Новые пестицидные протеины и штаммы

Новые пестицидные протеины и штаммы

Реферат

 

Изобретение может быть использовано в селекции растений. Трансгенное растение получают введением в его геном молекулы ДНК, кодирующей инсектицидный протеин, который секретируется на вегетативной стадии роста Bacillus spp. Трансформация может также включать использование последовательностей ДНК, кодирующих вспомогательные и/или слитые протеины. Секреция инсектицидных протеинов во время вегетативной стадии роста штаммов Bacillus обеспечивает защиту растения от повреждения насекомыми-вредителями. 3 с. и 43 з.п. ф-лы, 33 табл.

Изобретение относится к способам и композициям для борьбы с вредителями растений и другими вредителями. В частности оно относится к новым протеинам с пестицидной активностью, которые могут быть выделены из Bacillus на стадии вегетативного роста. Изобретение относится также к штаммам Bacillus, протеинам и генам, кодирующим протеины. Способы и композиции, также предлагаемые согласно настоящему изобретению, могут быть использованы в различных системах для борьбы с вредителями растений и другими вредителями.

Насекомые-вредители являются основным фактором потери урожая экономически важных сельскохозяйственных культур во всем мире. Для борьбы или полного уничтожения важных с сельскохозяйственной точки зрения вредителей используют широкий спектр химических пестицидов. Тем не менее существенный интерес представляет разработка эффективных альтернативных пестицидов.

Микробиологические пестициды играют важную роль в качестве альтернативы химическому методу борьбы с вредителями. Наиболее широко применяемый микробиологический продукт основан на использовании бактерии Bacillus thuringiensis (Bt). Bt представляет собой грамположительную спорообразующую бактерию рода Bacillus, которая во время споруляции продуцирует инсектицидный кристаллический протеин (ИКП).

Известны многочисленные разновидности Bt, которые продуцируют более 25 различных, но родственных ИКП. Большинство ИКП, продуцируемых Bt, токсичны для личинок определенных видов насекомых из отрядов Lepidoptera (Чешуекрылых), Diptera (Двукрылых) и Coleoptera (Жесткокрылых). Обычно при поедании ИКП чувствительным к нему насекомым кристалл растворяется и превращается с помощью протеаз кишечника насекомого в токсичное производное. Ни один из ИКП, активных в отношении личинок жуков, таких как колорадский жук (Leptinotarsa decemlineata) или большой мучной хрущак (Tenebrio molitor), не проявил существенной эффективности в отношении представителей рода Diabrotica, в частности Diabrotica virgifera virgifera - блошки длинноусой западной (БДЗ) - или Diabrotica longicornis barberi - блошки длинноусой северной.

Bacillus cereus (Bc) во многом схож с Bt. Основным характерным отличием является отсутствие у Вс параспорального кристалла. Вс является широко распространенной бактерией, обычно присутствующей в почве и выделяемой из различных пищевых и лекарственных продуктов. Этот организм принимает участие в порче пищи.

Хотя Bt очень полезна для борьбы с насекомыми-вредителями, необходимо расширять количество потенциальных агентов, предназначенных для биологической борьбы.

Настоящее изобретение относится, таким образом, к композициям и способам борьбы с вредителями растений. В частности оно относится к новым пестицидным протеинам, которые продуцируются штаммами Bacillus на стадии вегетативного роста. Эти протеины могут найти применение в качестве пестицидных агентов.

Настоящее изобретение относится прежде всего к практически очищенному штамму Bacillus, который продуцирует протеин с пестицидной активностью на стадии вегетативного роста, причем этот штамм Bacillus не является В. sphaericus SSII-1. Предпочтительным является штамм Bacillus cereus, имеющий регистрационный номер NRRL В-21058 и Bacillus thuringiensis, имеющий регистрационный номер NRRL В-21060. Также предпочтительным является штамм, выбранный из группы штаммов, имеющих регистрационные номера NRRL В-21224, NRRL В-21225, NRRL В-21226, NRRL В-21227, NRRL В-21228, NRRL В-21229, NRRL В-21230 и NRRL B-21439.

Кроме того, изобретение относится к специфичному в отношении насекомых протеину, который может быть выделен в фазе вегетативного роста из Bacillus spp. и предпочтительно из штамма Bacillus thuringiensis и В. cereus, и к его компонентам, причем этот протеин не является токсичным для комаров из В. sphaericus SSII-1. Специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению предпочтительно является токсичным для насекомых из отрядов Coleoptera или Lepidoptera и имеет молекулярную массу приблизительно 30 кДа или более, предпочтительно от приблизительно 60 до приблизительно 100 кДа и более предпочтительно приблизительно 80 кДа.

В частности специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению обладает таким спектром инсектицидной активности, который включает активность в отношении видов Agrotis и/или Spodoptera и предпочтительно активность в отношении совки ипсилон [Agrotis ipsilon; СИ], и/или совки травяной [Spodoptera frugiperda], и/или совки малой [Spodoptera exigua], и/или табачной листовертки, и/или совки хлопковой [Helicoverpa zea].

Специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению предпочтительно может быть выделен, например, из штамма Bacillus cereus, имеющего регистрационный номер NRRL В-21058, или из Bacillus thuringiensis, имеющего регистрационный номер NRRL B-21060.

Специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению предпочтительно может быть выделен из штамма Bacillus spp., выбранного из группы штаммов, имеющих регистрационные номера NRRL В-21224, NRRL В-21225, NRRL B-21226, NRRL B-21227, NRRL B-21228, NRRL B-21229, NRRL В-21230 и NRRL B-21439.

В частности в объем настоящего изобретения включен специфичный в отношении насекомых протеин, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 7, включая любые протеины, которые структурно и/или функционально являются его гомологами.

Кроме того, предпочтительным является специфичный в отношении насекомых протеин, когда этот протеин имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 2, включая любые протеины, которые структурно и/или функционально являются его гомологами.

Особенно предпочтительным является специфичный в отношении насекомых протеин, когда этот протеин имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 32, включая любые протеины, которые структурно и/или функционально являются его гомологами.

Кроме того, предпочтительный вариант осуществления изобретения включает специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению, в котором последовательности, представляющие собой сигнал секреции, были удалены или инактивированы.

В объем настоящего изобретения, кроме того, включены вспомогательные протеины, которые усиливают специфичную в отношении насекомых активность протеина, специфичного в отношении насекомых. Эти вспомогательные протеины предпочтительно имеют молекулярную массу приблизительно 50 кДа и могут быть выделены, например, из штамма Bacillus cereus во время фазы вегетативного роста и особенно предпочтительно из штамма Bacillus cereus AB78.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к вспомогательному протеину, в котором последовательности, представляющие собой сигнал секреции, были удалены или инактивированы.

Кроме того, настоящее изобретение относится к обладающим пестицидной активностью многомерным протеинам, которые содержат более одной полипептидной цепи и в которых по крайней мере одна из полипептидных цепей представляет собой специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению, а по крайней мере одна из полипептидных цепей представляет собой вспомогательный протеин по изобретению, который активирует или усиливает пестицидную активность специфичного в отношении насекомых протеина.

Многомерные протеины по изобретению, обладающие пестицидной активностью, предпочтительно имеют молекулярную массу от приблизительно 50 кДа до приблизительно 200 кДа.

В объем изобретения включен, в частности, обладающий пестицидной активностью многомерный протеин, который содержит специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению и вспомогательный протеин по изобретению, который активирует или усиливает пестицидную активность специфичного в отношении насекомых протеина.

Кроме того, настоящее изобретение относится к слитым протеинам, содержащим несколько протеиновых доменов, включающих по крайней мере специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению и/или вспомогательный протеин по изобретению, образующихся посредством генетических слияний, которые при трансляции рибосомами продуцируют слитый протеин, сочетающий в себе по крайней мере свойства специфичного в отношении насекомых протеина по изобретению и/или вспомогательного протеина по изобретению и необязательно других компонентов, применяемых при слиянии.

Один из вариантов осуществления изобретения относится к слитому протеину, содержащему рибонуклеазный S-протеин, специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению и вспомогательный протеин по изобретению.

Кроме того, еще один вариант осуществления изобретения относится к слитому протеину, содержащему специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению и вспомогательный протеин по изобретению, причем либо специфичный в отношении насекомых протеин, либо вспомогательный протеин находятся на N-конце слитого протеина.

Предпочтительным является слитый протеин, который содержит специфичный в отношении насекомых протеин, представленный в SEQ ID NO: 5, и вспомогательный протеин, представленный в SEQ ID NO: 2, что приводит к образованию протеина, представленному в SEQ ID NO: 23, включая любые протеины, которые структурно и/или функционально являются его гомологами.

Также предпочтительным является слитый протеин, содержащий специфичный в отношении насекомых протеин, представленный в SEQ ID NO:35, и вспомогательный протеин, представленный в SEQ ID NO: 27, что приводит к образованию протеина, представленного в SEQ ID NO: 50, включая любые протеины, которые структурно и/или функционально являются его гомологами.

Кроме того, изобретение относится к слитому протеину, содержащему специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению и/или вспомогательный протеин по изобретению, слитый с сигнальной последовательностью, предпочтительно с секретирующей сигнальной последовательностью или с последовательностью, обеспечивающей целенаправленную доставку, которая направляет трансгенный продукт к определенной органелле или компартменту клетки, причем сигнальная последовательность является гетерологичной по происхождению по отношению к протеину-реципиенту.

Особенно предпочтительным по изобретению является слитый протеин, когда этот протеин имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 43 или в SEQ ID NO: 46, включая любые протеины, которые структурно и/или функционально являются его гомологами.

В контексте настоящего изобретения такое понятие, как "практически гомологичная последовательность", обозначает близкое структурное сходство между последовательностями аминокислот. Например, практически гомологичные протеины могут быть гомологичными на 40%, предпочтительно на 50% и наиболее предпочтительно гомологичными на 60% или 80% или более. Гомология также включает сходство, когда отсутствуют одна или несколько субпоследовательностей аминокислот или когда включены субпоследовательности с дополнительными аминокислотами.

Еще один предмет изобретения относится к молекуле ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует специфичный в отношении насекомых протеин, который может быть выделен в фазе вегетативного роста из Bacillus spp., и его компоненты, причем этот протеин не является токсичным для комаров из В. sphaericus SSII-1. В частности настоящее изобретение относится к молекуле ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует специфичный в отношении насекомых протеин, причем спектр его инсектицидной активности включает активность в отношении видов Agrotis и/или Spodoptera и предпочтительно активность в отношении совки ипсилон [Agrotis ipsilon; СИ], и/или совки травяной ISpodoptera frugiperda], и/или совки малой [Spodoptera exigua], и/или табачной листовертки, и/или совки хлопковой [Helicoverpa zea] .

Предпочтительной является молекула ДНК, когда эта молекула содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6, включая любые молекулы ДНК, которые являются ее структурными и/или функциональными гомологами.

Также предпочтительной является молекула ДНК, когда эта молекула содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31 или SEQ ID NO: 1, включая любые молекулы ДНК, которые являются ее структурными и/или функциональными гомологами.

Кроме того, изобретение относится к молекуле ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует вспомогательный протеин по изобретению, усиливающий специфичную в отношении насекомых активность протеина, специфичного в отношении насекомых.

Предпочтительной является молекула ДНК, когда эта молекула содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19, включая любые молекулы ДНК, которые являются ее структурными и/или функциональными гомологами.

Еще один вариант осуществления изобретения относится к молекуле ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую специфичный в отношении насекомых протеин, который может быть выделен в фазе вегетативного роста из Bacillus spp. , и его компоненты, когда этот протеин не является токсичным для комаров из В. sphaericus SSII-1, причем эта нуклеотидная последовательность оптимизирована для экспрессии в микроорганизме или в растении.

Предпочтительной является молекула ДНК, когда эта молекула содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18, включая любые молекулы ДНК, которые являются ее структурными и/или функциональными гомологами.

Также предпочтительной является молекула ДНК, когда эта молекула содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 или SEQ ID NO: 30, включая любые молекулы ДНК, которые являются ее структурными и/или функциональными гомологами.

Кроме того, изобретение относится к молекуле ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую обладающий пестицидной активностью многомерный протеин, который содержит более одной полипептидной цепи и в котором по крайней мере одна из полипептидных цепей представляет собой специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению, а по крайней мере одна из полипептидных цепей представляет собой вспомогательный протеин по изобретению, который активирует или усиливает пестицидную активность специфичного в отношении насекомых протеина.

Предпочтительной является молекула ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению и вспомогательный протеин по изобретению, который активирует или усиливает пестицидную активность специфичного в отношении насекомых протеина.

Особенно предпочтительной является молекула ДНК, когда эта молекула содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 19, включая любые нуклеотидные последовательности, которые являются ее структурными и/или функциональными гомологами.

Еще один вариант осуществления изобретения относится к молекуле ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый протеин, который содержит несколько протеиновых доменов, включающих по крайней мере специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению и/или вспомогательный протеин по изобретению, образуемый посредством генетических слияний, и которая при трансляции на рибосомах продуцирует слитый протеин, который по крайней мере сочетает в себе свойства специфичного в отношении насекомых протеина по изобретению и/или вспомогательного протеина по изобретению и необязательно других компонентов, применяемых при слиянии.

Предпочтительной по изобретению является молекула ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый протеин, содержащий специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению и вспомогательный протеин по изобретению, причем либо специфичный в отношении насекомых протеин, либо вспомогательный протеин находятся на N-конце слитого протеина. Особенно предпочтительной является молекула ДНК, когда эта молекула содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, включая любые молекулы ДНК, которые являются ее структурными и/или функциональными гомологами.

Кроме того, изобретение относится к молекуле ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый протеин, содержащий специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению и/или вспомогательный протеин по изобретению, слитый с сигнальной последовательностью, предпочтительно с секретирующей сигнальной последовательностью или с последовательностью, обеспечивающей целенаправленную доставку, которая направляет трансгенный продукт к конкретной органелле или компартменту клетки, причем сигнальная последовательность является гетерологичной по происхождению по отношению к ДНК-реципиенту.

В объем настоящего изобретения, кроме того, включена молекула ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый протеин или многомерный протеин по изобретению, и которая оптимизирована для экспрессии в микроорганизме или в растении.

Предпочтительной является оптимизированная молекула ДНК, причем эта молекула содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 45 или SEQ ID NO:49, включая любые молекулы ДНК, которые являются ее структурными и/или функциональными гомологами.

Кроме того, изобретение относится к оптимизированной молекуле ДНК, в которой последовательности, кодирующие сигнал секреции, удалены с ее 5'- конца, и прежде всего к оптимизированной молекуле ДНК, когда эта молекула содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 39, включая любые молекулы ДНК, которые являются ее структурными и/или функциональными гомологами.

В контексте настоящего изобретения такое понятие, как "практически гомологичная последовательность", обозначает близкое структурное сходство между последовательностями нуклеотидов. Например, практически гомологичные молекулы ДНК могут быть гомологичными на 60%, предпочтительно на 80% и наиболее предпочтительно гомологичными на 90% или 95% или более. Гомология также включает сходство, когда одна или несколько субпоследовательностей нуклеотидов или аминокислот отсутствуют или когда включены субпоследовательности с дополнительными нуклеотидами или аминокислотами.

Настоящее изобретение также включает молекулы ДНК, которые гибридизируются в умеренно строгих условиях с молекулой ДНК по изобретению, как она определена выше в настоящем описании, и предпочтительно с олигонуклеотидным зондом, который получают из этой молекулы и который включает смежную часть кодирующей последовательности для специфичного в отношении насекомых протеина длиной по крайней мере 10 нуклеотидов, причем эти молекулы имеют специфичную в отношении насекомых активность, и эти молекулы ДНК также кодируют специфичные в отношении насекомых протеины.

Предпочтительными являются молекулы ДНК, когда гибридизация происходит при 65^oС в буфере, содержащем 7%-ный ДСН (додецилсульфат натрия) и 0,5М фосфат натрия.

Особенно предпочтительной является молекула ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению, и которую получают способом, включающим: (а) получение молекулы ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую специфичный в отношении насекомых протеин; (б) гибридизацию этой молекулы ДНК с олигонуклеотидным зондом, получаемым из молекулы ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 31; и (в) выделение гибридизующейся ДНК.

Изобретение, кроме того, относится к специфичному в отношении насекомых протеину, когда этот протеин кодируется молекулой ДНК по изобретению.

Также в объем настоящего изобретения включена кассета экспрессии, содержащая молекулу ДНК по изобретению, функционально связанную с обеспечивающими экспрессию последовательностями, включающими регуляторные сигналы транскрипции и трансляции, необходимые для экспрессии объединенных конструкций ДНК в организме-хозяине, предпочтительно в микроорганизме или растении, и необязательно дополнительные регуляторные последовательности.

Изобретение, кроме того, относится к векторной молекуле, содержащей кассету экспрессии по изобретению.

Кассета экспрессии и/или веторная молекула по изобретению предпочтительно представляет собой часть генома растения.

Еще один вариант осуществления изобретения относится к организму-хозяину, предпочтительно к организму-хозяину, выбранному из группы, состоящей из клеток растений и насекомых, бактерий, дрожжей, бакуловирусов, простейших, нематод и водорослей, и содержащему молекулу ДНК по изобретению, кассету экспрессии, содержащую эту молекулу ДНК, или векторную молекулу, содержащую эту кассету экспрессии, предпочтительно стабильно включенную в геном организма-хозяина.

Изобретение, кроме того, относится к трансгенному растению и предпочтительно к растению кукурузы, включая его части, а также потомство и семенной материал, содержащему молекулу ДНК по изобретению, кассету экспрессии, содержащую эту молекулу ДНК, или векторную молекулу, содержащую эту кассету экспрессии, предпочтительно стабильно включенную в геном растения.

Предпочтительным является трансгенное растение, включая его части, а также потомство и семенной материал, стабильно трансформированные молекулой ДНК по изобретению, кассетой экспрессии, содержащей эту молекулу ДНК, или векторной молекулой, содержащей эту кассету экспрессии.

Также предпочтительным является трансгенное растение, включая его части, а также потомство и семенной материал, экспрессирующие специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению.

Кроме того, изобретение относится к трансгенному растению, предпочтительно к растению кукурузы по изобретению, как оно определено выше в настоящем описании, которое дополнительно экспрессирует второй, отличный от первого, пригодный для борьбы с насекомыми ингредиент, предпочтительно -эндотоксин Bt. Это растение предпочтительно представляет собой гибридное растение.

Следует отметить, что в объем настоящего изобретения включены части трансгенного растения, в том числе клетки растения, протопласты, ткани, каллюс, эмбрионы, а также цветки, стебли, плоды, листья, корни, имеющие происхождение от трансгенных растений или их потомства, предварительно трансформированного молекулой ДНК по изобретению и, следовательно, состоящего, по крайней мере частично, из трансгенных клеток, которые являются предметом настоящего изобретения.

Кроме того, изобретение относится к растительному материалу для размножения растения по изобретению, который обрабатывают защитным покрытием для семенного материала.

Кроме того, изобретение включает микроорганизм, трансформированный молекулой ДНК по изобретению, кассетой экспресии, содержащей эту молекулу ДНК, или вектороной молекулой, содержащей кассету экспресии, причем этот микроорганизм предпочтительно представляет собой микроорганизм, который размножается на растениях, и более предпочтительно представляет собой бактерию, образующую колонии на корнях.

Еще один вариант осуществления изобретения относится к инкапсулированному специфичному в отношении насекомых протеину, который содержит микроорганизм, включающий специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению.

Изобретение также относится к инсектицидной композиции, содержащей организм-хозяин по изобретению, предпочтительно очищенный штамм Bacillus, в количестве, обладающем инсектицидной активностью, вместе с пригодным носителем.

Кроме того, изобретение включает инсектицидную композицию, содержащую выделенную молекулу протеина по изобретению индивидуально либо в сочетании с организмом-хозяином по изобретению и/или инкапсулированный специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению в количестве, обладающем инсектицидной активностью, вместе с пригодным носителем.

Изобретение относится также к способу получения очищенного специфичного в отношении насекомых протеина по изобретению, причем этот способ включает нанесение раствора, содержащего специфичный в отношении насекомых протеин, на NAD-колонку и элюирование связанного протеина.

Изобретение относится также к способу выявления инсектицидной активности специфичного в отношении насекомых протеина по изобретению, включающему: выращивание штамма Bacillus в культуре; получение супернатанта из этой культуры; кормление личинки насекомого пищей с добавлением супернатанта; и определение смертности.

Еще один предмет настоящего изобретения относится к способу выделения специфичного в отношении насекомых протеина по изобретению, включающему: выращивание штамма Bacillus в культуре; получение супернатанта из этой культуры; и выделение специфичного в отношении насекомых протеина из супернатанта.

В объем изобретения также включен способ выделения молекулы ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую специфичный в отношении насекомых протеин, обладающий инсектицидной активностью протеинов по изобретению, причем этот способ включает: получение молекулы ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую специфичный в отношении насекомых протеин; гибридизацию этой молекулы ДНК с ДНК, полученной из видов р. Bacillus; и выделение этой гибридизующейся ДНК.

Кроме того, изобретение относится к способу расширения спектра насекомых-мишеней в результате использования специфичного в отношении насекомых протеина по изобретению в сочетании по крайней мере еще с одним, вторым инсектицидным протеином, отличным от специфичного в отношении насекомых протеина по изобретению, и предпочтительно с инсектицидным протеином, выбранным из группы, состоящей из -эндотоксинов Bt, ингибиторов протеаз, лектинов, -амилаз и пероксидаз.

Предпочтительным является способ расширения спектра насекомых-мишеней для растения путем экспрессии в этом растении специфичного в отношении насекомых протеина по изобретению в сочетании по крайней мере еще с одним, вторым инсектицидным протеином, отличным от специфичного в отношении насекомых протеина по изобретению, и предпочтительно с инсектицидным протеином, выбранным из группы, состоящей из -эндотоксинов Bt, ингибиторов протеаз, лектинов, -амилаз и пероксидаз.

Изобретение также относится к способу защиты растений от повреждений, вызываемых насекомым-вредителем, предпочтительно видами Spodoptera и/или Agrotis и более предпочтительно насекомым-вредителем, выбранным из группы, состоящей из совки ипсилон [Agrotis ipsilon; СИ], совки травяной [Spodoptera frugiperda] , совки малой [Spodoptera exigua], табачной листовертки и совки хлопковой [Helicoverpa zea], причем этот способ включает обработку растения или места произрастания этого растения инсектицидной композицией или токсичным протеином по изобретению.

Изобретение также относится к способу защиты растений от повреждений, вызываемых насекомым-вредителем, предпочтительно видами Spodoptera и/или Agrotis и более предпочтительно насекомым-вредителем, выбранным из группы, состоящей из совки ипсилон [Agrotis ipsilon; СИ], совки травяной [Spodoptera frugiperda] , совки малой [Spodoptera exigua], табачной листовертки и совки хлопковой [Helicoverpa zea], причем этот способ включает выращивание трансгенного растения, экспрессирующего специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению, в ареале, где может встречаться это насекомое-вредитель.

Изобретение также включает способ получения организма-хозяина, который содержит стабильно интегрированную в его геном молекулу ДНК по изобретению и предпочтительно экспрессирует специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению, причем этот способ включает трансформацию организма-хозяина молекулой ДНК по изобретению, кассетой экспрессии, содержащей эту молекулу ДНК, или вектороной молекулой, содержащей кассету экспрессии.

Еще один предмет изобретения относится к способу получения трансгенного растения или клетки растения, которая содержит стабильно интегрированную в геном растения молекулу ДНК по изобретению и предпочтительно экспрессирует специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению, причем этот способ включает трансформацию растения и клетки растения соответственно молекулой ДНК по изобретению, кассетой экспрессии, содержащей эту молекулу ДНК, или векторной молекулой, содержащей кассету экспрессии.

Изобретение также относится к способу получения инсектицидной композиции, включающему смешение выделенного штамма Bacillus, и/или организма-хозяина, и/или выделенной молекулы протеина, и/или инкапсулированного протеина по изобретению в количестве, обладающем инсектицидной активностью, с пригодным носителем.

В изобретении также предлагается способ получения трансгенного потомства трансгенного родительского растения, содержащего стабильно включенную в геном растения молекулу ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую специфичный в отношении насекомых протеин по изобретению, причем этот способ включает трансформацию родительского растения молекулой ДНК по изобретению, кассетой экспрессии, содержащей молекулу ДНК, или векторной молекулой, содержащей кассету экспрессии, и передачу признака пестицидной активности потомству этого трансгенного родительского растения с использованием известных методов селекции растений.

Изобретение также относится к олигонуклеотидному зонду, способному к специфической гибридизации с нуклеотидной последовательностью, кодирующей специфичный в отношении насекомых протеин, выделяемый на стадии вегетативного роста Bacillus spp., и его компоненты, где этот протеин не является токсичным для комаров из В. sphaericus SSII-1, причем этот зонд включает смежную часть кодирующей последовательности для специфичного в отношении насекомых протеина длиной по крайней мере 10 нуклеотидов, и к применению олигонуклеотидного зонда для скрининга любого штамма Bacillus или других организмов для определения того, присутствует ли в нем специфичный в отношении насекомых протеин в естественных условиях или включает ли определенный трансформированный организм этот ген.

Согласно настоящему изобретению предполагается, что протеины, обладающие пестицидной активностью, продуцируются во время вегетативного роста штаммов Bacillus. Принимая во внимание, что такой класс существует, в объем настоящего изобретения включены все вегетативные инсектицидные протеины, обозначаемые в настоящем описании как VIP, за исключением токсина для комаров из В. sphaericus.

Указанные VIP присутствуют в небольшом количестве после споруляции, и они практически экспрессируются во время фазы логарифмического роста перед стационарной фазой. Согласно настоящему изобретению вегетативный рост определяется как период времени до начала споруляции. Гены, кодирующие такие VIP, могут быть выделены, клонированы в различные средства доставки и использованы для трансформации с целью использования в программах регуляции численности вредителей.

Согласно настоящему изобретению под понятие "вредители" подпадают, но не ограничены ими, насекомые, грибы, бактерии, нематоды, растительноядные клещи, иксодовые клещи, паразиты-простейшие, паразитирующие на животных печеночные двуустки и т.п.. Насекомые-вредители включают насекомых, выбранных из отрядов Coleoptera (Жесткокрылые), Diptera (Двукрылые), Hymenoptera (Перепончатокрылые), Lepidoptera (Чешуекрылые), Mallophaga (Пухоеды), Homoptera (Равнокрылые), Hemiptera (Полужесткокрылые), Orthoptera (Прямокрылые), Thysanoptera (Трипсы), Dennaptera (Уховертки), Isoptera (Термиты), Anoplura (Вши), Siphonaptera (Блохи), Trichoptera (Ручейники) и др., в частности насекомые из отрядов Coleoptera и Lepidoptera.

В таблицах 1-10 представлен список вредителей основных сельскохозяйственных культур и вредителей, имеющих медицинское и ветеринарное значение. Указанные вредители включены в объем настоящего изобретения.

Было установлено, что протеины, обладающие пестицидной активностью, могут быть выделены из Bacillus во время фазы вегетативного роста и из других штаммов, которые могут быть выделены с помощью стандартных методик, а их активность может быть определена в отношении конкретных вредителей растений и других вредителей. Обычно штаммы Bacillus могут быть выделены из любых образцов, взятых из окружающей среды, включая почву, растение, насекомого, зерновую элеваторную пыль, других материалов и т.д., с помощью методов, известных в данной области техники. См., например, у Travers и др. (1987) Appl. Environ. Microbiol. 53: 1263-1266; Saleh и др. (1969) Can. J. Microbiol. 15: 1101-1104; DeLucca и др. (1981) Can J. Microbiol. 27: 865-870; и у Norris и др. (1981) в "The genera Bacillus and Sporolactobacillus", у Starr и др. (ред.) в The Prokaryotes: A Handbook on Habitats, Isolation, and Identification of Bacteria, том II, Springer-Veriog, Berlin-Heidelberg. После выделения штаммы могут быть исследованы на пестицидную активность во время вегетативного роста. Таким образом могут быть выявлены новые пестицидные протеины и штаммы.

Те микроорганизмы рода Bacillus, которые используются в настоящем изобретении, включают Bacillus cereus и Bacillus thuringiensis, а также виды Bacillus, перечисленные в таблице 11.

Группировка дана согласно Parry J.M. и др., (1983) Color Atlas of Bacillus species, Wolfe Medical Publications, Лондон.

В соответствии с настоящим изобретением из Bacillus могут быть выделены обладающие пестицидной активностью протеины, продуцируемые во время вегетативного роста. В одном из вариантов осуществления изобретения могут быть выделены инсектицидные протеины, продуцируемые во время вегетативного роста. Методы выделения протеинов известны в данной области техники. Обычно протеины могут быть очищены с помощью стандартной хроматографии, включающей гель-фильтрацию, ионообменную и иммуноаффинную хроматографии, жидкостную хроматографию высокого разрешения (ЖХВР), такую как жидкостная хроматография высокого разрешения с обращенной фазой, ионообменная жидкостная хроматография высокого разрешения, гель-фильтрирующая жидкостная хроматография высокого разрешения, хроматофокусирование высокого разрешения и хроматография с гидрофобным взаимодействием, и т.д., с помощью электрофоретического разделения, такого как одномерный гель-электрофорез, двумерный гель-электрофорез и т.д. Такие методы известны в данной области техники. См., например, в Current Protocols in Molecular Biology, т.т. 1 и 2, Ausubel и др. (ред.), John Wiley & Sons, NY (1988). Кроме того, могут быть получены антитела против практически чистых препаратов протеина. См., например, у Radka и др. (1983) в J. Immunol. 128: 2804; и у Radka и др. (1984) в Immunogenetics 19: 63. Для очистки протеина, обладающего пестицидными свойствами, могут быть использованы любые комбинации методов. После выбора протокола пестицидную активность определяют после каждой стадии очистки.

Такие стадии очистки приводят к получению практически очищенных фракций протеина. Под понятиями "практически очищенный" или "практически чистый" понимают протеин, который практически не содержит любых компонентов, обычно связанных с протеином в его естественном состоянии. Оценку "практически чистых" препаратов протеина можно проводить по отсутствию выявляемых полос другого протеина при электрофорезе в полиакриамидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ), что определяется визуально или денсиометрическим сканированием. В другом варианте уровень очистки может характеризовать отсутствие в очищенном препарате других последовательностей с концевой аминогруппой или остатков с концевым атомом азота. Чистота может быть проверена с помощью повторной хроматографии "чистых" препаратов, показывающей отсутствие других пиков при ионообменной хроматографии, хроматографии с обращенной фазой или капиллярном электорофорезе. Понятия "практически чистый" или "практически очищенный" не означают, что исключаются искусственные