Профилактический или терапевтический агент для лечения воспалительных заболеваний кишечника, содержащий в качестве активного ингредиента антагонист il-6

Профилактический или терапевтический агент для лечения воспалительных заболеваний кишечника, содержащий в качестве активного ингредиента антагонист il-6

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и касается профилактического или терапевтического агента для лечения такого воспалительного заболевания кишечника, как болезнь Крона или неспецифический язвенный колит, причем такой агент включает в качестве активного ингредиента такой антагонист интерлейкина-6 (IL-6), как антитело против рецептора IL-6. Преимущество изобретения заключается в разработке нового метода лечения вышеуказанных заболеваний, заключающийся в ингибированной активности цитокиков. 4 с. и 18 з.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к профилактическому или терапевтическому агенту для лечения воспалительного заболевания кишечника, содержащему антагонист интерлейкина-6 (IL-6) в качестве активного ингредиента. Кроме этого, настоящее изобретение относится к профилактическому или терапевтическому агенту для лечения болезни Крона или язвенного колита, содержащему IL-6 антагонист в качестве активного ингредиента.

Уровень техники IL-6 представляет собой цитокин, называемый также В-клеточным стимулирующим фактором 2 (BSF2) или интерфероном 2. IL-6 был открыт, как фактор дифференцировки, принимающий участие в активации В-лимфоцитных клеток (Hirano. T с сотр. , Nature (1986) 324, 73-76). Позже был обнаружен многофункциональный цитокин, оказывающий влияние на различные клеточные функции (Akira, S. с сотр., Adv. In Immunology (1993) 54, 1-78). Имеется сообщение о том, что IL-6 индуцирует созревание Т-лимфатических клеток (Lotz, М. с сотр. , J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258).

IL-6 передает свой биологический сигнал через два белка к клетке. Один из них служит рецептором IL-6, т.е. IL-6-связывающим белком с молекулярным весом порядка 80 кД (Тада, Т. с сотр., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981; Yamasaki, К. с сотр., Science (1987) 241, 825-828). IL-6 рецептор существует не только в связанной с мембраной форме с трансмембранным доменом, экспрессированным на поверхности клетки, но и в виде растворимого IL-6 рецептора, главным образом, состоящего из внеклеточной области.

Другой белок представляет собой связанный с мембраной gp130, с молекулярным весом около 130 кД, принимающий участие в трансдукции несвязанного с лигандом сигнала. IL-6 и рецептор IL-6 образуют IL-6/ IL-6-рецепторный комплекс, который после связывания с gp130 передает свой биологический сигнал клетке (Тада, Т. с сотр., Cell (1989) 58, 573-581).

Антагонисты IL-6 представляют собой вещества, ингибирующие трансдукцию биологической активности IL-6. В качестве антагонистов IL-6 к настоящему времени известны антитело против IL-6 (aнти-IL-6 антитело), антитело против рецептора IL-6 (анти-IL-6 рецепторное антитело) и антитело против gр130 (анти-gр130 антитело), измененный IL-6, частные пептиды IL-6 или рецептора IL-6 и т.п.

Анти-IL-6 рецепторное антитело описано в нескольких работах (Novick D. с сотр. , Hybridoma (1991) 10, 137-146, Huang, Y.W. с сотр., Hybridoma (1993) 12, 621-630, опубликованная международная заявка WO 95/09873, заявка на патент Франции FR 2694767, патент США 521628). Известно, что очеловеченное (гуманизированное) антитело РМ-1 получают трансплантацией гипервариабельного участка (CDR) мышиного антитела РМ-1 (Hirata, Y. с сотр., J. Immunology (1989) 143, 2900-2906) на человеческое матричное антитело (Международная патентная публикация WO/92-19759).

Воспалительное заболевание кишечника (IBD) представляет собой неспецифическое воспаление, примерами которого может служить язвенный колит и болезнь Крона. Иммунологические нарушения проявляются в начале болезни, но это не приводит к выяснению этиологии. Однако, предполагается, что моноциты и лимфоциты, кластеризующиеся на поврежденных участках, принимают участие в повреждениях слизистой оболочки и в этой связи особое внимание уделяется медиаторам воспалительных процессов, особенно цитокинам (например, IL1, TNF и IL-6).

В том, что касается IL-6, как медиаторов воспалений, обращается внимание на их взаимосвязь со статусом заболевания или на возможность выполнения ими функций специфического показателя IBD. Уровень содержания IL-6 в сыворотке повышен как в случае болезни Крона, так и язвенного колита, и этот уровень коррелирует с состоянием заболевания (Holtkamp, W. с сотр., J.Clin.Gastroenterology (1995) 20, 123-126, Niederau, С., с сотр., Hepato-Gastroenterology (1997) 44, 90-107). Измерение количества мРНК IL-6 в ткани в виде продуктов PCR (цепной полимеразной реакции) позволило обнаружить, что это количество хорошо коррелирует со статусом заболевания как в случае язвенного колита, так и болезни Крона (Stevens, С. с сотр., Dig. Dis. Sci. (1992) 37, 818-826. При увеличении продукции IL-6 в ходе активной стадии IBD анализировали механизм процесса и было установлено, что степень продуцирования, в том случае, когда моноядерные клетки в собственной пластинке (lamina propria) стимулируются митогеном Pokeweed, хорошо коррелирует с состоянием болезни (Reinecker, H, -С. с сотр., Clin.Exp. Immunol. (1993) 94, 174-181).

После этого, корреляцию между продуцированием IL-6 и статусом болезни наблюдали в культуре моноядерных клеток производных из lamina propria и в тканевой культуре слизи пациентов. В первом случае, было также показано, что число клеток, продуцирующих IL-6 в слизистой ткани, также возрастает. Среди мононуклеарных клеток наиболее важными клетками, продуцирующими IL-6, являются макрофаги, и было установлено, что имеется большое число СD68-позитивных макрофагов, которые бурно продуцируют IL-6 в собственной пластинке пациентов с IBD в активной стадии (Kusugami, К. с сотр., Dig. Dis. Sci. (1995), 40, 949-959).

Было также обнаружено, что продуцирование IL-6 коррелирует с эндоскопическими наблюдениями пациентов, страдающих болезнью Крона (Reimund, J.-M. с сотр. . Gut (1996) 39, 684-689). Кроме этого, было обнаружено, что не только концентрация IL-6, но и концентрация рецептора IL-6 в сыворотке хорошо коррелируют со статусом заболевания (Mitsuyama, К. с сотр.. Gut (1995) 36, 45-49).

Также известно, что в случае медиаторов воспалительного состояния, отличных от IL-6, степень продуцирования, например, IL-l также коррелирует с состоянием заболевания. С другой стороны, это не всегда справедливо для TNF- и в этом случае, степень продуцирования может иметь тенденцию к увеличению при низкой активности болезненного состояния (Reinecker,H - С. с сотр. , Clin. Exp. Immunol. (1993) 94, 174-181, Reimund, J. - M. с сотр., Gut (1996) 39, 684-689).

Современный метод лечения IBD заключается в комбинации диеты и медикаментов, причем в качестве последних были описаны салазосульфапиридин, глюкокортикоид и т.п. Однако, в случае применения этих медикаментов, некоторые пациенты не переносят эти лекарства из-за их побочных эффектов, в связи с чем возникают проблемы, касающиеся длительности применения.

С другой стороны, проводился ряд опытов в качестве нового метода лечения IBD, цель которых состояла в улучшении состояния заболевания в результате ингибирования активности цитокинов. Основными мишенями таких исследований служили IL-1 и TNF- (Van Deventer, S.J.H. Gut (1997) 40, 443-448); причем IL-1, антагонист рецептора IL-1 (Cominelli F. с сотр., Gastroenterology (1992) 103, 65-71 и ингибитор IL-1, CGP47969A (Casini-Raggi с сотр., Gastroenterology (1995) 109, 812-818) и аналогичные объекты проходят клиническое исследование или экспериментальное изучение на животных. В случае TNF-, специфическое моноклональное антитело применяли на пациентах с болезнью Крона, и при этом наблюдали пониженную активность и залечивание язвы (Van Dullemen, H. M. с сотр., Gastroenterology (1995) 109, 129-135). Однако, до настоящего времени не было известно, что антагонист IL-6 способен излечивать IBD и специфически подавлять биологическую активность IL-6.

Описание изобретения.

Цель настоящего изобретения заключается в разработке профилактического или терапевтического агента для воспалительного заболевания кишечника, причем указанный агент свободен от указанных выше недостатков.

Таким образом, настоящее изобретение предусматривает (1) профилактический или терапевтический агент для воспалительного заболевания кишечника, включающий антагонист IL-6 в качестве активного ингредиента.

Кроме этого, настоящее изобретение предусматривает (2) профилактический или терапевтический агент для воспалительного заболевания кишечника, включающий антитело против рецептора IL-6, в качестве активного ингредиента.

Настоящее изобретение также предусматривает (3) профилактический или терапевтический агент для воспалительного заболевания кишечника, включающий моноклональное антитело против рецептора IL-6, в качестве активного ингредиента.

Настоящее изобретение также предлагает (4) профилактический или терапевтический агент для лечения воспалительного заболевания кишечника, включающий моноклональное антитело против рецептора человеческого IL-6, в качестве активного ингредиента. Такое моноклональное антитело против рецептора человеческого IL-6, предпочтительно, представляет собой антитело РМ-1.

Кроме этого, настоящее изобретение предусматривает (5) профилактический или терапевтический агент для лечения воспалительного заболевания кишечника, включающий моноклональное антитело против рецептора мышиного IL-6, в качестве активного ингредиента. Такое моноклональное антитело против рецептора мышиного IL-6, предпочтительно, представляет собой антитело MR16-1.

В настоящем изобретении, также предлагается (6) профилактический или терапевтический агент для лечения воспалительного заболевания кишечника, включающий рекомбинантное антитело против рецептора IL-6, в качестве активного ингредиента. Такое рекомбинантное антитело против рецептора IL-6, предпочтительно имеет константную область (С область) человеческого антитела.

Настоящее изобретение предусматривает также (7) профилактический или терапевтический агент для лечения воспалительного заболевания кишечника, включающий химерное или очеловеченное антитело против рецептора IL-6 в качестве активного ингредиента.

Кроме этого, настоящее изобретение предусматривает также (8) профилактический или терапевтический агент для лечения воспалительного заболевания кишечника, включающий в качестве активного ингредиента гуманизированное антитело РМ-1.

Настоящее изобретение предусматривает также (9) профилактический или терапевтический агент для лечения болезни Крона или язвенного колита, включающий в качестве активного ингредиента антагонист IL-6, описанный выше в пунктах (1)-(8).

Кроме этого, настоящее изобретение предусматривает (10) агент для подавления потерь веса при воспалительном заболевании кишечника, причем указанный агент включает в качестве активного ингредиента антагонист IL-6, описанный выше в пунктах (1)-(8).

Настоящее изобретение предусматривает также (11) агент для подавления потерь веса при воспалительном заболевании кишечника, причем указанный агент включает в качестве активного ингредиента антагонист IL-6, описанный выше в пунктах (3)-(8).

Описание предпочтительного варианта осуществления изобретения В качестве антагонистов IL-6, используемых в настоящем изобретении, могут применяться соответствующие объекты любого происхождения, любого вида и любой формы, при условии наличия у них профилактического или терапевтического эффекта при лечении воспалительного заболевания кишечника, или эффекта контроля потерь веса при воспалительном заболевании кишечника.

Антагонисты IL-6 блокируют трансдукцию сигнала от IL-6 и ингибируют биологическую активность IL-6. В качестве примеров антагонистов IL-6 предпочтительно следует отметить анти-Il-6-антитело, антитело к IL-6-рецептору, антитело к gр130, измененный IL-6, рецептор измененного растворимого IL-6, частичный пептид IL-6 или рецептора IL-6, а также вещества с низким молекулярным весом, обладающие аналогичной активностью.

Анти-IL-6-антитела, предназначенные для использования в настоящем изобретении, могут быть получены в виде поликлональных или моноклональных антител, с использованием известного способа. В качестве антител к IL-6, предназначенных для применения в настоящем изобретении, особенно предпочтительными являются антитела млекопитающих. Моноклональные антитела такого происхождения включают такие вещества, которые продуцируются гибридомами, а также рекомбинантные антитела, продуцируемые клеткой хозяина, которую трансформировали с помощью вектора экспрессии, содержащего гены антитела, полученные методами генной инженерии. Такие антитела, в результате связывания с IL-6, блокируют связывание IL-6 с рецептором IL-6 и, вследствие этого, блокируют трансдукцию сигнала биологической активности IL-6 в клетку.

Примерами таких антител могут служить МН166 (Matsuda с сотр., Eur.J.Immunol. (1988) 18, 951-956) и SK2 антитело (Sato. К. с сотр.. The 21-st Nihon Mennekigakkai Soukai (Общий конгресс Японского иммунологического общества), Academic Record (1991) 21, 166) и т.п.

Гибридома, продуцирующая антитело анти-IL-6, может быть, в основном, сконструирована с использованием известного способа, описанного ниже. Так например, IL-6 может использоваться в качестве сенсибилизирующего антигена в традиционном методе иммунизации. Полученные таким образом иммунизированные клетки сливают с известными родительскими клетками с помощью общепринятого процесса слияния, после чего клетки, продуцирующие моноклональные антитела, подвергают скринингу с использованием известного способа с целью получения желаемой гибридомы.

Если говорить более подробно, антитело анти-IL-6 может быть получено следующим образом. Так например, человеческий IL-6, предназначенный для использования в получении антитела, может быть получен с применением системы ген IL-6/аминокислотная последовательность, раскрытой в Eur.J.Biochem (1987) 168, 543-550, J. Iimmuno. (1988) 140, 1534-1541, или Agr.Biol.Chem. (1990) 54, 2685-2688.

После того, как клетку подходящего хозяина трансформируют путем вставки последовательности IL-6 гена в известную экспрессионную векторную систему, белок LI-6 очищают от клетки хозяина или ее культурального супернатанта. Очищенный протеин IL-6 может применяться в качестве сенсибилизирующего антигена. С другой стороны, слитый белок протеина IL-6 и другого белка может использоваться в качестве сенсибилизирующего антигена.

Антитела к IL-6-рецептору, предназначенные для использования в настоящем изобретении, могут быть получены в виде поликлональных или моноклональных антител с помощью известного способа. В качестве антител к IL-6-рецептору для использования в настоящем изобретении, предпочтительными объектами являются моноклональные антитела, особенно, млекопитающего происхождения. Моноклональные антитела млекопитающего происхождения включают те, что продуцируются гибридомами, и те, что продуцируются клеткой хозяина, которую трансформировали вектором экспрессии, содержащим ген антитела, полученный методом генной инженерии. Такие антитела, путем связывания с рецептором IL-6, ингибируют связывание IL-6 с рецептором IL-6 и тем самым блокируют трансдукцию биологической активности IL-6 в клетку.

Примерами таких антител могут служить антитело MR16-1 (Tamura, Т., с сотр. , Proc.Natl.Acad.Sci. USA (1993)90, 11924-11928), антитело РМ-1 (Hirata, с сотр., J. Immunology (1998) 143, 2900-2906), или антитело AUK12-20, антитело AUK12-7 или антитело AUK146-15 (Международная патентная публикация WO 92-19759) и т.д. Среди них наиболее предпочтительным является антитело РМ-1.

Линия клеток гибридомы, которая продуцирует антитело РМ-1, прошла международное депонирование в соответствии с Будапештским договором, как РМ-1 10 июля 1990 г. с помощью National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki pref. , Япония, с получением названия FERM ВР-2998. Кроме этого, линия клеток гибридомы, которая продуцирует антитело MR16-1, прошла международное депонирование в соответствии с Будапештским договором, как РМ-1 13 марта 1997 г. с помощью National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki pref. , Япония, с получением названия FERM ВР-5875.

Гибридому, продуцирующую моноклональное антитело к IL-6-рецептору, можно сконструировать с использованием известного способа, описанного ниже. Так например, рецептор IL-6 используют в качестве сенсибилизирующего антигена согласно традиционному способу иммунизации. Полученные таким образом иммунизированные клетки сливают с известными родительскими клетками в традиционном процессе слияния и, после этого, клетки, продуцирующие моноклональное антитело, могут быть подвергнуты скринингу с использованием известного способа, с получением целевой гибридомы.

Антитело к IL-6-рецептору может быть получено следующим образом. Например, рецептор человеческого IL-6, используемый в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела, может быть получен с использованием системы генная последовательность IL-6 рецептора/аминокислотная последовательность, раскрытой в заявке на европейский патент ЕР 325474, а мышиный IL-6 рецептор может быть получен с использованием методики, раскрытой в заявке на патент Японии (Kokai) 3 (1991)-155795.

Существует два типа рецепторных белков IL-6: IL-6 рецептор, экспрессированный на клеточной мембране, и IL-6 рецептор, отсоединенный от клеточной мембраны (рецептор растворимого IL-6) (Yasukava, К. с сотр., J. Biochem. (1990) 108, 673-676). Антитело рецептора растворимого IL-6, в основном, состоит из внеклеточной области рецептора IL-6, связанной с клеточной мембраной, и на этом основании оно отличается от IL-6 рецептора, связанного с мембраной, тем, что в последнем случае не имеется трансмембранной области и внутриклеточной области. Помимо белка рецептора IL-6 может использоваться любой IL-6 рецептор, если он может использоваться в качестве сенсибилизирующего антигена для продуцирования антитела к IL-6 рецептору, подходящего для использования в настоящем изобретении.

После включения генной последовательности рецептора IL-6 в известную экспрессионную векторную систему, с целью трансформации соответствующей клетки-хозяина, желаемый IL-6 рецептор может быть очищен от клеток-хозяев или его культурального супернатанта с использованием известного способа. Очищенный таким образом белок рецептора IL-6 может использоваться в качестве сенсибилизирующего антигена. С другой стороны, в качестве сенсибилизирующего антигена могут применяться клетки, экспрессирующие IL-6 рецептор или слитый белок рецепторного протеина IL-6 и другого белка.

E.coli, содержащая плазмиду pIBIBSF2R, имеющую кДНК, кодирующую человеческий IL-6 рецептор, прошла международное депонирование в соответствии с Будапештским договором, как HB101-pIBIBSF2R 9 января 1989 с помощью National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki pref., Япония, с получением названия FERM BP-2232.

Анти-gp130 антитела, предназначенные для использования в настоящем изобретении, могут быть получены известными способами в виде поликлональных или моноклональных антител. В качестве анти gp-130 антител, для применения в настоящем изобретении, особенно предпочтительными являются антитела, происходящие от млекопитающих. Моноклональные антитела млекопитающего происхождения включают те, что продуцированы гибридомами, и те, что продуцированы клеткой-хозяином, трансформированной вектором экспрессии, содержащим гены антитела, полученные методами генной инженерии. Такие антитела, в результате связывания с gp130, ингибируют связывание комплекса IL-6/рецептор IL-6 с gр130 и вследствие этого блокируют трансдукцию биологической активности IL-6 в клетку.

Примерами таких антител могут служить антитело АМ64 (Японская патентная публикация (Kokai) 3(1991)-219894), антитело 4В11 и антитело 2Н4 (патент США 5571513), антитело BS12 и антитело В-Р8 (Японская патентная публикация (Kokai) 8(1996)-291199).

Гибридома, продуцирующая моноклональное антитело, может быть, в основных чертах, создана с использованием описанного ниже способа. Так, gp130 может применяться в качестве сенсибилизирующего антигена и использоваться для иммунизации традиционным способом. Полученные таким образом иммунизированные клетки сливают с известными родительскими клетками с помощью общепринятого способа, после чего гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, подвергают скринингу с использованием традиционного метода отбора, с целью получения целевой гибридомы.

Моноклональное антитело может быть получено следующим способом. Так например, gp130, применяемый в качестве сенсибилизирующего антигена для выработки антитела, может быть получен с использованием системы, генная последовательность gp130/аминокислотная последовательность, раскрытой в заявке на Европейский патент ЕР 411946.

После инсерции генной последовательности gp130 в известную экспрессионную векторную систему, подходящую клетку хозяина трансформируют такой векторной системой и белок gp130 очищают от клетки-хозяина или от ее культурального супернатанта. Такой очищенный белок рецептора gp130 может использоваться в качестве сенсибилизирующего антигена. В качестве альтернативы, слитый белок протеина gp130 и другого белка может применяться в качестве сенсибилизирующего антигена.

Хотя природа млекопитающих, подлежащих иммунизации с помощью сенсибилизирующего агента, не имеет решающего значения, такие объекты предпочтительно выбирать исходя из соображений их совместимости с родительскими клетками, при использовании в слиянии клеток. Обычно, они включают таких грызунов, как мыши, крысы, хомяки и т.п.

Иммунизацию животных с помощью сенсибилизирующего антигена проводят известным способом. Так например, общий способ включает внутрибрюшинное или подкожное введение сенсибилизирующего антигена млекопитающему. Согласно такому способу, сенсибилизирующий антиген, разбавленный в соответствующем количестве фосфатного буферного раствора (PBS) или физиологического раствора и т.п., смешивают, если это желательно, с соответствующим количеством традиционного стимулятора, например, полного адьюванта Фрейнда. После эмульгации, полученную эмульсию предпочтительно вводят млекопитающему несколько раз в течение каждых 4-21 дня. Совместно с сенсибилизирующим агентом во время иммунизации может применяться подходящий носитель.

После иммунизации и подтверждения увеличения титра желаемого антитела в сыворотке, иммунизированные клетки отбирают от млекопитающего, подвергают процессу клеточного слияния. Предпочтительные иммунизированные клетки включают, главным образом, клетки селезенки.

Клетки миеломы млекопитающих, в качестве других родительских клеток, которые подвергают клеточному слиянию с упомянутыми выше иммунизированными клетками, предпочтительно, включают такие известные различные клеточные линии, как Р3Х63Аg8.653)(Kearney, J.F. с сотр., J. Immunol. (1979)123: 1548-1550), P3X63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81: 1-7), NS-1 (Kohler, G. and Milstein, C., Eur.J.Immunol. (1976) 6: 511-519), MPC-11 (Margulies, D.H. с сотр., Cell (1976) 8: 405-415), SP2/0 (Shulman, M с сотр. , Nature (1978) 276: 269-270), FO (de St.Groth. S.F. с сотр., J. Iinmunol. Methods (1980) 35: 1-21), S194 (Trowbridge, I.S., J.Exp. Med (1978) 148: 313-323), R210 (Galfre, G. с сотр., Nature (1979) 277: 131-133) и т.п.

Процесс слияния клеток, осуществляемый между указанными выше иммунизированными клетками и миеломными клетками, может проводиться в соответствии с таким известным способом, как метод, описанный Milstein с сотр. (Kohler, G. и Milstein, С., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) и т.п.

Если говорить более подробно, то описанное слияние клеток проводят в традиционном питательном бульоне в присутствии, например, ускорителя слияния клеток. В качестве акселератора клеточного слияния могут применяться, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ), вирус Sendai (HVJ) и т.п. Кроме этого, такой адъювант, как диметилсульфоксид и т.п., может добавляться по желанию с целью повышения эффективности слияния.

Предпочтительное соотношение между количеством иммунизированных клеток и миеломных клеток таково, что иммунизированных клеток, например, в 1-10 раз больше, чем миеломных клеток. Примерами культурной среды, применяемой для упомянутого выше слияния клеток, могут служить среда RPMI1640 и культурная среда MEM, подходящая для роста указанных выше миеломных клеточных линий, причем могут добавляться традиционная культурная среда, применяемая для клеток такого типа, и такая дополнительная сыворотка, как фетальная телячья сыворотка (FCS).

В таком процессе клеточного слияния, определенные количества иммунизированных клеток и миеломных клеток хорошо смешивают в указанной выше культурной среде, к которой добавляют раствор ПЭГ, предварительно нагретый до 37^oС, например раствор ПЭГ со средним молекулярным весом 1000-6000 с концентрацией 30-60% (вес. /об. ) и полученную систему перемешивают с получением желаемых слитых клеток (гибридом). Затем, в результате повторения стадий последовательного добавления подходящей культурной среды и центрифугирования для удаления супернатанта, могут быть удалены агенты клеточного слияния и т. п., которые нежелательны для роста гибридомы.

Указанную гибридому подвергают селекции с помощью культуры в традиционной селекционной среде, например, среде HAT (культурная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Культивирование в среде HAT обычно продолжают в течение времени, достаточного для уничтожения клеток, отличных от желаемых гибридом (неслитые клетки), обычно в течение промежутка времени от нескольких дней до нескольких недель. Осуществляют традиционный способ серийного разбавления, согласно которому гибридомы, продуцирующие желательное антитело, подвергают скринингу и клонированию.

Кроме этого, для получения указанных выше гибридом иммунизацией животного, отличного от человека, антигеном, можно также сенсибилизировать человеческие лимфоциты in vitro желаемым антигеном или желаемыми антиген-экспрессирующими клетками, и полученные в результате сенсибилизированные лимфоциты В сливают с клетками человеческой миеломы, например, U266, с получением желаемого человеческого антитела с активностью связывания с желаемым антигеном или желаемыми антиген-экспрессирующими клетками (см. патентную публикацию Японии (Kokoku) 1 (1989)-59878). Кроме этого, трансгенное животное с полным набором генов человеческого антитела, иммунизируют антигеном или антиген-экспрессирующими клетками с получением желаемого человеческого антитела, с помощью описанного выше способа (см. международные патентные публикации WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 и WO 96/33735).

Сконструированные таким образом гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, могут быть субкультивированы в традиционную культурную среду, или могут храниться в течение продолжительного времени в жидком азоте.

С целью получения моноклональных антител из указанной гибридомы можно применять способ, в котором указанную гибридому культивируют обычным методом и антитело получают в виде супернатанта, либо способ, в котором гибридому вводят и выращивают в организме млекопитающего, совместимого с указанной гиборидомой, а антитело получают в асцитах. Первый способ подходит для получения антител высокой чистоты, тогда как последний - подходит для крупномасштабного производства антител.

Согласно специальному варианту, гибридома, продуцирующая антитело к рецептору IL-6, может быть сконструирована с использованием способа, раскрытого в Японской патентной публикации (Kokai) 3(1989)-139293. Такое конструирование можно проводить способом, в котором гибридому, продуцирующую антитело РМ-1, прошедшую международное депонирование в рамках Будапештского договора с присвоением названия FERM ВР-2998, 10 июля 1990 в National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsucuba-shi, Ibaraki pref. , Япония, внутрибрюшинно вводят мышам BALB/с с получением асцитов, из которых получают антитело РМ-1 в чистом виде, или способом, в котором указанную гибридому культивируют в такой подходящей культурной среде, как RPMI1640, содержащей 10% фетальной коровьей сыворотки и 5% BM-Condimed HI (препарата, выпускаемого Boehringer Mannheim), гибридомная SEM среда (выпускаемая GIBCO-BRL), среда PFHM-II (выпускаемая GIBCO-BRL) и т.п., и антитело РМ-1 может быть очищено от супернатанта.

Рекомбинантное антитело, которое получают методом генной рекомбинантной технологии, в котором ген антитела клонируют из гибридомы и интегрируют в подходящий вектор, которым трансформируют клетки хозяина, может использоваться в настоящем изобретении в качестве моноклонального антитела (см., например, Borrebaeck С.А.К. и Larrick J.W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, опубликованную в Великобритании изд-ом MACMILLAN PUBLISHERS LTD. 1990).

Согласно конкретному варианту, мРНК, кодирующую вариабельный участок (V) желаемого антитела, отделяют от таких клеток, продуцирующих антитело, как гибридомы. Выделение мРНК проводят путем получения общей РНК с использованием, например, такого известного способа, как ультрацентрифужный гуанидиновый способ (Chirgwin, J.M. с сотр., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), способ AGPC (Chomczynski, P с сотр., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) и после этого, мРНК очищают из общей РНК с использованием набора для очистки мРНК (выпускаемого Pharmacia) и т.п. С другой стороны, мРНК может быть получена непосредственно с использованием набора Quick Prep mRNA purification Kit (выпускаемого Pharmacia).

кДНК V области антитела может быть синтезирована из мРНК с использованием обратной транскриптазы. кДНК может быть синтезирована с использованием набора для синтеза ДНК AMV reverce Transcriptase first-strand cDNA Synthesis Kit и т.п. С другой стороны, для синтеза и амплификации кДНК, могут применяться набор 5'-Ampli FINDER RACE KIT (выпускаемый Clontech) и 5'-race способ (Frohman, M.A. с сотр., Proc. Natl. Acad. Sci. США (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, А. С сотр., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932), в котором применяется цепная полимеразная реакция (PCR). Желаемый фрагмент ДНК очищают от продукта PCR и его можно лигировать с вектором ДНК. Кроме этого, из него конструируют рекомбинантный вектор и затем трансформируют в E.coli. и т.п., из которой выбирают колонии для получения желаемого рекомбинантного вектора. Нуклеотидная последовательность желаемой ДНК может быть подтверждена таким известным способом, как дидеокси-способ.

После получения ДНК, кодирующей V-область желаемого антигена, ее можно лигировать с ДНК, кодирующей константную область (С область) желаемого антитела, с последующей интеграцией в вектор экспрессии. С другой стороны, ДНК, кодирующую V-область антитела, можно интегрировать в вектор экспрессии, который уже содержит ДНК, кодирующую C-область антитела.

Для получения антитела для использования в настоящем изобретении, ген антитела интегрируют, как описано ниже, в вектор экспрессии с целью проведения экспрессии под контролем участка регуляции экспрессии, например, энхансера и/или промотора. Далее, вектор экспрессии можно трансформировать в клетку-хозяина и после этого в него можно экспрессировать антитело.

В соответствии с настоящим изобретением, такое искусственно измененное рекомбинантное антитело, как химерное антитело или гуманизированное антитело, можно использовать в целях снижения гетерологической антигенности против человека. Такие измененные антитела могут быть получены с использованием известных способов.

Химерное антитело может быть получено путем лигирования полученной таким образом ДНК, кодирующей V-область антитела, с ДНК, кодирующей C-область человеческого антитела, с последующей интеграцией в вектор экспрессии и трансформацией в клетку хозяина для продуцирования в ней антитела (см. заявку на Европейский патент ЕР 125023 и Международную патентную публикацию WO 92/19759). При использовании такого известного способа, может быть получено полезное для настоящего изобретения химерное антитело.

Так например, плазмида, содержащая ДНК, кодирующую L-цепь V-области или H-цепь V-области химерного антитела РМ-1, обозначается, как pPM-k3 или рРМ-h1, соответственно, a E. coli с такой плазмидой прошла международное депонирование в соответствии с Будапештским договором с присвоением названия NCIMB 40366 и NCIMB 40362, соответственно, на 11 февраля 1991 г. в рамках National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited.

Гуманизированное антитело, которое также называют реконструированным человеческим антителом, может быть получено трансплантацией гипервариабельных участков (CDR) антитела млекопитающего, отличного от человека, например, мышиного антитела в CDR человеческого антитела. Общая рекомбинантная технология ДНК для получения таких антител также известна (см. заявку на европейский патент ЕР 125023 и Международную патентную публикацию WO 92-19759).

Более конкретно, последовательность ДНК, которая предназначена для лигирования CDR мышиного антитела с каркасными областями (FR) человеческого антитела, синтезируют из нескольких раздельных олигонуклеотидов, поглощающих участки перекрывания на их концах. Полученную таким образом ДНК лигируют с ДНК, кодирующей С-область человеческого антитела, и затем интегрируют в вектор экспрессии, которым трансформируют клетки-хозяина для продуцирования антитела (см. заявку на Европейский патент ЕР 239400 и Международную патентную публикацию WO 92-19759).

Для FR человеческого антитела, лигированной с CDR, выбирают гипервариабельный участок, образующий благоприятную структуру, связывающую антиген. Если желательно, то аминокислоты в каркасной области вариабельного участка антитела могут быть заменены таким образом, что гипервариабельная область реконструированного человеческого антитела может образовывать соответствующую структуру, связывающую атиген (Sato, К. с сотр., Cancer Res. (1993) 53 851-856).

Так например, в химерном антителе или гуманизированном антителе используют С-область человеческого антитела. В качестве С-области человеческого антитела, можно отметить С_y, кроме этого, могут также использоваться C_y1, С_y2, С_y3 и С_y4. C-область человеческого антитела может быть модифицирована с целью повышения стабильности антитела или его продуктов.

Химерное антитело состоит из вариабельной области антитела, производного млекопитающего, отличного от человека, и С-области, производной человеческого антитела, тогда как гуманизированное антитело состоит из гиперваприабельных областей антитела, производного млекопитающего, отличного от человека, и каркасных областей и С-области антитела, производного человеческого антитела. В соответствии с этим, их антигенность в организме человека понижена таким образом, что эти вещества становятся полезными антителами для применения в настоящем изобретении.

Предпочтительное воплощение гуманизированного антитела для применения в настоящем изобретении включает гуманизированное РМ-1 антитело (см. Международную патентную публикацию WO 92-19759).

Гены антитела, сконструированные, как описано выше, могут экспрессироваться и продукт такого процесса получают известными способами. В случае клеток млекопитающих, экспрессия может осуществляться с использованием вектора, содержащего традиционно применяемый промотор, ген антитела, подлежащий экспрессиии и ДНК, в которой поли А сигнал операбельно присоединен к его 3' в прямом направлении считывания генетического кода или вектор, содержащий указанную ДНК. Примером системы промотор/энхансер может служить человеческий цитомегаловирусный непосредственно ранний промотор/энхансер.

Кроме этого, в качестве промотора/энхансера, который может использоваться для экспрессии антитела при применении в настоящем изобретении, существуют такие вирусные промоторы/энхансеры, как ретровирусы, полиомные вирусы, аденовирусы и вирус обезьяны 40 (SV40), а также промоторы/энхансеры, производные таких клеток млекопитающих, как человеческий фактор элонгации 1 (HEF1).

Так например, экспрессию можно легко осуществлять по способу Mulligan с сотр. , (Mulligan, R.C. с сотр., Nature (1979) 277, 108-114) при использовании SV40 промотора/энхансера, или по способу Mizushima с сотр. (Mizushima, S. и Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) с использованием HEFI промотора/энхансера.

В случае E. coli, экспрессию можно осуществлять оперативной сшивкой традиционно используемого промотора, сигнальной последовательности для секреции антитела, и гена антитела, подлежащего экспресиии, с последующей его экспрессией. В качестве промотора можно, например, упомянуть lacz промотор и arab промотор. При использовани промотора lacz можно применять способ Ward с сотр., (Ward, E.S. с сотр.. Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E. S. с сотр., FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), а способ Better с сотр. (Better, M. с сотр., Science (1988) 240, 1041-1043) может применяться при использовании аraВ промотора.

В качестве сигнальной последовательности для секреции антитела, в случае продуцирования в периплазме Е.coli, может использоваться ре1В сигнальная последовательность (Lei, S.P. с сотр., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383). После выделения антитела, накопленного в периплазме, структуру антитела соответствующим образом перегибают перед применением (см., например, WO 96/30394).

В качестве источника репликации можно исп