Аналог hin47 haemophilus с редуцированной протеазной активностью

Аналог hin47 haemophilus с редуцированной протеазной активностью

Реферат

 

Изобретение относится к иммунологии, а именно к иммуногенам и антигенам от видов Наеmophilus. Изолированный и очищенный аналог белка Hin47 Наеmophilus influenzae обладает пониженной протеазной активностью, которая составляет менее чем 10% от активности природного белка Hin47, и теми же иммуногенными свойствами, что и природный белок Hin47, за счет замены или включения у нативного белка Hin47, по крайней мере, одной аминокислоты, ответственной за протеазную активность. Аминокислота может быть выбрана из аминокислот 195-201, His-91 или Asp-121 нативного белка Hin47. Химерная молекула содержит аналог белка Hin47 Наеmophilus influenzae, связанный с полисахаридом. Рекомбинантная плазмида DS-1011-1-1 (рТ7/Hin47*) несет молекулу нуклеиновой кислоты, экспрессирующую аналог белка Hin47 с заменой Ser-197 на аланин. Идентифицируют, по крайней мере, один аминокислотный остаток белка Hin47, ответственный за протеазную активность. Осуществляют сайт-направленный мутагенез гена hin47 для удаления или замены нуклеотидной последовательности, кодирующей эту аминокислоту. Вводят мутанный ген в клетку с получением трансформированной клетки и культивируют последнюю с получением аналога Hin47. Иммуногенная композиция включает эффективное количество аналога Hin47. Проводят взаимодействие образца с аналогом Hin47 с получением комплексов, содержащих аналог Hin47 и специфично распознающие его антитела, если таковые присутствуют в образце. При иммунизации субъекта получают антитела, специфичные к белку Hin47. Проводят взаимодействие образца с антителами. Диагностический набор для определения наличия антител, специфично распознающих белок Hin47, в образце содержит аналог белка Hin47 и средства для взаимодействия аналога с образцом. Изобретение позволяет получать вакцинные препараты против заболеваний, вызываемых патогенными бактериями Наеmophilus influenzae. 8 с. и 10 з.п.ф-лы, 3 табл., 26 ил.

Область изобретения Изобретение относится к области иммунологии, в частности к иммуногенам и антигенам от видов Haemophilus. Ссылка на родственную заявку.

Настоящая заявка является составной частью патентной заявки США серийный 08/296149 от 26 августа 1994 г., которая сама по себе является составной частью заявки серийный 08/278091 от 21 июля 1994 г.

Предпосылки изобретения Haemophilus influenzae представляет собой организм, который ответственен за множество тяжелых заболеваний человека, такие как менингит, эпиглотит, пневмония и отит. Haemophilus influenzae тип b (Hib) является основной причиной бактериального менингита у детей в возрасте до пяти лет. Защитные антитела к этому заболеванию индуцируются капсулярным полисахаридом этого организма, и была разработана вакцина, в которой использовали в качестве антигена очищенный полирибозилрибитолфосфат (ПРФ). Эта вакцина обеспечивала 90%-ную защиту у взрослых и у детей возрастом старше 24 месяцев, но была неэффективна у детей младше 24 месяцев (Zangwill et al, 1993). (Ссылки приведены в списке литературы в конце настоящего описания, каждая из ссылок данного списка включена здесь в качестве ссылки без последующей к ней отсылки). Как и другие полисахаридные антигены, ПРФ не индуцирует пролиферацию Т-хелперных клеток, и реиммунизация не способна ни вызывать усиленный ответ, ни увеличивать клетки памяти. Конъюгация полисахарида ПРФ с белком-носителем придает зависимые от Т-клеток характеристики вакцине и существенно усиливает иммунный ответ на ПРФ-антиген. В настоящее время существует четыре доступных вакцины ПРФ-несущего конъюгата. Это вакцины, основанные на конъюгате капсулярного полисахарида Н. influenzae типа b с дифтерийным токсиоидом, тетанус токсиоидом или белком внешней мембраны Neisseria meningitidis (рассмотрены у Zangwill et al, 1993). Эти конъюгированные вакцины Н. influenzae b значительно снизили частоту случаев бактериального менингита (Schoendorf et al, 1994).

Имеется шесть серотипов Н. influenzae, обозначаемых а - f, которые определяются по их капсулярным полисахаридам. Имеющиеся в настоящие время коньюгированные вакцины Haemophilus не защищают от других инвазивных типирующихся штаммов (типы а и с) и, что важно, не защищают от нетипирующихся (NTHi) штаммов, которые являются распространенной причиной послеродового сепсиса и сепсиса новорожденных, пневмонии и отита. Отит является наиболее распространенным заболеванием раннего детства, при этом приблизительно 70% всех детей в возрасте до семи лет перенесли, по крайней мере, однажды отит. Хронический отит может привести к нарушению слуха, речи и распознавания у детей. Это вызывается бактериальной инфекцией Streptococcus pneumoniae (приблизительно 50%), нетипирующимся Н. influenzae (приблизительно 30%) и Moraxella (Branhamella) catarrhalis (приблизительно 20%). Только в одних Соединенных Штатах для лечения отитов на антибиотики и хирургические процедуры, такие как тонзиллоэктомия, аденоидоэктомия и введение тимпаностомических трубок, тратится от 1 до 2 миллиардов долларов в год. Для того, чтобы достигнуть универсальной защиты от Н. influenzae-опосредованных заболеваний, особенно в возрастной группе от двух до шести месяцев и в группах определенного высокого риска, желательно иметь запас консервированных перекрестно-реактивных некапсулярных иммуногенов Н. influenzae. Нетипированные штаммы Н. influenzae также являются важными патогенами, ответственными за пневмонию у пожилых и других индивидуумов, которые особенно предрасположены к респираторным инфекциям. Таким образом, необходимо наличие антигенов Н. influenzae, которые используются в качестве компонентов в иммуногенных препаратах, обеспечивающих защиту от множества серотипов Н. influenzae. В заявке РСТ WO 92/10936, опубликованной 9 июля 1992 г. и включенной здесь в качестве ссылки, описывается белок внешней мембраны, полученный из Н. influenzae с молекулярной массой 47000, который, как сообщается, представляет собой адгезин и обозначается как Hin47, который является иммунологически консервативным между нетипирующимися типа b и для нетипичных клинических изолятов Н. influenzae. Аминокислотная последовательность Hin47 и нуклеотидная последовательность гена, кодирующего Hin47, представлены на конференции Американского Общества Микробиологов (American Society of Microbiology - ASM), состоявшейся в Новом Орлеане 26-30 мая 1992 г. Эти последовательности также были опубликованы в заявке РСТ WO 94/00149, опубликованной 6 января 1994 г. и включенной здесь в качестве ссылки.

Поскольку Hin47 является консервативным между штаммами Haemophilus influenzae и, как сообщается, представляет собой адгезин, белок, применяющийся для диагностики и вакцинации против заболеваний, вызываемых Н. influenzae или другими бактериальными патогенами, которые продуцируют Hin47, или белок, способный увеличивать специфическую реактивность антител к Hin47.

Недостатком Hin47 при использовании в качестве антигена для диагностики, для наработки анти-Нin47 антител, применяемых для диагностики и в качестве иммуногена при вакцинации, является неожиданное обнаружение для заявителей настоящего изобретения, что Hin47 обладает протеазной активностью, которая приводит к аутоперевариванию Hin47 и протеолитической деградации других смешанных с ним антигенов.

Было бы преимуществом создать аналоги белка Hin47 (иногда обозначаемые при этом как мутанты или производные), которые проявляют существенно сниженную протеолитическую активность, для использования в качестве антигенов, иммуногенных препаратов, включая вакцины, носителей для других иммуногенов и для производства диагностических реагентов.

Описание изобретения Настоящее изобретение касается разработки аналогов белка Haemophilus Hin47, обладающих пониженной протеазной активностью.

В соответствии с первым аспектом изобретения предложен выделенный и очищенный аналог белка Haemophilus Hin47, обладающий пониженной протеазной активностью, которая составляет менее чем 10% активности природного белка Hin47. Такой аналог Hin47 предпочтительно имеет, по существу, те же иммуногенные свойства природного белка Hin47. Аналог настоящего изобретения может быть получен путем химической, биохимической или генетической модификации природного Hin47.

При одном осуществлении настоящего изобретения, когда аналог получен путем генетической модификации, по крайней мере, одна аминокислота природного Hin47, вносящая вклад в протеазную активность, может быть удалена или заменена на другую аминокислоту для получения пониженной протеазной активности. Альтернативно пониженная протеазная активность может быть достигнута путем введения, по крайней мере, одной аминокислоты в природный белок Hin47. По крайней мере, одна удаленная или замененная аминокислота может быть выбрана среди 195-201 аминокислотного остатка Hin47, в частности это может быть serin-197, который может быть удален или заменен на аланин, цистеин или треонин. Кроме того, по крайней мере, одной удаленной или замещенной аминокислотой может быть His-91, который может быть удален или заменен на аланин, лизин или аргинин. Далее, по крайней мере, одной удаляемой или замещаемой аминокислотой может быть Asp-121, которая может быть удалена или заменена на аланин.

Кроме того, множество аминокислот в молекуле Hin47 могут быть удалены или заменены. Такие аминокислоты могут включать His-91 и Serin-197, и они могут быть удалены или заменены на Ала-91 и Ала-197 с получением аналога Hin47 H19A/S197A. Помимо этого, множество аминокислот могут включать His-91, Asp-121 и Ser-197 и они могут быть удалены или заменены на Ала-91, Ала-121 и Ала-197 соответственно с получением аналога Hin47 H91A/D121A/S197A. Описание некоторых свойств некоторых аналогов Hin47, предложенных здесь, представлено в таблице 3. Обнаружено, что только один мутант Hin47 D121E сохраняет существенную протеазную активность.

С другой стороны, настоящее изобретение относится к выделенной и очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей мутантный ген Haemophilus influenzae hin47, кодирующий аналог белка Haemophilus influenzae Hin47, имеющий пониженную протеазную активность, которая составляет менее 10% от активности природного белка Hin47. Мутантный ген hin47 может кодировать любой из аналогов Hin47, обсуждаемых выше. Мутантный ген преимущественно образован путем сайт-направленного мутагенеза дикого типа гена hin47. Молекула нуклеиновой кислоты может быть включена в рекомбинантную плазмиду, адаптированную для трансформации хозяина и может быть плазмидой DS-1011-1-1 (депонированой 27 июля 1994 г. в Американскую коллекцию типов культур, American type Culture Collection, Rockwill, Maryland, USA, под входящим N 75845). Изобретение также включает трансформированную клетку, содержащую такую рекомбинантную плазмиду.

Настоящее изобретение, с другой стороны, включает способ для получения аналога белка Haemophilus influenzae Hin47, имеющего пониженную протеазную активность, которая составляет менее чем 10% от активности природного белка Hin47, который заключается в идентификации, по крайней мере, одного аминокислотного остатка белка Hin47, который вносит вклад в его протеазную активность, в осуществлении сайт-направленного мутагенеза гена hin47 для удаления или замены нуклеотидной последовательности, кодирующей, по крайней мере, одну аминокислоту, и для получения мутированного гена hin47, введении мутированного гена hin47 в клетку для получения трансформированной клетки и выращивания трансформированной клетки для получения аналога Hin47. По крайней мере, одна аминокислота, которая является выбранной, может быть любой из специфически идентифицированных аминокислот, указанных выше, в отношении к аналогу Hin47.

Введение мутированного гена hin47 предпочтительно продуцирует трансформированную клетку, в которой мутированный ген hin47 находится под контролем Т7 промотера, а выращивание трансформированной клетки и экспрессия аналога Hin47 под воздействием Т7 промотера далее предпочтительно осуществляется путем культивирования в присутствии индуцирующей концентрации лактозы. Введение мутированного hin47 предпочтительно осуществляется путем трансформации клетки рекомбинантной плазмидой DS-1011-1-1, иногда другим способом, относительно как для плазмиды pT/Hin47*.

По дальнейшему аспекту изобретения предложен способ получения выделенного и очищенного аналога Hin47, который заключается в использовании метода, описанного выше для получения аналога Hin47, с продуцированием трансформированных клеток, включающих тельца включения, содержащие аналог Hin47, разрушении выросших трансформированных клеток с получением супернатанта и телец включения, солюбилизации телец включения с получением аналога Hin47, хроматографическую очистку аналога Hin47 из раствора, не содержащего клеточных остатков, и выделении очищенного аналога Hin47.

Аналоги Hin47, предложенные здесь, с их пониженной протеолитической активностью являются применимыми в качестве антигенов в иммунологической композиции, в качестве носителей для других иммуногенов, диагностических агентов и в производстве диагностических агентов. Молекулы нуклеиновых кислот также используются в качестве проб для диагностического использования, а также в качестве иммуногенных композиций.

Следующий аспект изобретения относится к иммуногенной композиции, содержащей иммуноэффективное количество аналога Hin47 или молекулы нуклеиновой кислоты, включающей ген, кодирующий аналог Hin47. Иммуногенная композиция может быть получена в виде вакцины для введения in vivo хозяину, включая человека, для придания защиты против заболеваний, вызываемых бактериальным патогеном, который продуцирует Hin47 или белок, способный к индукции у хозяина антител, специфически реактивных к Hin47. Бактериальный патоген может быть видом Haemophilus, таким как Haemophilus influenzae. Иммуногенные композиции по изобретению могут также содержать, по крайней мере, один другой иммуногенный или иммуностимулирующий материал, такой как адъювант. При дополнительном осуществлении молекула нуклеиновой кислоты, включающая ген, кодирующий аналог Hin47, может содержать в себе живой вектор, такой как вирус оспы. Salmonella, полиовирус, аденовирус, вирус коровий оспы или BCG.

Изобретение также охватывает способ выработки иммунного ответа у хозяина, включая человека, заключающегося во введении ему иммуноэффективного количества иммуногенных композиций, предложенных здесь.

Как отмечено выше, аналог Hin47, предложенный здесь, является полезным для диагностического применения. Соответственно, в дополнительном аспекте изобретения описан способ определения наличия антител, специфически реактивных к Hin47 в образце, включающий следующие стадии: (а) контактирование образца с аналогом Hin47, обладающим, по существу, теми же иммуногенными свойствами, что и природный белок Hin47, заявленный здесь, с получением комплексов, содержащих аналог Hin47 и любые подобные антитела, присутствующие в образце, специфически реагирующие с ним, и (б) определение образования комплексов.

Настоящее изобретение описывает также метод определения наличия Hin47 в образце, включающий следующие этапы: (а) иммунизация субъекта иммуногенной композицией, как описано здесь для получения антител, специфических к белку Hin47; (б) контактирование образца с антителами для образования комплексов, включающих любой присутствующий в образце Hin47 и Hin47 специфические антитела, и (с) определение образования комплексов.

Изобретение также охватывает диагностический набор для определения наличия антител в образце, специфически реактивных к Hin47, включающего: (а) аналог Hin47, обладающий, по существу, теми же иммуногенными свойствами, что и природный белок Hin47, как описано здесь; (б) устройство для контактирования аналога с образцом для получения комплекса, включающего аналог и любое подобное антитело, присутствующее в образце, и (с) устройство для определения образования комплекса.

Краткое описание чертежей На фиг. 1 показана рестрикционная карта плазмид JB-1031-1-14 и JB-1068-2-2 и построение плазмиды для анализа последовательности; На фиг. 2 A-H представлена полная нуклеотидная (SEQ ID NO: I) и выведенная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 2) Hin47 из Н. influenzae штамма SB33, как и частичная нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 33) и частичная выведенная аминокислотная последовательность, скопированная здесь заявителем из материалов, представленных на конференции АОМ, как описано выше.

На фиг. 3 A-B представлено сравнение аминокислотных последовательностей Н. influenzae Hin47 (SEQ ID NO:2), E. coli htrA (SEQ ID NO: 5) и Salmonella typhimirium htrA (SEQ ID NO: 6).

На фиг. 4 A-E показана последовательность аминокислотных остатков Hin47 от 57 до 256 в сравнении с некоторыми известными протеазами (SEQ ID NO: 7-16).

Обозначения следующие: TON, тонин крысы; РКААВ, калликреин; PTN, трипсин; СНАА, химотрипсин; EST, эластаза; RP2A, протеаза тучных клеток крысы; SGBE, протеиназа А S. griseus; SGA, протеиназа В S. griseus; ALP, альфа-литическая протеаза L. enzymogenes; hin47, остатки 57 - 256 Hin47. Звездочкой (*) обозначены структурно консервативные регионы. Триады каталитических остатков обозначены значком (#). 'con' соответствует областям структурного согласования среди протеаз млекопитающих.

На фиг. 5 А-В представлены рестрикционные карты плазмид DS-1011-1-1 и DS-1048-2, которые экспрессируют аналог Hin47 из Е. coli и конструкционная схема для плазмиды DS-1011-1-1 (плазмида рТ7/Hin47*).

На фиг. 6 показан процесс очистки аналога Hin47 из Е. coli в соответствии с одним из описаний настоящего изобретения и анализ геля очищенного продукта.

На фиг. 7 показаны протеазные активности природного Hin47 и аналога Hin47 по отношению к бетта-казеину.

На фиг. 8 показана стабильность природного Hin47 и аналога Hin47 при различных температурах.

На фиг. 9 показана энзиматическая деградация рекомбинантного белка Н. influenzae под действием природного Hin47 и аналога Hin47.

На фиг. 10 представлена сравнительная иммуногенность природного Hin47 и аналога Hin47 мыши.

На фиг. 11 А-B представлено сравнение аминокислот белка Hin47, выделенного из штаммов SB33 и SB12 Н. influenzae.

На фиг. 12 показана очистка Hin47 аналога Н19А из Е. coli.

Общее описание изобретения Любые штаммы Haemophilus, которые имеют гены Hin47, могут быть использованы общепринятым способом для очистки и выделения молекул нуклеиновых кислот (которые могут быть в форме молекул ДНК), содержащих, по крайней мере, часть, кодирующую Hin47, как типировано при осуществлениях настоящего изобретения. Такие штаммы обычно доступны из клинических источников и из коллекций бактериальных культур, таких как Американская коллекция типов культур (American Type Culture Collection). Такие штаммы включают штаммы Н. influenzae и других бактерий, которые продуцируют белок, способный образовывать антитела, которые специфически распознают фрагменты Hin47 или его аналогов. Подходящие штаммы Haemophilus могут включать: Н. influenzae тип b штамм MinnA; Н. influenzae тип b штамм Еаgаn; Н. influenzae нетипирующийся штамм SB33; Н. influenzae нетипирующийся штамм SB12 или Н. influenzae нетипирующийся штамм РАК 12085.

Что касается фиг. 1, на нем представлены рестрикционные карты плазмид JB-1031-1-14 и JB-1068-2-2, которые содержат часть, кодирующую белок Hin47 из нетипируемого штамма Н. influenzae SB33. Была определена нуклеотидная последовательность гена Hin47, которая представлена на фиг. 2 вместе с выведенной аминокислотной последовательностью белка Hin47. Что касается фиг. 3, на нем представлена аминокислотная последовательность Hin47 Н. influenzae и сериновой протеиназы htrA из Escherichia coli и htrA из Salmonella tyрhimirium. Эта линейная последовательность в первую очередь проявляет неожиданное обнаружение заявителей настоящего изобретения о том, что Hin47 относится к бактериальным сериновым протеазам и что Hin47 обладает протеазной активностью. Как ранее сообщалось, Hin47 является адгезином. Его обнаруженная протеазная активность существенно ограничивает применимость природного Hin47 как иммуногена для вакцинации и как антигена в диагностических целях. Линейная последовательность, представленная на фиг. 3, показывает, что белки htrA и Hin47 содержат GNSGGAL (SEQ ID NO: 17) последовательность между остатками 195 и 201 зрелого белка. Согласованной последовательностью активного центра сериновых протеаз является GDSGGPK (SEQ ID NO: 18) (Brenner, 1988) и активным остатком является серин. Таким образом, Serin-197 в Hin47 мутировал с получением аналога Hin47 с пониженной протеазной активностью в соответствии с осуществлением изобретения. При частном осуществлении Serin-197 был заменен на аланин. Аминокислотные остатки от 57 до 256 Hin47 были далее сличены с известными протеазами и остатки активного центра идентифицированы из локальных гомологий, окружающих остатки каталитической триады (фиг. 4). Существует стандартная система нумерации для сериновых протеаз, у которых остатки каталитической триады пронумерованы как His-57, Asp-102 и Ser-195. Это соответствует остаткам His-91, Asp-121 и Ser-197 в последовательной системе нумерации. Таким образом, что касается фиг. 4, то там представлена линейная структурная основа десяти структурно определенных сериновых протеаз (SEQ ID NOS: 7-16), у которых гомологические остатки первично линейны в основе подобного расположения в трехмерном пространстве. Положение многих остатков в гидрофобном ядре Hin47, а также остатки вокруг активного центра могут быть выстроены вполне приемлемо для идентификации функциональных аминокислот протеазы Hin47. Следовательно, другие аминокислотные остатки в Hin47, которые вносят вклад в протеазную активность белка, включают His-91 и Asp-121. При частном осуществлении His-91 может быть заменен на аланин, лизин или аргинин. При дополнительном осуществлении Asp-121 может быть заменен на аланин или глютаминовую кислоту. При дополнительном осуществлении Serin-197 может быть заменен на аланин, серии или треонин. Хотя приготовление аналога Hin47, имеющего пониженную протеазную активность, путем частичного аминокислотного заменения в белке Hin47, было приведено здесь в примерах, обнаружение протеазной активности и методы экспрессии Hin47, очистки и анализа, предложенные здесь, позволяют получать другие аналоги, обладающие, по крайней мере, одной другой аминокислотой, удаленной или замененной, или обладающие, по крайней мере, одной дополнительной аминокислотой, введенной в белок Hin47. При конкретных применениях и осуществлениях может быть желательно одновременное изменение нескольких аминокислот в белке Hin47 для частичного уменьшения протеазной активности Hin47. Несколькими аминокислотами могут быть His-91 и Ser-197 и могут быть удалены или заменены на аланин. По альтернативному осуществлению несколькими аминокислотами могут быть His-91, Asp-121 и Ser-197 и они могут быть удалены или заменены на аланин. Соответственно, настоящее изобретение касается аналогов белка Hin47, обладающих пониженной протеазной активностью в результате единичного или множественного удаления, заменения или добавления в белке Hin47.

Как обсуждается выше, Hin47 проявляет гомологию с Е. coli htrA или S. typhimirium htrA, оба из которых являются стресс-зависимыми белками с сериновой протеазной активностью. Е. coli включается при росте при температуре 43,5^oС (ссылка 13). Заявителями было показано, что белок htrA E. coli также является индуцибельным 6% этанолом. Hin47 также индуцируется 6% этанолом и, в меньшей степени, при доведении температуры до 43,5^oС, как это подробно описано далее. Этот анализ экспрессии Hin47 обеспечивает дальнейшее доказательство взаимосвязи между этим белком и LtrA.

Ген hin47 также был клонирован из нетирующегося штамма Н. influenzae SB12 путем PCR амплификации. Что касается фиг. 11, то там приведено сравнение аминокислот между белками Hin47 Н. influenzae штаммов SB12 и SB33. Показана почти полная идентичность аминокислотной последовательности.

Что касается фиг. 5, то там проиллюстрированы плазмиды DS-1011-1-1 и DS-1048-2, которые экспрессируют аналог Hin47 Serin-197 --> аланин у Е. coli. Фиг. 6 показывает последовательную диаграмму метода очистки аналога Hin47 из телец включения Е. coli.

Фиг. 7 показывает пониженную протеазную активность аналога Hin47 Serin-197 --> аланин по отношению к субстрату бетта-казеина и показывает то, что аналог обладает менее чем 10% протеазной активности природного белка Hin47. Таким образом, по одному осуществлению изобретения предложен аналог Hin47, обладающей протеазной активностью, составляющей менее чем 10% от протеазной активности природного Hin47, и такой аналог специфически имеет аминокислоту Serin-197, замененную на аланин.

Что касается фиг. 8, то там представлен анализ повышенной стабильности аналога Hin47, предложенного здесь. Таким образом, одно осуществление настоящего изобретения касается аналога белка Hin47, имеющего повышенную температурную стабильность, и такой аналог может специфически иметь аминокислоту Serin-197, замененную на аланин.

Что касается фиг. 9, то там показана протеолитическая деградация не-Нin47 Haemophilus антигена под действием аналога Hin47 и Hin47, предложенного здесь. Таким образом, в соответствии со следующим осуществлением настоящего изобретения предложен аналог Hin47, совместимый со вторым белком не-Нin47, и такой аналог может специфически иметь аминокислоту Serin-197, замененную на аланин.

Что касается фиг. 10 и таблицы 1, то там показана сравнительная иммуногенность у мышей немодифицированного Hin47 и аналога Hin47, обладающего пониженной протеазной активностью. Белок Hin47 и аналог Hin47 S197A и Н91А имеют сравнимую иммуногенность. Таким образом, при частном осуществлении предложен аналог Hin47, обладающей пониженной протеазной активностью и имеющий существенно те же иммуногенные свойства природного белка Hin47. Подобный аналог может специфически иметь аминокислоту Serin-197, замененную на аланин.

Что касается таблиц 2 и 3, то там представлены иммуногенные свойства аналогов Hin47, обладающих пониженной протеазной активностью по отношению к Hib на модели бактериемии у детенышей крыс и на модели отитов при активной иммунизации шиншилл в соответствии с конкретным осуществлением изобретения, подобный аналог может специфически иметь аминокислоту His-91, удаленную или замененную на аланин, лизин или аргинин; Asp-121, удаленный или замененный на аланин или глютаминовую кислоту; Serin-197, замененный на аланин, цистеин или треонин, или их сочетание.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена вакцина против Haemophilus или других бактериальных патогенов, которые производят Hin47 или белок, способный к индукции антител, которые специфически распознают Hin47, содержащая иммуногенно-эффективное количество иммунопротективного аналога Hin47, предложенного здесь, или молекулу нуклеиновой кислоты, обладающей последовательностью, кодирующей Hin47, предложенный здесь, и их физиологически приемлемый носитель. Предложенные аналоги также могут быть использованы как белки переносчики для гаптена, полисахаридов или пептидов для создания коньюгатной вакцины против антигенных детерминант, не родственных Hin47.

Как будет ясно из следующего описания, настоящее изобретение далее относится к плазмидам и новым штаммам бактерий для продукции аналогов Hin47, предложенных здесь.

Очищенные и выделенные молекулы ДНК, содержащие, по крайней мере, часть, кодирующую аналог белка Haemophilus influenzae Hin47, обладающий пониженной протеазной активностью по сравнению с природным Hin47, типированным путем осуществления описанного здесь, являются улучшенными в качестве проб нуклеиновых кислот для специфического обнаружения штаммов Haemophilus in vivo и in vitro. Аналоги Hin47, закодированные молекулами ДНК, предложенными здесь, используются в качестве диагностических реагентов, как антигены или для производства анти-Нin47 антител, антигенов для вакцинации против заболеваний, вызываемых видами Haemophilus и другими бактериальными патогенами, которые продуцируют белок, способный к продуцированию антител, которые специфически распознают Hin47 и для определения инфицирования Haemophilus и другими подобными бактериями.

При дополнительном осуществлении настоящего изобретения аналог Hin47, имеющий пониженную протеазную активность, предложенный здесь, может быть использован в качестве переносчика молекул для приготовления молекул химер и конъюгатов вакцин (включая гликоконъюгаты) против патогенных бактерий, включая инкапсулированные бактерии. Таким образом, например, гликоконъюгаты по настоящему изобретению могут быть применены для вакцинации, чтобы выработать защиту против заболевания и инфекции, вызываемой любой другой бактерией, имеющей полисахаридный антиген, включая липополисахариды (ЛПС) и PRF. Бактериальные патогены могут включать, например, Haemophilus influenzae, Strptococcus pneumonae, Niesseria meningitides. Salmonella typhi, Streptococcus mutans, Cryptococcus neophormans, Klebsiella, Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa. Конкретные антигены, которые могут быть конъюгированы с аналогами Hin47 и методы для получения таких коньюгатов описаны в приложениях опубликованной заявки РСТ WO 94/12641, которая, кроме того, включена здесь в ссылки.

В следующем осуществлении функция переносчика аналогов Hin47 может быть использована, например, для индукции иммунитета по отношению к анормальным полисахаридам опухолевых клеток или для продукции антиопухолевых антител, которые могут быть конъюгированы к химиотерапевтическим или биоактивным агентам.

Соответственно, настоящее изобретение касается первичной последовательности и получения аналогов Hin47 H. influenzae, которые могут быть использованы для профилактики и диагностики заболеваний, вызываемых H. influenzae. В частности, заявители обнаружили, что аналоги Hin47 могут вырабатывать защитные иммунные ответы против бактериальной провокации живыми H. influenzae тира b. Таким образом, настоящее изобретение имеет полезность для вакцин. Изобретение также описывает нуклеотидные последовательности генов, кодирующих аналоги Hin47. Эти сегменты ДНК могут быть использованы для создания иммуногена, практически свободного от других антигенов H. influenzae, таких как PRP и липополисахариды (ЛПС), путем применения технологии с рекомбинантной ДНК технологии. Аналог белка Hin47 может быть получен в подходящих системах для экспрессии, таких как Е. coli, Haemophilus, Bacillus, Bordetella, грибы, дрожжи, бакуловирус, поксивирус, вирус коровий оспы, или системах экспрессии млекопитающих. Настоящее описание далее включает новые методы, которые могут быть применены для получения практически чистых аналогов Hin47.

Специалисту понятно, что различные осуществления настоящего изобретения имеют множество применений в областях вакцинации, диагностики, лечения, например, инфекций Haemophilus и инфекций других бактериальных патогенов, которые производят белки, способные для продукции антител, которые специфически распознают Hin47, и в области производства иммунологических реагентов. Дальнейшее не ограничивающее обсуждение таких применений представлено далее.

1. Препарат вакцины и применение Иммуногенные композиции, удобные для применения в качестве вакцины, могут быть приготовлены из аналогов Hin47, как здесь описано. Вакцина усиливает иммунный ответ у субъекта, который продуцирует антитела, включая анти-Нin47 антитела и антитела, которые являются опсонизирующими или бактерицидными. Вакцинируемый объект должен быть отзывчивым на Haemophilus или другие бактерии, которые продуцируют белки, способные вырабатывать антитела, которые специфически распознают Hin47, антитела связывают и инактивируют бактерию. Более того, опсонизирующие или бактерицидные анти-Нin47 могут также обеспечивать защиту путем альтернативных механизмов.

Иммуногенная композиция, включающая вакцины, может быть получена в виде, пригодном для инъекций, в виде жидких растворов или эмульсий. Аналоги Hin47 могут быть смешаны с фармацевтически приемлемыми наполнителями, которые совместимы с аналогом Hin47. Такие наполнители могут включать воду, физраствор, декстрозу, глицерин, этанол и их сочетание. Иммуногенная композиция и вакцины могут, кроме того, содержать вспомогательные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие агенты, рН буферирующие агенты или адъюванты, для улучшения их эффективности. Методы для достижения действия адъюванта включают применение агентов, таких как гидроксид или фосфат алюминия, обычно используемых в виде 0,05-0,1 процентного раствора в фосфатном буфере на физиологическом растворе. Иммуногенные композиции и вакцины могут вводиться внутрь путем инъекции подкожно или внутримышечно. Альтернативно иммуногенные композиции, образованные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть составлены и доставлены для вызова иммунного ответа на слизистые оболочки. Таким образом, иммуногенная композиция может доставляться на слизистые оболочки, например, через носовые или ротовые (внутрижелудочные) пути. Альтернативно могут быть желательны другие методы введения, включающие суппозитории и пероральные составы. Для суппозиториев связывающие носители могут включать, например, полиалкеновые гликоли или триглицериды. Пероральные составы могут включать обычно используемые добавки, такие как, например, фармацевтически чистый сахарин, целлюлозу и карбонат магния. Эти композиции могут иметь вид растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, составов с поддерживающим высвобождением или порошков и содержать от 1 до 95 % аналогов Hin47. Иммуногенные препараты и вакцины вводятся методом, совместимым с дозировкой препарата, и в таких количествах, которые будут терапевттически эффективными, профилактическими и иммуногенными. Вводимое количество зависит от субъекта, подвергающемуся лечению, включая, например, способность индивидуальной иммунной системы для синтеза антител, и, если необходимо, для продукции клеток, опосредующих иммунный ответ. Точные количества активного ингредиента, требуемого для введения зависит от оценки лечащего врача. Однако области подходящих дозировок легко определимы специалистом и могут составлять порядка микрограмм для аналога Hin47. Подходящие режимы для начального введения и ударных доз также является вариабельными, но могут включать начальное и последующее за ним введение. Дозировки могут также зависеть от путей введения и будут варьировать в соответствии с размером хозяина.

Концентрация антигена в иммуногенной композиции, в соответствии с изобретением, составляет обычно от 1 до 95 %. Вакцина, которая содержит антигенный материал только одного патогена, являются моновалентной вакциной. Вакцины, которые содержат антигенный материал от нескольких патогенов, являются комбинированными вакцинами и также относятся к настоящему изобретению. Такие комбинированные вакцины содержат, например, материал от различных патогенов или от различных штаммов того же самого патогена, или от сочетаний различных патогенов.

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие аналог Hin47 по настоящему изобретению, могут также использоваться непосредственно для иммунизации путем непосредственного введения ДНК, например путем инъекции для генетической иммунизации или путем создания живого вектора, такого как Salmonella, BCG, аденовирус, поксивирус, вирус коровий оспы или полиовирус. Обсуждение некоторых живых векторов, которые были использованы для перенесения гетерологических антигенов в иммунную систему рассматривается, например, O'Наgаn (1992). Способы прямой инъекции ДНК в исследуемые субъекты для генетической иммунизации описаны, например, Ulmer et al, 1993.

2. Иммуноанализы Аналоги Hin47 по настоящему изобретению используются в качестве иммуногенов для наработки анти-Нin47 антител, в качестве антигенов для иммуноанализов, включая анализы на ферментах, пришитых к сорбенту (ELISA), радиоиммуноанализы (RIA) и другие анализы связывания неэнзиматически пришитых антител или методы, известные в данной области для обнаружения антибактериальных, Haemophilus и анти-Нin47 антител. При анализах ELISA аналоги Hin47 иммобилизуют на выбранной поверхности, например поверхности, способной к связыванию белков, такой как полистерольные микротитровальные планшеты. После отмывания для удаления не полностью абсорбированных аналогов Hin47 с выбранной поверхностью может быть связан неспецифический белок, такой как бычий сывороточный альбумин (BSA) в растворе, который, как известно, является антигенно нейтральным по отношению к исследуемому образцу. Это позволяет блокировать места неспецифической адсорбции на иммобилизационной поверхности и, таким образом, подавлять фон из-за неспецифического связывания антисыворотки к поверхности.

Иммобилизационная поверхность затем контактирует с образцом, таким как клинический или биологический материалы, исследуемые методом, способствующим образованию иммунного комплекса (антиген/антитело). Это может включать разбавление образца разбавителями, такими как растворы BSA, бычий гамма- глобулин (BGG) и/или фосфатный буфер на физрастворе (РВS)/Твин. Образец затем инкубируют от 2 до 4 часов при температуре, такой как положено, от 25 до 37^oС. После инкубации поверхность, контактирующую с образцом, отмывали для удаления неиммунокомплексного материала. Процедура отмывки может включать отмывку раствором, таким как РВS/