытеснении Вb из C3b.

Эти мутации желательны для уменьшения степени как спонтанной, так и осуществляемой за счет фактора Н декомпозиции C3bВb. Даже в отсутствие фактора Н срок полураспада комплекса C3bВb в жидкой фазе составляет всего около 10 минут при 37^oС в присутствии пропердина [6].

iii/ Остатки 752-761 С3 человека участвуют в связывании фактора В. Это высококонсервативный участок С3, и близкородственная последовательность обнаружена в С4. Так как С4 связывает гомолог С2 фактора В, близкое сходство этого участка для С3 и С4, наряду с его высокой консервативностью в С3, является дальнейшим подтверждением его роли в С3 в качестве сайта связывания фактора В. Таким образом, изменения в этом участке могут оказывать влияние на афинность В и на стабильность C3bВb.

iv/ Устойчивость к другим регуляторам активации комплемента, таким как СR1, DАF и МСР, также была бы желательна. Тип действия этих регуляторов совершенно схож с действием фактора Н, так что при этом не потребуется дополнительного мутагенеза. Аналогично некоторые патогенные организмы экспрессируют свои собственные ингибиторы активации комплемента, которые часто структурно и функционально гомологичны фактору Н /например, секреторный пептид вируса Vaccinia/. Эти молекулы защищают вторгающихся от иммунной реакции, и было бы желательно иметь возможность атаковать их направленными энзимами - С3-конвертазами, устойчивыми к этим защитным свойствам.

v/ Мутации, которые повышают стабилизацию С3 конвертазы за счет пропердина. Активность пропердина состоит в стабилизации C3bВb комплекса, уменьшая спонтанную и зависящую от фактора Н диссоциацию. Такая стабилизация неэффективна в жидкой фазе, но, по-видимому, более важна в усилении процесса, коль скоро он уже начался на подходящей активирующей поверхности [5]. Повышение активности /за счет повышения афинности/ может нарушить баланс в жидкой фазе и тем самым промотировать спонтанную С3 конверсию. Это должно быть особенно эффективно в сочетании с другими модификациями, описанными ранее.

vi/ Мутации, которые предохраняют C3bВb от обладания С5 конвертазной активностью. При использовании для предотвращения активного С3 от циркуляции нежелательным побочным эффектом может быть выработка больших количеств анафилактических пептидов. Наиболее эффективным из них является С5а, который отщепляется от С5 С3 конвертазными энзимами. Эта реакция, вероятно, зависит от афинности конвертазы для другой молекулы С3b [11], и поэтому может служить предметом для подавления за счет мутаций для С3, которые удаляют это взаимодействие.

vii/ Повышенная активность С3 конвертазы. Активный сайт C3bВb С3 конвертазы расположен в Вb части. Предположительная функция С3 компонента состоит в придании активной конформации на Вb и/или в связывании и ориентировании субстрата, на который необходимо воздействовать, за счет Вb. Это неизвестно, но в любом случае может найтись возможность для повышения активности конвертазы за счет мутаций в С3.

viii/ Экспрессия в функциональной форме. Дикого типа С3 требует конверсии в C3b до того, как он может объединиться в новый С3 конвертазный комплекс. При использовании ин виво, требование для превращения в C3b /или C3i/ будет замедлять действие модифицированного С3. Поэтому было бы желательно либо вводить протеин в форме, способной к немедленному образованию конвертазы, либо вводить заранее сформированные комплексы конвертазы. Поэтому выгодно создавать C3b-подобный реагент экс виво. Этого можно достичь ин витро /например, за счет протеолиза/.

ix/ Модификации нативного протеина, которые служат для введения новых сайтов расщепления, таких как пептидные участки, необходимые для связывания фактора В, сохраняют, а те, которые необходимы исключительно для связывания фактора Н, можно специфически удалить. Так, например, можно ввести сайты таким образом, чтобы C3b-подобную форму модифицированных С3 можно было бы далее расщепить до форм, которые все еще связывают фактор В, но которые менее подвержены инактивации за счет факторов Н и I.

х/ Модификации в других участках, которые могут повлиять на C3b взаимодействия с фактором В и/или фактором Н.

Настоящее изобретение основано на опровержении традиционного подхода за счет промотирования С3 конверсии для расщепления С3 и тем самым выведения системы из строя. Дополнительное применение изобретения состоит в возможности промотировать С3 конверсию по конкретному сайту и тем самым заставить комплементзависимый эффекторный механизм атаковать специфическую мишень.

Вот почему конечным эффектом является повышение степени С3 конверсии при введении модифицированного протеина в физиологическую среду /например, в кровь/, содержащую регуляторы активации комплемента. Затем эту активность используют либо для истощения этой среды нативного С3, либо для локализации С3 конверсии целевой мишени.

Аналог С3, С3b-фрагмент которого устойчив к действию фактора I /например, производное, описанное в примере 1/, будет связывать фактор В, который затем будет расщепляться фактором D, и, в конечном счете, будет диссоциировать в неактивную форму. В отсутствие инактивации за счет фактора I модифицированный C3b будет способен повторно связывать новые молекулы фактора В и тем самым промотировать его инактивацию. Поэтому другим возможным применением описываемых в настоящем изобретении модификаций должна быть инактивация альтернативной схемы за счет исключения активности фактора В. Аналогичный подход можно также использовать для модификации С4 для промотирования исключения С2 и тем самым исключить классическую схему активации комплемента.

Настоящее изобретение включает любые другие протеазы, которые используют способом, аналогичным с C3bBb ферментом, что приводит к расщеплению С3 до C3b, независимо от присутствия регуляторов активации комплемента.

Настоящее изобретение включает также ДНК последовательности, которые кодируют протеин настоящего изобретения, а также ДНК конструкции, включающие такие ДНК последовательности.

Термин "ДНК последовательности" включает все другие последовательности нуклеиновых кислот, которые за счет дегенеративности генетического кода также кодируют данную аминокислотную последовательность или которые практически гомологичны этой последовательности. Поэтому такие последовательности также включены в объем настоящего изобретения.

Последовательности нуклеиновых кислот, которые "практически гомологичны", также входят в объем настоящего изобретения. Термин "существенная гомологичность" может относиться либо к уровню нуклиновых кислот, либо к уровню аминокислот. На уровне нуклеиновых кислот последовательности, обладающие существенной гомологичностью, могут рассматриваться как последовательности, которые гибридизуются с последовательностями нуклеиновых кислот настоящего изобретения в жестких условиях /например, при 35-65^oС в солевом растворе около 0,9 М/. На аминокислотном уровне последовательность протеина можно рассматривать как практически гомологичную другой последовательности протеина, если значительное количество составляющих аминокислот демонстрируют гомологичность. Гомологичными могут быть по крайней мере 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или даже 99% аминокислот в порядке возрастающей предпочтительности.

Как обсуждалось ранее, протеины настоящего изобретения можно использовать для достижения эффектов локализованной активации комплемента. Одним из способов достижения этого является конъюгация протеина с фрагментом, который будет связываться по нужной мишени. Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает конъюгат, включающий протеин настоящего изобретения, связанный со специфическим связывающим фрагментом, например со специфическим связывающим протеином. Примером такого протеина может служить антитело или антиген, связывающие его фрагмент.

Протеины настоящего изобретения предназначены для введения субъекту для выработки желательного терапевтического эффекта. С этой точки зрения настоящее изобретение обеспечивает также: а/ протеин настоящего изобретения для использования при терапевтическом лечении; b/ использование протеина или конъюгата настоящего изобретения для получения медикамента для использования для снижения уровней протеина, действующего по схеме комплемента, и, в частности, для предотвращения отторжения чужеродного материала; с/ фармацевтическую композицию, включающую один или более из протеинов или конъюгатов изобретения вместе с одним или более из фармацевтически приемлемых носителей и/или эксципиентов; и d/ способ уменьшения уровней протеина, действующего по схеме комплемента, у млекопитающего, который включает введение этому млекопитающему протеина настоящего изобретения предпочтительно в форме фармацевтической композиции.

Фармацевтические композиции могут присутствовать в форме единичных доз, содержащих заранее определенное количество активного ингредиента на дозу. Такая единица может содержать как минимум, например, 1 мг активного ингредиента и предпочтительно 2-3 мг. Верхний предел, который может содержать такая доза, будет зависеть от многих факторов, таких как подлежащее лечению состояние, способ введения и возраст пациента, вес и его состояние, а также экономические соображения. В качестве примера, единичная дозовая форма может содержать 10 мг и даже 100 мг активного ингредиента.

Протеины настоящего изобретения можно использовать ин виво для разрушения системы комплемента. Такая необходимость может возникнуть в следующих случаях: а/ Для предотвращения осуществляемой за счет комплемента деструкции или повреждения трансплантата, в частности ксенотрансплантата /материала, трансплантированного от другого человека или от животного/ и особенно дискордантных ксенотрансплантатов /когда виды донора и реципиента дискордантно связаны/. Реципиента следует "декомплементировать" до операции и поддерживать в этом состоянии до тех пор, пока трансплантат не приживется, либо не будет заменен более совместимым органом.

Начальную обработку можно осуществить за несколько дней до трансплантации. В моменты кризисов отторжения может потребоваться дополнительная декомплементация. Такое лечение может сопровождаться использованием антигистаминных реагентов для контроля за общими воспалительными реакциями /например, за вазодиляцией/, подобно результатам образования С3а и/или С5а.

Декомплементация может оказаться выгодной при использовании искусственных органов или тканей /например, мембран для диализа искусственной почки/, которые активируют систему комплемента. Как было указано ранее, протеин можно вводить либо в инактивированной форме, функционально C3b-подобной форме или преформе активной С3 конвертазы /подобно C3bВb/. Их можно вводить любым способом, за счет которого активированная конвертаза сможет встретить циркулирующие С3 /например, внутривенно, подкожно и т.д./.

Другой альтернативной является экс виво обработка, например, за счет трансфузии циркулирующей жидкости через матрицу, содержащую активную конвертазу. Этот способ имеет то преимущество, что позволяет анафилактические пептиды /С3а и C5a/ и другие низкомолекулярные медиаторы воспалений /например, гистамин и окись азота/ удалять /например, за счет диализа/ до того, как декомплементированная кровь /или плазма/ будет возвращена в организм пациента.

b/ Для предотвращения осуществляемых за счет комплемента повреждений после хирургических операций. Осуществляют декомплементацию пациента, как указано ранее, предпочтительно перед операцией /но при необходимости после нее/ и поддерживают это состояние до тех пор, пока не уменьшается опасность дополнительных внутренних осложнений за счет зависимых от комплемента иммунных реакций.

с/ Для минимизации связанных с комплементом повреждений, возникающих за счет травм нехирургического происхождения. В этих случаях декомплементацию следует осуществлять после исходного повреждения, но композиции и способы введения, по-видимому, должны быть в основном сходны с описанными ранее. Это может быть особенно полезным, если выздоровление включает повторную перфузию ишемических тканей за счет циркуляции /например, ишемия миокарда, обморожения, ожоги и т.д./.

d/ Для минимизации связанных с комплементом повреждений, возникающих за счет взаимодействий типа антитело - антиген. Защитные реакции, осуществляемые за счет комплемента, особенно нежелательны при автоиммунных заболеваниях, которые могут включать гломерулонефриты, гемолитическую анемию, миастению гравис и артриты, вызванные коллагеном типа II. Блокирование функций системы комплемента во время серьезных случаев заболеваний может облегчить состояние.

е/ Для того чтобы сделать специфическую патогенную мишень более чувствительной к действию иммунных механизмов, осуществляемых за счет комплемента. При таком подходе целью является не использование суперактивной С3 конвертазы для достижения полного исчерпания С3, но вместо этого использование конвертазы локально для концентрирования С3 конверсии у желательной цели. Такой целью может быть патогенный организм, например бактерия, вирус или другие паразиты, или вредные клетки или ткани хозяина, например опухолевые клетки или инфицированные вирусом клетки. С3 конвертазу можно локализовать у мишени за счет локального введения /например, за счет прямой инъекции, возможно в среду, которая задерживает его распространение в общую циркуляцию/, или за счет объединения с направляющим к мишени фрагментом, например антителом. Таким образом, модифицированный протеин можно связать со специфическим иммуноглобулином либо за счет химической сшивки протеинов, либо за счет присоединения к ДНК кодирующим последовательностям и последующей экспрессии /и выделения/ слитого белка /например, в случае IgG, либо тяжелая, либо легкая цепи могут быть соединены с С3 и могут совместно экспрессироваться с С3, либо обе цепи можно объединить в один полный слитый полипептид/, или за счет введения специфических кодирующих последовательностей /например, для доменов, похожих на "лейциновую молнию/" в ДНК обоих партнеров слияния /например, модифицированного С3 и специфического антитела/ так, что продукты экспрессии, будучи смешаны вместе, самоассоциируют с образованием стабильных конъюгатов. Затем слитый белок можно ввести локально или в общую циркуляцию.

Липосомы /содержащие антитела на поверхности с модифицированным протеином, либо на поверхности либо внутри липосомы/ и/или вирионы /например, сконструированные так, чтобы экспрессировать протеины на своей поверхности/ также можно использовать для совместной доставки антитела и модифицированного протеина. Такой подход можно использовать непосредственно, отдельно или в сочетании с другими обработками, на любой стадии развития заболевания. Это может быть особенно подходящим для исключения любых раковых клеток, которые остаются в циркуляции после хирургического удаления опухоли. Конъюгаты антитело - модифицированный протеин также можно использовать экс виво для исключения патогенных тканей. Так например, для уничтожения лейкемичных клеток в извлеченном костном мозге с последующим возвращением оставшихся здоровых клеток пациенту.

В другом варианте лимфоциты, которые не соответствуют МНС типам реципиента /основной комплекс гистосовместимости/, можно исключить из костного мозга перед трансплантацией. Кроме того, модифицированный протеин можно связать с антигеном, и такую комбинацию использовать либо ин виво, либо экс виво для подавления лимфоцитов с нежелательной реакционной способностью /например, против трансплантата или собственной ткани/.

Ту же самую технологию можно применить при лечении других видов, используя либо производные модифицированного протеина человека, либо аналоги, сконструированные специально для этих видов.

Предпочтительными характеристиками для каждого из аспектов настоящего изобретения являются те же, что и для каждого аспекта Mutatis Mutandis.

Далее настоящее изобретение будет описано со ссылкой на следующие примеры, которые не следует рассматривать как ограничивающие изобретение. Примеры сопровождаются чертежами, на которых: Фиг. 1 представляет предсказанную последовательность протеина С3 человека, как закодировано в РС3 /использован стандартный однобуквенный код для аминокислот/.

Фиг. 2 представляет кДНК последовательность в РС3 /использован стандартный однобуквенный код для дезоксинуклеотида для смысловой цепочки, записанный как 5'-3'/.

Фиг. 3 представляет визуализацию модифицированных протеинов настоящего изобретения.

Фиг.4 представляет влияние различных мутаций на С3 человека, при которых заменяют Аrg 1303 или Аrg 1320 на расщепление по этим сайтам за счет фактора I.

Примечание: 1. [35S] - биосинтетически меченные образцы.

2. Реакции ведут при нормальной ионной силе.

3. Иммуноосаждение за счет анти-С3.

4. ПААГ - ДСН (гель - электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом Nа) в восстанавливающих условиях.

5. Авторадиография.

Фиг. 5 представляет повышенную устойчивость С3 человека, содержащего мутацию, при которой Аrg 1303 заменяют на Сln 1303, к инактивации за счет факторов I и Н.

Фиг.6 представляет анализ расщепления С3 конвертазы, мутированной по аминокислотным остаткам 752-754 и 758-760.

Это фотография результатов Вестернблоттинга из 7,5% полиакриламидного ПААГ-ДСН геля /восстановительные условия/ после электрофоретического переноса на нитроцеллюлозу, зондирования овечьими анти-С3 человека антителами и выработки антител к антиовечьему иммуноглобулину, соединенному с пероксидазой хрена, и усовершенствованной хемилюминесценции /способ и реагенты для детектирования от Amersham, Великобритания/, зарегистрированный на ренгеновской пленке. Реакции расщепления и процедуру детектирования осуществляют в соответствии со способом примера 4 со ссылкой на результаты, представленные на фиг.3.

Ключ: Полосы 1-4: дикого типа С3 /экспрессированы в COS клетках) Полосы 5-8: мутантные С3 /остатки 752-754 заменены на Сlу - Ser-Gly и остатки 758-760 также заменены на Сlу--Сlу /экспрессированы в COS клетках) Полосы 1,5: без добавления Полосы 2,6: +CVFBb Полосы 3,7: + факторы Н+I Полосы 4,8: +CVFBb + факторы Н+I Стрелками указаны полосы: А: С3 альфа-цепь В: С3 альфа'-цепь С: С3 бета-цепь Д: 68 кDа продукт расщепления С3 альфа'-цепи Е: тяжелая цепь IgG Фиг. 7 представляет анализ расщепления радиомеченого фактора В за счет фактора D в присутствии дикого типа и мутантных С3 /С3i/.

Представлена фотография авторадиографии ПААГ-ДСН геля.

Все образцы, содержащие фактор D и ¹²⁵I-меченый фактор В, были инкубированы в течение 3 часов при 37^oС.

Образцы в пронумерованных полосах включают также: 1. Один буфер 2. 1/125 дикого типа С3 3. 1/25 дикого типа С3 4. 1/5 дикого типа С3 5. 1/25 мутант С3 /остатки 1427 Gln, 1431 Asp и 1433 Gln/ 6. 1/5 мутант С3 7. Неразбавленный мутант С3 Полосы, указанные стрелками: А. Нерасщепленный ¹²⁵I-меченый фактор В /93 кДа/ B. 60 кДа продукт расщепления /"Bb"/ С. 33 кДа продукт расщепления /"Ва"/ Фиг. 8 представляет ПААГ-ДСН исследования, иллюстрирующие образование конъюгата между С3i и IgG.

Это штамм Coomassic 4% акриламидного ПААГ-DСН геля, проведенного в невосстанавливающих условиях. Пронумерованные полосы содержат образцы: 1. РДР - IgG 2. С3 3. РДР - IgG + С3i реакционная смесь Стрелками обозначены: А. Вероятный C3i - IgG конъюгат /350 кДа/ В. С3i /200 кДА/ С. IgG /150 КДа/ Фиг. 9 демонстрирует тот факт, что конъюгат направляет С3 конвертазную активность против эритроцитов овцы. /Этот график показывает % подвергшихся лизису эритроцитов овцы после нанесения на них разбавлений либо C3i-IgG-конъюгата, PDP-IgG, или C3i с последующей промывкой, выработкой С3 конвертаз с пропердином и факторами В и D и, наконец, осуществлением лизиса за счет NGPS в CFD/EDTA, как указано в разделе методики. Только конъюгат осуществляет лизис, и этот лизис зависит от дозы/.

Нижеследующие стандартные методики и определения применимы во всех примерах.

Все компоненты комплемента, которые упоминаются, относятся к комплементу человека, если только нет других указаний; использована стандартная терминология для всех протеинов и полученных из них фрагментов /например, как указано в ссылке [15]/. Кроме того, термин "C3i " относится к любой молекулярной форме С3 без интактной тиолэстерной связи, но сохраняющей С3а полипептид на альфа-цепи.

кДНК С3 человека и кодирующая последовательность пронумерованы, как представлено на фиг.2, с использованием нумерации, принятой для EMBL нуклеотидной базы данных /из ссылки [2]/. Представленная последовательность представляет нашу конструкцию /'РС3'/, в которой отсутствуют первые 11 нуклеотидов 5' нетранслируемого участка, о котором сообщается в ссылке [2], и, следовательно, первое основание пронумеровано как 12. Предполагаемый кодон инициирования представлен нуклеотидами 61-63, кодон для аминотерминального серинового остатка бета-цепи представлен нуклеотидами 127-129, а кодон для аминотерминального серинового остатка альфа-цепи представлен нуклеотидами 2074-2076.

Последовательность протеинов пронумерована в соответствии с нумерацией последовательности-предшественника, представленной на фиг. 1, которая представляет предсказанную трансляцию ДНК последовательности /ожидается, что аминокислоты 1-22 содержат сигнальную последовательность, которая удаляется во время биосинтеза, и, как ожидается, аминокислоты 668-671 удаляются, когда предшественник расщепляется на альфа- и бета-цепи/.

Следующие сокращения имеют следующие значения: CVF фактор яда кобры, ELIS А иммуноадсорбентный анализ со связанным энзимом; E.coli - Escherichia coli; к.п.о. - килопароснований; HSV - 1-вирус герпес симплекс типа 1; РВS - фосфатом буферированный раствор; COS-1 представляет клеточную линию, полученную из клеток почки обезьяны.

Рестрикционные эндонуклеазы: - AflII, DraI, DraIII, EcoRI, HindIII, NaeI, XbaI, NheI. EcoRV.

Стандартные методики Описание стандартных процедур, применяемых в молекулярной биологии, таких как выделение плазмид, электрофорез в агарозном геле и ДНК лигирование, можно найти в ссылке [21]. Двухцепочечную ДНК секвенируют, используя набор Sequenase Version 2.0, поставляемый "United States Biochemicals".

С3 экспрессию измеряют в анализе ELISA, используя пластиковые пластины, предварительно покрытые афинно-очищенными поликлональными овечьими античеловеческими С3, к которым добавлены образцы культуральных надосадочных жидкостей. Связанные С3 определяют с помощью моноклональных крысиных антител к С3, конъюгированных с щелочной фосфатазой, и хромогенным субстратом, р-нитрофенолфосфатом. Результаты анализов прокалиброваны за счет С3 очищенной плазмы человек